DE102005018273B4

DE102005018273B4 - Rückgesteuerte Tandem-Massenspektrometrie

Info

Publication number: DE102005018273B4
Application number: DE102005018273A
Authority: DE
Inventors: Roman Zubarev; Mikhail Savitski; Michel Lund Nielsen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2025-04-21
Also published as: GB2429835B; GB2429835A; US8110793B2; DE102005018273A1; GB0607731D0; US20060255259A1

Abstract

Verfahren zur Aufnahme von Fragmentionenspektren von Biopolymerionen in einem Tandem-Massenspektrometer, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Aufnahme eines Fragmentionenspektrums eines Biopolymerions eine Gütezahl berechnet wird, die im Wesentlichen proportional zur Länge der längsten geschlossenen Kette von Polymerbausteinen ist, die den Signalen des Fragmentionenspektrums zu entnehmen ist, und dass diese Gütezahl zur Entscheidung verwendet wird, ob von diesem Biopolymerion ein weiteres Fragmentionenspektrum mit anderen Fragmentierungsparametern aufzunehmen ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Aufnahmeverfahren für Fragmentionenspektren von Biopolymermolekülen in Tandem-Massenspektrometern, die mit separierenden Trennverfahren gekoppelt sind.
Die Erfindung stellt ein Echtzeit-Verfahren zur Berechnung einer Gütezahl für jedes Fragmentionenspektrum zur Verfügung, wobei die Gütezahl angibt, ob das Fragmentionenspektrum Erfolg versprechend für eine Identifizierung des Biopolymermoleküls verwendet werden kann oder mit anderen Aufnahmeparametern wiederholt aufgenommen werden sollte.
Stand der Technik
Die heutige massenspektrometrische Forschung an Biopolymeren wie Peptiden, Proteinen oder auch genetischem Material ist häufig gekoppelt mit schnellen Trennverfahren wie Flüssigkeitschromatographie (HPLC oder einfach LC) oder Kapillarelektrophorese (CE). Dabei tritt häufig die Aufgabe auf, Ionen der Biopolymere im Massenspektrometer zu fragmentieren, um Auskünfte über die Sequenzen der Bausteine des Biopolymers zu erhalten; im Falle der Peptide und Proteine also Auskünfte über die Sequenz der Aminosäuren. Es sollen also Fragmentionenspektren aufgenommen werden. Die dazu notwendigen Arten von Massenspektrometern sind unter dem Begriff „Tandem-Massenspektrometer" bekannt geworden. Die Verfahren der Aufnahme von Fragmentionenspektren mit Tandem-Massenspektrometern werden häufig als MS/MS abgekürzt.
Tandem-Massenspektrometer bestehen aus einem ersten Massenspektrometer, mit dem Ionen einer bestimmten Art ausgewählt werden, einer Fragmentierungseinrichtung, in der diese Ionen fragmentiert werden, und einem weiteren Massenspektrometer, mit dem die Fragmentionen analysiert werden. In Ionenfallen-Massenspektrometern können diese Vorgänge der Selektion, der Fragmentierung und der Analyse der Fragmentionen auch nacheinander in derselben Ionenfalle ausgeführt werden, man spricht dann von „tandem-in-time", statt von „tandem-in-space" bei räumlich getrennten Massenspektrometern.
In der Proteomik geht es häufig um die Analyse von Tausenden von Peptiden, die aus einem enzymatischen Verdau eines komplexen Proteingemisches gewonnen wurden. Im Folgenden wird die Aufgabenstellung der Erfindung besonders im Lichte dieser sehr komplexen Peptidgemische beschrieben.
