DE4444229A1 - Schaltbare Elektrosprüh-Ionisierung für getaktet arbeitende Massenspektrometer - Google Patents

Description

Umfeld der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die "Elektrosprüh-Ionisierung" von Molekülen in Lö­ sung aus einer Sprühkapillare bei Normaldruck unter der Einwirkung eines elektri­ schen Feldes. Dieses Verfahren ist besonders günstig für die Analyse von Ionen gro­ ßer Moleküle in Massenspektrometern. Die Ionenerzeugung findet dabei außerhalb des Vakuums des Massenspektrometers statt.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfindung besteht darin, das Sprühen durch Veränderung der Sprühspannung für die Beladungsphase von getaktet arbeitenden Massenspektrometern mit Ionen einzuschalten, und für die Untersuchungsphase abzuschalten. Das Schalten wird technisch möglich, wenn sehr kleine Sprühraten in fein angespitzten Sprühkapilla­ ren mit einem Nachschub an Flüssigkeit allein durch den Sog des elektrischen Feldes eingestellt werden. Es lassen sich dadurch ICR-Massenspektrometer und Quadru­ pol-Hochfrequenz-Ionenfallen besonders substanzsparsam mit Ionen füllen. Der Probenverbrauch kann, je nach dem Zeitdauerverhältnis der beiden Phasen, durch das Schalten um ein bis zwei Zehnerpotenzen gesenkt werden.

Patentgeschichte

Diese Patentanmeldung ist eine Ausscheidung aus der Anmeldung P 4408032.8, deren Beschreibungstext hier vollinhaltlich eingeschlossen werden soll.

Stand der Technik

Das konventionelle Verfahren der Elektrosprüh-Ionisierung, für das es bereits ver­ schiedene kommerziell erhältliche Geräte gibt, arbeitet im wesentlichen wie folgt:

Zwischen einer Metallkapillare und einer ebenen Fläche, die einen Abstand von et­ wa 20 bis 50 Millimeter voneinander haben, liegt eine Spannung von mehreren Kilo­ volt an. Eine Flüssigkeit in der Kapillare wird dabei unter der Wirkung des elektri­ schen Feldes am Ende der Kapillare dielektrisch polarisiert und zu einem Konus ausgezogen, dem sogenannten Taylor-Konus. Am spitzen Ende dieses Konus kann die Oberflächenspannung der Flüssigkeit der ziehenden Kraft des elektrischen Fel­ des nicht mehr standhalten, daher reißt hier ein kleines Tröpfchen ab, das wegen der dielektrischen Polarisierung elektrisch aufgeladen ist. Das geladene Tröpfchen fliegt unter der Wirkung des inhomogenen elektrischen Feldes zunächst stark beschleunigt auf die ebene Gegenelektrode zu, wird aber in der umgebenden Luft abgebremst. Während des Fluges tritt von der Oberfläche des Tröpfchens eine starke Verdun­ stung ein. Befinden sich in der Flüssigkeit einige größere Moleküle, die sich durch Elektronenentzug, durch Protonierung oder sonst leichter laden (ionisieren) lassen als die Moleküle der Flüssigkeit, so können im günstigen Falle nach vollständiger Verdampfung der Flüssigkeit die größeren Moleküle in ionisierter Form zurückblei­ ben. Die ionisierten Moleküle fliegen dabei unter der Wirkung des elektrischen Fel­ des durch den bekannten Prozeß der "Ionenmobilität" weiter auf die Gegenelektro­ de zu, und können durch eine feine Öffnung oder durch eine Kapillare in das Vaku­ umsystem eines Massenspektrometers überführt werden.

Das Abreißen der Tröpfchen findet, abhängig vom Nachschub der Flüssigkeit in der Kapillare, außerordentlich häufig statt, so daß gewöhnlich ein kontinuierlicher Io­ nenstrom entsteht. Der Nachschub wird durch eine sehr gleichmäßig arbeitende Pumpe, meist eine Spritzenpumpe, aufrechterhalten.

