DE10358366B4

DE10358366B4 - Massenspektrometrische Substanzidentifizierung

Info

Publication number: DE10358366B4
Application number: DE10358366A
Authority: DE
Inventors: Peter Sander
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2003-12-10
Publication date: 2008-04-03
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: US7271384B2; GB2409102A; GB2409102B; GB0426088D0; DE10358366A1; US20050127288A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, bestehend aus folgenden Schritten:
a) Ionisieren einer Substanz durch Elektrosprühen,
b) Aufnahme eines Massenspektrums,
c) Bestimmung einer wahrscheinlichen Molmasse der Substanz durch Auffinden eines Adduktmusters,
d) Verwendung der wahrscheinlichen Molmasse zur Auswahl eines Pseudomolekül-Ions der Substanz als Elternion für die Aufnahme eines Tochterionenspektrums,
e) Identitätssuche durch Spektrenvergleiche in einer Bibliothek, die Massenspektren und Tochterionenspektren bekannter Substanzen enthält.

Description

Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Substanz-Ionen, die in der Regel nach Trennung durch Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese durch Elektrosprühen erzeugt werden, anhand von Bibliotheken mit Massenspektren. Die Substanz-Ionen werden häufig nicht nur in protonierter (oder deprotonierter) Form, sondern als Addukte mit Kationen oder Anionen gebildet, was die Identifizierung erschwert.
Die Erfindung besteht darin, die Identifizierung dadurch sicherer zu machen, dass zusätzlich eine Bestimmung der wahrscheinlichsten Molmasse mit Hilfe von Adduktmustern vorgenommen wird.
Stand der Technik
Die Analyse von umweltrelevanten Substanzen und Naturstoffen hat sich weitgehend von der Kopplung der Massenspektrometrie mit der Gaschromatographie (GC-MS) zur Kopplung mit der Flüssigkeitschromatographie (LC-MS) oder der Kapillarelektrophorese (CE-MS) bewegt. Gründe dafür sind vielfältig: zum Einen sind die meisten der gegenwärtig untersuchten Substanzen dieses Gebietes nicht mehr unzersetzt verdampfbar, wie es für die Gaschromatographie unabdingbar ist, zum Anderen befinden sich diese Substanzen an ihren Fundorten bereits in meist wässriger Lösung. Die Verdampfbarkeit grenzt im Verständniss dieser Beschreibung den „niedermolekularen" vom „mittelmolekularen" Massenbereich ab.
Unter „umweltrelevanten Substanzen" sollen hier ganz allgemein Substanzen und ihre Abbauprodukte (Metaboliten) verstanden werden, die uns Menschen in unserer Umwelt – Natur, Pflanzen, Tieren – vorzugsweise in wässriger Umgebung begegenen und dort einem ständigen chemischen, enzymatischen oder mikrobiologischen Abbau unterworfen sind. Es kann sich dabei also sowohl um den Metabolismus von potenziellen Arzneimitteln wie auch um den Abbau von Herbiziden oder Pestiziden in Menschen, Tieren, Pflanzen oder Natur handeln, die sich – unter anderem – auch als Rückstände in Nahrungsmitteln finden lassen. Die Ausgangssubstanzen sind in der Regel vom Menschen erzeugt, sie können, müssen aber nicht, bei Beginn der Analyse bekannt sein.
Unter „Naturstoffen" wird hier die große Gruppe von organischen Substanzen verstanden, die sich in der belebten und unbelebten Natur, vor allem in Tieren und Pflanzen, aber auch in fossilen Lagerstätten finden, und die nicht der als „hochmolekular" verstandenen Gruppe der vielgliedrigen Biopolymere (Proteine, DNA, Polysacchararide) angehören. Zu diesen Naturstoffen gehören viele Hormone, Vitamine und pflanzliche Wirkstoffe, aber auch die unendlich vielen Inhaltsstoffe von Erdölen und Kohlen. Neben rein organischen Substanzen treten hier gelegentlich auch metall-organische oder mineral-organische Substanzen auf.