Das vorgeschaltete Trennverfahren für die Biopolymere bietet dem Massenspektrometer die Analytsubstanz, also im speziellen Fall ein Verdaupeptid, nur wenige Sekunden lang an. Es bieten mehrere Firmen für einen solchen Fall Tandem-Massenspektrometer und Messverfahren zur automatischen Aufnahme von Fragmentmassenspektren an. Es werden Massenspektren in steter Folge aufgenommenen, beispielsweise in schnellen Massenspektrometern ein bis zwanzig Massenspektren pro Sekunde. Für jedes Massenspektrum ist dann durch ein Auswerteprogramm zu ermitteln, ob überhaupt ein oder mehrere Verdaupeptide in genügender Konzentration angeliefert werden. Bei den oben geschilderten komplexen Gemischen werden häufig zu einem Zeitpunkt mehrere Verdaupeptide gleichzeitig angeliefert, häufig sogar zehn bis zwanzig Verdaupeptide gleichzeitig.
In diesem Fall ist zunächst durch eine mathematische Analyse des Massenspektrums eine Auswahl zu treffen, welche Ionensorte für die Aufnahme eines Fragmentionenspektrums zu fragmentieren ist. Für die Fragmentierung sind doppelt geladene Ionen am besten geeignet, somit wird für gewöhnlich die intensivste Ionensorte verwendet, die innerhalb eines vorbestimmtem Massenbereiches doppelt geladen vorkommt und nicht in einer Ausschlusstabelle steht. Die Ausschlusstabelle enthält die Massenwerte solcher Peptide, die bereits in vorherigen Messzyklen analysiert wurden oder von vornherein als nicht interessant markiert wurden. Daraufhin ist in einer nächsten Spektrenaufnahme die ausgewählte Ionensorte im erstem Massenspektrometer auszufiltern und in der Fragmentierungsstufe zu fragmentieren; die Fragmentionen sind in Form eines Fragmentionenspektrums zu messen. Für die Fragmentierung gibt es verschiedene Verfahren, deren Verfahrensparameter für gewöhnlich blind so eingestellt werden, wie es sich für Ionen eines Verdaupeptids dieser Masse im Durchschnitt als günstig erwiesen hat.
Die Arten der Verfahrensparameter für die Fragmentierung sind für verschiedene Massenspektrometer und verschiedenartigen Fragmentierungsarten sehr verschieden. Als Fragmentierungsarten gibt es zum Einen die Stoßfragmentierung (CID = collisional ion decomposition), in der Stöße mit einem Stoßgas einen Energieübertrag auf das Ion bewirken, was, je nach Stoßenergie, nach bereits einem oder auch erst nach vielen Stößen zu einer Fragmentierung führt. In besonders dazu eingerichteten Massenspektrometern gibt es des Weiteren auch eine Fragmentierung durch niederenergetische Elektronen, entweder durch direkten Beschuss oder durch Transfer der Elektronen aus negativ geladenen Ionen oder hoch angeregten Neutralteilchen (ECD = electron capture dissociation; ETD = electron transfer dissociation, MAID = metastable-atom-induced dissociation). Für die Arten der Fragmentierung durch Elektronen gibt es nur die Parameter der angebotenen Elektronendichte und der Bestrahlungsdauer.
In Massenspektrometern, die mit quadrupolaren Stoßzellen ausgerüstet sind, gibt es als Fragmentierungsparameter insbesondere die Stoßenergie, mit der die selektierten Ionen in die gasbefüllte Stoßzelle eingeschossen werden, und in einigen Massenspektrometern auch die Art des Stoßgases, das sich aber nicht schnell, also keinesfalls von Spektrenaufnahme zu Spektrenaufnahme wechseln lässt. Zu diesen Geräten mit Stoßzelle gehören die Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (generische Abkürzung QqQ), aber auch bestimmte Arten von Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss (generische Abkürzung QqOTOF). Die Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss haben darüberhinaus auch die Möglichkeit, die Dauer der Spektrenaufnahme zu ändern, da sie Einzelspektren mit hoher Frequenz aufnehmen und fortlaufend zu einem Spektrum addieren.
