DE19709086B4

DE19709086B4 - Verfahren der Raumladungsregelung von Tochterionen in Ionenfallen

Info

Publication number: DE19709086B4
Application number: DE19709086A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen; Michael Cambridge Schubert
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 1997-03-06
Filing date: 1997-03-06
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2017-03-07
Also published as: DE19709086A1; US5936241A; GB9804688D0; GB2322961A; GB2322961B

Abstract

Verfahren zur Regelung der Ionenmenge für Tochterionenspektren in einem Ionenfallenmassenspektrometer mit folgenden Schritten,
(a) Befüllung der Ionenfalle mit Ionen und Aufnahme eines Normalspektrums, wobei das Normalspektrum durch nicht isolierte und nicht fragmentierte Ionen charakterisiert ist,
(b) Bestimmung der Füllrate für das Normalspektrum und eines Erwartungswertes für die Füllrate für das nächste Normalspektrum,
(c) Bestimmung eines Erwartungswertes für die Füllrate für ein Tochterionenspektrum aus dem Erwartungswert für die Füllrate für das nächste Normalspektrum multipliziert mit der Häufigkeit einer ausgewählten Elternionensorte, mit der Isolierungsausbeute der ausgewählten Elternionensorte, mit der Fragmentierungsausbeute an Tochterionen und dividiert durch den integralen Ionenstrom des Normalspektrums,
(d) Befüllung der Ionenfalle mit Ionen für die Aufnahme des Tochterionenspektrums, wobei der Erwartungswert für die Füllrate für das Tochterionenspektrum als Regelgröße für die Raumladung verwendet wird,
(e) Erzeugung von Tochterionen durch die Isolierung und Fragmentierung von Ionen der ausgewählten Elternionensorte und Aufnahme des Tochterionenspektrums.

Description

Die Erfindung betrifft die Regelung der Raumladung für die Aufnahme von Tochterionenspektren in Ionenfallenmassenspektrometern, aber auch für Isolierungs- oder Enkelionenspektren, wenn diese in eine Serie von Normalspektren eingebettet sind.
Die Erfindung besteht darin, die Regelung der Raumladung in der Ionenfalle für die ersten Tochterionenspektren aus den Füllraten vorhergehender Normalspektren, aus dem Häufigkeitsverhältnis der zu isolierenden Elternionen zum Gesamtspektrum, und aus den zumindestens grob bekannten Isolierungs- und Fragmentierungsausbeuten herzuleiten. Für weitere Tochterionenspektren kann zusätzlich auf die Füllrate der Tochterionenspektren zurückgegriffen werden. Analoges gilt für Spektren isolierter Ionen oder von Ionen durch MSⁿ-Prozesse.
Ionenfallen nach Paul bestehen aus einer hochfrequenzversorgten Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden; im Inneren können Ionen gespeichert werden. Die Ionenfallen können als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll.
In Hochleistungs-Ionenfallenmassenspektrometern dürfen sich nur relativ wenige Ionen befinden, wenn gut aufgelöste Spektren mit richtiger Massenzuordnung erhalten werden sollen. Befinden sich zu viele Ionen in der Ionenfalle, so stört die Raumladung der Ionen den Ionenauswurf und damit die Spektrenaufnahme. So wurde für ein weitverbreitetes, kommerzielles Massenspektrometer dieser Art von nur 300 Nutzionen berichtet, die für die Messung eines Einzelspektrums zur Verfügung stehen. In Ionenfallen der antragstellenden Firma stehen für ein Einzelspektrum etwa 2000 Ionen zur Verfügung. Selbst damit ist aber der dynamische Bereich innerhalb eines Spektrums außerordentlich beschränkt.
Ionenfallenmassenspektrometer haben andererseits Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen interessant macht. So können insbesondere ausgewählte Ionensorten (sogenannte „Elternionen") in der Ionenfalle isoliert und fragmentiert werden. Die Spektren dieser Fragmentionen werden „Tochterionenspektren" der betreffenden Elternionen genannt. Es können auch „Enkelionenspektren" als Fragmentionenspektren ausgewählter Tochterionen gemessen werden.
Die Raumladungsgrenze kann aus der Drift oder der Breitenzunahme der Ionensignale bestimmt werden. Eine übliche Definition bezieht sich auf eine Drift von 0,1 atomaren Masseneinheiten, das heißt, als Raumladungsgrenze wird diejenige Ionenmenge in der Ionenfalle definiert, die eine Zeitverzögerung des Auswerfens der Ionen um eine solche Zeitdifferenz bewirkt, die umgerechnet einer Massendrift von 0,1 atomaren Masseneinheiten gegenüber Normalbedingungen entspricht.
Der Einsatz der Raumladungswirkung ist relativ scharf. Eine Zunahme der Füllmenge an der Raumladungsgrenze von nur 10 % bewirkt bereits eine weitere Drift um etwa 0,1 atomare Masseneinheiten, bleibt man dagegen um etwa 20 % unter der Raumladungsgrenze, so ist die Massendrift nicht mehr meßbar.
Die optimale Füllmenge maß sich stets um einen Sicherheitsabstand unterhalb der Füllmenge an der Raumladungsgrenze befinden. Es hängt von der Güte der Raumladungsregelung ab, wie groß dieser Sicherheitsabstand gewählt werden maß. Eine sehr gute Regelung erlaubt es, bei einer optimalen Füllung zu arbeiten, die sich lediglich 20 % unterhalb der Raumladungsgrenze befindet; eine weniger gute Regelung kann dazu zwingen, bei der halben oder sogar bei einem Drittel der Raumladungsgrenze zu arbeiten. Die Güte der Regelung ist also von starkem Einfluß auf die Meßdynamik im Spektrum.
Insbesondere bei der Kopplung der Ionenfallenmassenspektrometer mit chromatographischen oder elektrophoretischen Trennverfahren ändern sich die angebotenen Substanzkonzentrationen sehr stark. Die Anpassung der Ionenfalle an solch wechselnde Konzentrationen der zugeführten Substanzen, oder beispielsweise auch an wechselnde Ionisierungs-, Reaktions- oder Zerfallsbedingungen, kann bei der Ionenfalle aus oben genannten Gründen nicht über die Dynamik im Massenspektrum, die sich für ein Aufnahmenverfahren unter Normalbedingungen ergibt, vorgenommen werden, wie es bei magnetischen Sektorfeld- oder Quadrupolfilter-Massenspektrometern möglich ist. Diese haben eine Meßdynamik von sechs bis neun Zehnerpotenzen für die Messung der Ionenströme eines Spektrums.
In der Ionenfalle muß daher die Meßdynamik über die Bedingungen bei der Regelung zur optimalen Füllung der Ionenfalle hergestellt werden. Ist beispielsweise die Konzentration einer Substanz in der Probe groß, so ist bei konstanter Ionisierungsstärke die Füllzeit für die Ionenfalle bis zum Erreichen der optimalen Befüllung nur kurz. Ist die Konzentration dagegen sehr klein, so braucht es eine lange Zeit, um die Ionenfalle optimal zu füllen. Für die Füllung mit Reaktionsprodukten oder Tochterionen kann eine dazu analoge Steuerung vorgenommen werden.
Die Füllzeiten können in der Praxis zwischen 10 Mikrosekunden und 100 Millisekunden variiert werden (in Fällen langsam veränderlicher Konzentrationen auch bis zu einer Sekunde), also über vier bis fünf Zehnerpotenzen hinweg. Wird dieses Verfahren auf die quantitative Analyse angewandt, so berechnet sich die Konzentration dann aus einem Wert, der sich – bei konstanter Erzeugung der Ionen – als Signalhöhe im Spektrum geteilt durch die Füllzeit berechnet. Dieser Wert ist dem Ionenstrom dieser Ionensorte, der während der Ionisierung generiert wird, proportional. Somit wird bei der Anwendung dieses berechneten Wertes für den Ionenstrom die Bestimmung der Konzentration vergleichbar mit der durch andere Arten von Massenspektrometern. Die Meßdynamik der Ionenfallenmassenspektrometer erhöht sich damit von drei auf sieben bis acht Zehnerpotenzen; allerdings nur, wenn sich keine störenden Ionen im Überschuß in der Ionenfalle befinden.