Die umweltrelevanten Substanzen und Naturstoffe, wie überhaupt die Substanzgruppe des mittelmolekularen Massenbereichs, sind von großem generellen Interesse. Wie oben kurz ausgeführt, kann ein geringer Teil von ihnen über eine Kopplung von Gaschromatographie mit Massenspektrometern (GC-MS) identifiziert werden. Diese Identifizierung ist relativ problemlos, da die dabei gewöhnlich eingesetzte Elektronenstoß-Ionisierung im Allgemeinen gut über Bibliotheken identifizierbare Massenspektren liefert. Die heute bevorzugte, sehr viel allgemeiner anwendbare Methode einer Trennung über Flüssigkeitschromatographie (HPLC = high performance liquid chromatography) mit nachfolgender Ionisierung über Elektrosprühen (ESI = electro spray ionization) bietet Vorteile, aber auch eine Reihe von Schwierigkeiten, die schon damit beginnen, dass die Spektren kaum charakteristische Fragment-Ionen enthalten. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, werden häufig in schneller Folge die Spektren positiver Ionen und negativer Ionen und automatisch auch in beiden Fällen Tochterionenspektren von jeweils prominenten Ionen aufgenommen, aber selbst dann ist eine schnelle Identifizierung problematisch, zum Einen wegen ihrer Zugehörigkeit zu sehr vielen chemischen Klassen, zum Anderen wegen der häufigen Bildung von einfachen und komplexen Addukt-Ionen. Unter „prominenten Ionen" verstehen wir hier in ihrer Intensität herausragende Ionen; dabei können es, je nach Affinität zu Addukten, die Pseudomolekular-Ionen sein, aber es kann sich auch, bisher mangels schneller Erkennbarkeit, um irgendwelche Addukt-Ionen handeln.
Zusätzlich zur Trennung der Substanzen durch die Flüssigkeitschromatographie treten auch Auftrennungen durch die verschiedenen Arten der Kapillarelektrophorese in den Vordergrund.
Unter „Pseudomolekülionen" verstehen wir hier die protonierten Molekülionen (Wasserstoffionen-Addukte) in den Massenspektren der positiven Ionen, und die deprotonierten Molekülionen (Wasserstoffionen-Dedukte) in den Massenspektren der negativen Ionen. Im Prozess des Elektrosprühens entstehen, je nach angewandter Spannungspolarität, entweder positive oder negative Ionen, die von entsprechend umschaltbaren Massenspektrometern als Spektren aufgenommen werden können. Die negativen deprotonierten Ionen entstehen wahrscheinlich durch die Anlagerung eines OH^–-Ions an das Substanzmolekül, mit sofortiger Abspaltung von H₂O.
Die hier betrachteten Analytsubstanzen haben im Allgemeinen Molekulargewichte zwischen etwa 100 und 1000 atomaren Masseneinheiten und befinden sich in der Regel in komplex zusammengesetzten Lösungen, in denen sich auch in wechselnd starkem Maße Salze und damit sowohl Kationen wie auch Anionen, vor allem Alkali-Ionen und Chlor-Ionen befinden. Die Ionisierung durch Elektrosprühen erzeugt hier bevorzugt einfach geladene Ionen, doch gibt es auch hier Ausnahmen (besonders bei schwereren Analytsubstanzen), wobei doppelt geladenen Ionen wiederum zum Teil als Addukt-Ionen auftreten. Bei der Auftrennung dieser Gemische mit Flüssigkeitchromatographie und der nachfolgenden Ionisierung durch Elektrosprühen entstehen also häufig im positiven Massenspektrum Alkali-Addukt-Ionen (Kationen-Addukte) der Form (M + Kat)⁺ statt der normalerweise gebildeten Pseudomolekülionen (M + H)⁺; bei negativen Ionen entstehen häufig Anionen-Addukte der Form (M + An)^– statt der Pseudomolekül-Ionen (M – H)^–.
Die Affinität der Substanzen zu den Alkali-Ionen ist recht unterschiedlich. Es gibt Substanzen, die bei dieser Form der Analytik fast nur noch in der Form (M + Na)⁺ erscheinen, also nur als Addukte mit Natrium. Das Signal der protonierten Molekül-Ionen (M + H)⁺ kann dabei sehr klein ausfallen oder sogar im Untergrundrauschen verschwinden. Für diese Substanzen ist eine Identifizierung sehr erschwert, zumal nach bisheriger Technik mit der Aufnahmen von Tochterionenspektren von prominenten Ionen auch keine Tochterionenspektren der Pseudomolekül-Ionen aufgenommen werden. Es können aber auch nebeneinander verschiedene Addukt-Ionen erscheinen, beispielsweise (M + Na)⁺ und (M + K)⁺.