Für Massenspektrometern mit Hochfrequenz-Quadrupolionenfallen, in der eine Stoßfragmentierung durch Helium als Dämpfungs- und Fragmentierungsgas vorgenommen wird, gibt es im Wesentlichen nur zwei Parameter: Befüllungszeit und Fragmentierungsdauer. Die Anregungshochfrequenzspannung wird dabei stets so hoch gewählt, dass die zu Oszillationen angeregten selektierten Ionen gerade nicht an die Endkappenelektroden anstoßen. Diese Anregungshochfrequenzspannung fällt daher in der Regel als variierbarer Parameter aus.
Leider erweist sich sehr häufig bei der Verwendung dieser Fragmentionenspektren zur Identitäts- und Struktursuche mit Hilfe von „Suchmaschinen" in Proteinsequenzdatenbanken, dass die Qualität einer überwiegenden Anzahl dieser Spektren nicht ausreichend gut war. Untersuchungen zeigen, dass die Anzahl der qualitativ nicht ausreichend guten Fragmentionenspektren in manchen Massenspektrometerarten häufig nicht über zehn Prozent der aufgenommenen Fragmentionenspektren hinauskommt. Da in einem dreistündigen Lauf einer einzigen flüssigkeitschromatographischen oder kapillarelektrophoretischen Trennung mit massenspektrometrischer Analyse durchaus etwa 20 000 bis 60 000 Fragmentionenspektren aufgenommen werden können, erscheint vielfach die Absolutanzahl von 2000 bis 6000 qualitativ guter Spektren als erfreulich hoch; doch die analytische Aufgabe einer Erfassung möglichst vieler Analytsubstanzen wird nicht ausreichend gelöst.
In anderen Arten von Tandem-Massenspektrometern werden 20 bis 30 Prozent gute Spektren erhalten, immer noch eine nur geringe Anzahl.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, aus Proben von Biopolymeren, die durch ein Separationsverfahren getrennt wurden, die Anzahl der nutzbaren Fragmentionenspektren mit genügend guter Qualität für eine Identifizierung zu erhöhen.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung verwendet eine schnelle Echtzeit-Berechnung einer Gütezahl zur Abschätzung, ob von einem Biopolymerion ein Fragmentionenspektrum ein zweites Mal unter veränderten Fragmentierungsbedingungen aufgenommen werden soll. Die Gütezahl beschreibt die Chancen, über das Fragmentionenspektrum das Biopolymer zu identifizieren. Sie entspricht im Wesentlichen der längsten Kette von Polymerbausteinen, im Falle der Verdaupeptide also der Aminosäuren, die im Fragmentspektrum gefunden werden kann. Dabei kommen nicht nur Aminosäuren als solche für die Kettenbausteine in Betracht, sondern auch die gängigsten Modifikationen der Aminosäuren, wie sie für gewöhnlich im Proteom zu finden sind.
Es ist für die Berechnung der Gütezahl zunächst aus den Signalen des Fragmentionenspektrums eine Tabelle der Massenwerte dieser Signale zu erstellen. Diese Tabelle wird aus Zeitgründen bevorzugt nur für Signale über einer Intensitätsschwelle erstellt, wobei für diese Signale auch nur der schnell zu ermittelnde Massenwert des Maximums berechnet wird. Für Isotopengruppen wird in bekannter Weise nur die Masse des monoisotopischen Signals in die Tabelle eingetragen. Für mehrfach geladene Ionen, die am Abstand der Massenwerte ihrer Isotopensignale zu erkennen sind, werden bevorzugt nur die Massenwerte der daraus berechneten einfach geladenen Ionen in die Tabelle eingestellt. Die Berechnung dieser Tabelle anhand einer vorbekannten Kalibrierkurve dauert nur Millisekunden oder weniger. Aus dieser Tabelle der virtuellen Massenwerte einfach geladener Fragmentionen wird der Gütewert bestimmt.
