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Die
Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von Analyt-Ionen aus festen
Proben auf Oberflächen durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI).
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Die
Erfindung verwendet Laserlichtpulse von deutlich unter einer Nanosekunde
Dauer mit Spotdurchmessern unter zwanzig Mikrometern und vorzugsweise
so geringer Energiedichte, dass nur Mengen von etwa einem Picogramm
pro Laserlichtpuls und Laserspot desorbiert werden. Entgegen Angaben
in der Literatur liefert diese Kombination von Desorptionsparametern
bei Verwendung bestimmter Matrixsubstanzen einen unerwartet hohen
Ionisierungsgrad für die Analytmoleküle der Probe,
allerdings auch nur eine geringe Anzahl von Analytionen pro Laserspot.
Für die Verwendung in üblichen MALDI-Flugzeitmassenspektrometern
ist es daher günstig, in einem Laserlichtpuls viele Laserspots
nebeneinander zu erzeugen. Für andere Arten von Massenspektrometern
kann eine hohe Wiederholfrequenz der Laserlichtpulse von etwa 50
Kilohertz, die mit preiswerten Festkörperlasern hergestellt
werden kann, mit einzelnen Spots einen konstanten Ionenstrom mit
günstiger Ionenstromstärke liefern. Die Spots
werden durch Bewegung der Probe oder durch Führung des
Laserlichtstrahls so über die Probe geführt, das
jedes Mal abgekühlte Stellen der Probe getroffen werden.
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Stand der Technik
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Eine
bedeutende Ionisierungsart für Biomoleküle ist
die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI), die besonders durch M. Karas und K. Hillenkamp vor etwa
zwanzig Jahren entwickelt wurde und für deren Grundlagen
Koichi Tanaka im Jahre 2002 den Nobelpreis erhielt. MALDI ionisiert
die Biomoleküle, die sich in hoher Verdünnung
in einer Mischung mit Molekülen einer Matrixsubstanz in
Proben auf Probenträgern befinden, durch den Beschuss mit
Laserlichtpulsen. Das Verhältnis von Analytmolekülen
zu Matrixmolekülen beträgt höchstens etwa
eins zu zehntausend, wobei aber die Analytsubstanzen ein Gemisch
bilden können, in dem zwischen den verschiedenen zu messenden
Analytsubstanzen Konzentrationsverhältnisse herrschen können,
die einige Größenordnungen überdecken.
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MALDI
steht in Konkurrenz zur Ionisierung durch Elektrosprühen
(ESI), das in einer Flüssigkeit gelöste Analytmoleküle
ionisiert und daher leicht mit Separationsverfahren wie Flüssigkeitschromatographie
oder Kapillarelektrophorese gekoppelt werden kann. MALDI besitzt
jedoch viele Vorteile. Auf einem Probenträger können
Hunderte von Proben aufgebracht werden. Dafür stehen Pipettierroboter
zur Verfügung. Der Transport einer benachbarten Probe mit dem
Probenträger in den Fokus eines UV-Pulslasers dauert nur
Bruchteile von Sekunden, für die Analyse dieser Probe steht
dann so viel Zeit wie immer nötig zur Verfügung,
nur begrenzt durch einen vollständigen Verbrauch der Probe.
Das unterscheidet MALDI sehr vorteilhaft von der Elektrosprüh-Ionisierung,
die nur einen sehr langsamen Probenwechsel bietet, und, bei Kopplung
mit der Chromatographie, eine Beschränkung der Analysenzeit
auf die Dauer des chromatographischen Peaks erzwingt. MALDI ist
beispielsweise ideal für die Identifizierung von tryptisch verdauten
Proteinen, die durch 2D-Gelelektrophorese getrennt wurden, und deren
getrennte Fraktionen zu getrennten MALDI-Proben verarbeitet wurden. Auch
die MALDI-Untersuchung von Peptiden, die durch Flüssigkeitschromatographie
getrennt und auf MALDI-Probenträger aufgebracht wurden,
ist im Vormarsch („HPLC-MALDI"). Besonders interessant
ist die Verwendung von MALDI in der bildgebenden Massenspektrometrie
von histologischen Dünnschnitten, mit der die örtliche
Verteilung einzelner Proteine, aber auch einzelner Pharmaka oder
ihrer Metabolite gemessen werden kann.
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Für
MALDI werden üblicherweise UV-Laser verwendet, die Laserlichtpulse
von einigen Nanosekunden Länge liefern und deren Lichtstrahlen
durch Linsen auf einen Fokusfleck von etwa 100 bis 200 Mikrometer
Durchmesser abgebildet werden. Da der „Fokusfleck" auf
der Probe durch absichtliche Einstellung nicht dem wahren Fokusdurchmesser
des Laserlichtstrahls entspricht, spricht man hier besser von „Spot” und „Spotdurchmesser".
Die Ionen jedes einzelnen Laserlichtpulses werden in besonders dazu
konstruierten MALDI-Flugzeitmassenspektrometern axial in eine Flugzeitstrecke
hinein beschleunigt und nach Durchlaufen der Flugstrecke einem Detektor
zugeführt, der die massenabhängige Ankunftszeit
der Ionen und ihre Menge misst und die digitalisierten Messwerte
als Flugzeitspektrum speichert. Dabei werden Wiederholfrequenzen
der Laserlichtpulse bis zu etwa 2 Kilohertz verwendet. Die Messwerte
von einigen Hundert so aufeinander folgend gemessener Flugzeitspektren
der Ionen aus den einzelnen Laserlichtpulsen werden zu einem Summenspektrum
addiert, dieses wird einer Peak-Erkennung unterworfen, und die Liste
mit den Flugzeit-Peaks wird über eine Kalibrierkurve in
eine Liste der Massen und ihrer Intensitäten umgewandelt.