Größere Moleküle werden bei diesem Vorgang meist nicht nur einfach geladen, son­ dern vielfach. Als grobe Regel gilt, daß die mittlere Ladungszahl um so größer ist, je größer das Molekül ist. Die Ladung ist zumeist nicht eine einfache Ionisierung, son­ dern eine Protonierung, also eine Bindung mit einem geladenen Wasserstoffatom H⁺. Daher hängt die Ionisierung auch stark von der Wasserstoff-Ionen-Konzentra­ tion (also vom pH-Wert) der Lösung ab. Um die mittlere Ladungszahl herum gibt es meist eine breite Verteilung mit verschiedenen Anzahlen von Ladungen.

Als Stand der Technik für das Elektrosprühen bei Normaldruck kann das Patent US 4531 056 betrachtet werden. Das Patent US 5 115 131 wird hier wegen der darin verwendeten feinen Sprühkapillaren zitiert, und besonders auch wegen der darin angegebenen weiteren Patent- und Literaturzitate über das Elektrosprühen im all­ gemeinen, die hier eingeschlossen werden sollen, obwohl das Patent selbst im we­ sentlichen ein Versprühen im Vakuum beschreibt, das vom Elektrosprühen in Gas bei Normaldruck sehr verschieden ist.

Die Flußrate wird in konventionellen Methoden üblicherweise durch eine Pumpe bestimmt, was auch für die direkte Kopplung der Sprühkapillare mit einer Mikro- HPLC-Kapillare gilt. Die Flußrate kann aber auch durch den elektro-osmotischen Vortrieb der Flüssigkeit in einer elektrophoretisch betrieben Kapillarsäule erzeugt werden, wie in US 4 885 076 beschrieben.

Nachteile des jetzigen Standes der Technik

In der Biochemie und Medizin sind häufig nur extrem geringe Substanzmengen für Analysen verfügbar (zum Teil nur Mengen von sehr wenigen Femtomol).

Die untere Grenze für den Substanzverbrauch des Elektrosprühens liegt aber bei herkömmlichen Elektrosprüh-Methoden bei etwa 100 Femtomol pro Minute, legt man eine untere Konzentration von etwa 0,1 Picomol pro Mikroliter, und eine mini­ male Flußrate von einem Mikroliter pro Minute zugrunde. Die Spektrenaufnahme, zumal bei MS/MS-Verfahren, dauert meist mehrere Minuten. Es werden also meh­ rere Hundert Femtomol Substanz benötigt. In Routineverfahren liegen diese Werte noch um Faktoren 10 bis 100 höher; es werden daher regelmäßig Mengen weit über einem Picomol verbraucht. Versuche zur Verringerung der Flußrate, die bei kom­ merziell erhältlichen Geräten minimal etwa 1 Mikroliter pro Minute beträgt, schlu­ gen bisher fehl, da sich keine stabilen Verhältnisse einstellen ließen.

In der parallelen Patentanmeldung P 44 08 032.8 wird bereits eine Sprühmethode beschrieben, deren Substanzverbrauch um ein bis drei Zehnerpotenzen niedriger liegt.