Der Gütewert wird dabei sukzessiv aus den Differenzen eines Massenwerts zu anderen Massenwerten bestimmt, ausgehend von einem kleinsten oder auch größten Massenwert. Dabei braucht aus Zeitgründen nicht die gesamte längste Kette der Polymerbausteine gesucht werden, es genügt, wenn eine Länge gefunden wird, die als Minimum für eine gute Identifizierung steht.
Aus Zeitgründen kann für die Prüfungen eine Prüftabelle verwendet werden, in der für jeden Wert einer Massendifferenz eingetragen ist, ob es für diesen Wert eine Aminosäure oder eine kurze Kette von Aminosäuren gibt. In der Prüftabelle sind dabei auch Einträge für modifizierte Aminosäuren enthalten. Die Einträge sind entweder Nullen (keine Kette möglich) oder eine kleine Zahl, die für eine geschlossene Kette zusammengezählt die Gütezahl ergibt. Unter einer geschlossenen Kette wird hier auch eine Kette verstanden, bei der die Massendifferenz für eine einfache Aminosäure fehlt, die Kette jedoch über eine Lücke, die zwei oder drei Aminosäuren entspricht, hinweg fortgesetzt werden kann. Die Zahlenwerte der Einträge können dabei das Vorhandensein von Lücken berücksichtigen. Beispielsweise kann für Massendifferenzen, die einzelnen Aminosäuren und deren Modifizierungen entsprechen, eine „drei" eingetragen sein, während für zwei aneinanderhängende Aminosäuren und deren Modifikationen nur eine „zwei", und für drei aneinanderhängende Aminosäuren nur eine „eins" eingetragen ist.
Die Abstufung der Massenwerte, die für die Tabelle verwendet werden, richtet sich nach der Massengenauigkeit des betreffenden Tandem-Massenspektrometers. Beträgt die Massengenauigkeit beispielsweise 0,005 atomare Masseneinheiten (Dalton), so kann die Tabelle in Massenwerten von einem Hundertstel Dalton gestuft sein. Berücksichtigt man in der Tabelle nur Kettenlängen bis zu zwei Aminosäuren und deren Modifikationen, so müssen die Massenwerte etwa 500 Dalton überstreichen, die Tabelle wird also 50 000 Einträge lang sein.
Die Gütezahl der längsten geschlossenen Kette bestimmt, ob das Fragmentionenspektrum noch einmal gemessen werden sollte. Liegt die Gütezahl unterhalb eines sehr kleinen unteren Schwellenwerts, so heißt das für gewöhnlich, dass das vorliegende Spektrum wahrscheinlich überhaupt kein Fragmentspektrum eines Biopolymerions ist. Dann lohnt sich eine Neumessung nicht. Etwas größere Gütezahlen unterhalb einer oberen Schwelle weisen darauf hin, dass eine Wiederholungsmessung mit anderen Fragmentierungsparametern Erfolg verspricht. Gütewerte oberhalb der oberen Schwelle zeigen an, dass die Qualität des Fragmentionenspektrums ausreichend ist.
Günstige Ausführungsformen
Die Erfindung berechnet in Echtzeit eine Gütezahl, mit der abgeschätzt wird, ob von einem Biopolymerion ein zweites Fragmentionenspektrum unter veränderten Fragmentierungsbedingungen aufgenommen werden soll. Die Gütezahl soll die Aussicht beziffern, über das Fragmentionenspektrum das Biopolymer zu identifizieren. Als Gütezahl wird dabei eine Zahl ermittelt, die im Wesentlichen der Länge der längsten geschlossenen Kette von Polymerbausteinen proportional ist. Dabei kann unter einer „geschlossenen Kette" auch eine Kette verstanden werden, in der die Ionensignale für einen oder zwei Polymerbausteine fehlen, wenn sich nur die Kette über diese Lücke hinweg weiter verfolgen lässt. Unter einer „dicht geschlossenen Kette" wird eine Kette verstanden, die keine solchen Lücken aufweist.