Eine Apparatur zur Analyse von umweltrelevanten Substanzen und Naturstoffen besteht aus einer Kopplung eines Flüssigkeitschromatographen über eine Einrichtung zum Elektrosprühen mit einem Massenspektrometer, das sowohl positive wie auch negative Ionen messen kann und zur Aufnahme von Tochterionenspektren eine Einrichtung zur Fragmentierung der Ionen besitzt. Als Beispiel eines solchen Massenspektrometers sei hier ein Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometer nach Wolfgang Paul angeführt; es können aber auch Fourier-Transform-Massenspektrometer oder Tandem-Massenspektrometer verschiedener Art, beispielsweise als Quadrupolfilter, Stoßzelle, und Flugzeit-Massenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss verwendet werden.
Ein günstiges Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit einer solchen Apparatur besteht nun darin, nicht nur für jede eluierende Substanz in schneller Folge positive wie auch negative Massenspektren aufzunehmen, sondern auch Tochterionenspektren beider Polaritäten. Die Auswahl der Ionensorten für die Aufnahme von Tochterionenspektrum beruht dabei für gewöhnlich auf der Intensität der Ionen im Massenspektrum, meist gestützt durch eine Verbotsliste, die Ionen von stets vorhandenen Verunreinigungen ausschließt. Dabei nimmt man häufig nur Tochterionenspektren von Addukt-Ionen auf, weil die Pseudomolekülionen oft nur geringe Intensität besitzen. Die Tochterionenspektren der Addukt-Ionen sind allerdings in der Regel sehr informationsarm, da sie häufig nur die Abspaltung des Addukts anzeigen und keine weitere Information über die Struktur der Substanz enthalten. Die Massenspektren und Tochterionenspektren werden nun verwendet, die Substanz anhand einer Spektrenbibliothek zu identifizieren, wobei die Spektrenbibliothek positive und negative Substanzspektren wie auch Tochterionenspektren der Pseudomolekülionen, nach Möglichkeit auch Tochterionenspektren von den häufigsten Adduktionen enthält.
Da jedoch die durch Elektrosprühen erzeugten Spektren in der Regel keine Fragment-Ionen enthalten, und da auch die Tochterionenspektren dieser Substanzgruppen durch nur wenige Fragment-Ionen im Vergleich zu Elektronenstoß-Spektren häufig relativ informationsarm sind, sind die so gewonnenen Ergebnisse der Identifizierung in der überwiegenden Anzahl der Analysen nicht eindeutig. Insbesondere sind die Tochterionenspektren von Addukt-Ionen, wie oben schon ausgeführt, häufig kaum für eine Identifizierung zu gebrauchen.
Obwohl die Massenspektren der Substanzen praktisch kaum je Fragmentionen enthalten, können sie sehr komplex sein. Im Prozess des Elektrosprühens werden zwar überwiegend einfach geladene Ionen erzeugt, aber auch doppelt geladene. Zudem werden Ionen der Substanz-Dimere, in einigen Fällen sogar der Substanz-Trimere, gebildet. Alle diese Ionen unterliegen der Adduktbildung: Addukte der einfach geladenen Molekülionen, der doppelt geladenen Molekülionen und der Dimer-Ionen. Und diese Addukte können wiederum einfache Anionen- oder Kationenaddukte sein, aber auch komplexere Addukte mit mehreren An- oder Kationen. Die Art der Addukte richtet sich nach den dissoziierbaren Substanzen, in der Regel Salze, die nach der Probenvorbereitung in der Lösung verbleiben, und nach der Affinität der Substanzen zu den verschiedenen Anionen und Kationen. Ein Entfernen der Salze ist sehr schwierig, in vielen Fällen überhaupt nicht möglich. Die dissoziierbaren Substanzen wiederum können die Dimeren- und Trimerenbildung beeinflussen. Die Anforderungen an die Sauberkeit der Lösungsmittel gehen häufig über die standardmäßig erhältlichen Reinheitsgrade hinaus.