Diese Liste wird als „Massenspektrum" verstanden.
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Es
ist ein Nachteil dieses üblichen MALDI-Verfahrens, nur
etwa ein Zehntausendstel der Analytmoleküle zu ionisieren.
Aus einem Attomol einer Analytsubstanz, also aus etwa 600 000 Molekülen,
werden somit nur etwa 60 Analyt-Ionen gewonnen. Der Rest wird nicht
ionisiert, wobei ein unbekannt großer Teil der restlichen
Moleküle in abgesprengten Brocken oder in geschmolzenen
Spritzern der Matrixsubstanz enthalten sein mag und sich einer Ionisierung
völlig entzieht, während andererseits ein ebenfalls
unbekannt großer Teil der Analytmoleküle im Prozess
der Laserdesorption einfach nicht ionisiert wird.
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Die
matrixunterstützte Laserdesorption wird bisher überwiegend
im Hochvakuum mit direktem axialen Einschuss der Ionen in die Flugstrecke
eines besonders dazu konstruierten MALDI-Flugzeitmassenspektrometers
vorgenommen. Sie geht (mit wenigen Ausnahmen) von festen Probenpräparationen auf
einem Probenträger aus. Die Proben bestehen im Wesentlichen
aus kleinen Kriställchen der Matrixsubstanz, der in geringen
Anteilen (maximal nur etwa ein hundertstel Prozent) Moleküle
der Analytsubstanzen beigemischt sind, wobei die „Analytsubstanzen" selbst
wiederum aus einer Mischung verschiedenartiger Analytsubstanzen
beste hen können. Die Analytmoleküle sind einzeln
in das Kristallgitter der Matrixkristalle eingebaut oder befinden
sich in Kristallgrenzflächen. Die so präparierten
Proben werden mit kurzen Pulsen von UV-Laserlicht bestrahlt. Die
Dauer der Pulse beträgt üblicherweise etwa drei
bis zehn Nanosekunden. Dabei entstehen Verdampfungswolken, die sowohl
Ionen der Matrixsubstanz wie auch einige Analyt-Ionen enthalten.
Die Analyt-Ionen sind zum Teil bereits in der festen Probe ionisiert
enthalten, entstehen zu einem weiteren Teil direkt bei dem explosionsartigen
Verdampfungsprozess im heißen Plasma, und werden zu einem
dritten Teil in der sich ausdehnenden Wolke in Reaktionen mit den
Matrixsubstanz-Ionen durch Protonenübertragung gebildet.
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In
dem sehr detailreichen Review-Artikel „The Desorption
Process in MALDI" von Klaus Dreisewerd (Chem. Rev. 2003, 103, 395–425) sind
die Einflüsse vieler Parameter wie Spotdurchmesser, Laserlichtpulsdauer
oder Energiedichte auf die Desorption und die Entstehung der Matrix-Ionen
und der Analyt-Ionen referiert. Obwohl die Einflüsse vieler dieser
Parameter nicht voneinander unabhängig sind, sind kaum
jemals sorgfältig alle Parameter gegeneinander variiert
worden. So wurde beispielsweise berichtet, dass die Laserlichtpulslänge
zwischen 0,55 und 3,0 Nanosekunden keinen Einfluss auf die Ionenbildung
habe, dabei wurde aber nicht der Spotdurchmesser variiert oder auch
nur angegeben. Für variierende Spotdurchmesser wurde dagegen
die Schwelle der Energiedichte für das erste Auftreten von
Ionen untersucht, ohne aber das Profil der Energiedichte im Laserspot
zu untersuchen, das nach unseren eigenen Untersuchungen von außerordentlich hoher
Bedeutung ist. Diese Schwelle soll übrigens nach dieser
Literaturstelle für kleiner werdende Spotdurchmesser sehr
stark ansteigen: für Spotdurchmesser von etwa 10 Mikrometer
soll man etwa die zehnfache Energiedichte (Fluenz) wie für
Spotdurchmesser von 200 Mikrometern brauchen. Wir können das
nicht bestätigen. Über den gegenseitigen Einfluss
von Spotdurchmesser und Laserpulslänge ist in der Literatur
anscheinend nichts bekannt.
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Die
bisherigen Untersuchungen des MALDI-Prozesses waren aber durch Präparationsverfahren
für die Proben beeinträchtigt, die nicht reproduzierbar
waren. Es wurden im Allgemeinen einfach Tröpfchen auf die
Probenträgerplatte aufgetragen und eingetrocknet. Diese
Proben waren extrem inhomogen, man musste regelmäßig
auf der Probe nach Stellen („hot spots") suchen, die Analytmoleküle
enthielten, um so eine Analyse dieser Substanzen vornehmen zu können.
An ein quantitatives Arbeiten war nicht zu denken. Die meisten Untersuchungen
des MALDI-Prozesses wurden mit diesen Proben vorgenommen, was viele
Ungereimtheiten dieser Untersuchungen erklären mag.