Die Regelung zur Füllung der Ionenfalle muß auf einer Messung der Ionenanzahl in der Ionenfalle beruhen, aus dem sich dann ein Steuerwert für die Füllung berechnen läßt. Da sich die Ionen in der Ionenfalle bisher nicht genügend einfach zerstörungsfrei messen lassen, haben sich zwei verschiedenartige Verfahren herausgebildet:

(1) Das Verfahren des „Prescan", bei dem ein kurzer Füllprozeß mit konstanter Füllzeit der eigentlichen Spektrennahme vorgeschaltet wird. Die dabei gebildeten Ionen werden aus der Falle ausgetrieben und gemessen. Aus diesem Meßwert wird die optimale Füllzeit bestimmt ( US 5 107 109 A ). – Eine Verbesserung besteht darin, die Füllzeit des Prescan nicht konstant zu halten, sondern die Füllzeit des Prescan aus vorangegangenen Messungen auf optimale Meßbedingungen hin zu steuern ( US 5 448 061 A ) In der Patentanmeldung EP 0 603 042 wird ebenfalls die Information aus einem Prescan verwendet, um die optimale Füllzeit einer nachfolgenden Spektrenaufnahme zu steuern. Allerdings wird hier weiterhin eine interne Kalibrierung durch Referenzsubstanzen durchgeführt, deren Ionen – gleichzeitig (durch eine zusätzliche Dipolspannung) mit den zu analysierenden Ionen aus der Ionenfalle ausgeworfen werden. – Diese beiden Verfahren brauchen zusätzliche Meßzeit für den Prescan, die der eigentlichen Spektrennahme verlorengeht.
(2) Ein anderes Verfahren verwendet eine Füllsteuerung, die auf die bekannte Füllrate eines oder sogar mehrerer vorhergehender Spektren zurückgreift ( DE 4 326 549 C1 ). Aus diesen Füllraten vorhergehender Spektren wird auf einen Erwartungswert für die aktuelle Füllra te extrapoliert. Die Extrapolation kann je nach den Bedingungen linear, quadratisch, kubisch, exponentiell oder nach einer anderen bekannten Funktion erfolgen. Aus dem prognostizierten Erwartungswert wird die aktuelle Füllzeit für die optimale Füllmenge berechnet. Die Füllrate ist dabei als Füllmenge geteilt durch die bekannte Füllzeit definiert, die Füllmenge wird als integrierter Ionenstrom über ein Spektrum bestimmt. Da dabei auf die vorhergehend gemessenen Nutzspektren zurückgegriffen wird, wird keine zusätzliche Zeit für einen Prescan verbraucht. Besonders bei starken Änderungen in der Konzentration der zugeführten Substanzen, wie sie besonders in der Kopplung mit chromatographischen Trennverfahren vorliegen, ist diese Art der Raumladungsregelung der Prescan-Methode weit überlegen.