Da die Zusammensetzung der Lösung, in der sich die Substanzen befinden, schon aus Gründen der Herkunft der Substanzen nie vollkommen gleich ist, sind auch die Spektren mit ihrer komplexen Bildung von Addukten, Dimeren-Addukten und doppelt geladenen Addukten nie so gleich, dass sie eine eindeutige Substanzidentifizierung ermöglichen.
Aus der Offenlegungsschrift US 2003/0213 902 A1 sind Verfahren bekannt, bei denen die Molekülmasse einer Substanz aus dem Adduktmuster eines Massenspektrums ermittelt wird. Im gemessenen Massenspektrum werden die Massensignale der Adduktionen entfernt und durch ein Massensignal des Molekülions ersetzt. Das geänderte Massenspektrum wird für einen Spektrenvergleich in einer Substanzbibliothek verwendet. In den Druckschriften US 2002/0168775 A1 , US 2002/0086434 A1 und US 4,713,346 werden Substanzen in einer Probenlösung nachgewiesen, indem einer Probelösung substanzspezifische Adduktbildner zugegeben werden und die so erzeugten Adduktionen massenspektrometrisch nachgewiesen werden.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, die Identifizierung der Substanzen anhand von Elektrosprüh-Massenspektren zu verbessern.
Erfindung
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1.
Es ist die Grundidee der Erfindung, eine Identitätssuche durch Spektrenvergleiche in einer Substanzbibliothek durch eine Bestimmung des wahrscheinlichsten Molekulargewichts (Molmasse) der Substanz zu ergänzen, wobei sich diese Bestimmung auf ein erwartbares Adduktmuster stützt. Ein erwartbares Adduktmuster setzt sich aus Massendifferenzen erwartbarer Addukte zur Molmasse im positiven beziehungsweise negativen Massenspektrum zusammen. Die Massendifferenzen im positiven Spektrum stützen sich auf Protonierung (Addukt mit Wasserstoff-Ion) und auf die durch Probenvorbereitung erwartbaren Kationen-Addukte, die Massensdifferenzen im negativen Spektrum ergeben sich aus Deprotonierung (Dedukt eines Wasserstoff-Ions) und die erwartbaren Anionen-Addukte. Bei Fehlen von Kation- und Anionen-Addukten ist bereits die Massendifferenz von 2 atomaren Masseneinheiten zwischen den negativen und positiven Pseudomolekül-Ionen ein starkes Indiz für die Molmasse.
Die Erfindung beruht darauf, dass erstens die Fragmentabspaltung in Elektrosprüh-Massenspektren selten ist und dass zweitens Adduktionenbildung und Fragmentabspaltung meist eindeutig voneinander zu unterscheiden sind. Tritt beispielsweise bei einer Substanz neben dem Pseudomolekülion (M + H)⁺ noch das Natrium-Addukt (M + Na)⁺ auf, und so kann aus dem Massenunterschied von 22 atomaren Masseneinheiten bereits streng auf das Vorliegen von Addukt-Ionen geschlossen werden. Die Abspaltung eines Molekülfragmentes mit 22 Masseneinheiten aus einem Molekülion ist unmöglich, da es weder CH₁₀ noch NH₈ noch OH₆ noch FH₃ gibt; sollte es sich nicht um Addukt-Ionen mit Na handeln, so kann es sich nur um zwei verschiedene, durch die Chromatographie nicht aufgetrennte Substanzen handeln, die zufällig diesen Massenunterschied aufweisen. Die Wahrscheinlichkeit hierfür ist sehr gering. Tritt zusätzlich das Kalium-Addukt (M + K)⁺ auf, so gilt für die zusätzliche Massendifferenz von 16 atomaren Masseneinheiten ähnliches. Das gleichzeitige Auftreten von Natrium und Kalium-Addukten kann also bereits zur Addukterkennung (ihren, ohne dass überhaupt das Pseudomolekülion erkennbar vorhanden ist. Auch bei negativen Addukt-Ionen mit anionischem Chlor (M + Cl)^– kann die Differenz von 36 bzw. 38 Masseneinheiten zum Pseudomolekülion (M – H) praktisch nicht durch Abspaltungen auftreten.