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Inzwischen
gibt es für einige nicht wasserlösliche Matrixsubstanzen
Verfahren, beispielsweise für α–Cyano-4-Hydroxyzimtsäure
(CHCA), sehr reproduzierbar Dünnschichten herzustellen,
die aus nur einer einzigen Schicht von dicht an dicht liegenden Kristallen
mit nur etwa einem Mikrometer Durchmesser bestehen. Auf diese Dünnschicht
von Matrixkristallen wird dann eine überwiegend wässerige
Lösung von Analytmolekülen aufgebracht, wobei
die Matrixkristalle die Analytmoleküle oberflächlich
binden, ohne sich dabei aufzulösen. Das überschüssige
Lösungsmittel kann dann nach einer halben oder ganzen Minute
wieder abgesaugt werden, wodurch viele Verunreinigungen, wie beispielsweise
Salze, entfernt werden. Es wird aber auch ein großer Anteil
der Analytmoleküle entfernt, was bei quantitativen Untersuchungen
zu berücksichtigen ist. Die oberflächlich adsorbierten
Analytmoleküle können nachträglich auch in
die Matrixkriställchen eingelagert werden, indem nach dem
Trocknen ein organisches Lösungsmittel aufgebracht wird,
das die Matrixkriställchen anlöst. Nach dem Verdampfen
dieses Lösungsmittels hat man eine sehr homogene Probe,
die an jeder Stelle die gleichen Ionenströme mit den gleichen
analytischen Ergebnissen liefert. Inzwischen werden mit Dünnschichten
von CHCA vorpräparierte Probenträgerplatten kommerziell
hergestellt. Für die MALDI-Prozesse, die an diesen Dünnschichtproben
ablaufen, wurden noch keine ausreichenden Untersuchungen veröffentlicht.
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Die
früher nur im Hochvakuum verwendete Laserdesorption wird
seit einigen Jahren auch an Atmosphärendruck benutzt, was
die Probenzuführung einfacher macht, aber bisher nicht
die Nachweisstärke erhöht hat. Dieses Verfahren
wird mit der Abkürzung AP-MALDI bezeichnet (atmospheric
Pressure MALDI).
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Mit
der Einführung von Festkörper-Lasern in die MALDI-Technik
statt der bisher verwendeten Stickstoff-Laser musste man feststellen,
dass das homogenere Strahlprofil dieser Festkörperlaser
die Ionenausbeute verringerte. Es wurde daher ein Verfahren zur
inhomogenen Profilierung entwickelt, die die Ionenausbeute sogar
noch über die Ionenausbeute der Stickstoff-Laser hinaus
erhöhte, Diese Technik ist in der Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196
A1 (A. Haase et al.) beschrieben (Patent Application
GB 2 421 352 A ,
US patent 7,235,781 C1 ).
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Für
andere Arten von Massenspektrometern, beispielsweise für
Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonaler Einführung
der Ionen („OTOF"), ist es günstiger, statt der
gepulsten Ionenerzeugung einen kontinuierlichen Ionenstrahl zu verwenden.
In der Patentpublikation
WO
99/38 185 A2 (A. N. Krutchinski et al.) wurde bereits über
ein Verfahren berichtet, bei dem die Ionenwolken aus üblichen
MALDI-Prozessen in Hochfrequenz-Ionenleitsystemen auseinander gezogen
und in dieser Weise zu zumindest zeitweilig konstanten Ionenströmen
umgewandelt wurden, um solche Massenspektrometer bedienen zu können, die
eines konstanten Ionenstroms bedürfen.
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Wenn
hier von „Masse der Ionen" oder auch nur einfach von „Masse” in
Verbindung mit Ionen die Rede ist, so ist stets die „ladungsbezogene
Masse" m/z gemeint, also die physikalische Masse m der Ionen geteilt
durch die dimensionslose und absolut genommene Anzahl z der positiven
oder negativen Elementarladungen, die dieses Ion trägt.
Die ladungsbezogene Masse m/z wird auch oft etwas unschön
als „Masse-zu-Ladungs-Verhältnis" bezeichnet.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die vordringliche Aufgabe der Erfindung, den Ionisierungsgrad
für Analytmoleküle im MALDI-Prozess zu erhöhen.
Dabei sollen die Ionen in einer Menge erzeugt werden, die für
eine Spektrenaufnahme in dem dabei verwendeten Massenspektrometer
möglichst optimal ist. Es ist eine weitere Aufgabe der
Erfindung, für bestimmte Arten von Massenspektrometern
die Ionen in Form eines kontinuierlichen Ionenstrahles an Analytionen
zur Verfügung zu stellen, obwohl sie an sich in diskontinuierlichen
Desorptionsprozessen hergestellt werden.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung beruht auf einer Kombination von solchen Parameterwerten
des Desorptionsprozesses, die in der Literatur weder einzeln noch
in Kombination als besonders günstig für den MALDI-Vorgang
angesehen werden, aber einen bisher nicht gekannt hohen Ionisierungsgrad
ergeben.
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Durch
Verdampfung von Probenmaterial aus sehr kleinen Spotarealen der
Probe von weniger als zwanzig Mikrometer Durchmesser, vorzugsweise weniger
als zehn Mikrometer Durchmesser, und durch gleichzeitig angewandte
sehr kurze Laserlichtpulsdauern von weniger als einer Nanosekunde,
vorzugsweise weniger als 500 Picosekunden, werden zwar in jedem
Laserspot nur relativ wenige Analyt-Ionen erzeugt, insgesamt steigt
aber der Ionisierungsgrad für die Analytmoleküle
bei Verwendung bestimmter Matrixmaterialien auf Werte zwischen einem
Zehntel und einem Prozent an. Das ist mehr als das zehnfache des
bisher erreichten Ionisierungsgrades. Daraus ergibt sich eine zehn-
bis zwanzigfach erhöhte, bisher für MALDI nicht
bekannte Nachweisempfindlichkeit für die Analytmoleküle.
