DE19709086A1 - Verfahren der Raumladungsregelung von Tochterionen in Ionenfallen - Google Patents
Verfahren der Raumladungsregelung von Tochterionen in IonenfallenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Regelung der Raumladung für die Aufnahme von Tochterionenspek
tren in Ionenfallenmassenspektrometern, aber auch für Isolierungs- oder Enkelionenspektren,
wenn diese in eine Serie von Normalspektren eingebettet sind.
Die Erfindung besteht darin, die Regelung der Raumladung in der Ionenfalle für die ersten
Tochterionenspektren aus den Füllraten vorhergehender Normalspektren, aus dem Häufig
keitsverhältnis der zu isolierenden Elternionen zum Gesamtspektrum, und aus den zuminde
stens grob bekannten Isolierungs- und Fragmentierungsausbeuten herzuieiten. Für weitere
Tochterionenspektren kann zusätzlich auf die Füllrate der Tochterionenspektren zurückgegrif
fen werden. Analoges gilt für Spektren isolierter Ionen oder von Ionen durch MSn-Prozesse.
Ionenfallen nach Paul bestehen aus einer hochfrequenzversorgten Ringelektrode und zwei
Endkappenelektroden; im Inneren können Ionen gespeichert werden. Die Ionenfallen können
als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv
ausbeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen werden. Es sind mehrere
verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher ein
gegangen werden soll.
In Hochleistungs-Ionenfallenmassenspektrometern dürfen sich nur relativ wenige Ionen befin
den, wenn gut aufgelöste Spektren mit richtiger Massenzuordnung erhalten werden sollen.
Befinden sich zu viele Ionen in der Ionenfalle, so stört die Raumladung der Ionen den Ionen
auswurf und damit die Spektrenaufnahme. So wurde für ein weitverbreitetes, kommerzielles
Massenspektrometer dieser Art von nur 300 Nutzionen berichtet, die für die Messung eines
Einzelspektrums zur Verfügung stehen. In Ionenfallen der antragstellenden Firma stehen für ein
Einzelspektrum etwa 2000 Ionen zur Verfügung. Selbst damit ist aber der dynamische Bereich
innerhalb eines Spektrums außerordentlich beschränkt.
Ionenfallenmassenspektrometer haben andererseits Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele
Arten von Analysen interessant macht. So können insbesondere ausgewählte Ionensorten
(sogenannte "Elternionen") in der Ionenfalle isoliert und fragmentiert werden. Die Spektren
dieser Fragmentionen werden "Tochterionenspektren" der betreffenden Elternionen genannt
Es können auch "Enkelionenspektren" als Fragmentionenspektren ausgewählter Tochterionen
gemessen werden.
Die Raumladungsgrenze kann aus der Drift oder der Breitenzunahme der Ionensignale be
stimmt werden. Eine übliche Definition bezieht sich auf eine Drift von 0,1 atomaren Massen
einheiten, das heißt, als Raumladungsgrenze wird diejenige Ionenmenge in der Ionenfalle defi
niert, die eine Zeitverzögerung des Auswerfens der Ionen um eine solche Zeitdifferenz bewirkt,
die umgerechnet einer Massendrift von 0,1 atomaren Masseneinheiten gegenüber Normalbe
dingungen entspricht.
Der Einsatz der Raumladungswirkung ist relativ scharf. Eine Zunahme der Füllmenge an der
Raumladungsgrenze von nur 10% bewirkt bereits eine weitere Drift um etwa 0,1 atomare
Masseneinheiten, bleibt man dagegen um etwa 20% unter der Raumladungsgrenze, so ist die
Massendrift nicht mehr meßbar.
Die optimale Füllmenge muß sich stets um einen Sicherheitsabstand unterhalb der Füllmenge
an der Raumladungsgrenze befinden. Es hängt von der Güte der Raumladungsregelung ab, wie
groß dieser Sicherheitsabstand gewählt werden muß. Eine sehr gute Regelung erlaubt es, bei
einer optimalen Füllung zu arbeiten, die sich lediglich 20% unterhalb der Raumladungsgrenze
befindet; eine weniger gute Regelung kann dazu zwingen, bei der halben oder sogar bei einem
Drittel der Raumladungsgrenze zu arbeiten. Die Güte der Regelung ist also von starkem Ein
fluß auf die Meßdynamik im Spektrum.
Insbesondere bei der Kopplung der Ionenfallenmassenspektrometer mit chromatographischen
oder elektrophoretischen Trennverfahren ändern sich die angebotenen Substanzkonzentratio
nen sehr stark. Die Anpassung der Ionenfalle an solch wechselnde Konzentrationen der zuge
führten Substanzen, oder beispielsweise auch an wechselnde Ionisierungs-, Reaktions- oder
Zerfallsbedingungen, kann bei der Ionenfalle aus oben genannten Gründen nicht über die Dy
namik im Massenspektrum, die sich für ein Aufnahmenverfahren unter Normalbedingungen
ergibt, vorgenommen werden, wie es bei magnetischen Sektorfeld- oder Quadrupolfilter-Mas
senspektrometern möglich ist. Diese haben eine Meßdynamik von sechs bis neun Zehner
potenzen für die Messung der Ionenströme eines Spektrums.