Durch gezielte Salzzugabe während der Probenvorbereitung, beispielsweise durch Zugabe von Kaliumfluorid, kann die Adduktbildung in Maßen gesteuert werden, um eine eindeutigere Molmassenbestimmung zu erhalten.
Die Suche nach der wahrscheinlichsten Molmasse kann durch eine Korrelationsanalyse zwischen Massenspektren und dem erwartbaren Adduktmuster ausgeführt werden. Besonders günstig ist eine gemeinsame Korrelationsanalyse eines kombinierten Adduktmusters aus positiven und negativen Intensitäten in einem kombinierten positiven und negativen Massenspektrum, das ebenfalls aus positiven und negativen Intensitäten besteht. Die Wahl der Intensitäten des Adduktmusters richtet sich nach Erfahrungswerten, im einfachsten Fall können die Intensitätswerte +1 und –1 angenommen werden.
Mit Kenntnis der wahrscheinlichen Molmasse und der bevorzugten Addukte lassen sich auch Dimeren-Addukte und Addukte doppelt geladener Substanzionen erkennen und zur Bestätigung der Identität verwenden. Dimeren-Addukte sind stark konzentrationsabhängig; sie werden oft erst nur durch eine Kationenanlagerung ermöglicht, wie in 1 sichtbar wird.
Im Allgemeinen sind die Tochterionenspektren von Pseudomolekülionen aussagekräftiger für die Identität der Substanz als die Tochterionenspektren der Addukt-Ionen. Es ist daher ein weiterer Gedanke der Erfindung, das Adduktmuster in einem Spektrum zum Auffinden des Pseudomolekülions zu verwenden, um dann (rückgesteuert) ein Tochterionenspektrum dieses Ions aufzunehmen, selbst wenn dieses Pseudomolekülion nur sehr klein ist oder sogar im Untergrundrauschen nicht sichtbar ist.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt oben ein positives und unten ein negatives Massenspektrum einer Substanz, die durch Elektrosprühen ionisiert wurde. Es treten hier im positiven Spektrum, das sehr einfach zu interpretieren ist, neben dem Pseudomolekülion auch Addukte mit Natrium, mit Kalium und sogar sowohl mit Natrium wie auch mit Kalium auf, wobei im letzteren Fall eine Deprotonierung notwendig ist, um nur eine postive Ladung zu behalten. Das Dimer kommt nur als Natrium-Addukt vor. Das negative Spektrum zeigt interessanterweise keine Adduktbildung mit Chlor; auch die Dimerenbildung findet ohne die Mithilfe des Natrium-Ions statt.
2 zeigt das negative Spektrum einer anderen Substanz mit Addukten von Chlor und mit einer Gruppe HCO₂, die auch schon in anderen Spektren beobachtet wurde.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfindung besteht darin, bei der massenspektrometrischen Identifizierung von mittelschweren Analytsubstanzen, die durch Elektrosprühen ionisiert wurden, neben der Suche in Spektrenbibliotheken auch eine Bestimmung der wahrscheinlichen Molmasse mit Hilfe des Adduktmusters zur Absicherung der Identifizierung vorzunehmen. Die Substanzen werden in der Regel durch Flüssigkeitschromatographie vorgetrennt, stehen also zur massenspektrometrischen Messung nur einige Sekunden zur Verfügung. In diesen Sekunden müssen alle Massenspektren und Tochterionenspektren aufgenommen werden.