Vorteilhaft ist die Einstellung einer so geringen Energiedichte,
dass in jedem Laserlichtpuls nur etwa ein Picogramm oder weniger
Probenmaterial verdampft wird.
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Für
einen Einsatz in üblichen MALDI-Flugzeitmassenspektrometem
ist es günstig, dabei aus jedem Laserlichtpuls mehrere,
beispielsweise 10 bis 20 Laserspots nebeneinander auf der Probe
zu erzeugen, um in jedem Laserlichtpuls genügend Ionen für
eine optimale Ausnutzung des Flugzeitspektrometers und seiner Messeinrichtung
für Ionen bereitzustellen. Einrichtungen zur Erzeugung
mehrerer Laserspots aus einem Laserlichtstrahl sind in der oben bereits
zitierten Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196 A1 (A. Haase et al.) beschrieben.
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Für
andere Arten von Massenspektrometer, die besser mit einem konstant-kontinuierlichem
Ionenstrahl arbeiten, beispielsweise für Flugzeitmassenspektrometern
mit orthogonaler Einführung der Ionen, kann durch eine
außerordentlich hohe Wiederholrate der UV-Laserlichtpulse
von über 20 Kilohertz, vorzugsweise höher als
50 Kilohertz, ein solch konstanter Ionenstrahl erreicht werden.
Die schnell nacheinander erzeugten Desorptionswolken laufen im umgebenden
Vakuum ineinander und bilden den kontinuierlichen Ionenstrom mit
einer Ionenstromstärke, die für viele Massenspektrometer
bereits bei nur einem Laserspot pro Laserlichtpuls optimal ist.
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Wird
nur jeweils ein Laserspot pro Laserlichtpuls erzeugt, so beträgt
die auf die Probe in jedem Laserlichtpuls übertragene Energie
nur Bruchteile eines Mikrojoule; es kann dann ein Laser mit an sich recht
kleiner Gesamtleistung und daher auch kleinen Abmessungen verwendet
werden.
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Bei
so hohen Wiederholraten für die Laserschüsse entsteht
eine praktisch kontinuierliche Ionenquelle, auch wenn sich dabei
einzelne Plasmawolken ausbilden. In einer Ausführungsform
kann sich jede Plasmawolke auf etwa ein bis zwei Zentimeter Durchmesser
relativ ungestört ausdehnen, bevor die Ionen durch die
Saugwirkung eines Ionentrichters eingefangen werden. Dabei können
die neutralen Gasmoleküle der Verdampfungswolke gut abgepumpt
werden. Es kann aber auch die Desorption direkt in ein Hochfrequenz-Ionenleitsystem
hinein erfolgen. Günstig ist es, die freie Ausdehnung der
Plasmawolken durch zugeführtes Umgebungsgas etwas zu dämpfen.
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Die
Spots sollten von Laserschuss zu Laserschuss über die Probe
wandern, um dem jeweils erzeugten Verdampfungskrater Zeit zum Abkühlen
zu geben. Bei Erzeugung mehrerer Spots parallel ist in der zitierten
Offenlegungsschrift dargelegt, wie eine solche Wanderung erzeugt
werden kann. Bei Verwendung einzelner Spots können bewegte
Spiegel verwendet werden, beispielsweise durch Piezo-Effekte oder
Galvano-Effekte bewegte Spiegel, die auch zusammen mit einer Bewegung
der Probenträgerplatte eingesetzt werden können.
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Beschreibung der Abbildungen
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1 zeigt
ein Schema eines Flugzeitmassenspektrometers mit orthogonalem Ioneneinschuss, das
mit MALDI-Ionen nach dieser Erfindung gespeist wird. Ein UV-Pulslaser
(1) mit 60 Kilohertz Wiederholfrequenz sendet fein fokussierte
Laserlichtpulse (2) über einen beweglichen Spiegel
(3) auf Proben, die sich auf einer beweglich angebrachten
Probenplatte (4) befinden, und erzeugt dabei sich ausdehnende
Plasmawolken (5), die die Analytionen enthalten. Diese
können durch einen Ionentrichter angesaugt und über
Ionenleitsysteme (8) und (10) als feiner Strahl
(12) einem Flugzeitmassenanalysator zugeführt
werden, dessen Pulser (13) Abschnitte des Ionenstrahls über
einen Reflektor (15) zu einem Ionendetektor (16)
beschleunigt, der die massenabhängig nacheinander ankommenden
Ionen in Form eines Zeitprofils misst.
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2 stellt
ein Schema einer geringfügig anders aufgebauten Ionenquelle
dar. Auf der Probenplatte (21) befinden sich Proben (22, 23),
die vom UV-Pulslaser (24) mit schnell aufeinander folgenden Laserlichtpulsen
(25) über einen beweglichen Spiegel (26)
beschossen werden können. Die in den Plasmawolken enthaltenen
Analytionen (27) werden vom Ionentrichter, der aus einzelnen
Lochblenden (28) besteht, in die Ionenleitsysteme (29)
und (31) weitergeleitet.