Im Nachfolgenden beschränkt sich die Beschreibung im Wesentlichen auf Mixturen von Verdaupeptiden. Es soll jedoch damit eine größere Allgemeinheit nicht ausgeschlossen werden. Es soll sich also nicht allein um Verdaupeptide oder Proteine handeln; somit ist für eine größere Allgemeinheit statt des Begriffs „Aminosäuren" stets der Begriff „Polymerbausteine" zu lesen. Aus der Druckschrift DE 689 14 372 T2 ist lediglich bekannt, dass die Länge der Kette von Nukleinsäurefragmenten bestimmt wird, indem die Anzahl entsprechend markierter Nukleotide massenspektrometrisch bestimmt wird.
Im Falle der Verdaupeptide kann die Gütezahl beispielsweise einfach die Anzahl der Aminosäuren sein, die als längste geschlossene Kette im Fragmentspektrum gefunden werden kann. Dabei können aber nicht nur Aminosäuren als solche in Betracht gezogen werden, sondern auch die gängigsten Modifikationen der Aminosäuren, wie sie üblicherweise im Proteom zu finden sind.
Für die Berechnung der Gütezahl muss zunächst aus den Signalen des Fragmentionenspektrums eine Tabelle der Massenwerte dieser Signale erstellt werden. Ist nur sehr wenig Zeit für diese Berechnung vorhanden, so wird diese Tabelle nur für Signale über einer Intensitätsschwelle erstellt. Für alle Signale über dieser Schwelle wird nur der schnell zu ermittelnde Massenwert des Signalmaximums berechnet. Isotopengruppen werden in bekannter Weise auf die Masse des monoisotopischen Signals reduziert. Dabei kann das Intensitätsverhältnis der ersten beiden Isotopensignale für eine Plausibilitätsprüfung herangezogen werden. Diese Prüfung untersucht in einfachster Weise, ob Masse und Ladungszustand übereinstimmen können. Das Intensitätsverhältnis der beiden ersten Ionensignale einer Isotopengruppe beträgt für Peptide einer Masse von 1200 Dalton etwa 2:1, für solche einer Masse von 2400 Dalton etwa 1:1, für solche einer Masse von 4800 Dalton etwa 1:2, wobei hier allerdings die beiden nächst schwereren Isotopensignale größer sind als die ersten beiden.
Für mehrfach geladene Ionen, die am Abstand der Massenwerte ihrer Isotopensignale zu erkennen sind, werden zweckmäßiger Weise nur die Massenwerte der daraus leicht zu berechnenden einfach geladenen Ionen in die Tabelle eingetragen. Für ein doppelt geladenes Ion beispielsweise wird der doppelte gemessene Massenwert minus der Masse eines Protons eingetragen. Aus dieser Tabelle der virtuellen Massenwerte einfach geladener, monoisotopischer Fragmentionen wird der Gütewert bestimmt.
Für die Berechnung des Gütewerts geht man beispielsweise vom kleinsten Massenwert der Tabelle aus. (Man kann ebenfalls vom Ionensignal mit der größten Masse oder sogar, mit einigen Besonderheiten, die jeder Fachmann kennt, von der Masse des fragmentierten Biopolymerions ausgehen). Man berechnet die Differenzen zu den nächsten Massenwerten und prüft, ob eine dieser Massendifferenzen einer Aminosäure oder einer Modifikation einer Aminosäure zugeordnet werden kann. Ist das der Fall, so erhöht man den Gütewert, berechnet von hier aus die Differenzen zu den nächsten Massenwerten und prüft wieder. Man fährt so lange fort, den Gütewert zu erhöhen, bis die Kette abbricht. Ist diese Kette im Sinne der Erfindung für die mögliche Identifizierung lang genug, so kann man abbrechen, da kein weiteres Fragmentionenspektrum zu messen ist. Man kann aber auch die Kette bis zum Ende verfolgen, um diesen Gütewert für spätere Zwecke mit dem Fragwertspektrum zusammen zu speichern.