Die meisten der heute erhältlichen Massenspektrometer lassen sich von der Aufnahme positiver Ionen auf die Aufnahme von negativen Ionen umschalten. Die Umschaltung geht allerdings nicht momentan vor sich, sondern erfordert, je nach Massenspektrometer, kürzere oder längere Umschalt- und Beruhigungszeiten. Es wird daher in der Regel so vorgegangen, dass zunächst positive Massenspektren aufgenommen werden und dann Tochterionenspektren von positiven Ionen, wobei die Anzahl der Tochterionenspektren möglichst klein gehalten werden sollte. Es ist also wichtig, die informationsreichsten Elternionen für die Tochterionenspektren zu finden. Das informationsreichste Elternion ist in aller Regel das Pseudomolekül-Ion, auch wenn es nur geringe Intensität im Spektrum besitzt. Mit einigen Arten von Massenspektrometern, beispielsweise Ionenfallen-Massenspektrometern, lässt sich das Pseudomolekül-Ion (durch entsprechendes Sammeln der Ionen) auch dann noch als Elternion verwenden, wenn es praktisch im Untergrundrauschen untergeht.
Erst nach der Aufnahme aller positiven Spektren dann wird, wenn überhaupt noch Zeit bleibt, auf die Aufnahme von negativen Spektren umgeschaltet. Für die Aufnahme der Tochterionenspektren negativer Ionen bleibt regelmäßig wenig Zeit, die entsprechend gut genutzt werden muss. Auch hier ist es gut, das Pseudomolekül-Ion als Elternion zu finden, selbst wenn dieses nur eine geringe Intensität hat.
Werden nur (oder zunächst nur) Massenspektren von positiven Ionen aufgenommen, so besteht eine einfache Ausführungsform der Erfindung bereits darin, in dem Massenspektrum der Substanz nach einfach geladenen Ionensignalen mit einer Massendifferenz von 22 atomaren Masseneinheiten zu suchen, da Addukte mit Natrium weitaus am häufigsten auftreten. Die einfach geladenen Ionensignale lassen sich daran erkennen, dass die Abstände ihrer Isotopen-Ionen ganzzahligen Masseneinheiten entsprechen. Die Differenz von 22 Masseneinheiten entspricht der Massendifferenz zwischen dem Pseudomolekül-Ion (M + H)⁺ und dem Natrium-Addukt-Ion (M + Na)⁺. Diese Differenz kann in der Praxis nicht als Abspaltung eines Neutralfragmentes auftreten, und ist daher ein erstes, schon strenges Indiz für die wahrscheinlichste Molmasse.
Tritt diese Differenz von 22 Masseneinheiten zweimal auf, so ist zu vermuten, dass es sich um die Differenzen der Natrium-Addukte des Molekül-Ions (M + Na)⁺ und des Dimer-Ions (2M + Na)⁺ zu den entsprechenden Wasserstoffionen-Addukten (M + H)⁺ und (2M + H)⁺ handelt. Diese Vermutung kann sehr leicht durch Nachrechnen bestätigt werden und führt zu einer bereits recht sicheren Bestimmung der Molmasse der Substanz. Dieses sehr einfache Verfahren führt überraschend oft zum Erfolg.
Es kommt jedoch auch häufig vor, dass die Zusammenfügung zu einem Dimeren der Substanz erst durch die Adduktion mit Natrium zustande kommt. Es existiert dann zwar das Natriumionen-Addukt (2M + Na)⁺, nicht aber das Wasserstoffionen-Addukt (2M + H)⁺. Auch in diesem Fall kann ein Nachrechnen eine Bestätigung der wahrscheinlichen Molmasse erbringen. Ein Nachrechnen ist angezeigt, wenn weit oberhalb der Ionen mit der Massendifferenz von 22 Masseneinheiten noch weitere Ionengruppen auftauchen.
Bei völligem Fehlen einer Massendifferenz von 22 Masseneinheiten im positiven Spektrum kann dann nach einer Massendifferenz von 16 Masseneinheiten gesucht werden. Es handelt sich dann mit hoher Wahrscheinlichkeit um die Differenz zwischen Natrium-Addukt (M + Na)⁺ und dem Kalium-Addukt (M + K)⁺. Auch hier kann man durch das Auftreten von Dimeren-Addukten eine Bestätigung erlangen.
Es gibt jedoch auch komplexere Addukt-Ionen: so wurden beispielsweise die Addukt-Ionen (M + CH₃OH + Na)⁺ und (M + NH₄ + K – H)⁺ beobachtet.