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Die 3 gibt
ein Flugzeitmassenspektrometer mit axialer Beschleunigung der aus
der Probe (47) auf dem Probenträger (41)
erzeugten Ionen durch die Beschleunigungsblenden (48) in
die Flugstrecke (49) wieder. Der Laserlichtpuls aus dem
Picosekunden-UV-Laser (43) wird in einer Teilerscheibe (44),
beispielsweise aus einem Feld von Einzellinsen bestehend, geteilt; über
Linse (45) und beweglichen Spiegel (46) wird eine
Vielzahl von sehr kleinen Spots von jeweils unter 20 Mikrometer
Durchmesser auf der Probe (47) bestrahlt.
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Bevorzugte Ausführungsformen
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Einigermaßen
präzise Untersuchungen über die Ionenausbeute
des MALDI-Prozesses sind in der Literatur kaum zu finden. Das wird
verständlich, wenn man versteht, wie schwierig solche Untersuchungen durchzuführen
sind: man muss dabei eine sehr genau zubereitete und eingewogene
Probe bis zur völligen Erschöpfung der in der
Regel inhomogenen Probe mit konstant gehaltenen MALDI-Parametern messen,
die oft nicht sehr genau bekannten Ionentransmissionen in den einzelnen
Teilbereichen des verwendeten Massenspektrometers abschätzen,
die Detektorempfindlichkeit kalibrieren und aus den Messergebnissen
die Ionenausbeute berechnen. Das ist für das bisherige
Präparationsverfahren mit getrockneten Tröpfchen
wegen der starken Inhomogenität der Probe kaum zufriedenstellend
möglich.
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Untersucht
man die Ionenausbeute des MALDI-Prozesses pro Analytmolekül
an Dünnschichtpräparationen in Abhängigkeit
von Spotdurchmesser, Laserschuss-Energie und Laserlichtpulslänge
relativ zueinander, was wesentlich einfacher ist, so stellt man überraschend
und entgegen den in der Literatur verbreiteten Angaben fest, dass
die Ausbeute stark ansteigt, wenn man mit sehr kurzen Laserlichtpulsen
von deutlich unter einer Nanosekunde arbeitet und in einem nur sehr
kleinem Probenareal eine winzige Menge an Probenmaterial von unter
einem Picogramm verdampft. Es werden dabei hohe Ausbeuten an Analyt-Ionen
erreicht: es können durchaus etwa zehn- bis hundertfach
mehr Analyt-Ionen aus der Probe gewonnen werden, als mit üblichen
Bedingungen. Es sind allerdings die Absolutzahlen der Analyt-Ionen
pro Laserschuss sehr niedrig; sie betragen für Analytsubstanzen
höchster Konzentrationen in der Probe nur etwa einige Hundert Analyt-Ionen.
In Mischungen vieler Analytsubstanzen in einer Probe, die jedoch
alle analysiert werden sollen, sind für solche Analytsubstanzen,
die sich in wesentlich niedrigerer Konzentrationen als die hauptsächlich
vorhandenen Analytsubstanzen in der Probe befinden, nur in jedem
zehnten oder hundertsten Laserlichtpuls ein Analyt-Ion zu finden.
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Diese
höchst effiziente Art von MALDI ist aber ohne weitere Maßnahmen
nicht optimal für die übliche MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie
mit axialer Beschleunigung der Ionen, da diese für einen
zufrieden stellenden Betrieb möglichst etwa 2000 bis 10 000
Analyt-Ionen pro Laserschuss braucht. Diese MALDI-Flugzeitmasenspektrometrie
nimmt die Ionen eines jeden Laserschusses in einem eigenen Massenspektrum
auf. Da auch noch Komponenten der Analytsubstanzen gemessen werden
sollen, die nur ein Zehntausendstel der Konzentration der Hauptkomponente
haben, müssten bei Anwendung der neuen Technik für
dieses Ziel mit nur einem Spot pro Laserlichtpuls weit über
Zehntausend Massenspektren addiert werden, was eine für
massenspektrometrische Verhältnisse lange Zeit in Anspruch
nimmt, selbst wenn man ein Massenspektrometer mit einer Messfrequenz
für Massenspektren von zwei Kilohertz verwenden kann.
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Es
ist daher eine erste günstige Ausführungsform
eines Massenspektrometers unter Benutzung dieser Erfindung, aus
dem Lichtstrahl eines kurzen UV-Laserlichtpulses von weit unter
einer Nanosekunde Dauer nicht nur einen einzigen kleinen Laserspot,
sondern mehrere Laserspots zu erzeugen, die jeweils Durchmesser
unter zwanzig Mikrometer, vorzugsweise unter zehn Mikrometer, haben,
und die so erzeugte größere Anzahl von Ionen axial
in die Flugstrecke zu beschleunigen. Mit fünf bis zwanzig Laserspots
werden so in jedem Laserlichtpuls einige Tausend Analyt-Ionen erzeugt,
wie sie für die axiale MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie
günstig sind. Die Erzeugung von mehreren Laserspots aus
einem Laserlichtstrahl ist in der oben zitierten Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196
A1 (A. Haase et al.) detailliert dargelegt.