Das Elektrosprühen wurde bisher für Massenspektrometer entwickelt, die wegen ihrer rein massenfilternden Arbeitsweise einen kontinuierlich fließenden Ionenstrom benötigten. Es gibt aber getaktet arbeitende Massenspektrometer, die keinen konti­ nuierlichen Ionenstrom benötigen. In ihnen wechseln sich zwei Phasen miteinander ab, eine Phase für die Beladung mit Ionen und eine Untersuchungsphase für Expe­ rimente mit den Ionen und für die anschließende Messung des Ionenspektrums. Der Ionenstrom braucht in diesen Massenspektrometern nur in der Beladungsphase ein­ geschaltet zu sein. Zu dieser Art von Spektrometern gehören insbesondere die Io­ nenfallen-Massenspektrometer, wie Ionen-Cyclotron-Resonanz-Spektrometer oder Quadrupol-Hochfrequenz-Ionenfallen. In diesen lassen sich insbesondere MS/MS- Untersuchungen oder reaktionsdynamische Untersuchungen sehr günstig durchfüh­ ren, wobei sich aber die Untersuchungszeit gegenüber der Beladungszeit kräftig verlängert. Der Substanzverbrauch würde sich beim Schalten, je nach Verhältnis von Beladungszeit zu Experimentier- und Meßzeit, nochmals um ein bis zwei Größen­ ordnungen erniedrigen. Das Schalten läßt sich bei der herkömmlichen Methode des Elektrosprühens nicht durchführen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Elektrosprüh-Methode zu finden, die sich ohne Schwierigkeit im Millisekundenmaßstab ein- und ausschalten läßt, und so un­ ter Verwendung von getaktet arbeitenden Massenspektrometern mit weit geringe­ rem Substanzverbrauch arbeiten kann als die konventionelle Elektrosprüh-Technik. Sie soll auch sonst möglichst substanzsparend arbeiten. So soll sie nach Möglichkeit einen solchen Ionenstrahl bilden können, der praktisch vollkommen von der feinen Öffnung zum Vakuumsystem des Massenspektrometers aufgenommen werden kann. Die Sprühmethode soll stabil sein, und wenig beeinflußbar durch Salzkonzen­ trationen oder pH-Werte. Sie soll positives wie negatives Sprühen zulassen.

Basis und Grundgedanke der Erfindung

Elektrosprüh-Experimente mit sehr spitz ausgezogenen Kapillaren, wie sie schon in US 5 115 131 für das Sprühen unter Vakuum benutzt wurden, führten in Gas bei Normaldruck zu überraschenden Ergebnissen.

Mit niederviskosen Flüssigkeiten (Wasser mit Methylalkohol) konnte der Nachschub an Lösung allein durch die elektrischen Ziehkräfte bewältigt werden, wodurch sich eine Selbstregulierung des Nachflusses mit der Folge eines sehr konstanten Ionen­ stroms und stabiler Arbeitsweise ergab, selbst bei außerordentlich geringen Flußra­ ten. Bei höherviskosen Flüssigkeiten genügte ein leichter Gas-Überdruck am Ende der Kapillare, um zu einem selbstregulierenden Nachfluß zu kommen. Der Gas­ druck durfte auf keinen Fall so groß sein, daß sich die Lösung ohne das Anlegen der elektrischen Spannung in der Kapillare bewegte und aus der Kapillare ausfloß.

Mit dieser neuen Methode des Elektrosprühens ohne zwangsweise Erzeugung eines Lösungsflusses mit einer Pumpe ließ sich der Ionenstrahl sehr leicht an- und abstel­ len. So hörte der Ionenstrahl durch ein Absenken der Spannungsdifferenz um etwa 200 Volt (bei 600 bis 800 Volt gesamter Sprühspannung) vollkommen auf, und konnte durch Erhöhen der Potentialdifferenz auf den ursprünglichen Wert wieder in vormaliger Höhe eingeschaltet werden. An- und Abschalten konnte in weniger als je einer Millisekunde durchgeführt werden.

Für speichernde Massenspektrometer, wie Ionen-Cyclotron-Resonanz-Spektrometer (ICR) oder Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen, läßt sich aufgabengemäß mit die­ ser Schalttechnik eine verbesserte Ausnutzung geringer Substanzmengen erreichen.

Die Glaskapillaren lieferten, in völlig stabilem Betrieb, Tröpfchen von etwa 200 Nanometern Durchmesser (wahrscheinlich noch geringer). Der Durchmesser war also mindestens um Faktoren 5 bis 10, die Masse der Tröpfchen mindestens um Faktoren 125 bis 1000 kleiner als bei der konventionellen Methode.

Der optimale Abstand zwischen Spitze und Gegenelektrode betrug nur 1,5 Milli­ meter. Die Tröpfchen verdampften, wie indirekt geschlossen werden konnte, weit­ gehend auf einer Strecke von nur etwa einem Millimeter und zeigten eine Strahlver­ breiterung von nur etwa 200 Mikrometern, so daß sie praktisch vollständig durch eine üblicherweise verwendete Kapillare mit 500 Mikrometer Innendurchmesser ins Vakuum des Massenspektrometers überführt werden konnten.