Weitere Bestätigungen kann man auch durch die gelegentlich auftretenden doppelt geladenen Ionen erhalten. Die Wahrscheinlichkeit doppelt geladener Ionen steigt mit steigender Molmasse der Substanz. Diese können vom Typ (M + 2H)⁺⁺, (M + H + Na)⁺⁺ oder (M + 2Na)⁺⁺ sein; es sind aber natürlich auch Addukte mit anderen Kationen möglich.
Diese Bestimmungen der wahrscheinlichsten Molmasse lassen sich in modernen Rechnern, wie sie zur Steuerung von Massenspektrometern zu finden sind, außerordentlich schnell (in wenigen Millisekunden) durchführen. Die Berechnungen können daher auch dazu dienen, die geeigneten Elternionen für die Aufnahme von Tochterionenspektren in Echtzeit auszuwählen. In den weitaus meisten Fällen ergibt das Tochterionenspektrum des Pseudomolekül-Ions die beste Information über die Identität der Substanz.
Steht jetzt immer noch Substanz aus dem chromatographischen Peak zur Verfügung, so kann auf die Aufnahme eines negativen Substanz-Massenspektrums umgeschaltet werden.
Ein erstes, bereits relativ sicheres Indiz für die wahrscheinlichste Molmasse erhält man, wenn man im negativen Spektrum ein Ionensignal findet, das sich zwei Massen unterhalb des positiven Pseudomolekül-Ions befindet, wobei es sich bei dem positiven Pseudomolekül-Ion um ein gemessene Ionenmasse oder auch nur um eine berechnete Ionenmasse handeln kann.
In den seltenen Fällen, in denen das negative Pseudomolekül-Ion verschwindet, kann geprüft werden, ob zwischen Addukt-Ionensignalen im positiven und im negativen Massenspektrum bekannte Massendifferenzen auftreten. Insbesondere deuten zwei Differenzen von 12 und 14 Masseneinheiten zu zwei schwereren Ionen im negativen Massenspektrum auf die Differenz zwischen Natrium-Addukt (M + Na)⁺ und dem Chlor-Addukt (M + Cl)^– hin. Dabei kann auch das Intensitätsverhältnis von 1 : 3 der beiden Ionen im negativen Spektrum auf Clor hinweisen. Eine solche Konstellation allein ist ein ziemlich sicheres Indiz für die wahrscheinliche Molmasse.
Auch bei den negativen Addukt-Ionen gibt es komplexere Formen, beispielsweise wurden (M + HCO₂)^- oder (M + CH₃HCO₂)^- beobachtet. Bei den negativen Dimeren wurden auch schon Formen der Zusammensetzung (2M + Na – 2H)^- gesehen), es wurden also zwei negative Pseudomolekülionen durch ein positives Natium-Ion zusammengehalten.
Es ist somit die Grundidee der Erfindung, die Identitätssuche durch Spektrenvergleich mit einer Substanzbibliothek durch eine Bestimmung des wahrscheinlichsten Molekulargewichts (Molmasse) der Substanz zu ergänzen, wobei sich diese Bestimmung auf ein erwartbares Adduktmuster stützt. Ein erwartbares Adduktmuster setzt sich aus Massendifferenzen erwartbarer Addukte zur Molmasse im positiven beziehungsweise negativen Massenspektrum zusammen. Die Massendifferenzen im positiven Spektrum stützen sich auf Protonierung (Addukt mit Wasserstoff-Ion) und auf die durch Probenvorbereitung erwartbaren Kationen-Addukte, die Massensdifferenzen im negativen Spektrum ergeben sich aus Deprotonierung (Dedukt eines Wasserstoff-Ions) und die erwartbaren Anionen-Addukte. Bei Fehlen von Kation- und Anionen-Addukten ist bereits die Massendifferenz von 2 atomaren Masseneinheiten zwischen den negativen und positiven Pseudomolekül-Ionen ein starkes Indiz für die Molmasse.
Die Erfindung beruht insbesondere darauf, dass die Adduktionenbildung mit den wichtigsten Addukt-Ionen und die Fragmentionenabspaltung eindeutig voneinander zu unterscheiden sind, da die bei der Adduktbildung vorkommenden Massendifferenzen praktisch nicht als Abspaltungen vorkommen können. In Massenspektren durch Elektrosprühen treten sowieso kaum Fragmentionen auf. Die bei der Adduktbildung vorkommenden Massendifferenzen können also nur zufällig durch einen Überlapp von verschiedenen Substanzen entstehen, die durch die Chromatographie nicht aufgetrennt werden.