Ionenfallenmassenspektrometer werden häufig als massenspezifische Detektoren für die Chromatographie oder Kapillarelektrophorese verwendet. Eine gängige Art der Ionisierung ist dabei die Elektrospray-Methode (ESI = electro spray ionization), die Ionen bei Atmosphärendruck ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlaßsysteme bekannter An in das Vakuum des Massenspektrometers und von dort in die Ionenfallen eingebracht. In ähnlicher An kann auch eine chemische Ionisierung durch Reaktanntgasionen an Atmosphärendruck benutzt werden (APCI = atmospheric pressure chemical ionization).

Diese Ionisierungarten erzeugen praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind im wesentlichen die des Moleküls. Wohl aber treten dabei ganze Serien vielfach geladener Ionen der Moleküle auf. Durch das Fehlen der Fragmentionen beschränkt sich aber die Information aus dem Massenspektrum auf das Molekulargewicht; Informationen über interne Molekularstrukturen, die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt werden können, fehlen. Die Spektren sind also gar nicht mit denen aus Elektronenstoßionenquellen vergleichbar.

Um die Spektren mit denen einer GC/MS-Methode mit Elektronenstoßionisierung vergleichbar aussagekräftig zu machen, ist es notwendig, in geeigneter Weise Fragmentionenspektren zu erzeugen. Das kann durch automatisch aufgenommene Tochterionenspektren geschehen.

Die automatische Aufnahme von Tochterionenspektren ist allerdings nicht trivial, da die Elternionen, aus denen die Tochterionen erzeugt werden müssen, nicht von vorneherein bekannt sind. Zu diesem Zwecke müssen daher die sequentiell aufgenommenen Massenspektren aus der Kopplung der Ionenfalle mit dem Chromatographen oder Elektrophoresegerät laufend von einem Rechenprogramm überprüft werden. Erscheint eine Substanz im Chromato- oder Elektropherogramm, so muß automatisch eine geeignete Ionensorte ausgewählt und eine Tochterionenspektrenaufnahme vorbereitet werden. Für diese Tochterionenaufnahme wird nun eine Regelung der Raumladung gesucht.

Für die Auswahl der Elternionen kann man beispielsweise den größten Massenpeak des Spektrums auswählen. Wenn die untersuchten Substanzen nicht zu große Molekulargewichte haben, hat es sich jedoch als besser herausgestellt, die doppelt geladenen Ionen zu verwenden, die sehr gute Strukturinformationen liefern. Die doppelt geladenen Ionen lassen sich an dem Abstand der Peaks in der Isotopengruppe erkennen, der gerade ½ Masseneinheit beträgt.

Für die Regelung der Raumladung bei der Aufnahme des Tochterionenspektrums ist bisher nur die Prescan-Methode bekannt geworden. Dazu ist es allerdings erforderlich, nach der Probefüllung der Ionenfalle in vorgegebener Zeit auch die Ionenisolierung und Fragmentierung durchzuführen, um dann durch schnellen Auswurf die Anzahl der gebildeten Tochterionen messen zu können. Diese Prozedur kostet aber fast ebenso viel Zeit wie die nachfolgende Aufnahme des Tochterionenspektrums. Die Methode ist daher sehr unbefriedigend.

Besonders bei der Kopplung mit chromatographischen oder elektrophoretischen Trennverfahren stehen die Substanzen, von denen automatisch Tochter- oder Enkelionenspektren (oder solche von isolierten Ionen) gemessen werden sollen, nur für wenige Sekunden zur Verfügung und die angebotene Konzentration ändert sich sehr schnell. Damit wird die Regelung der Raumladung, die für gute Spektren wichtig ist, zu einem schwerwiegenden Problem.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, für ein raumladungsgeregeltes Ionenfallenmassenspektrometer Verfahren für die Regelung der Ionenmenge für Tochterionenspektren (aber auch für Spektren isolierter Ionen oder für Enkelionenspektren) zu finden, die in eine Serie von Normalspektren eingebettet aufgenommen werden. Insbesondere ist ein Verfahren gesucht, das eingesetzt werden kann, wenn vorher noch gar kein Tochterionenspektrum dieser Elternionensorte aufgenommen wurde. Das Verfahren soll auch unter erschwerenden Bedingungen schnell veränderlicher Konzentration gut und substanzsparsam arbeiten.