In der Ionenfalle muß daher die Meßdynamik über die Bedingungen bei der Regelung zur op
timalen Füllung der Ionenfalle hergestellt werden. Ist beispielsweise die Konzentration einer
Substanz in der Probe groß, so ist bei konstanter Ionisierungsstärke die Füllzeit für die Ionen
falle bis zum Erreichen der optimalen Befüllung nur kurz. Ist die Konzentration dagegen sehr
klein, so braucht es eine lange Zeit, um die Ionenfalle optimal zu füllen. Für die Füllung mit
Reaktionsprodukten oder Tochterionen kann eine dazu analoge Steuerung vorgenommen wer
den.
Die Füllzeiten können in der Praxis zwischen 10 Mikrosekunden und 100 Millisekunden vari
iert werden (in Fällen langsam veränderlicher Konzentrationen auch bis zu einer Sekunde), also
über vier bis fünf Zehnerpotenzen hinweg. Wird dieses Verfahren auf die quantitative Analyse
angewandt, so berechnet sich die Konzentration dann aus einem Wert, der sich - bei konstan
ter Erzeugung der Ionen - als Signalhöhe im Spektrum geteilt durch die Füllzeit berechnet
Dieser Wert ist dem Ionenstrom dieser Ionensorte, der während der Ionisierung generiert wird,
proportional. Somit wird bei der Anwendung dieses berechneten Wertes für den Ionenstrom
die Bestimmung der Konzentration vergleichbar mit der durch andere Arten von Massenspek
trometern. Die Meßdynamik der Ionenfallenmassenspektrometer erhöht sich damit von drei auf
sieben bis acht Zehnerpotenzen; allerdings nur, wenn sich keine störenden Ionen im Überschuß
in der Ionenfalle befinden.
Die Regelung zur Füllung der Ionenfalle muß auf einer Messung der Ionenanzahl in der Ionen
falle beruhen, aus dem sich dann ein Steuerwert für die Füllung berechnen läßt. Da sich die
Ionen in der Ionenfalle bisher nicht genügend einfach zerstörungsfrei messen lassen, haben sich
zwei verschiedenartige Verfahren herausgebildet:
- (1) Das Verfahren des "Prescan", bei dem ein kurzer Füllprozeß mit konstanter Füllzeit der eigentlichen Spektrennahme vorgeschaltet wird. Die dabei gebildeten Ionen werden aus der Falle ausgetrieben und gemessen. Aus diesem Meßwert wird die optimale Füllzeit bestimmt (US 5 107 109). - Eine Verbesserung besteht darin, die Füllzeit des Prescan nicht konstant zu halten, sondern die Füllzeit des Prescan aus vorangegangenen Messun gen auf optimale Meßbedingungen hin zu steuern (US 5448 061). - Diese beiden Ver fahren brauchen zusätzliche Meßzeit für den Prescan, die der eigentlichen Spektrennahme verlorengeht.
- (2) Ein anderes Verfahren verwendet eine Füllsteuerung, die auf die bekannte Füllrate eines oder sogar mehrerer vorhergehender Spektren zurückgreift (DE 43 26 549). Aus diesen Füllraten vorhergehender Spektren wird auf einen Erwartungswert für die aktuelle Füllrate extrapoliert. Die Extrapolation kann je nach den Bedingungen linear, quadratisch, kubisch, exponentiell oder nach einer anderen bekannten Funktion erfolgen. Aus dem prognosti zierten Erwartungswert wird die aktuelle Füllzeit für die optimale Füllmenge berechnet Die Füllrate ist dabei als Füllmenge geteilt durch die bekannte Füllzeit definiert, die Füll menge wird als integrierter Ionenstrom über ein Spektrum bestimmt. Da dabei auf die vorhergehend gemessenen Nutzspektren zurückgegriffen wird, wird keine zusätzliche Zeit für einen Prescan verbraucht. Besonders bei starken Änderungen in der Konzentration der zugeführten Substanzen, wie sie besonders in der Kopplung mit chromatographischen Trennverfahren vorliegen, ist diese Art der Raumladungsregelung der Prescan-Methode weit überlegen.
Ionenfallenmassenspektrometer werden häufig als massenspezifische Detektoren für die Chro
matographie oder Kapillarelektrophorese verwendet. Eine gängige Art der Ionisierung ist dabei
die Elektrospray-Methode (ESI = electro spray ionization), die Ionen bei Atmosphärendruck
ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlaßsysteme bekannter Art in das Vakuum des Mas
senspektrometers und von dort in die Ionenfallen eingebracht. In ähnlicher Art kann auch eine
chemische Ionisierung durch Reaktantgasionen an Atmosphärendruck benutzt werden
(APCI = atmospheric pressure chemical ionization).