Der Lösungsmittelfluß, und damit der Substanzverbrauch, lag aber um den Faktor 40 niedriger als der niedrigste Fluß, der sich in konventionellen Verfahren noch stabil einstellen läßt. Es konnte mit einem Lösungsfluß von nur 25 Nanolitern pro Minute stabil gearbeitet werden.

Die Sprühspannung betrug wegen des geringen Abstandes nur etwa 600 bis 800 Volt, was eine sehr viel einfachere Spannungsversorgung zur Folge hat. Insbesonde­ re für die schnelle Schaltbarkeit ist die niedrige Spannung sehr günstig.

Verglichen mit einer konventionellen Elektro-Spray-Einrichtung, die mit einer Lö­ sung gleicher Konzentration arbeitete, war der Ionenstrom im Massenspektrometer etwa zwei- bis dreimal höher.

Mit der außerordentlich geringen Konzentration von nur 0,05 Picomol pro Mikroliter konnten bei einer Flußrate von 25 Nanolitern pro Minute gute Protein-Spektren auf­ genommen werden. Das entspricht einer Substanzflußrate von nur 1,3 Femtomol pro Minute, mehr als 70 mal geringer als bei den geringsten Werten für die konventionel­ le Technik.

Aus Tröpfchendurchmesser, Flußrate und Konzentration läßt sich berechnen, daß pro Tröpfchen nur etwa ein Proteinmolekül vorhanden ist, das dann die gesamte Ladung des Tröpfchens übernimmt. Die Spektren der Fig. 2 und 3 unterscheiden sich praktisch nicht von denen der konventionellen Elektrosprüh-Technik.

Aus den oben angegebenen Werten läßt sich errechnen, daß sich für eine Konzentra­ tion von nur 0,05 Picomol pro Mikroliter bei durchschnittlich 10 Elementarladungen pro Proteinmolekül aus einem Lösungsfluß von nur 25 Nanolitern pro Minute ein Ionenstrom von etwa 10⁸ Elementarladungen pro Sekunde ergibt. Für die Füllung eines Ionenfallen-Massenspektrometer braucht man nur etwa 10⁵ Elementarladun­ gen, da sonst Störungen durch Raumladungen auftreten.

Weitere Vorteile der Erfindung

Der Vorteil gegenüber dem Verfahren in US 5 115 131, das ebenfalls mit sehr gerin­ gen Flußraten arbeitet, besteht darin, daß durch das Sprühen bei Normaldruck au­ ßerhalb des Vakuums die Sprühkapillare sehr leicht ausgetauscht werden kann, oh­ ne das Massenspektrometer zu belüften. Eine Sprühkapillare kann für diese extreme Art von Spurenanalytik nur ein einziges Mal benutzt werden, da ein Teil der Analy­ sensubstanz unvermeidbar an den Wänden adsorbiert wird und bei der nachfolgen­ den Analyse durch eine polarere Substanz verdrängt und im Massenspektrometer sichtbar werden kann. Die erhöhte Pumpleistung für die Vakuumerzeugung und die Notwendigkeit differentiellen Pumpens spielt bei heute erhältlichen doppelstufigen Turbomolekularpumpen nur noch eine untergeordnete Rolle.

Der Kapillareinlaß eines Massenspektrometers für konventionelle Elektrosprüh- Ionisierung beträgt etwa ein Liter Umgebungsgas pro Minute. Meist wird Stickstoff verwendet, so daß etwa ein Gramm Gas pro Minute eingeführt wird. Der Lösungs­ mittelfluß von 25 Nanolitern entspricht aber einem Massenfluß von nur 25 Mikro­ gramm pro Minute. Selbst wenn das gesamte Lösungsmittel mit in das Massen­ spektrometer eingeführt würde, entspräche es nur einer Gewichtskonzentration von 0,0025%.