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In 3 ist
ein solches Flugzeitmassenspektrometer schematisch gezeigt. Der
Strahl des Laserlichtpulses aus dem UV-Laser (43) wird
dabei in einer Teilerscheibe (44) vielfach geteilt. Die
Teilerscheibe (44) kann beispielsweise aus einem Feld kleiner
Einzellinsen bestehen, die eine Vielzahl von kleinen Fokuspunkten
erzeugen, die dann wiederum von der Linse (45) und dem
beweglichen Spiegel (46) auf die Probe (47) fokussiert
werden. Dadurch wird erfindungsgemäß eine Vielzahl
kleiner Spots auf der Probe erzeugt. Die Probe (47) befindet
sich auf einer Probenträgerplatte (41), die durch
eine Bewegungseinrichtung (42) bewegt werden kann, um die
verschiedenen Proben auf der Probenträgerplatte in den Lichtstrahl
zu bringen, aber auch, um die Spots zusätzlich zur Führung
durch den beweglichen Spiegel (46) über die Probe
von Laserlichtpuls zu Laserlichtpuls wandern zu lassen. Die Ionen
werden durch die Beschleunigungsblenden (48) zur einem
Ionenstrahl (49) geformt, der über den energiefokussierenden Reflektor
(50) zum Detektor (51) fokussiert wird.
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Für
ein Flugzeitmassenspektrometer dagegen, das mit orthogonalem Ioneneinschuss,
einem konstanten Ionenstrom und einer üblichen Spektrenaufnahmefrequenz
von 5000 bis 10 000 Massenspektren pro Sekunde arbeitet, sind die
Verhältnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens
selbst bei nur einem einzigen Spot pro Laserlichtpuls nahezu ideal, wenn
eine genügend hohe Frequenz der Laserlichtpulse gewählt
wird. Es ist also eine weitere günstige Ausführungsform,
hierfür eine Laserpulsrate von mindestens zwanzig Kilohertz,
vorzugsweise mindestens fünfzig Kilohertz einzusetzen.
Es gibt kommerzielle UV-Laser, die bei etwa 350 Picosekunden Laserlichtpulsdauer
mit etwa 60 Kilohertz arbeiten und wegen der geringen Laserleistung
auch eine sehr kleine Baugröße haben. Es liefert
dann die Ionenquelle bei 60 Kilohertz, also mit sechs bis zwölf Laserschüssen
für ein Massenspektrum, etwa tausend bis fünftausend
Analyt-Ionen für jeweils eine Spektrenaufnahme. Wegen der
hohen Massenauflösung dieser Geräte liegen dann
die intensivsten Ionensignale relativ dicht unter der Sättigungsschwelle für
den Ionendetektor. Zur Zeit wird normalerweise mit einem Messtakt
von zwei Gigahertz und einer Digitalisierungsbreite von acht Bit
gearbeitet. In Aufnahmezeiten von einer Zehntelsekunde bis zu einer Sekunde
können also durchaus etwa ein bis zehn Millionen Analyt-Ionen
vermessen werden; daraus ergibt sich ein hoher dynamischer Messbereich
für diese Art von Messungen.
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Sollten
in Zukunft durch Weiterentwicklung der Elektronik wesentlich höhere
Aufnahmeraten und breitere Digitalisierungen möglich werden,
die eine höhere Sättigungsschwelle darstellen,
beispielsweise acht Gigahertz mit 12 bit Breite, so kann man auch hier
mit optischen Systemen für die Fokussierung der Laserlichtpulse
arbeiten, die durch Aufspaltungen des Laserlichtstrahls mehr als
nur einen Spot pro Laserlichtschuss liefern und damit die Erzeugungsrate für
Ionen entsprechend der Anzahl von Spots vervielfachen.
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Ein
Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonaler Ioneneinführung
ist in Verbindung mit einer erfindungsgemäßen
Ionenquelle schematisch in 1 dargestellt.
Ein UV-Pulslaser (1) mit 60 Kilohertz Wiederholfrequenz
sendet fein fokussierte Laserlichtpulse (2) auf Proben,
die sich auf einer beweglich angebrachten Probenplatte (4)
befinden. Der Laserlichtstrahl wird über ein hier nicht
gezeigtes Linsensystem auf einen Spotdurchmesser von weniger als
zwanzig, vorzugsweise weniger als zehn Mikrometer auf der Probe
fokussiert. Er wird dabei von einem beweglichen Spiegel (3)
geführt, der es erlaubt, den Verdampfungsspot von Laserschuss
zu Laserschuss auf eine andere Stelle der Probe zu lenken. Dabei
werden Plasmawolken (5) erzeugt, die neben Untergrund-Ionen,
die dem Matrixmaterial entstammen, insbesondere die Analyt-Ionen
enthalten und sich fortlaufend in das umgebende Vakuum hinein ausdehnen.
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Die
Ionen können durch einen Ionentrichter (6) angesaugt
und über Linsensysteme (7, 9, 11)
und Ionenleitsysteme (8, 10) als feiner Strahl
(12) einem Flugzeitmassenanalysator zugeführt
werden, dessen Pulser (13) Abschnitte des Ionenstrahls
(12) über einen Reflektor (15) zu einem
Ionendetektor (16) beschleunigt. Die massenabhängig
nacheinander ankommenden Ionen in ergeben ein Zeitprofil des Ionenstroms,
dessen Peaks die Ionenmassen und Ionenmengen widerspiegeln. Die
Digitalisierung ergibt Wertefolgen, die jeweils ein Flugzeitspektrum
darstellen. In diesen Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonaler
Ioneneinführung werden durchaus etwa 5000 bis 10 000 Flugzeitspektren
pro Sekunde aufgenommen. Aufeinanderfolgende Flugzeitspektren werden
zu einem Summenspektrum addiert. Das Summenspektrum wird dann einem
Rechenprogramm zur Peak-Erkennung unterworfen und die Flugzeiten
der Peaks werden über eine Kalibrierkurve in ein Massenspektrum
umgewandelt.