Diese Ionisierungarten erzeugen praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind im wesentli
chen die des Moleküls. Wohl aber treten dabei ganze Serien vielfach geladener Ionen der Mo
leküle auf. Durch das Fehlen der Fragmentionen beschränkt sich aber die Information aus dem
Massenspektrum auf das Molekulargewicht; Informationen über interne Molekularstrukturen,
die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt werden können, fehlen. Die
Spektren sind also gar nicht mit denen aus Elektronenstoßionenquellen vergleichbar.
Um die Spektren mit denen einer GC/MS-Methode mit Elektronenstoßionisierung vergleichbar
aussagekräftig zu machen, ist es notwendig, in geeigneter Weise Fragmentionenspektren zu
erzeugen. Das kann durch automatisch aufgenommene Tochterionenspektren geschehen.
Die automatische Aufnahme von Tochterionenspektren ist allerdings nicht trivial, da die Eltern
ionen, aus denen die Tochterionen erzeugt werden müssen, nicht von vorneherein bekannt
sind. Zu diesem Zwecke müssen daher die sequentiell aufgenommenen Massenspektren aus der
Kopplung der Ionenfalle mit dem Chromatographen oder Elektrophoresegerät laufend von
einem Rechenprogramm überprüft werden. Erscheint eine Substanz im Chromato- oder Elek
tropherogramm, so muß automatisch eine geeignete Ionensorte ausgewählt und eine Tochter
ionenspektrenaufnahme vorbereitet werden. Für diese Tochterionenaufnahme wird nun eine
Regelung der Raumladung gesucht.
Für die Auswahl der Elternionen kann man beispielsweise den größten Massenpeak des Spek
trums auswählen. Wenn die untersuchten Substanzen nicht zu große Molekulargewichte haben,
hat es sich jedoch als besser herausgestellt, die doppelt geladenen Ionen zu verwenden, die sehr
gute Strukturinformationen liefern. Die doppelt geladenen Ionen lassen sich an dem Abstand
der Peaks in der Isotopengruppe erkennen, der gerade ½ Masseneinheit beträgt.
Für die Regelung der Raumladung bei der Aufnahme des Tochterionenspektrums ist bisher nur
die Prescan-Methode bekannt geworden. Dazu ist es allerdings erforderlich, nach der Probefül
lung der Ionenfalle in vorgegebener Zeit auch die Ionenisolierung und Fragmentierung durch
zuführen, um dann durch schnellen Auswurf die Anzahl der gebildeten Tochterionen messen zu
können. Diese Prozedur kostet aber fast ebenso viel Zeit wie die nachfolgende Aufnahme des
Tochterionenspektrums. Die Methode ist daher sehr unbefriedigend.
Besonders bei der Kopplung mit chromatographischen oder elektrophoretischen Trennverfah
ren stehen die Substanzen, von denen automatisch Tochter- oder Enkelionenspektren (oder
solche von isolierten Ionen) gemessen werden sollen, nur für wenige Sekunden zur Verfügung
und die angebotene Konzentration ändert sich sehr schnell. Damit wird die Regelung der
Raumladung, die für gute Spektren wichtig ist, zu einem schwerwiegenden Problem.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, für ein raumladungsgeregeltes Ionenfallenmassenspektrome
ter Verfahren für die Regelung der Ionenmenge für Tochterionenspektren (aber auch für Spek
tren isolierter Ionen oder für Enkelionenspektren) zu finden, die in eine Serie von Normalspek
tren eingebettet aufgenommen werden. Insbesondere ist ein Verfahren gesucht, das eingesetzt
werden kann, wenn vorher noch gar kein Tochterionenspektrum dieser Elternionensorte auf
genommen wurde. Das Verfahren soll auch unter erschwerenden Bedingungen schnell verän
derlicher Konzentration gut und substanzsparsam arbeiten.
Die Massenspektren nicht isolierter und fragmentierter Ionen sollen im weiteren Verlauf mit
"Normalspektren" bezeichnet werden, im Gegensatz zu "Isolierionenspektren", die nur aus
isolierten, aber nicht fragmentierten Ionen bestehen, und den oben definierten "Tochterionen
spektren" oder "Enkelionenspektren".
Es ist nun die Grundidee der Erfindung, für die Regelung der Raumladung des ersten Tochter
ionenspektrums auf die Füllraten der letztaufgenommenen Normalspektren zurückzugreifen,
und daraus (wie beispielweise in DE 43 26 549) einen Erwartungswert für die Füllrate f0 des
nächsten Normalspektrums zu berechnen, und für den Erwartungswert der Füllrate ft der
Tochterionen zusätzlich das Verhältnis ie/itot der aus dem letzten Spektrum bekannten Häufig
keit ie der Elternionen zum integralen Ionenstrom des Gesamtspektrums itot, die Ausbeute ae der
Isolierung dieser Elterionen und die Ausbeute af der Fragmentierung zu Tochterionen zu be
rücksichtigen: ft = f0×ie×ae×af/itot. Die Ausbeuten der einzelnen Prozesse sind im allgemeinen
genügend gut vorbekannt. Sie können aber auch durch Benutzung ähnlicher Analytsubstanzen
einkalibriert werden.