Die Adduktbildung kann in eingeschränkter Weise auch gesteuert werden. Da es häufig nicht möglich ist, alle Salze und anderen dissoziierbaren Stoffe aus der Analytlösung zu entfernen, kann man es zumindest vermeiden, dass nur eine einzige Adduktsorte gebildet wird. Tritt nur eine einzige Adduktsorte auf, so ist die Identifizierung der Analytsubstanz sehr erschwert, weil dann weder die richtigen Elternionen für eine Aufnahme von informationsreichen Tochterionenspektren zur Verfügung stehen, noch kann eine wahrscheinliche Molmasse leicht bestimmt werden. Durch gezielte Salzzugabe während der Probenvorbereitung, beispielsweise durch Zugabe von Kaliumfluorid zu praktisch immer vorhandenem Natriumchlorid in der Probenlösung, kann die Adduktbildung in Maßen gesteuert werden, um durch die Bildung von mindestens zwei verschiedenen Adduktsorten eine eindeutigere Molmassenbestimmung zu erhalten.
Während oben die Suche nach der wahrscheinlichsten Molmasse als eine Reihe von Einzelprüfungen beschrieben wurde, kann sie auch in mehr geschlossener Form durch eine Korrelationsanalyse zwischen Massenspektren und dem erwartbaren Adduktmuster ausgeführt werden. Besonders günstig ist eine gemeinsame Korrelationsanalyse eines kombinierten Adduktmusters aus positiven und negativen Intensitäten in einem kombinierten positiven und negativen Massenspektrum, das ebenfalls aus positiven und negativen Intensitäten besteht. Aus dem Korrelationsspektrum ragen die Molmassen im Allgemeinen als größte Signale heraus. Die Wahl des Adduktmusters, aber auch die Wahl der Intensitäten für das Adduktmuster richten sich nach Erfahrungswerten. Im einfachsten Fall können die Intensitätswerte zu +1 und –1 angenommen werden.
Für die Bestimmung der Identität der Substanzen können, wie auch schon gelegentlich üblich, auch die chromatographischen Retentionszeiten herangezogen werden. Dazu müssen diese Retentionszeiten mit in die Spektrenbibliotheke aufgenommen werden. Moderne Flüssig keitschromatographen sind mit Detektoren zur Messung von UV-Absorptionsspektren ausgerüstet. Diese UV-Absorptionsspektren können ebenfalls mit in die Bibliotheken aufgenommen und zur Identitätsbestimmung herangezogen werden.
Statt der Flüssigkeitschromatographen können auch Kapillarelektrophoresegeräte zur Auftrennung der Substanzen verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, bestehend aus folgenden Schritten: a) Ionisieren einer Substanz durch Elektrosprühen, b) Aufnahme eines Massenspektrums, c) Bestimmung einer wahrscheinlichen Molmasse der Substanz durch Auffinden eines Adduktmusters, d) Verwendung der wahrscheinlichen Molmasse zur Auswahl eines Pseudomolekül-Ions der Substanz als Elternion für die Aufnahme eines Tochterionenspektrums, e) Identitätssuche durch Spektrenvergleiche in einer Bibliothek, die Massenspektren und Tochterionenspektren bekannter Substanzen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Massenspektren und Tochterionenspektren positiver und negativer Ionen aufgenommen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Auffinden des Adduktmusters durch eine Korrelation des Massenspektrums mit dem Adduktmuster vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass dem Ionisieren der Substanz eine Substanztrennung durch Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese vorhergeht.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die chromatographische Retentionszeit oder elektrophoretische Durchlaufzeit als zusätzliches Suchkriterium verwendet werden, wobei die Spektrenbibliotheken auch Retentionszeiten oder Durchlaufzeiten enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Spektrenvergleiche mit UV-Absorptionsspektren zur Identitätsbestimmung herangezogen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Adduktmuster durch Zugabe von Salzen oder anderen dissoziierenden Substanzen während der Probenvorbereitung beeinflusst wird.