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ERFINDUNGSGEBIET
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und ein System zum Bestimmen und
Quantifizieren spezifischer Spurenelemente in Proben von komplexen
Materialien. Es versteht sich, daß der Ausdruck Elemente auch
ihre Ionen und Isotope beinhaltet.
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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Die
Analyse spezifischer Elemente in komplexen Materialien wie etwa
biologischen Materialien, geologischen und Umweltproben hat jüngst in
biochemischen und biotechnologischen Anwendungen, der Entwicklung
fortgeschrittener Umwelttechnologie, Geotechnologie und in der biomedizinischen
Diagnose hohes Interesse gefunden. Zu Beispielen zählen Bestimmungen
spezifischer Elemente von modifizierten Proteinstrukturen wie etwa
Phosphor und Schwefel in der Proteomik (Analyse von Proteinen), Übergangs-
und Schwermetallen in Prozeduren der geologischen und Umweltanalyse
und von biologischen und exogenen Metallen in toxikologischen Analysen.
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Bei
einer Reihe jüngerer
Anwendungen wurde eine Kombination aus Laserablation (LA) oder thermischer
Probendesorption, Element-ICP-(inductively
coupled plasma – induktiv
gekoppeltes Plasma)-Ionisation
und Elementmassenspektrometrie (MS) verwendet. Beispielsweise werden
bei biochemischen Anwendungen zur Proteomanalyse (kompletter Satz
von Proteinen, der in einer Zelle oder einem Organismus vorliegt)
Proteine durch Gelelektrophorese, z.B. aus Zellysat, unter Verwendung
von Laserablation direkt aus Protein-Spots gesampelt. Das Probenmaterial
wird durch die fokussierte Laserstrahlung verdampft oder vernebelt
und mit Argon in die induktiv gekoppelte Plasmaionenquelle eines
induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometers (ICP-MS) transportiert.
Die resultierenden Ionen werden durch eine Grenzfläche in das
Hochvakuum des Massenspektrometers geleitet und werden dort entsprechend
ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses
getrennt und dann detektiert (wie z.B. Becker, J.S. et al.: "Determination of
phosphorus and metals in human brain proteins after isolation by
gel electrophoresis by laser ablation inductively coupled plasma
source mass spectrometry" in
Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2004, 19(1), 149–152).
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Seit
einiger Zeit sind Vierpol-Massenspektrometer in der ICP-MS verwendet
worden, doch der Einsatz von Magnetsektor-Massenspektrometern ist wegen ihrer
höheren
Auflösung üblicher
geworden.
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Gegenwärtige Hauptprobleme
bei der direkten Elementanalyse aus komplexen Materialien wie etwa
Elementproteomik oder Metallomik (ähnlich zu Proteomik, beschäftigt sich
aber mit Metallkonzentrationen und insbesondere mit ihrer Bindung
an Proteine und andere Moleküle)
sind Interferenzen von Hintergrundelementen wie etwa Phosphor in
biologischen Materialien sowie eine unzureichende Separation von
Element- und Isotopmassen
und unzureichende Auflösung
für eine
Identifikation spezifischer Elemente.
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Vierpol-Massenspektrometer
weisen Auflösungen
auf, die für
die meisten Routineanwendungen ausreichen, aber nicht zur Analyse
spezifischer Elemente ausreichen. Magnetsektor-Massenspektrometer,
die in der ICP-MS üblicher
geworden sind, können
eine höhere
Massenauflösung
liefern, wodurch der Benutzer überlappende
molekulare oder isobare Interferenzen von den relevanten elementaren
Isotopen trennen kann. Abgesehen von der Tatsache, daß Magnetsektor-Massenspektrometer
sehr teuer sind, reicht jedoch ihre Massenauflösung immer noch nicht für viele
Anwendungen aus, die eine Auflösung
einzelner Isotope erfordern, insbesondere wenn die Massen von Isotopen
von verschiedenen Elementen zusammenfallen.