Beschreibung der Erfindung

Die Massenspektren nicht isolierter und fragmentierter Ionen sollen im weiteren Verlauf mit „Normalspektren" bezeichnet werden, im Gegensatz zu „Isolierionenspektren", die nur aus isolierten, aber nicht fragmentierten Ionen bestehen, und den oben definierten „Tochterionenspektren" oder „Enkelionenspektren".

Es ist nun die Grundidee der Erfindung, für die Regelung der Raumladung des ersten Tochterionenspektrums auf die Füllraten der letztaufgenommenen Normalspektren zurückzugreifen. und daraus (wie beispielweise in DE 4 326 549 C1 ) einen Erwartungswert für die Füllrate f₀ des nächsten Normalspektrums zu berechnen, und für den Erwartungswert der Füllrate f_t der Tochterionen zusätzlich das Verhältnis i_e/i_tot der aus dem letzten Spektrum bekannten Häufigkeit i_e der Elternionen zum integralen Ionenstrom des Gesamtspektrums i_tot, die Ausbeute a_e der Isolierung dieser Elterionen und die Ausbeute a_f der Fragmentierung zu Tochterionen zu berücksichtigen: f_t = f₀ × i_e × a_e × a_f/i_tot. Die Ausbeuten der einzelnen Prozesse sind im allgemeinen genügend gut vorbekannt. Sie können aber auch durch Benutzung ähnlicher Analytsubstanzen einkalibriert werden.

Aus dieser prognostizierten Füllrate f_t wird dann eine optimale Füllzeit für eine vorgegebene, optimale Füllmenge berechnet, die dann zur Steuerung der Füllung des ersten Tochterionenspektrums benutzt wird.

Dabei kann zwischenzeitlich während der meist sequentiell ablaufenden Prozesse der Ionenerzeugung, Einspeicherung, Isolierung und Fragmentierung durchaus eine Überfüllung der Ionenfalle eintreten. Da aber die Isolierung auch arbeitet, wenn eine mehr als hundertfache Überfüllung der Ionenfalle herrscht, wird die Überfüllung wieder abgebaut. Auch für die Fragmentierung ist eine leichte Überfüllung unschädlich, es kommt vielmehr darauf an, für die übrigbleibenden Tochterionen die optimale Füllmege zu erreichen.

Der Erwartungswert f₀ für die Normalspektren kann bei langsamer Änderung der Konzentrationen gleich dem des letzten Massenspektrums gewählt werden. Besser jedoch ist die Extrapolation dieses Wertes aus mehreren letzten Spektrenaufnahmen, wie in DE 4 326 549 C1 beschrieben. Dabei kann beispielsweise eine lineare Extrapolation f_0,lin aus zwei, eine quadratische Extrapolation f_0,qu aus drei oder eine kubische Extrapolation f_0,kub aus vier Spektren gewählt werden. Da im Fuß eines chromatographischen Peaks eine in etwa exponentielle Änderung herrscht, kann hier auch ein Wachtumsfaktor aus den letzten zwei Spektren gebildet werden, der dann eine Extrapolation auf den Erwartungswert gestattet.

Aus der Integration über den Ionenstrom des Tochterionenspektrums kann dann die tatsächliche Füllrate f_real bestimmt werden. Damit kann auch für zukünftige Tochterionenspektren (beispielsweise des gleichen Chromatogramms) der Faktor a_e × a_f der Ausbeuten korrigiert werden.

Für das zweite Tochterionenspektrum kann dann bei langsamerer Änderung ein Erwartungswert für die Füllrate f_t angenommen werden, die der gemessenen Füllrate f_real des ersten Spektrums gleich ist.

Besser ist jedoch ein anderes Verfahren: Es wird nach dem ersten Tochterionenspektren zunächst ein weiteres Normalspektrum eingeschoben. Aus den Normalspektren vor und nach dem ersten Tochterionenspektrum wird dann wie oben ein Erwartungswert für die Füllrate des zweiten Tochterionenspektrums berechnet, eventuell unter Berücksichtigung der Korrektur der Ausbeuten.

Die Füllung des dritten Tochterionenspektrums kann dann, eventuell unter Einschieben eines weiteren Normalspektrums, aus den Füllraten der beiden bereits aufgenommenen Tochterionenspektren geregelt werden. Normalerweise würde aus zwei Spektren lediglich eine lineare Extrapolation erfolgen, hier kann aber auch ein weitergehender Trend (zweiter und dritter Differentialkoeffizient) durch die bekannten Füllraten der begleitenden Normalspektren berücksichtigt werden.

Das Einschieben der Normalspektren hat dabei einen weiteren Vorteil: nach dem Ende der Tochterionenaufnahmen kann sofort mit den Normalspektren unter optimaler Regelung der Füllung fortgefahren werden, da deren Trend bekannt ist. Außerdem ist durch die eingeschobenen Normalspektren der Verlauf des chromatographischen Peaks sehr gut bekannt. Dadurch können für quantitative Abschätzungen die Peakformen sehr gut integriert werden.