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Es
ist aber die MALDI-Ionisierung wegen ihrer schnellen Abarbeitung
von vielen Proben in kurzer Zeit und wegen ihrer Entkopplung von
Separationsverfahren auch für andere Arten von Massenspektrometern
nachgefragt, beispielsweise für Ionenzyklotronresonanz-Fourier-Transform-Massenspektrometer
(ICR-FT-MS) oder für elektrostatische Ionenfallen. Obwohl
diese Arten von Massenspektrometern getaktet arbeiten, ist auch
für diese ein konstant fließender Ionenstrom günstig.
Auch hier kann die erfindungsgemäße Art von MALDI
mit kurzen Laserlichtpulsen sehr hoher Wiederholfrequenz und geringer
Verdampfungsmenge gut eingesetzt werden.
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Es
sind UV-Laser mit einer Wiederholfrequenz von 60 Kilohertz, einer
Laserlichtpulsdauer von nur 350 Picosekunden und relativ geringer
Leistung auf dem Markt, die für diese Anforderungen ideal
geeignet sind, wenn nur ein einziger Spot pro Laserlichtpuls bestrahlt
werden soll. Verglichen mit anderen, bisher für MALDI eingesetzten
UV-Pulslasern haben sie nur geringe räumliche Abmessungen.
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Die
Vorgänge in den Plasmawolken, die durch sehr kurze Laserlichtpulse
erzeugt wurden, sind anscheinend von denen in bisher für
MALDI erzeugten Laserplasmen sehr verschieden. So werden die Matrixmoleküle
weit weniger stark zersetzt und weit weniger zu höchst
komplexen Ionen mit verschiedensten Massen umgebaut. Es entsteht
bedeutend weniger chemischer Untergrund aus solchen Ionen, die aus
Matrixmolekülbruchstücken aufgebaut sind, als
das bei klassischem MALDI der Fall ist. Die Ionen der unzersetzten
Matrixsubstanzen und deren Dimere und Trimere sind weit klarer im
Untergrund zu erkennen als bei klassischem MALDI. Der Untergrund,
der sich bei klassischem MALDI stark störend bis zu einer
Masse von etwa 1000 Dalton erstreckt, reicht bei Anwendung der kurzen
Laserlichtpulse längst nicht so weit in den Massenbereich
der Massenspektren hinein. Durch den niedrigeren Untergrund wird
die Nachweisgrenze in günstiger Weise zu niedrigeren Konzentrationen
verschoben.
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Die 2 zeigt
eine erfindungsgemäße Ionenquelle in etwas mehr
Detail. Es ist hier die Strahlführung für die
Laserlichtpulse (25) etwas anders als in 1:
Der Laserlichtstrahl tritt hier durch zusätzliche Löcher
in den Lochblenden (28) des Ionentrichters hindurch. Er
trifft auf die Probe (23) auf der Probenträgerplatte
(21), die insgesamt eine große Anzahl von Proben
(22, 23) enthält. Die Probenträgerplatte
kann aus einem beliebigen Material bestehen; es ist allerdings günstig,
wenn die Probenträgerplatte elektrisch leitend ist oder
ein metallischer Kern, eine metallische Hinterlegung oder eine metallische
Oberfläche ein elektrisches Potential annehmen kann, das für
eine Potentialdifferenz zwischen Probenträgerplatte (21)
und Ionentrichter (28) dienen kann. Die Probenträgerplatte
(21) muss außerdem so beschaffen sein, dass die
Proben (22, 23) festgehalten werden und später
ohne Absprengen größerer Probenbrocken desorbiert
werden können. Vorteilhaft sind Proben auf der Basis von
Dünnschichten des Matrix-Materials. Da eine Desorption
durch Laserlicht vorgenommen wird, sollte die Oberfläche
der Probenträgerplatte einigermaßen resistent
gegen eine Abtragung durch die Laserlichtpulse sein. Die Probenträgerplatte
(21) ist parallel zur Oberfläche, die die Proben
(22, 23) aufnimmt, in zwei Richtungen verschiebbar,
so dass alle Proben (22, 23) nacheinander in den
Spot des Laserlichtstrahls (25) gebracht werden können.
In 2 befindet sich die besonders gekennzeichnete
Probe (23) im Spot des Laserlichtstrahls (25).
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Die
MALDI-Proben (22, 23) bestehen hier wie bei üblichem
Vakuum-MALDI aus einer Auftragung von Matrixsubstanz mit einem geringen
Anteil von nur etwa einem Hundertstel Prozent an Analytmolekülen.
Die Verdünnung bewirkt, dass die Analytmoleküle
nicht in Form von Dimeren oder Trimeren desorbiert werden; denn
einmal gebildete Dimere und Trimere werden sich in der Gasphase
nicht mehr trennen. Die Aufgabe der Matrixsubstanz besteht also
darin, die Analytmoleküle in fein verteilter Form auf der
Probenträgerplatte (21) festzuhalten, Laserlicht
aus dem Laserlichtpuls (25) zu absorbieren, dadurch das
Probenmaterial so zu desorbieren, dass die Analytmoleküle
weitgehend unbeschädigt und einzeln entweder ionisiert
oder neutral in die Gasform überführt werden,
und einen möglichst großen Anteil der noch nicht
ionisierten Analytmoleküle in der Plasmawolke durch Protonenübertragung
von den Matrixsubstanz-Ionen auf die Analytmoleküle zu
ionisieren.