Ein besonderer Gegenstrom reinen Gases zum Fernhalten großer Mengen des Löse­ mittels aus dem Massenspektrometer kann damit entfallen. Der Gegenstrom ist nur dann angebracht, wenn letzte Spuren des Lösemittels ferngehalten werden müssen, oder wenn die letzten Reste der Solvathüllen entfernt werden müssen. Letzteres ist aber insbesondere bei den hier verwendeten Ionenfallen-Massenspektrometern nicht erforderlich, da die Solvathülle in der Falle selbst leicht durch Stöße mit Rest- oder Dämpfungsgas entfernt werden kann.

Die Entfernung der restlichen Solvathülle gelang auch schon in geheizten Einlaß­ kapillaren des Massenspektrometers.

Mit 1/10 Mikroliter Füllung in einer Kapillare (etwa 3 mm Flüssigkeitssäule in einer Kapillare von 200 Mikrometer Innendurchmesser), und mit einer Konzentration von 0,05 Picomol Protein pro Mikroliter, also mit einer Substanzmenge von nur 5 Fem­ tomol Protein, läßt sich etwa 6 Minuten ununterbrochen arbeiten. Wird das Sprühen auf die Beladungsperioden beschränkt, so kann man eine volle Stunde arbeiten, wenn sich das Verhältnis der Beladungszeit zur Meßzeit wie 1 : 10 verhält.

Das Sprühverfahren ohne erzwungenen Substanzfluß ist sehr stabil und nur wenig von Salzkonzentrationen abhängig. So konnten Salzkonzentrationen von 100 Milli­ mol pro Liter leicht versprüht werden (siehe Fig. 4). Natürlich treten die Salze als Ionen und Addukte im Spektrum auf, trotzdem können die Spektren gut interpre­ tiert werden.

Auch die pH-Werte beeinflussen den Sprühvorgang kaum. Es konnten Lösungen im Bereich von pH = 1 bis 12,5 verarbeitet werden. Damit ist auch negatives Sprühen zur Erzeugung von negativ geladenen Ionen möglich, wie sie für Nukleotide günstig sind.

Auch wäßrige Lösungen mit größeren Anteilen an organischen Lösemitteln, bei­ spielsweise 30% Acetonitril oder Methanol, ließen sich mit dieser Methode ver­ sprühen.

Die Kapillaren können leicht und reproduzierbar zu Spitzen ausgezogen werden, wenn automatisch arbeitende Geräte benutzt werden, wie sie für die Herstellung feinster Kapillarspitzen für Zell-Injektionen entwickelt worden sind. Die leichte Herstellbarkeit legt die Einmalverwendung dieser Kapillaren nahe, zumal die Ana­ lyse von Lösungen mit außerordentlich niedrigen Konzentrationen extreme Reini­ gungsverfahren verlangen würde. Es bietet sich eine industrielle Herstellung der Kapillaren an.

Wegen der geringen Abstände zwischen der Kapillarenspitze und der feinen Öff­ nung zum Massenspektrometer läßt sich die Kapillare sehr leicht justieren. Es hat sich als ausreichend erwiesen, nur eine mechanische Justierung vorzunehmen, ohne gleichzeitige Beobachtung des Ionenstroms. Damit eignet sich das Verfahren in be­ sonderer Weise für eine automatische Zuführung der Proben.

Einen besonderen Vorteil bildet auch die niedrige Sprühspannung von unter 1000 Volt, da sich diese Spannung relativ einfach und preiswert schaltbar und regelbar herstellen läßt.

Bevorzugte Ausführungsformen

Ein bevorzugtes Verfahren besteht aus folgenden Schritten:

Es werden Sprühkapillaren von 500 Mikrometer Außendurchmesser, 300 Mikro­ meter Innendurchmesser und 50 Millimeter Länge benutzt. Entsprechendes Kapillar­ glas wird nach sorgfältiger Reinigung auf einem Gerät für die Herstellung von Zell- Injektions-Pipetten zu einer feinen Spitze ausgezogen, die einen äußeren Durch­ messer von etwa 4 Mikrometer und eine feine Öffnung von etwa 2,5 Mikrometer aufweist. Die Sprühkapillaren werden anschließend im Vakuum mit einer sehr dün­ nen Goldschicht von weniger als 1/10 Mikrometer Dicke versehen, die durch Ionen­ zerstäubung (Sputtering) oder durch Verdampfung eines Golddrahtes aufgebracht wird.