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Exakte
Elementquantifizierungen sind deshalb oftmals bei vorliegenden Analysen
stark beeinträchtigt,
in den meisten Fällen
durch eine Überlappung
von Metallionen aus dem biologischen oder chemischen Hintergrund.
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Die
Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometrie
(FT-ICR-MS) hat wegen ihrer Fähigkeit,
Massenmessungen mit einer Kombination aus Auflösung und Genauigkeit vorzunehmen,
die höher
ist als jedes andere Massenspektrometer erhebliche Aufmerksamkeit
auf sich gezogen. Im gegenwärtigen
Zustand der technologischen Entwicklung und Anwendung haben sich FT-ICR-MS-Instrumente
auf dem Gebiet der Bioanalyse, Proteomik und Analyse anderer komplexer
Mischungen völlig
auf Anwendungen bei der biomolekularen Analyse unter Verwendung
entsprechender spezifischer Ionisationsprozeduren wie etwa Elektrospray-Ionisation
(ESI) und matrixunterstützte
Laserdesorptionsionisation (MALDI) konzentriert. Bei MALDI wird
ein Laser verwendet, um Probenmoleküle aus einer festen oder flüssigen Matrix
zu desorbieren, die eine stark UV-absorbierende Substanz enthält. Bei
ESI werden aus einer Kapillare in einem elektrischen Feld dispergierte
stark geladene Tröpfchen
verdampft, und entstandene Ionen werden in das Massenspektrometer
gesaugt. Der Vorteil von ESI und MALDI ist ihre Fähigkeit,
große
Biomoleküle wie
etwa Peptide und Proteine zu ionisieren, wodurch sich ESI- und MALDI-FT-ICR-MS
besonders für
die fortgeschrittene biomedizinische Analyse eignen.
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Ein
Beispiel eines Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometers (FT-ICR-MS)
ist in dem US-Patent Nr. 6,822,223 (Davis) mit dem Titel "Method, system and
device for performing quantitative analysis using a FMTS" gezeigt, dessen
Offenbarung durch Bezugnahme hier aufgenommen ist. Das bekannte
FT-ICR-MS umfaßt
eine Zelle für
eingefangene Ionen, die innerhalb einer evakuierten Kammer enthalten
ist und von einem homogenen statischen Magnetfeld durchdrungen wird.
Die zu analysierende Probe wird in die Vakuumkammer und die Zelle
für eingefangene
Ionen zwischen den Magnetpolen und somit über das Magnetfeld gegeben.
Innerhalb der Zelle für
eingefangene Ionen können
die entnommenen Moleküle
von einem gesteuerten Elektronenstrahl, der durch die Zelle für eingefangene
Ionen hindurchläuft,
oder durch andere entsprechende Ionisationstechniken automatisch
in geladene Ionen konvertiert werden. Das US-Patent Nr. 6,822,223
erwähnt
eine Photonenquelle, chemischen Ionisierer, negativen Ionisierer,
Elektronenionisation (EI), Elektrospray-Ionisation (ESI), MALDI, APCI
(atmospheric pressure chemical ionization – chemische Ionisierung unter
atmosphärischem Druck),
FAB (fast atom bombardment – Bombardierung
mit schnellen Atomen) und ICP. Alternativ können die Probenmoleküle außerhalb
der Vakuumkammer durch eine beliebige von vielen verschiedenen Techniken
hergestellt und entlang der Magnetfeldachse in die Kammer und die
Zelle für
eingefangene Ionen injiziert werden.
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, das Bestimmen und Quantifizieren
spezifischer Spurenelemente in Proben von komplexen Materialien mit
hoher Auflösung
zu gestatten.
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KURZE DARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der Erfindung
wird diese Aufgabe durch das in Anspruch 1 definierte Laserablations-Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer,
das in Anspruch 2 definierte System bzw. das Verfahren nach Anspruch
5 gelöst.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
des Systems und Verfahrens gemäß der Erfindung
sind in den übrigen
Ansprüchen
spezifiziert.