Natürlich brauchen die Normalspektren nicht gleichmäßig eingeschoben zu werden. Manchmal ist es zweckmäßig, mehr Tochterionenspektren als Normalspektren aufzunehmen. Das ist beispielsweise dann der Fall, wenn für das Tochterionenspektrum durch eine Summierung der Einzelspektren eine möglichst große Meßdynamik erreicht werden soll. Die Aufklärung einer Struktur eines Moleküls kann auch durch sehr selten auftretende Fragmentionen gut gestützt werden, und diese seltenen Fragmentionen kann man nur durch eine hohe Meßdynamik sehen.

Bei der Addition zur Erhöhung der Meßdynamik müssen die Rohspektren vor irgendeiner weiteren Auswertung addiert werden, weil nur dadurch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis und damit die Meßdynamik entsprechend steigt. Meist werden etwa 3 bis 20 Einzelspektren zu einem „Summenspektrum" durch Addition aller korrespondierenden Einzelmeßwerte längs der Spektrenaufnahme zusammengefaßt.

Die Isolierung der Elternionen kann in bekannter Weise bereits während der Ionisierung durch Resonanzauswurf unerwünschter Ionen durch die Anwendung von anregenden Frequenzgemischen mit Lücken vorgenommen werden. Es können aber auch, wie ebenfalls bekannt, Isolierungsverfahren nach einer gesteuerten Überfüllung der Ionenfalle angewandt werden, da die Isolierungsverfahren auch mit mehr als hundertfacher Überfüllung der Ionenfalle noch arbeiten können. Es bleibt somit auch bei nachträglicher Isolierung die erwünschte Meßdynamik im Spektrum erhalten.

Das hier beschriebene Verfahren der Füllsteuerung für die Tochterionenspektren ist besonders vorteilhaft, weil meßzeitsparend. Es wird für die Regelung kein zeitraubender Prescan ausgeführt, der für die Tochterionenspektren ja notwendigerweise den Vorgang der Isolierung und Fragmentierung mit umfassen muß. Dieser Prescan dauert daher länger als die Aufnahme eines Normalspektrums, liefert aber außer dem Wert für die Regelung keine weiteren Informationen.

Die Grundidee kann in analoger Weise angewandt werden, wenn Enkelionenspektren aufgenommen werden sollen. Auch bei der Aufnahme von Spektren isolierter, aber nicht fragmentierter Ionen kann entsprechend vorgegangen werden.

Beschreibung der Abbildung
1 zeigt das einfache und schnelle Berechnungsschema für die lineare, quadratische und kubische Extrapolation der Füllraten aus den gemessenen Füllraten f₁ bis f₄ der vorausgehenden Spektren, wenn diese – wie gewöhnlich – gleiche Aufnahmenzeitabstände haben.
Für Tochterionen gibt es den mit Hilfe der Ausbeuten berechneten Erwartungswert an.
Die Bezeichnungen bedeuten:

f_0,lin: = Erwartungswert der Füllrate bei linearer Extrapolation
f_0,qu: = Erwartungswert der Füllrate bei quadratischer Extrapolation
f_0,kub: = Erwartungswert der Füllrate bei kubischer Extrapolation
f_t: = Erwartungswert der Füllrate für Tochterionen
f₀: = einer der Erwartungswerte f_0,lin, f_0,qu oder f_0,kub
i_e: = integrierter Ionenstrom des Elternionenpeaks
a_e: = Isolierungsausbeute der Elternionen
a_f: = Fragmentierungsausbeute an Tochterionen
i_tot: = integrierter Ionenstrom des gesamten Spektrums