Die Sprühkapillaren können ohne jede weitere Reinigung benutzt werden. Das Ausziehen zu einer Spitze stellt bereits ein sehr gutes Reinigungsverfahren dar. Es kann die innere Oberfläche aber auch mit üblichen Verfahren silanisiert oder sonst desaktiviert werden, um der Adsorption der Untersuchungsmoleküle vorzubeugen. Auch andere Methoden, die die Oberfläche adsorptions-inert machen, können an­ gewendet werden.

Die Sprühkapillaren werden mit einer Mikropipette befüllt, die einen Außendurch­ messer von etwa 200 Mikrometer hat. Bei sehr kleinen Mengen bis zu etwa 1/10 Mi­ kroliter ist auch ein einfaches Aufsaugen eines Tröpfchens in die Kapillare durch die Kapillarkräfte möglich.

Die gefüllte Sprühkapillare wird dann sofort mit der Rückseite in einer Dichtungs­ durchführung eines kleinen Gehäuses befestigt und durch Anziehen einer Dich­ tungsschraube in üblicher Weise gedichtet. In diesem Gehäuse befindet sich am Bo­ den etwas Lösemittel, daher ist das Gas in diesem Gehäuse mit Lösemittel gesättigt. Die Sättigung mit Lösemittel dient dazu, ein Austrocknen der Lösung in der Sprüh­ kapillare von der Rückseite her auch bei längerem Betrieb und auch in Betriebs­ pausen zu vermeiden. Das Gehäuse wird dann über eine Gaszuführung mit Druck beaufschlagt, der die Lösung in der Sprühkapillare bis in die vorderste Front der Spitze treibt. Das Gas kann anschließend etwas entspannt werden, ohne daß sich die Lösung aus der Spitze zurückzieht.

Ein Austrocknen der Sprühkapillare an der Vorderseite ist nicht zu befürchten, da hier die Flüssigkeitsoberfläche um etwa 4 Zehnerpotenzen kleiner ist.

Die Dichtung der Sprühkapillare im Gehäuse ist so ausgeführt, daß sie einen elek­ trischen Kontakt zu der Metallschicht der Spitze herstellt. Die Spitze kann also mit einer Spannung beaufschlagt werden.

Als Druckgas kann Luft verwendet werden, bei oxidationsempfindlichen Substan­ zen empfiehlt sich ein inertes Gas, beispielsweise Stickstoff.

Die Sprühkapillare wird in dem Gehäuse so befestigt, daß ihre Spitze um einen ge­ nau definierten Abstand aus dem Gehäuse herausragt, der auf etwa 0,1 Millimeter toleriert ist.

Das Gehäuse wird dann auf einer Präzisionsführung an die ebene Gegenelektrode herangeführt. Ein Anschlag arretiert das Gehäuse dann, wenn sich die Spitze genau 1,5 Millimeter von der Gegenelektrode entfernt befindet. Durch die Präzisionsfüh­ rung ist die Spitze automatisch auf die Öffnung in der Gegenelektrode zentriert. Die Toleranz für die Zentrierung beträgt etwa 1/20 Millimeter, die Zentrierung ist also nicht extrem kritisch.

Ein üblicher Eintritt in das Massenspektrometer ist durch eine etwa 15 Zentimeter lange Einlaßkapillare gegeben, mit einer Kapillaröffnung von etwa 500 Mikrometer und an beiden Enden mit einer Metallschicht versehen, die die Stirnfläche und einen Teil des zylindrischen Teils umfaßt. Diese Einlaßkapillaren werden bereits bei der herkömmlichen Art der Elektrosprüh-Ionisierung benutzt.

Das Einschalten der Spannung zwischen der Spitze der Sprühkapillare und der Ge­ genelektrode startet den Tröpfchen- und Ionenstrahl. Die Sprühspannung beträgt et­ wa 600 bis 800 Volt. Die Spannung ist nur geringfügig vom Abstand Spitze-Gegen­ elektrode abhängig, sehr wohl aber von der Art des Lösemittels. Die Einrichtung des Massenspektrometers zur Messung des Totalionenstromes kann dazu benutzt wer­ den, die richtige Spannung einzustellen. Eine andere Justierung des Verfahrens ist nicht notwendig.