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Die
Erfindung stellt somit ein Laserablations-Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer
(LA-FT-ICR-MS) zur
Spurenelementanalyse bereit, wobei das Spektrometer einen Massenbereich
von mindestens 2 bis 300 amu und eine Massenauflösung von mindestens 8000 für 300 amu
aufweist.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein System zum Bestimmen und Quantifizieren
spezifischer Spurenelemente in Proben von komplexen Materialien
bereit, wobei das System eine an ein Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (FT-ICR-MS)
gekoppelte Laserablations-(LA)-Vorrichtung mit einem Massenbereich
von mindestens 2 bis 300 amu und eine Massenauflösung von mindestens 8000 für 300 amu
umfaßt.
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Schließlich stellt
die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen und Quantifizieren von
spezifischen Spurenelementen in Proben von komplexem Materialien
bereit, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Sampeln des Materials mit
Hilfe von Laserablation (LA) und Einleiten der Proben in ein Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer
(FT-ICR-MS) mit einem Massenbereich von mindestens 2 bis 300 amu
und einer Massenauflösung
von mindestens 8000 für
300 amu.
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Die
Anwendung der hochauflösenden FT-ICR-Massenspektrometrie
gestattet vorteilhafterweise die Auflösung einzelner Isotope und
liefert signifikante Vorteile, was die uneingeschränkte Bestimmung
spezifischer Elemente von biologischem, geologischem und anderem
Material gestattet; dies gilt insbesondere bei Proben, die mit hoher
Hintergrundkontamination vorliegen.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung umfaßt das
FT-ICR-MS eine in einer evakuierten Kammer enthaltene Zelle für eingefangene
Ionen und ein Magnetsystem zum Liefern und Leiten eines homogenen
statischen Magnetfelds durch die Zelle für eingefangene Ionen, wobei
die Proben von der Laserablationsvorrichtung in die evakuierte Kammer
und die Zelle für
eingefangene Ionen entlang eines Wegs zwischen den Magnetpolen eingebracht
und durch einen durch die Zelle für eingefangene Ionen hindurchtretenden
Elektronenstrahl ionisiert werden. Somit werden Ionenprodukte aus
der Laserablation durch das Magnetfeld des FT-ICR-MS eliminiert,
und die durch die Laserablation produzierten (neutralen) Elementprodukte
werden durch Elektronenionisation (EI) innerhalb des FT-ICR-MS direkt
ionisiert.
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Alternativ
ist die Laserablationsvorrichtung an das FT-ICR-MS über eine
ICP-(inductively coupled plasma)-Ionenquelle gekoppelt, wobei das FT-ICR-MS
eine in einer evakuierten Kammer enthaltene Zelle für eingefangene
Ionen und ein Magnetsystem zum Liefern und Leiten eines homogenen statischen
Magnetfelds durch die Zelle für
eingefangene Ionen umfaßt,
wobei die von der ICP-Ionenquelle kommenden Proben entlang der Magnetfeldachse
in die Kammer und die Zelle für
eingefangene Ionen injiziert werden.
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KURZE
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegende
Zeichnung eingehender beschrieben. Es zeigen:
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1 ein
Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels
eines LA-FT-ICR-MS;
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2 ein
vereinfachtes Diagramm eines Ausführungsbeispiels einer Zelle
für eingefangene Innen
eines FT-ICR-MS und
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3 ein
Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels
eines LA-ICP-FT-ICR-MS.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
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1 zeigt
in einem schematischen Blockdiagramm ein Ausführungsbeispiel eines LA-FT-ICR-MS,
das eine Laserablations(LA)-Vorrichtung 1 zeigt, die über ein
Dreiwegeventil 3 an ein Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer
(FT-ICR-MS) 2 gekoppelt ist. Die LA-Vorrichtung 1 umfaßt eine
Probenkammer 4, die eine Probe 5 aus komplexem
Material wie etwa biologischem Material enthält. Die Probe 5 kann
aus Protein-Spots bestehen, die durch zweidimensionale Gelelektrophorese
von Zellysat separiert worden sind. Die Probenkammer 4 ist
auf einem Probentisch 6 befestigt, der in x- und y-Richtung parallel
verschoben werden kann. Die Probe 5 wird mit Hilfe eines einstellbaren
Lasers 7 und eines Überwachungssystems,
das eine Kamera 8 und einen Monitor 9 umfaßt, genau
eingestellt. Der Laser 7 erzeugt einen gepulsten Laserstrahl 10,
der mit Hilfe eines Optiksystems 11 auf ausgewählte einzelne
der mehreren Protein-Spots fokussiert wird. Der Probentisch 6,
der Laser 7, die Kamera 8, der Monitor 9 und
das Optiksystem 11 werden von einem nicht gezeigten Steuercomputer
gesteuert. In Folge des Auftreffens des Laserstrahls 10 wird
Material von der Oberfläche
der Probe 5 abgetragen und breitet sich in die Probenkammer 4 aus.