Aus dieser prognostizierten Füllrate ft wird dann eine optimale Füllzeit für eine vorgegebene,
optimale Füllmenge berechnet, die dann zur Steuerung der Füllung des ersten Tochterionen
spektrums benutzt wird.
Dabei kann zwischenzeitlich während der meist sequentiell ablaufenden Prozesse der Ionener
zeugung, Einspeicherung, Isolierung und Fragmentierung durchaus eine Überfüllung der Ionen
falle eintreten. Da aber die Isolierung auch arbeitet, wenn eine mehr als hundertfache Überfül
lung der Ionenfalle herrscht, wird die Überfüllung wieder abgebaut. Auch für die Fragmentie
rung ist eine leichte Überfüllung unschädlich, es kommt vielmehr darauf an, für die übrigblei
benden Tochterionen die optimale Füllmenge zu erreichen.
Der Erwartungswert f0 für die Normalspektren kann bei langsamer Änderung der Konzentra
tionen gleich dem des letzten Massenspektrums gewählt werden. Besser jedoch ist die Extrapo
lation dieses Wertes aus mehreren letzten Spektrenaufnahmen, wie in DE 43 26 549 beschrie
ben. Dabei kann beispielsweise eine lineare Extrapolation f0,lin aus zwei, eine quadratische Ex
trapolation f0,qu aus drei oder eine kubische Extrapolation f0,kub aus vier Spektren gewählt wer
den. Da im Fuß eines chromatographischen Peaks eine in etwa exponentielle Änderung
herrscht, kann hier auch ein Wachtumsfaktor aus den letzten zwei Spektren gebildet werden,
der dann eine Extrapolation auf den Erwartungswert gestattet.
Aus der Integration über den Ionenstrom des Tochterionenspektrums kann dann die tatsächli
che Füllrate freal bestimmt werden. Damit kann auch für zukünftige Tochterionenspektren (bei
spielsweise des gleichen Chromatogramms) der Faktor ae×af der Ausbeuten korrigiert werden.
Für das zweite Tochterionenspektrum kann dann bei langsamerer Änderung ein Erwartungs
wert für die Füllrate ft angenommen werden, die der gemessenen Füllrate freal des ersten Spek
trums gleich ist.
Besser ist jedoch ein anderes Verfahren: Es wird nach dem ersten Tochterionenspektren zu
nächst ein weiteres Normalspektrum eingeschoben. Aus den Normalspektren vor und nach
dem ersten Tochterionenspektrum wird dann wie oben ein Erwartungswert für die Füllrate des
zweiten Tochterionenspektrums berechnet, eventuell unter Berücksichtigung der Korrektur der
Ausbeuten.
Die Füllung des dritten Tochterionenspektrums kann dann, eventuell unter Einschieben eines
weiteren Normalspektrums, aus den Füllraten der beiden bereits aufgenommenen Tochterio
nenspektren geregelt werden. Normalerweise würde aus zwei Spektren lediglich eine lineare
Extrapolation erfolgen, hier kann aber auch ein weitergehender Trend (zweiter und dritter
Differentialkoeffizient) durch die bekannten Füllraten der begleitenden Normalspektren be
rücksichtigt werden.
Das Einschieben der Normalspektren hat dabei einen weiteren Vorteil: nach dem Ende der
Tochterionenaufnahmen kann sofort mit den Normalspektren unter optimaler Regelung der
Füllung fortgefahren werden, da deren Trend bekannt ist. Außerdem ist durch die eingescho
benen Normalspektren der Verlauf des chromatographischen Peaks sehr gut bekannt. Dadurch
können für quantitative Abschätzungen die Peakformen sehr gut integriert werden.
Natürlich brauchen die Normalspektren nicht gleichmäßig eingeschoben zu werden. Manchmal
ist es zweckmäßig, mehr Tochterionenspektren als Normalspektren aufzunehmen. Das ist bei
spielsweise dann der Fall, wenn für das Tochterionenspektrum durch eine Summierung der
Einzelspektren eine möglichst große Meßdynamik erreicht werden soll. Die Aufklärung einer
Struktur eines Moleküls kann auch durch sehr selten auftretende Fragmentionen gut gestützt
werden, und diese seltenen Fragmentionen kann man nur durch eine hohe Meßdynamik sehen.