Die verwendeten ionenspeichernden Massenspektrometer wie ICR oder Ionenfallen arbeiten mit zyklischen Beladungsphasen, die dann durch Phasen mit der eigentli­ chen Spektrenaufnahme unterbrochen werden. Die Beladungsphasen dauern durch­ schnittlich 5 bis 20 Millisekunden, die Untersuchungsphasen etwa 200 Millisekun­ den bis weit über 1 Sekunde.

Der Ionenstrom wird nur in der Beladungsphase eingeschaltet, und in der Meßphase durch Absenken der Sprühspannung um etwa 200 Volt unterbrochen. Der Substanz­ verbrauch erniedrigt sich dabei um einen Faktor, der für durchschnittliche Verhält­ nisse ein bis zwei Größenordnungen betragen kann. Je nach der Konzentration der Probenlösung, die die Länge der Beladungsphase bestimmt, und der Art der Unter­ suchung, die die Länge der Meßphase bestimmt, kann der Ersparnisfaktor extrem stark variieren.

Eine Reinigung der benutzten Sprühkapillaren ist kritisch, da trotz sorgfältiger Rei­ nigung der Röhrchen durch andere pH-Werte der Lösung sehr leicht wand-adsor­ bierte Moleküle früherer Proben gemessen werden, da die verwendeten Konzentra­ tionen extrem gering sind. Es ist daher zweckmäßig, die Sprühkapillaren nur einmal zu verwenden. Da aber das Sprühen bei Normaldruck außerhalb des Vakuums ge­ schieht, ist ein Wechsel sehr einfach.

Weitere Verbesserungen des Verfahrens betreffen die Automatisierung der Proben­ zuführung. Dabei kann die Probe sowohl von einem separierenden Chromato­ graphen aus (Flüssigkeits-Chromatographie, Gel-Chromatographie, Elektrophorese) wie auch durch Nachschub gefüllter Sprühkapillaren zugeführt werden.

Beschreibung der Bilder

Fig. 1 zeigt eine Kapillare, wie sie für dieses Verfahren verwendet wurde. Eine normale Glaskapillare wurde in einem automatisch arbeitenden Gerät zu einer Spit­ ze ausgezogen. Dieses Ausziehen ist sehr reproduzierbar. Die Kapillaren werden an der Spitze anschließend im Vakuum durch Ionenzerstäuben (Sputtering) oder Be­ dampfen mit Gold belegt. Die Goldbelegung reicht bis in den zylindrischen Teil, um einen Spannungskontakt herstellen zu können. Die Zeichnung zeigt das Prinzip, sie ist nicht proportional gezeichnet.

Fig. 2 zeigt ein normales Massenspektrum eines Peptids, das mit einer Konzentra­ tion von 0,5 Picomol pro Mikroliter und einer Gesamtmenge von 0,5 Mikroliter gleich 250 Femtomol aufgenommen wurde. Es wurde für die Spektren nur ein klei­ ner Teil der eingesetzten Menge verbraucht.

Fig. 3 zeigt ein MS/MS-Spektrum des Peptids, dessen Massenspektrum in Abb. 2 gezeigt wurde. Dieses Tochterionen-Spektrum wurde aus derselben Menge von 250 Femtomol des Peptids aufgenommen. Es zeigt die vollständige Analyse der Sequenz aus 16 Aminosäuren: MDMSKDESVDYVPMLD. Das Molekulargewicht ist 1873,8 u.

Fig. 4 zeigt das Massenspektrum eines Peptids, das aus einer 100-millimolaren Natriumchloridlösung heraus aufgenommen wurde. Ein solches Spektrum kann mit der konventionellen Elektrosprüh-Methode nicht aufgenommen werden. Das Spek­ trum unterscheidet sich sehr stark von konventionell aufgenommenen Spektren, die Identifizierung ist jedoch leicht durchzuführen. Die Möglichkeit, aus solchen Lösun­ gen heraus Spektren bekommen zu können, ist außerordentlich wichtig, weil viele separierende Verfahren nicht ohne Puffersalze oder Elektrolyte auskommen und Reinigungsschritte oft schwierig sind.