Das abgetragene Material wird von der Oberfläche der Probe 5 abgetragen
und von einem Strom aus inertem Trägergas 12 wie etwa
einem Argon- oder Stickstoffstrom transferiert. Eine Spritzenpumpe 12,
die an das Dreiwegeventil 3 angeschlossen ist und von einem
Schrittmotor 13 betätigt wird,
zieht das abgetragene Material zusammen mit einem Trägergas 14 wie
etwa Argon oder Stickstoff aus der Probenkammer 4 ab und
transferiert sie zu dem FT-ICR-MS 2 zur Detektion von Spurenelementen
wie etwa Phosphor, Schwefel, Selen, Silizium oder Metallen in der
abgetragenen Probe.
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Das
FT-ICR-MS 2 umfaßt
eine Vakuumkammer 15, die von einer entsprechenden Pumpeinrichtung 16 wie
etwa einer Ionenpumpe evakuiert wird. Die Vakuumkammer 15 enthält eine
Zelle 17 für
eingefangene Ionen, deren Funktion später beschrieben wird. Die Vakuumkammer 15 befindet
sich innerhalb eines Permanentmagneten 18, der ein homogenes statisches
Magnetfeld 19 über
der Abmessung der Zelle 17 für eingefangene Ionen auferlegt.
Die zu analysierende Probe wird in die Vakuumkammer 15 und
die Zelle 17 für
eingefangene Ionen entlang eines Wegs zwischen den Magnetpolen 18a, 18b durch
ein Gasphasenprobeneinleitungssystem 20 eingebracht, wodurch
das Probenvolumen von einem Benutzer oder automatisch eingestellt
werden kann. Die gesampelten Moleküle werden innerhalb der Zelle 17 für eingefangene
Ionen automatisch von einem gesteuerten Elektronenstrahl 21 in
geladene Ionen konvertiert, der in einer Richtung parallel zu der Magnetfeldachse
durch die Zelle 17 für
eingefangene Ionen hindurchtritt.
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Das
FT-ICR-MS 2 ist bevorzugt ein SIEMENS QUANTRA-MS mit einem
1-T-Permanentmagneten, der eine hohe Massenauflösung von Isotopen über den
ganzen Bereich der Elementanalyse liefert. Der Massenbereich erstreckt
sich mindestens von 2 bis 300 amu mit einer Massenauflösung von mindestens
8000, bevorzugt 10000, für
300 amu (die Massenauflösung
ist bei 2 amu von Natur aus höher und
etwa 400000) wodurch Interferenzen vermieden werden, wenn zwei Elemente
oder Isotopen eine sehr ähnliche
Masse aufweisen.
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2 ist
ein vereinfachtes Diagramm eines Ausführungsbeispiels der Zelle 17 für eingefangene Ionen,
deren Funktion nachfolgend beschrieben wird.
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Wenn
ein Gasphasenion bei niedrigem Druck einem gleichförmigen statischen
Magnetfeld ausgesetzt wird, kann das resultierende Verhalten des
Ions durch die Größe und Orientierung
der Ionengeschwindigkeit bezüglich
des Magnetfelds bestimmt werden. Wenn eine Komponente der Ionengeschwindigkeit
senkrecht zu dem angelegten Feld vorliegt, erfährt das Ion eine Kraft, die
senkrecht sowohl zu der Geschwindigkeitskomponente als auch dem
angelegten Feld verläuft.