Bei der Addition zur Erhöhung der Meßdynamik müssen die Rohspektren vor irgendeiner
weiteren Auswertung addiert werden, weil nur dadurch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis und
damit die Meßdynamik entsprechend steigt. Meist werden etwa 3 bis 20 Einzelspektren zu
einem "Summenspektrum" durch Addition aller korrespondierenden Einzelmeßwerte längs der
Spektrenaufnahme zusammengefaßt.
Die Isolierung der Elternionen kann in bekannter Weise bereits während der Ionisierung durch
Resonanzauswurf unerwünschter Ionen durch die Anwendung von anregenden Frequenzgemi
schen mit Lücken vorgenommen werden. Es können aber auch, wie ebenfalls bekannt, Isolie
rungsverfahren nach einer gesteuerten Überfüllung der Ionenfalle angewandt werden, da die
Isolierungsverfahren auch mit mehr als hundertfacher Überfüllung der Ionenfalle noch arbeiten
können. Es bleibt somit auch bei nachträglicher Isolierung die erwünschte Meßdynamik im
Spektrum erhalten.
Das hier beschriebene Verfahren der Füllsteuerung für die Tochterionenspektren ist besonders
vorteilhaft, weil meßzeitsparend. Es wird für die Regelung kein zeitraubender Prescan ausge
führt, der für die Tochterionenspektren ja notwendigerweise den Vorgang der Isolierung und
Fragmentierung mit umfassen muß. Dieser Prescan dauert daher länger als die Aufnahme eines
Normalspektrums, liefert aber außer dem Wert für die Regelung keine weiteren Informationen.
Die Grundidee kann in analoger Weise angewandt werden, wenn Enkelionenspektren aufge
nommen werden sollen. Auch bei der Aufnahme von Spektren isolierter, aber nicht fragmen
tierter Ionen kann entsprechend vorgegangen werden.
Fig. 1 zeigt das einfache und schnelle Berechnungsschema für die lineare, quadratische und
kubische Extrapolation der Füllraten aus den gemessenen Füllraten f1 bis f4 der vorausgehenden
Spektren, wenn diese - wie gewöhnlich - gleiche Aufnahmenzeitabstände haben.
Für Tochterionen gibt es den mit Hilfe der Ausbeuten berechneten Erwartungswert an.
Die Bezeichnungen bedeuten:
f0,lin = Erwartungswert der Füllrate bei linearer Extrapolation
f0,qu = Erwartungswert der Füllrate bei quadratischer Extrapolation
f0,kub = Erwartungswert der Füllrate bei kubischer Extrapolation
ft = Erwartungswert der Füllrate für Tochterionen
f0 = einer der Erwartungswerte f0,lin, f0,qu oder f0,kub
ie = integrierter Ionenstrom des Elternionenpeaks
ae = Isolierungsausbeute der Elternionen
af = Fragmentierungsausbeute an Tochterionen
itot = integrierter Ionenstrom des gesamten Spektrums
f0,qu = Erwartungswert der Füllrate bei quadratischer Extrapolation
f0,kub = Erwartungswert der Füllrate bei kubischer Extrapolation
ft = Erwartungswert der Füllrate für Tochterionen
f0 = einer der Erwartungswerte f0,lin, f0,qu oder f0,kub
ie = integrierter Ionenstrom des Elternionenpeaks
ae = Isolierungsausbeute der Elternionen
af = Fragmentierungsausbeute an Tochterionen
itot = integrierter Ionenstrom des gesamten Spektrums
Eine Ausführungsform des Verfahrens nach dieser Erfindung betrifft die automatische Auf
nahme von Tochterionenspektren der Substanzen in chromatographischen Trennungen unbe
kannter Gemische.
Es werde für eine detaillierte Beschreibung beispielhaft angenommen, daß es sich bei dem Ge
misch um einen enzymatischen Verdau eines unbekannten Proteins in kleinere Peptide handelt,
das durch Flüssigkeitschromatographie aufgetrennt und massenspektrometrisch in Ionenfallen
gemessen wird. Die Massen einiger Peptide und die Kenntnis einiger Bruchstücke der Ami
nosäuresequenzen reichen im allgemeinen aus, das Protein über Proteindatenbanken sicher und
eindeutig zu identifizieren. In den Proteindatenbanken sind die Sequenzen der Proteine gespei
chert. Bei dieser Aufgabe der Proteinidentifizierung liegt meist nur eine sehr geringe Menge
des Proteins vor; es ist also wesentlich, die Normal- und Tochterionenspektren in einem einzi
gen Analyenlauf aufzunehmen.
Für diese Aufgabe wird die Flüssigkeitschromatographie mit Ionisierung durch Elektrospray
eingesetzt. Dabei werden mit dem Ionenfallenmassenspektrometer zunächst nur normale Mas
senspektren aufgenommen. Die Ionisierung durch Elektrospray führt bei den kleineren Pepti
den, wie sie durch den Verdau entstehen, zu Ionen, die etwa zwei- bis fünffach geladen sind.