Claims (24)

1. Verfahren zur Elektrosprüh-Ionisierung von Atomen oder Molekülen in Lö­ sung aus einer Sprühkapillare heraus durch eine elektrische Sprühspannung zwi­ schen Sprühkapillare und einer Gegenelektrode, und zur Überführung der gelade­ nen Sprühpartikel durch eine feine Öffnung in der Gegenelektrode in das Vakuum eines getaktet arbeitenden Massenspektrometers, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrosprüh-Ionisierung im wesentlichen nur während der Beladungsphasen des Massenspektrometers eingeschaltet und in den Untersuchungsphasen abgeschaltet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das getaktet arbei­ tende Massenspektrometer ein Ionenfallen-Massenspektrometer ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Massenspek­ trometer ein Ionen-Cyclotron-Resonanz-Spektrometer ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Massenspek­ trometer ein Hochfrequenz-Quadrupol-Massenspektrometer ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Ein- und Abschalten der Elektrosprüh-Ionisierung durch eine Verän­ derung der Sprühspannung bewirkt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Lösung in der Sprühkapillare ohne Einwirkung der vollen Sprühspannung in Ruhe befindet und selbsttätig durch die Einwirkung des vollen elektrischen Feldes zu fließen und zu versprühen beginnt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß durch die Dimensionierung des Innendurchmessers der Öffnung an der Spitze der Sprühkapillare und durch die Sprühspannung ein Lösungsfluß kleiner als 1000 Nanoliter pro Minute erzeugt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Dimensionierung des Innendurchmessers der Öffnung an der Spitze der Sprühkapillare und durch die Sprühspannung ein Lösungsfluß in der Größenord­ nung von 25 Nanolitern pro Minute erzeugt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Innendurchmesser der Öffnung an der Spitze der Sprühkapillare einen Durchmesser kleiner als 5 Mikrometer hat.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Innendurchmesser der Öffnung an der Spitze der Sprühkapillare einen Durch­ messer zwischen 2 und 4 Mikrometer hat.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 6 bis 10, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Nachschub an Lösung zur Spitze der Sprühkapillare durch eine stationäre Druckdifferenz an den beiden Enden der Sprühkapillare unterstützt wird, wobei jedoch die Druckdifferenz nicht so groß ist, einen eigenständigen Fluß der Lösung ohne die Einwirkung der Sprühspannung zu erzeugen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die stationäre Druckdifferenz durch ein Gasvolumen erhöhten Drucks am nichtsprühenden Ende der Sprühkapillare aufrechterhalten wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die feine Öffnung in der Gegenelektrode die Stirnöffnung einer Über­ führungskapillare ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Überfüh­ rungskapillare beheizt wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Abstand der Sprühkapillare zur feinen Öffnung in der Gegenelek­ trode so klein ist, daß die Öffnung im wesentlichen den gesamten, divergenten Strom der geladenen Sprühpartikel aufnimmt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand der Sprühkapillare von der Öffnung kleiner als 3 Millimeter ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Sprühspannung kleiner als 1 Kilovolt ist.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß der Durchmesser der feinen Öffnung in der Gegenelektrode zum Vakuum des Massenspektrometers 500 Mikrometer oder kleiner ist.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß dem Raum zwischen Sprühkapillare und Gegenelektrode ein sauberes Schutzgas zugeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Schutzgas vor der Zuführung gewärmt wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Schutzgas im Gegenstrom zugeführt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das vorübergehen­ de Abschalten des Elektrosprühens durch völliges Abschalten der Sprühspannung bewirkt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das vorübergehen­ de Abschalten des Elektrosprühens durch Absenken der Sprühspannung um 10 bis 40% bewirkt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das vorübergehen­ de Abschalten des Elektrosprühens durch Absenken der Sprühspannung um 20 bis 30% bewirkt wird.