Beschreibung günstiger Ausführungsformen
Eine Ausführungsform des Verfahrens nach dieser Erfindung betrifft die automatische Aufnahme von Tochterionenspektren der Substanzen in chromatographischen Trennungen unbekannter Gemische.
Es werde für eine detaillierte Beschreibung beispielhaft angenommen, daß es sich bei dem Gemisch um einen enzymatischen Verdau eines unbekannten Proteins in kleinere Peptide handelt, das durch Flüssigkeitchromatographie aufgetrennt und massenspektrometrisch in Ionenfallen gemessen wird. Die Massen einiger Peptide und die Kenntnis einiger Bruchstücke der Aminosäuresequenzen reichen im allgemeinen aus, das Protein über Proteindatenbanken sicher und eindeutig zu identifizieren. In den Proteindatenbanken sind die Sequenzen der Proteine gespeichert. Bei dieser Aufgabe der Proteinidentifizierung liegt meist nur eine sehr geringe Menge des Proteins vor; es ist also wesentlich, die Normal- und Tochterionenspektren in einem einzigen Analyenlauf aufzunehmen.
Für diese Aufgabe wird die Flüssigkeitschromatograhie mit Ionisierung durch Elektrospray eingesetzt. Dabei werden mit dem Ionenfallenmassenspektrometer zunächst nur normale Massenspektren aufgenommen. Die Ionisierung durch Elektrospray führt bei den kleineren Peptiden, wie sie durch den Verdau entstehen, zu Ionen, die etwa zwei- bis fünffach geladen sind. Die sequentiell während der Separation aufgenommenen Normalspektren werden nun auf das Erscheinen einer ersten Substanz untersucht. Erscheint nun eine Substanz, so wird automatisch ein günstiges Elternion für die Aufnahme eines Tochterspektrums ausgewählt. Im einfachsten Fall wird dafür das häufigste Ion im Spektrum ausgewählt. Für Peptide ist es aber günstiger, das doppelt geladene Molekülion zu suchen, das am Massenabstand der Ionen in der Isotopengruppe erkannt werden kann. Das doppelt geladene Ion gehört in der Regel zu den häufigsten Ionen.
Es kann das doppelt geladene Ion aber auch anders gefunden werden. Es ist möglich, das Normalspektrum in Echtzeit auf das Molekulargewicht der Ionen der Substanz zu untersuchen, wobei die Serie der mehrfach protonierten Ionen und ihrer Massen für einen entsprechenden Algorithmus genutzt wird. Aus dem Molekulargewicht läßt sich sofort das doppelt protonierte Ion finden.
Es geht nun um die Regelung der Füllung der Ionenfalle für das erste, automatisch aufzunehmende Tochterionenspektrum. Dazu wird die letztaufgenommenen Normalspektren zurückgegriffen. Aus ihren bekannten Füllraten (die Füllrate ist die durch Integration über den Ionenstrom des Spektrums gemessene Gesamtionenmenge geteilt durch die bekannte Füllzeit) kann ein Erwartungswert für die Füllrate f₀ eines weiteren Normalspektrums extrapoliert werden.
Die Regelung greift in diesem Fall am besten auf eine kubische Extrapolation zurück, da sich das Signal im chromatographischen Peak sehr rasch ändert. Das Schema einer kubischen Extrapolation ist in 1 dargestellt. Aus den vier Füllraten f₁ (jüngstes Normalspektrum) bis f₄ werden die Differenzen a₁ bis a₃ gebildet, daraus die Differenzen b₁ und b₂, daraus die Differenz c₁. Die kubische Extrapolation für den Erwartungswert f_0,kub ergibt sich sehr einfach zu f₀ = f_0,kub = f₁ + a₁ + b₁ + c₁. Diese sehr einfache Berechnung setzt voraus, daß die zeitlichen Abstände der Spektrennahmen gleich sind. Für ungleiche Spektrenabstände ist die Extrapolation etwas umständlicher, jedoch dem Fachmann an sich bekannt. – Die lineare Extrapolation ergibt sich übrigens zu f_0,lin = f₁ + a₁; die quadratische Extrapolation zu f_0,qu = f₁ + a₁ + b₁.
Es soll nun jedoch kein Normalspektrum, sondern ein Tochterionenspektrum der ausgewählten Elternionen, also der doppelt geladenen Molekülionen, gemessen werden. Diese Elternionen bilden nur einen Teil der Ionen des Normalspektrums, daher ist zunächst der Anteil i_e/i_tot dieser Elternionen am Gesamtspektrum zu berücksichtigen, der aus dem letzten Normalspektrum bekannt ist. Diese Elternionen sind dann zu isolieren und zu fragmentieren. Dabei gehen Ionen verloren. Über die bekannte Ausbeute a_e bei der Isolierung und die ebenfalls bekannte Fragmentierungsausbeute a_f an Tochterionen kann aber ein Erwartungswert für die Füllrate f_t mit Tochterionen berechnet werden, der im allgemeinen recht gut stimmt und für die Steuerung der Füllung verwendet werden kann. Die Ausbeuten für Isolierung und Fragmentierung der Peptide sind von Peptid zu Peptid recht gut konstant und können daher durch Kalibrierung einigermaßen gut bestimmt werden.
Die Isolierung kann während der Einspeicherung der Ionen, die von außen in die Ionenfalle eingeschossen werden, in an sich bekannter Weise durch ein Frequenzgemisch erfolgen, das an die beiden Endkappen angelegt wird. Das Frequenzgemisch enthält die Frequenzen aller Ionen, die nicht in der Ionenfalle verbleiben sollen. Diese werden durch die Frequenzen in ihren Fundamentalschwingungen in Richtung der Fallenachse angeregt, vergrößern dabei ihre Schwingungsamplituden, und verlassen die Ionenfalle, indem sie an die Endkappen anstoßen und sich entladen, oder indem sie durch Perforationen austreten. Für diejenigen Ionen, die in der Ionenfalle verbleiben sollen, sind keine Anregungsfrequenzen im Frequenzgemisch enthalten.
Es ist aber nicht notwendig, die Isolierung während der Ionenerzeugung und -einspeicherung vorzunehmen. Es kann die Ionenfalle während der Ionenerzeugung bis weit über die optimale Füllmenge hinaus mit Ionen gefüllt und erst dann die Isolierung angewandt werden. Für diese nachträgliche Art der Isolierung sind mehrere Methoden bekannt. Da diese Methoden der Isolierung auch dann gut arbeiten, wenn eine mehr als hundertfache Überladung vorliegt, kann in diesem Fall die zeitweilige Überladung der erfindungsgemäßen Regelung der Füllzeit willentlich so gesteuert werden, daß erst nach der Isolierung der erwünschten Ionensorte die optimale Füllmenge der Ionenfalle vorliegt. Die „Füllrate" schließt also in diesem Fall den Prozeß der anfänglichen Überladung und der anschließenden Isolierung mit ein. Da sich die Regelung der Füllmenge nach der Erfindung auf die integralen Ionenmengen der vorausgehenden Spektren gleicher Erzeugungsart beziehen, muß nicht einmal bekannt sein, wie hoch die Überladung im speziellen Fall eigentlich ist.