Die sequentiell während der Separation aufgenommenen Normalspektren werden nun auf das
Erscheinen einer ersten Substanz untersucht. Erscheint nun eine Substanz, so wird automatisch
ein günstiges Elternion für die Aufnahme eines Tochterspektrums ausgewählt. Im einfachsten
Fall wird dafür das häufigste Ion im Spektrum ausgewählt. Für Peptide ist es aber günstiger,
das doppelt geladene Molekülion zu suchen, das am Massenabstand der Ionen in der Isotopen
gruppe erkannt werden kann. Das doppelt geladene Ion gehört in der Regel zu den häufigsten
Ionen.
Es kann das doppelt geladene Ion aber auch anders gefunden werden. Es ist möglich, das
Normalspektrum in Echtzeit auf das Molekulargewicht der Ionen der Substanz zu untersuchen,
wobei die Serie der mehrfach protonierten Ionen und ihrer Massen für einen entsprechenden
Algorithmus genutzt wird. Aus dem Molekulargewicht läßt sich sofort das doppelt protonierte
Ion finden.
Es geht nun um die Regelung der Füllung der Ionenfalle für das erste, automatisch aufzuneh
mende Tochterionenspektrum. Dazu wird die letztaufgenommenen Normalspektren zurückge
griffen. Aus ihren bekannten Füllraten (die Füllrate ist die durch Integration über den Ionen
strom des Spektrums gemessene Gesamtionenmenge geteilt durch die bekannte Füllzeit) kann
ein Erwartungswert für die Füllrate f0 eines weiteren Normalspektrums extrapoliert werden.
Die Regelung greift in diesem Fall am besten auf eine kubische Extrapolation zurück, da sich
das Signal im chromatographischen Peak sehr rasch ändert. Das Schema einer kubischen Ex
trapolation ist in Fig. 1 dargestellt. Aus den vier Füllraten f1 (jüngstes Normalspektrum) bis f4
werden die Differenzen a1 bis a3 gebildet, daraus die Differenzen b1 und b2, daraus die Diffe
renz c1. Die kubische Extrapolation für den Erwartungswert f0,kub ergibt sich sehr einfach zu
f0 = f0,kub = f1 + a1 + b1 + c1. Diese sehr einfache Berechnung setzt voraus, daß die zeitlichen
Abstände der Spektrennahmen gleich sind. Für ungleiche Spektrenabstande ist die Extrapolati
on etwas umständlicher, jedoch dem Fachmann an sich bekannt. - Die lineare Extrapolation
ergibt sich übrigens zu f0,lin = f1 + a1; die quadratische Extrapolation zu f0,qu = f1 + a1 + b1.
Es soll nun jedoch kein Normalspektrum, sondern ein Tochterionenspektrum der ausgewählten
Elternionen, also der doppelt geladenen Molekülionen, gemessen werden. Diese Elternionen
bilden nur einen Teil der Ionen des Normalspektrums, daher ist zunächst der Anteil ie/itot dieser
Elternionen am Gesamtspektrum zu berücksichtigen, der aus dem letzten Normalspektrum
bekannt ist. Diese Elternionen sind dann zu isolieren und zu fragmentieren. Dabei gehen Ionen
verloren. Über die bekannte Ausbeute ae bei der Isolierung und die ebenfalls bekannte Frag
mentierungsausbeute af an Tochterionen kann aber ein Erwartungswert für die Füllrate ft mit
Tochterionen berechnet werden, der im allgemeinen recht gut stimmt und für die Steuerung der
Füllung verwendet werden kann. Die Ausbeuten für Isolierung und Fragmentierung der Pepti
de sind von Peptid zu Peptid recht gut konstant und können daher durch Kalibrierung einiger
maßen gut bestimmt werden.
Die Isolierung kann während der Einspeicherung der Ionen, die von außen in die Ionenfalle
eingeschossen werden, in an sich bekannter Weise durch ein Frequenzgemisch erfolgen, das an
die beiden Endkappen angelegt wird. Das Frequenzgemisch enthält die Frequenzen aller Ionen,
die nicht in der Ionenfalle verbleiben sollen. Diese werden durch die Frequenzen in ihren Fun
damentalschwingungen in Richtung der Fallenachse angeregt, vergrößern dabei ihre Schwin
gungsamplituden, und verlassen die Ionenfalle, indem sie an die Endkappen anstoßen und sich
entladen, oder indem sie durch Perforationen austreten. Für diejenigen Ionen, die in der Ionen
falle verbleiben sollen, sind keine Anregungsfrequenzen im Frequenzgemisch enthalten.