Diese Kraft führt
zu einer kreisförmigen
Ionenbahn, die als Ionenzyklotronbewegung bezeichnet wird. Bei Abwesenheit
irgendwelcher anderer Kräfte
auf das Ion ist die Winkelfrequenz dieser Bewegung eine einfache
Funktion der Ionenladung, der Ionenmasse und der Stärke des Magnetfelds.
Die Funktion ist gegeben durch ω = qB/m,
wobei ω die
Winkelfrequenz, q die Ionenladung, B die Stärke des Magnetfelds und m die
Ionenmasse darstellt. Das FT-ICR-MS
kann diese fundamentale Beziehung ausnutzen, um die Masse von Ionen
zu bestimmen, indem eine Zyklotronbewegung mit großer Amplitude
induziert und dann die Frequenz der Bewegung bestimmt wird.
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Die
zu analysierenden Ionen 22 werden erst mit minimaler senkrechter
(radialer) Geschwindigkeit und Dispersion in das Magnetfeld 19 eingeleitet.
Die durch das Magnetfeld 19 induzierte Zyklotronbewegung
kann eine radiale Einschränkung
der Ionen 22 bewirken; eine Ionenbewegung parallel zur
Achse des Felds 19 wird jedoch in der Regel durch ein Paar einfangende
Elektroden 23a, 23b beschränkt. Diese einfangenden Elektroden 23a, 23b bestehen
in der Regel aus einem Paar paralleler Platten, die senkrecht zu
der Magnetachse orientiert und an gegenüberliegenden Enden der axialen
Abmessung der anfänglichen
Ionenpopulation angeordnet sind. Diese einfangenden Elektroden 23a, 23b werden
auf einem Potential gehalten, das das gleiche Vorzeichen wie die
Ladung der Ionen 22 aufweist und von ausreichender Größe ist,
um eine axiale Beschränkung
der Ionen 22 zwischen dem Elektrodenpaar zu bewirken.
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Die
eingefangenen Ionen 22 werden dann einem elektrischen Feld
ausgesetzt, das senkrecht zu dem Magnetfeld 19 verläuft und
mit der Zyklotronfrequenz der zu analysierenden Ionen 22 schwingt.
Dieses elektrische Feld wird in der Regel erzeugt durch Anlegen
entsprechender Differentialpotentiale an ein zweites Paar von Parallelplatten-Erregungselektroden 24a, 24b,
die parallel zu der Magnetachse orientiert und an gegenüberliegenden
Seiten der radialen Abmessung der anfänglichen Ionenpopulation angeordnet
sind.
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Wenn
Ionen 22 von mehr als einer Molekülmasse analysiert werden sollen,
wird die Frequenz des schwingenden elektrischen Felds über einen
entsprechenden Frequenzbereich geführt oder kann aus einer entsprechenden
Mischung individueller Frequenzkomponenten bestehen. Wenn die Frequenz des
schwingenden Felds der Zyklotronfrequenz für eine gegebene Ionenmasse
entspricht, erfahren alle der Ionen 22 dieser Masse eine
Resonanzbeschleunigung durch das elektrische Feld, und der Radius
ihrer Zyklotronbewegung nimmt zu.
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Während dieser
Resonanzbeschleunigung ist die anfängliche radiale Dispersion
der Ionen im wesentlichen unverändert.
Die erregten Ionen 22 bleiben im allgemeinen auf dem Umfang
des neuen Zyklotronorbit zusammen gruppiert, und in dem Ausmaß, daß die Dispersion
relativ zu dem neuen Zyklotronradius klein ist, wird ihre Bewegung
zueinander in Phase oder kohärent
sein. Wenn die anfängliche
Ionenpopulation aus Ionen 22 von mehr als einer Molekülmasse besteht,
kann der Beschleunigungsprozeß zu
Ionenbündeln
mehrerer Massen führen,
die jeweils von einer Masse sind und sich mit ihrer jeweiligen Zyklotronfrequenz
im Umlauf befinden.