Bricht die Kette zu früh ab, so kehrt man zu einem noch nicht in der Kette berücksichtigten Massenwert zurück und startet von dort eine erneute Berechnung des Gütewerts.
Die Massendifferenzen, die jeweils zu berechnen sind, werden dabei nur bis zu einer jeweils maximalen Massendifferenz berechnet. Soll die Kette dicht geschlossen sein, so brauchen nur die Massendifferenzen nur bis zur höchsten Masse einer Aminosäure oder ihrer Modifikation berechnet zu werden. Sollen Lücken über eine Aminosäure hinweg mit betrachtet werden, so sind entsprechend auch größere Massendifferenzen zu berechnen.
Für die Prüfungen, ob für eine Massendifferenz eine Aminosäure, eine Modifikation oder sogar eine kurze Kette aus zwei Aminosäuren oder Modifikationen in Frage kommt, kann aus Zeitgründen eine Prüftabelle verwendet werden. In dieser Prüftabelle ist für jeden Wert einer möglichen Massendifferenz eingetragen, ob es für diesen Wert eine Aminosäure oder eine kurze Kette von Aminosäuren oder ihrer Modifikationen gibt. Die Abstufung der Massenwerte, die für die Prüftabelle verwendet werden, richtet sich nach der Massengenauigkeit des betreffenden Tandem-Massenspektrometers. Beträgt die Massengenauigkeit beispielsweise 0,01 Dalton (es wird hier ein anderes Beispiel als oben für ein Massenspektrometer eines anderen Auflösungsvermögens wiedergegeben), so kann die Tabelle in Massenwerten von 0,02 Dalton gestuft sein. Berücksichtigt man in der Tabelle nur Kettenlängen bis zu zwei Aminosäuren und deren Modifikationen, so müssen die Massenwerte etwa 500 Dalton überstreichen, die Tabelle wird also 25 000 Einträge lang sein.
Es gibt 20 Aminosäuren, die für die Prüftabelle verwendet werden müssen. Werden auch Kombinationen aus jeweils zwei Aminosäuren berücksichtigt, so ergeben sich 400 positive Eintrage. Werden auch noch die etwa zehn häufigsten Modifikationen berücksichtigt, so ergeben sich etwa 1000 positive Einträge. Für eine rein zufällige Massendifferenz besteht damit eine Wahrscheinlichkeit von 1/25 (4 %), dass es sich um eine falsche Zuordnung handelt. Für eine Kette von zwei Aminosäuren nimmt diese Wahrscheinlichkeit schon drastisch ab; bei drei aufeinander folgenden Zuordnungen ist kaum noch mit einer Fehlzuordnung zu rechnen.
Als Modifikationen werden hier Oxidierung von Methionin, die Phosphorylierung von Cystin, Basisglycolisierungen, Methylierungen, Amidierungen entsprechender Aminosäuren und ähnliche verstanden. Auch bei anderen Biopolymerbausteinen können entsprechende Modifikationen oder Derivate auftreten.
Die Einträge in dieser eindimensionalen Tabelle sind entweder Nullen, wenn die Massendifferenz keiner bekannten Bausteinkette entspricht, oder eine kleine Zahl, die beispielsweise für die Anzahl der Aminosäuren steht und zusammengezählt die Gütezahl ergibt. Die Gütewerte entsprechen dann direkt der Kettenlänge. In der Tabelle ist dann eine „eins" für eine einzige Aminosäure eingetragen, jedoch die Zahl „zwei", wenn es sich um die Massendifferenz aus zwei Aminosäuren oder ihrer Modifikationen handelt.