Es ist aber nicht notwendig, die Isolierung während der Ionenerzeugung und -einspeicherung
vorzunehmen. Es kann die Ionenfalle während der Ionenerzeugung bis weit über die optimale
Füllmenge hinaus mit Ionen gefüllt und erst dann die Isolierung angewandt werden. Für diese
nachträgliche Art der Isolierung sind mehrere Methoden bekannt. Da diese Methoden der Iso
lierung auch dann gut arbeiten, wenn eine mehr als hundertfache Überladung vorliegt, kann in
diesem Fall die zeitweilige Überladung der erfindungsgemäßen Regelung der Füllzeit willent
lich so gesteuert werden, daß erst nach der Isolierung der erwünschten Ionensorte die optimale
Füllmenge der Ionenfalle vorliegt. Die "Füllrate" schließt also in diesem Fall den Prozeß der
anfänglichen Überladung und der anschließenden Isolierung mit ein. Da sich die Regelung der
Füllmenge nach der Erfindung auf die integralen Ionenmengen der vorausgehenden Spektren
gleicher Erzeugungsart beziehen, muß nicht einmal bekannt sein, wie hoch die Überladung im
speziellen Fall eigentlich ist.
Nach der Aufnahme des Tochterionenspektrums wird die reale Füllrate bestimmt. Stimmt sie
nicht mit der berechneten Füllrate überein, so wird daraus eine Korrektur der Ausbeutefakto
ren berechnet, die bei nachfolgenden Tochterionenspektren angewandt werden kann.
Auf das erste Tochterionenspektrum hin wird nun wieder ein Normalspektrum aufgenommen,
bevor ein zweites Tochterionenspektrum gemessen wird. Aus diesem Normalspektrum und
seinen Vorgängern wird nun, wie bekannt, ein weiterer Erwartungswert für die Füllrate eines
Normalspektrums hergeleitet, aus dem dann durch Korrektur mit den Ausbeutefaktoren der
Erwartungswert für die Füllrate des zweiten Tochterionenspektrums erhalten wird. In dieser
Weise können Tochterionenspektren mit optimaler Füllmenge erhalten werden, obwohl vorher
keine Tochterionen dieses Elterions gemessen wurden.
Es kann der Erwartungswert für die Füllrate des zweiten (oder eines weiteren) Tochterionen
spektrums aber auch anders berechnet werden. Es wird dabei von der gemessenen Füllrate freal
des letzten Tochterionenspektrums ausgegangen. Aus den begleitenden Normalspektren wird
nun ein Trendfaktor der Zu- oder Abnahme des chromatographischen Peaks berechnet, der
beispielsweise als Quotient des Erwartungswertes für eine Füllrate geteilt durch die letzte ak
tuelle Füllrate gewonnen wird. Dieser Trendfaktor wird dann auf die Füllrate freal des letzten
Tochterionenspektrums angewendet.
Es kann aus diesem Grunde, aber auch sonst zweckmäßig sein, im Verlauf der Messungen
auch weiterhin eingeschobene Normalspektren aufzunehmen. Dabei wird der Regelungszug
für die Normalspektren nicht unterbrochen. Auch bei komplexeren Trennverfahren mit unvoll
ständiger Separation der chromatographischen Peaks kann so der Verlauf recht gut verfolgt
werden. Es gehen insbesondere keine Substanzpeaks verloren, da die Ankunft einer Substanz
auch dann beobachtet werden kann, wenn schon für eine andere Substanz Tochterionenspek
tren aufgenommen werden.
Für höchste Dynamik in gut separierten Chromatogrammen mag es allerdings besser sein, zwi
schen weiteren Tochterionenaufnahmen keine Normmalspektren einzuschieben, sondern alle
Meßzeit für die Aufnahme der Tochterionen zu verwenden. Je mehr Tochterionenspektren zu
einem Summenspektrum addiert werden, desto höher ist die Meßdynamik im summierten
Tochterionenspektrum.
Aus den Normalspektren kann man nun die Molekulargewichte der Peptide bestimmen, aus
den Tochterionenspektren Informationen über die Sequenz der Aminosäuren im einzelnen
Peptid. Da die fadenförmigen Peptidionen ihre beiden Ladungen meist an den entgegengesetz
ten Enden tragen, zerfallen sie beim Fragmentieren häufig in zwei komplementäre, einfach ge
ladene Ionen, deren Massensumme immer gleich der Masse des Peptids sein muß. Daher kann
man die Sequenzinformationen relativ einfach aus dem Spektrum gewinnen.
Kennt man die Molekulargewichte der verdauten Peptide und einige Sequenzen, so kann man
die Identität des ursprünglichen Proteins sofort anhand entsprechend aufbereiteter Datenban
ken bestimmen.
Es sind jedoch auch andere Anwendungen mit dazu leicht veränderten Ausführungsformen
möglich. Ein dieser Anwendungen betrifft die sogenannte Nanospray-Methode, die mit extrem
geringen Substanzmengen auskommt, aber im allgemeinen mit einer visuellen Auswahl der
Elternionen betrieben wird.