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Die
Beschleunigung wird fortgesetzt, bis der Radius des Zyklotronorbits
die Ionen 22 nahe genug an eine oder mehrere Detektionselektroden 25a, 25b bringt,
damit es zu einer Induktion detektierbarer Bildströme an den
Elektroden kommt. Diese Detektionselektroden 25a, 25b bestehen
in der Regel aus einem dritten Paar von Parallelplattenelektroden,
die auf gegenüberliegenden
Seiten der radialen Abmessung der anfänglichen Ionenpopulation angeordnet und
senkrecht sowohl zu den Erregungselektroden 24a, 24b als
auch den Einfangelektroden 23a, 23b angeordnet
sind. Somit können
die drei Paare von Parallelplattenelektroden, die für das Ioneneinfangen,
die Erregung und die Detektion verwendet werden, zueinander senkrecht
stehen, und zusammen können
sie eine geschlossene kastenartige Struktur bilden, die als die
Zelle 17 für
eingefangene Ionen bezeichnet wird. Andere Zellendesigns sind möglich, einschließlich beispielsweise
zylindrische Zellen.
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Die
in den Detektionselektroden 25a, 25b induzierten
Bildströme
werden verstärkt
(Verstärker 26)
und digitalisiert (Analog-Digital-Umsetzer 27).
Da die Bildströme
Frequenzkomponenten von allen Masse-Ladungs-Verhältnissen der Ionen enthalten, werden diese
Frequenzen durch eine Fourier-Transformation (FFT-Einheit 28)
extrahiert, die das Zeitbereichssignal (Bildströme) in ein Frequenzbereichssignal
(das Massenspektrum) konvertiert.
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3 ist
ein Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels
eines LA-ICP-FT-ICR-MS. Im Gegensatz zu der in 1 gezeigten
Ausführungsform
sind die Laserablationsvorrichtung 1 und das nachgeschaltete
Ventil 3 und Spritzenpumpe 13 über eine ICP-(inductively coupled
plasma)-Ionenquelle (Brenner) 29 an das FT-ICR-MS 2 gekoppelt.
Hier wird die Probenwolke in atomare Spezies dissoziiert, und die Atome
werden ionisiert. Die von dem ICP-Brenner 29 kommenden
ionisierten Proben werden in die Kammer 15 und die Zelle 17 für eingefangene
Ionen des FT-ICR-MS 2 entlang der Magnetfeldachse injiziert, so
daß die
ionisierten Proben von dem Magnetfeld 19 nicht beeinflußt werden.
Dazu ist der externe ICP-Brenner 29 mit einer vierpoligen
Fokussiereinheit und einer Skimmer-Apertur-Ionenoptik 30 am oberen
Einlaßsystem
des FT-ICR-MS 2 im Austausch für den EI-Faden des in 1 gezeigten
MS-Instruments angebracht.
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Das
Massenspektrometer, das System und das Verfahren gemäß der Erfindung
eigenen sich insbesondere, aber nicht nur, für:
Bestimmung und Quantifizierung
von Phosphor, Schwefel, Selen und anderen relevanten Elementen in
posttranslational modifizierten Proteinen und Proteinkomplexen;
spezifische
Quantifizierungen von Phosphor, Schwefel und anderen organischen
Elementen in Proteinen;
direkte massenspektrometrische Bestimmung
und Quantifizierung von Metallionen in biologischen Proben;
quantitative
Elementbestimmungen in pathophysiologischen Proteinformen (z.B.
in angesammeltem Plaque-Material bei Alzheimer-Krankheit);
Identifikation
und Quantifizierung von Metallionen in Nukleinsäuren (DNA; RNA) in Zellmaterial;
Elementbestimmungen
wie oben beschrieben in Umwelt- und geologischen Proben;
topologische
Bestimmung von Elementen ("Element-Bildgebung") in biologischen
und Umweltstrukturen wie etwa Zellverteilungen und
Elementbestimmungen
in topologischen Verteilungen von Umwelt- und geologischen Mikrostrukturen.