Nach der Aufnahme des Tochterionenspektrums wird die reale Füllrate bestimmt. Stimmt sie nicht mit der berechneten Füllrate überein, so wird daraus eine Korrektur der Ausbeutefaktoren berechnet, die bei nachfolgenden Tochterionenspektren angewandt werden kann.
Auf das erste Tochterionenspektrum hin wird nun wieder ein Normalspektrum aufgenommen, bevor ein zweites Tochterionenspektrum gemessen wird. Aus diesem Normalspektrum und seinen Vorgängern wird nun, wie bekannt, ein weiterer Erwartungswert für die Füllrate eines Normalspektrums hergeleitet, aus dem dann durch Korrektur mit den Ausbeutefaktoren der Erwartungswert für die Füllrate des zweiten Tochterionenspektrums erhalten wird. In dieser Weise können Tochterionenspektren mit optimaler Füllmenge erhalten werden, obwohl vorher keine Tochterionen dieses Elterions gemessen wurden.
Es kann der Erwartungswert für die Füllrate des zweiten (oder eines weiteren) Tochterionenspektrums aber auch anders berechnet werden. Es wird dabei von der gemessenen Füllrate f_real des letzten Tochterionenspektrums ausgegangen. Aus den begleitenden Normalspektren wird nun ein Trendfaktor der Zu- oder Abnahme des chromatographischen Peaks berechnet, der beispielsweise als Quotient des Erwartungswertes für eine Füllrate geteilt durch die letzte aktualle Füllrate gewonnen wird. Dieser Trendfaktor wird dann auf die Füllrate f_real des letzten Tochterionenspektrums angewendet.
Es kann aus diesem Grunde, aber auch sonst zweckmäßig sein, im Verlauf der Messungen auch weiterhin eingeschobenene Normalspektren aufzunehmen. Dabei wird der Regelungszug für die Normalspektren nicht unterbrochen. Auch bei komplexeren Trennverfahren mit unvoll ständiger Separation der chromatographischen Peaks kann so der Verlauf recht gut verfolgt werden. Es gehen insbesondere keine Substanzpeaks verloren, da die Ankunft einer Substanz auch dann beobachtet werden kann, wenn schon für eine andere Substanz Tochterionenspektren aufgenommen werden.
Für höchste Dynamik in gut separierten Chromatogrammen mag es allerdings besser sein, zwischen weiteren Tochterionenaufnahmen keine Normmalspektren einzuschieben, sondern alle Meßzeit für die Aufnahme der Tochterionen zu verwenden. Je mehr Tochterionenspektren zu einem Summenspektrum addiert werden, desto höher ist die Meßdynamik im summierten Tochterionenspektrum.
Aus den Normalspektren kann man nun die Molekulargewichte der Peptide bestimmen, aus den Tochterionenspektren Informationen über die Sequenz der Aminosäuren im einzelnen Peptid. Da die fadenförmigen Peptidionen ihre beiden Ladungen meist an den entgegengesetzten Enden tragen, zerfallen sie beim Fragmentieren häufig in zwei komplementäre, einfach geladene Ionen, deren Massensumme immer gleich der Masse des Peptids sein muß. Daher kann man die Sequenzinformationen relativ einfach aus dem Spektrum gewinnen.
Kennt man die Molekulargewichte der verdauten Peptide und einige Sequenzen, so kann man die Identität des ursprünglichen Proteins sofort anhand entsprechend aufbereiteter Datenbanken bestimmen.
Es sind jedoch auch andere Anwendungen mit dazu leicht veränderten Ausführungsformen möglich. Ein dieser Anwendungen betrifft die sogenannte Nanospray-Methode, die mit extrem geringen Substanzmengen auskommt, aber im allgemeinen mit einer visuellen Auswahl der Elternionen betrieben wird.
Die Nanospray-Methode ist eine Elektrosprüh-Ionisierung, die mit einer winzigen Kapillare arbeitet. In der Kapillare wird überhaupt nur mit einer Lösungsmenge von ein bis drei Mikroliter gearbeitet, in der sich etwa ein Picogramm eines Substanzgemisches befindet. Die Nanospray-Ionisierung läßt sich sehr schnell elektrisch ein- und ausschalten ( DE 4 444 229 A1 ) so daß der Verbrauch an Substanz nur während der Füllung der Ionenfalle stattfindet.
Nach der Aufnahme einer Serie von Einzelnormalspektren kann (bei abgeschalteter Nanospray-Ionisierung, also ohne Substanzverlust) das Summenspektrum visuell ausgewertet werden. Dabei kann man (beispielsweise) mit der Maus auf dem Bildschirm einen Massenpeak des Spektrums anklicken, und sofort eine vorbestimmte Anzahl von Tochterioneneinzelspektrenspektren aus den Elternionen des angeklickten Massenspeaks erhalten, die zu einem Tochterionensummenspektrum addiert werden. Dabei kann die Füllsteuerung in analoger Weise auf die Steuerung der Normalspektren zurückgreifen, wie das oben geschildert wurde. Es braucht dazu allerdings keine Extrapolation vorgenommen zu werden, da die Ionenerzeugung der Nanospray-Methode sehr konstant ist.
Während der visuellen Auswertung eines solchen Tochterionensummenspektrums kann man dann wieder einen Massenpeak mit Tochterionen anklicken, die dann in einer weiteren Spektrenserie isoliert, fragmentiert und in Form von Enkelionenspektren aufgenommen werden. Dabei findet wieder eine Vorausberechnung der Füllrate nach obigem Muster statt. Die Füllzeit für ein einziges Enkelioneneinzelspektrum kann dabei durchaus mehrere Sekunden betragen. Diese Methode läßt sich auf Urenkel und Ururenkel beliebig fortsetzen. Diese Art der Spektrenaufnahme ist außerordentlich substanzsparend. Es können dabei auch längere Denk- oder Diskussionspausen eingelegt werden, ohne daß dabei wertwolle Probensubstanz verloren geht.
Die hier geschilderten Ausführungsformen können vom Fachmann durchaus auch auf andere Analysenaufgaben ähnlicher Problematik übertragen werden.