Die Zahlenwerte der Einträge können aber auch das Vorhandensein von Lücken in anderer Weise berücksichtigen, wenn solche Lücken als leicht mangelhaft für das Fragmentspektrum angesehen werden sollen. Beispielsweise kann für Massendifferenzen, die einzelnen Aminosäuren und deren Modifizierungen entsprechen, eine „drei" eingetragen sein, während für zwei aneinanderhängende Aminosäuren oder deren Modifikationen nur eine „zwei", und für drei aneinanderhängende Aminosäuren nur eine „eins" eingetragen ist. Es wirkt sich dann das Vorhandensein von Lücken mindernd auf die Gütezahl aus. Eine dicht geschlossene Kette erhält somit eine bessere Gütezahl als eine geschlossene Kette mit Lücken.
Im Detail wird nach jeder Berechnung einer Massendifferenz sofort eine Prüfung in der Tabelle angeschlossen, damit nach einer positiven Zuordnung die nutzlose Berechnung weiterer Massendifferenzen entfällt.
Die Gütezahl einer geschlossenen Kette bestimmt, ob das Fragmentionenspektrum noch einmal gemessen werden sollte. Liegt die Gütezahl unterhalb eines unteren Schwellenwerts, so heißt das für gewöhnlich, dass das vorliegende Spektrum wahrscheinlich überhaupt kein Fragmentspektrum eines Biopolymerions ist. Wird beispielsweise keine einzige oder nur eine einzige Massendifferenz gefunden, die einer Aminosäure entspricht (und die ja im obigen Beispiel zu 2,5 Prozent fehlerhaft eine Aminosäure vorspiegeln kann), sind aber andererseits genügend viele Masseneinträge vorhanden, so liegt mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit kein Verdaupeptid vor. Etwas größere Gütezahlen, die aber immer noch unterhalb einer oberen Schwelle liegen, beispielsweise eine Gütezahl, die nur eine Kette von zwei Aminosäuren anzeigt, weisen darauf hin, dass eine Wiederholungsmessung mit anderen Fragmentierungsparametern Erfolg verspricht.
Gütezahlen, die keine Wiederholungsmessung erfordern, sollen vorzugsweise mindestens eine dicht geschlossene Kette von drei Aminosäuren oder ihrer Modifikationen, oder eine nur lückenhaft geschlossene Kette von mindestens vier Aminosäuren oder ihrer Modifikationen anzeigen.
Die heutigen Arten der Flüssigkeitschromatographie, einschließlich der Nano-LC, bieten Peakbreiten von etwa fünf bis zwanzig Sekunden an. Eine Analytsubstanz steht also mehrere Sekunden lang zur Messung an. Damit besteht für heutige Massenspektrometer, die meist mehrere Fragmentionenspektren pro Sekunde aufnehmen können, die Möglichkeit, zwar aussichtsreiche, aber nicht genügend gute Fragmentionenspektren noch einmal zu messen. Die Berechnung der Gütezahl kann vorgenommen werden, während gerade ein anderes Fragmentionenspektrum einer anderen Analytsubstanz gemessen wird. Auch die Kapillarelektrophorese bietet die Substanzen über mehrere Sekunden lang an.
Das Separationsverfahren braucht aber nicht unbedingt direkt mit der Massenspektrometrie gekoppelt zu sein, um Nutzen aus der vorliegenden Erfindung ziehen zu können. Ein immer häufiger angewendetes Messverfahren ist die nicht-direkte Kopplung der Flüssigkeitschromatographie mit einem Massenspektrometer, das feste Proben auf einem Probenträger mit matrix-unterstützter Laserdesorption ionisiert („LC-MALDI"). Der Eluent aus dem Flüssigkeitschromatographen wird dabei in vielen einzelnen Tröpfchen auf vorpräparierte Probenträger aufgegeben, die Hunderte oder sogar Tausende von Proben aufnehmen können. Die Probentröpfchen werden getrocknet und dann der Massenspektrometrie zugeführt.
Auch hier kann die Güte eines Fragmentionenspektrums erst abgeschätzt werden, wenn dieses einem Suchverfahren in einer Proteinsequenzdatenbank unterworfen wurde. Das erfordert aber in der Regel so lange Rechenzeiten, dass eine Echtzeit-Suche während der Messungen im Massenspektrometer nicht in Frage kommt. Auch hier kann die Gütezahl helfen, die Eignung des Fragmentionenspektrums abzuschätzen und gegebenenfalls sofort eine Neumessung einzuleiten.