Die Nanospray-Methode ist eine Elektrosprüh-Ionisierung, die mit einer winzigen Kapillare
arbeitet. In der Kapillare wird überhaupt nur mit einer Lösungsmenge von ein bis drei Mikroli
ter gearbeitet, in der sich etwa ein Picogramm eines Substanzgemisches befindet. Die Nano
spray-Ionisierung läßt sich sehr schnell elektrisch ein- und ausschalten (DE 44 44 229), so daß
der Verbrauch an Substanz nur während der Füllung der Ionenfalle stattfindet.
Nach der Aufnahme einer Serie von Einzelnormalspektren kann (bei abgeschalteter Nanospray-Ioni
sierung, also ohne Substanzverlust) das Summenspektrum visuell ausgewertet werden.
Dabei kann man (beispielsweise) mit der Maus auf dem Bildschirm einen Massenpeak des
Spektrums anklicken, und sofort eine vorbestimmte Anzahl von Tochterioneneinzelspektren
spektren aus den Elternionen des angeklickten Massenspeaks erhalten, die zu einem Tochterio
nensummenspektrum addiert werden. Dabei kann die Füllsteuerung in analoger Weise auf die
Steuerung der Normalspektren zurückgreifen, wie das oben geschildert wurde. Es braucht da
zu allerdings keine Extrapolation vorgenommen zu werden, da die Ionenerzeugung der Nano
spray-Methode sehr konstant ist.
Während der visuellen Auswertung eines solchen Tochterionensummenspektrums kann man
dann wieder einen Massenpeak mit Tochterionen anklicken, die dann in einer weiteren Spek
trenserie isoliert, fragmentiert und in Form von Enkelionenspektren aufgenommen werden.
Dabei findet wieder eine Vorausberechnung der Füllrate nach obigem Muster statt. Die Füllzeit
für ein einziges Enkelioneneinzelspektrum kann dabei durchaus mehrere Sekunden betragen.
Diese Methode läßt sich auf Urenkel und Ururenkel beliebig fortsetzen. Diese Art der Spek
trenaufnahme ist außerordentlich substanzsparend. Es können dabei auch längere Denk- oder
Diskussionspausen eingelegt werden, ohne daß dabei wertvolle Probensubstanz verloren geht.
Die hier geschilderten Ausführungsformen können vom Fachmann durchaus auch auf andere
Analysenaufgaben ähnlicher Problematik übertragen werden.
Claims (7)
1. Verfahren für die Messung eines oder mehrerer Isolierionen-, Tochterionen- oder Enkel
ionenspektren mit raumladungsgeregelten Ionenfallenmassenspektrometern aus einer
Meßsequenz für Normalspektren heraus,
dadurch gekennzeichnet,
daß zur Regelung der Raumladung bei der Füllung mit Isolier-, Tochter- oder Enkelionen
ein Erwartungswert für eine Füllrate benutzt wird, der aus gemessenen Füllraten vorher
gehender Normalspektren, aus gemessener relativer Häufigkeit der Elternionen, aus be
kannten Ausbeutefaktoren für Isolierung und Fragmentierung und gegebenenfalls auch aus
Füllraten vorhergehender Tochterionenspektren hergeleitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus den gemessenen Füllraten
der Normalspektren ein Erwartungswert für eine Füllrate eines Normalspektrums pro
gnostiziert wird, und daß dieser Erwartungswert durch die relative Häufigkeit der selek
tierten Elternionen im Spektrum, durch den Ausbeutefaktor der Isolierung und gegebenen
falls durch den Ausbeutefaktor der Fragmentierung korrigiert wird, bevor er zur Steue
rung der Füllung verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die prognostizierte Füllrate des
Normalspektrums (als Basis für die Berechnung der Füllraten für die Isolier-, Tochter- oder
Enkelionen) gleich der letztgemessenen Füllrate des vorhergehenden Normalspek
trums gesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die prognostizierte Füllrate des
Normalspektrums (als Basis für die Berechnung der Füllraten für die Isolier-, Tochter- oder
Enkelionen) aus den gemessenen Füllraten vorhergehender Normalspektren durch li
neare, quadratische, kubische oder exponentielle Extrapolation berechnet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Erwartungswert für die
Füllrate für Isolierionen, Tochterionen oder Enkelionen aus den Füllraten mindestens eines
vorhergehenden Einzelspektrums gleicher Ionenerzeugungsbedingungen bestimmt wird,
wobei der Trend der Konzentrationsveränderungen aus begleitenden Normalspektren ab
geleitet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß aus
der berechneten und zur Steuerung verwendeten Füllrate und der nachträglich gemessenen
Füllrate eines Isolier-, Tochter- oder Enkelionenspektrums ein Korrekturfaktor berechnet
wird, der bei nachfolgenden Spektrenaufnahmen gleicher oder ähnlicher Art zur Verbesse
rung der Füllung verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß meh
rere Einzelspektren einer jeden Ionensorte getrennt zu einem Summenspektrum addiert
werden, und daß erst die Summenspektren quantitativ ausgewertet werden.
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