Claims

Verfahren zur Regelung der Ionenmenge für Tochterionenspektren in einem Ionenfallenmassenspektrometer mit folgenden Schritten, (a) Befüllung der Ionenfalle mit Ionen und Aufnahme eines Normalspektrums, wobei das Normalspektrum durch nicht isolierte und nicht fragmentierte Ionen charakterisiert ist, (b) Bestimmung der Füllrate für das Normalspektrum und eines Erwartungswertes für die Füllrate für das nächste Normalspektrum, (c) Bestimmung eines Erwartungswertes für die Füllrate für ein Tochterionenspektrum aus dem Erwartungswert für die Füllrate für das nächste Normalspektrum multipliziert mit der Häufigkeit einer ausgewählten Elternionensorte, mit der Isolierungsausbeute der ausgewählten Elternionensorte, mit der Fragmentierungsausbeute an Tochterionen und dividiert durch den integralen Ionenstrom des Normalspektrums, (d) Befüllung der Ionenfalle mit Ionen für die Aufnahme des Tochterionenspektrums, wobei der Erwartungswert für die Füllrate für das Tochterionenspektrum als Regelgröße für die Raumladung verwendet wird, (e) Erzeugung von Tochterionen durch die Isolierung und Fragmentierung von Ionen der ausgewählten Elternionensorte und Aufnahme des Tochterionenspektrums.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Erwartungswert für die Füllrate des nächsten Normalspektrums gleich der Füllrate des zuletzt gemessenen Normalspektrums gesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Erwartungswert für die Füllrate für das nächste Normalspektrum aus den gemessenen Füllraten von mehreren vorhergehenden Normalspektren durch lineare, quadratische, kubische oder exponentielle Extrapolation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die tatsächlichen Füllrate für das Tochterionenspektrum aus der Integration über den Ionenstrom des Tochterionenspektrums bestimmt wird, und dass die Isolierungsausbeute und die Fragmentierungsausbeute korrigiert werden, falls die tatsächliche Füllrate von dem Erwartungswert für die Füllrate abweicht.
Verfahren zur Regelung der Ionenmenge für Enkelionenspektren in einem Ionenfallenmassenspektrometer mit folgenden Schritten, a) Befüllung der Ionenfalle mit Ionen und Aufnahme eines Normalspektrums, wobei das Normalspektrum durch nicht isolierte und nicht fragmentierte Ionen charakterisiert ist, b) Bestimmung der Füllrate für das Normalspektrum und eines Erwartungswertes für die Füllrate für das nächste Normalspektrum, c) Befüllung der Ionenfalle mit Ionen, Erzeugung von Tochterionen durch die Isolierung und Fragmentierung von Ionen einer ausgewählten Elternionensorte und Aufnahme eines Tochterionenspektrums, d) Bestimmung eines Erwartungswertes für die Füllrate für ein Enkelionenspektrum aus dem Erwartungswert für die Füllrate für das nächste Normalspektrum multipliziert mit der Häufigkeit einer ausgewählten Eltern- und Tochterionensorte, der Isolierungsausbeute der ausgewählten Eltern- und Tochterionensorte, der Fragmentierungsausbeute an Tochter- und Enkelionen und dividiert durch den integralen Ionenstrom des Normalspektrums, e) Befüllung der Ionenfalle mit Ionen für die Aufnahme des Enkelionenspektrums, wobei der Erwartungswert für die Füllrate für das Enkelionenspektrum als Regelgröße für die Raumladung verwendet wird, f) Erzeugung von Enkelionen durch die Isolierung und Fragmentierung von Ionen der ausgewählten Eltern- und Tochterionensorte und Aufnahme des Enkelionenspektrums.