Neu gemessene Fragmentionenspektren können dann mit den früher gemessenen Fragmentionenspektren der gleichen Analytsubstanz addiert werden, um Spektren eines besseren Signal-zu-Rausch-Verhältnisses zu liefern. Dabei spielt es keine Rolle, ob das Separationsverfahren direkt gekoppelt war oder nicht.
Werden für ein Peptidion mehrere Fragmentierungsarten angewandt, die verschiedenartige Kettenbrüche erzeugen, so bestehen, wie jedem Fachmann bekannt ist, feste Massenabstände zwischen korrespondierenden Ionensignalen in den verschiedenen Fragmentionenspektren. Aus dem Vorhandensein dieser festen Massenabstände können leicht weitere Beiträge für die Gütezahl gewonnen werden.
Überhaupt wird der Fachmann auf diesem Gebiet mit Kenntnis dieser Erfindung weitere Modifizierungen der Verfahren vornehmen können.

Claims

Verfahren zur Aufnahme von Fragmentionenspektren von Biopolymerionen in einem Tandem-Massenspektrometer, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Aufnahme eines Fragmentionenspektrums eines Biopolymerions eine Gütezahl berechnet wird, die im Wesentlichen proportional zur Länge der längsten geschlossenen Kette von Polymerbausteinen ist, die den Signalen des Fragmentionenspektrums zu entnehmen ist, und dass diese Gütezahl zur Entscheidung verwendet wird, ob von diesem Biopolymerion ein weiteres Fragmentionenspektrum mit anderen Fragmentierungsparametern aufzunehmen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Tandem-Massenspektrometer Proben mit Biopolymerionen misst, wobei die Biopolymere vorher durch ein Separationsverfahren wie Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese getrennt wurden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Tandem-Massenspektrometer mit dem Separationsverfahren direkt gekoppelt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Biopolymerionen um Verdaupeptidionen handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Länge der längsten geschlossenen Kette aus dem Fragmentionenspektrum und daraus die Berechnung der Gütezahl darauf beruht, dass zunächst die Massenwerte der Fragmentionen im Fragmentspektrum berechnet werden, und dass dann die Differenzen der Massenwerte auf Übereinstimmung mit den Massen von Polymerbausteinen untersucht werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzen der Massenwerte nicht nur auf Übereinstimmung mit den Massen von Polymerbausteinen sondern auch auf Übereinstimmung mit den Massen von Polymerbausteinen mit bekannten Modifikationen untersucht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzen der Massenwerte auch auf Übereinstimmung mit den Massen zweier oder sogar dreier zusammenhängender Polymerbausteine ohne oder mit Modifikationen untersucht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzen der Massenwerte an Hand einer Prüftabelle auf Übereinstimmung untersucht werden, wobei in der Prüftabelle für alle möglichen Differenzen von Massenwerten jeweils ein Eintrag enthalten ist, der anzeigt, ob die jeweilige Differenz entweder mit keiner Masse einer Polymerbausteinkombination, mit einer Masse eines einzelnen Polymerbausteins oder mit einer Masse einer kurzen Kette aus Polymerbausteinen mit oder ohne jeweils mögliche Modifikationen übereinstimmt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Massenwerte der Prüftabelle so fein gestuft sind, wie es die Messgenauigkeit des Massenspektrometers vorgibt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Summe der Einträge in der Prüftabelle für die längste geschlossene Kette die Gütezahl ergibt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Berechnung der Gütezahl vor dem Erreichen der längsten geschlossenen Kette abgebrochen wird, wenn eine geschlossene Kette lang genug ist, um das Biopolymerion aus dem aufgenommenen Fragmentionenspektrum zu identifizieren.