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Im
Spot des Laserstrahls (25) wird nun ein winziger Teil der
Probe (23) mit vorzugsweise weniger als einem Picogramm
Probenmaterial desorbiert, wobei der Laserstrahl (25) aus
dem Laser (24) über den Spiegel (26)
auf die Probe (23) gelenkt wird. Die zur Fokussierung des
Laserlichtstrahls zu einem Spot notwendigen Linsen sind in 2 nicht
wiedergegeben. Als Laser (24) dient in dieser Ausführungsform
vorzugsweise ein UV-Pulslaser, der kurze Laserlichtpulse von unter
0,5 Picosekunden Dauer liefert; Jeder Laserlichtpuls erzeugt jeweils
eine eigenständige Desorptionswolke mit Analyt-Ionen (27),
die jedoch wegen der schnellen Folge ineinander laufen und den konstanten
Ionenstrom liefern. Der UV-Laser arbeitet vorzugsweise im Wellenlängenbereich von
etwa 310 bis 360 Nanometer.
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Der
Spiegel (26) soll sehr schnell um sehr kleine Winkel beweglich
sein, um den Laserlichtspot von Laserschuss zu Laserschuss über
die Probe zu bewegen. Dadurch kann der Verdampfungskrater nach jedem
Laserschuss jeweils wieder durch Wärmeabgabe abkühlen.
Die Bewegung kann beispielsweise durch Aufkleben des Spiegels auf
einen Piezo-Kristall realisiert werden. Der Piezo-Kristall kann dabei
flächig in seinen Eigenfrequenzen angeregt werden. Der
Spiegel folgt dann den Schwingungen und versetzt die Spots mit hoher
Geschwindigkeit. Zusätzlich kann auch die Bewegung der
Probenträgerplatte zu einer Verteilung der Spots über
die Probe beitragen. Die Verwendung eines Spiegels mit einem galvanometrischen
Antrieb ist ebenfalls möglich.
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Der
Ionentrichter (28) besteht aus einer Folge von Lochblenden,
an denen abwechselnd die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen,
so dass an der virtuellen Wand des trichterförmigen Ionenraums
ein Ionen abstoßendes Pseudopotential entsteht. Der Hochfrequenzspannung
ist eine Folge von Gleichspannungen überlagert, die die
Ionen in den Ionentrichter einsaugt und zum engeren Ende führt.
Am Ende geht der Trichter in ein Ionenleitsystem aus Lochblenden
(29) über. An den Lochblenden (29) liegen
wiederum abwechselnd die beiden Phasen einer Hochfreqenzspannung, überlagert
von einem Gleichspannungsgefälle. Ein Linsensystem (30) führt
dann die Ionen in das Multipol-Stabsystem (31), das die
Ionen zum Analysator leitet.
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Das
Ionenleitsystem (31), das hier zur Aufnahme der Analyt-Ionen
aus der erfindungsgemäßen Ionenquelle dient, ist
hier nur als ein Beispiel für ein System dargestellt, das
die Analyt-Ionen aufnehmen, gegebenenfalls weiterleiten oder auch
für einige Zeit zwischenspeichern kann. Das Ionenleitsystem
kann, wie in 2 gezeigt, aus Polstäben
bestehen, die mit einer Hochfrequenzspannung versorgt sind. Es kann,
muss aber nicht, die Analyt-Ionen in den Analysatorteil des Massenspektrometers
weiterleiten, wo sie nach Massen und Intensitäten analysiert
werden. Statt eines Massenspektrometers kann auch jede andere geeignete
Art von Spektrometer für die Analyse der Analyt-Ionen zum
Einsatz kommen, beispielsweise ein Ionenmobilitätsspektrometer,
oder ein optisches Spektrometer.
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Die
Verdampfung der Probenmaterialien in den Spots kann aber auch direkt
in die Achse eines Multipol-Stabsystems hinein erfolgen, wobei der
Laserlichtpuls durch die Zwischenräume zwischen den Polstäben
eingeschossen wird. Es hat sich in diesem Fall als günstig
erwiesen, die Probe auf dem Probenträger durch eine Kapillare
mit etwas Gas anzublasen, so dass vor der Probe ein leicht erhöhter
Druck von etwa einem Hundertstel bis zu einem Zehntel Pascal herrscht.
Dadurch steigt die Ausbeute an Analyt-Ionen nochmals an.
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Für
die Präparation der Proben (22, 23) können,
wie oben schon angemerkt, die klassischen Matrixsubstanzen und Aufbereitungsverfahren
genutzt werden. Die Proben auf den Probenträgern haben
im Allgemeinen Durchmesser, die zwischen 200 Mikrometern und zwei
Millimeter liegen. Vorpräparierte Dünnschichten
mit Matrixmaterial sind beispielsweise mit Durchmessern der Auftragungen
von 800 Mikrometern erhältlich. Dünnschichten
werden bevorzugt aus α–Cyano-4-hydroxyzimtsäure
(CHCA) hergestellt. Die Dünnschicht-Auftragungen befinden
sich in Gebieten der Probenträgerplatte, die stark hydrophob
sind. Die Proben können dann in gelöster Form mit
Pipettierrobotern auf die Dünnschichten auf der Probenträgerplatte
aufgebracht und dort eingetrocknet, oder besser nach kurzer Zeit
wieder abgehoben werden. Werden keine Dünnschichten verwendet, sondern
zum Beispiel 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), Sinapinsäure
(SA) oder 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), so können
besondere hydrophile Bereiche auf der Probenträgerplatte
in hydrophober Umgebung die Probenkristallisation auf diese hydrophilen
Bereiche beschränken. Es ist eine Vielzahl von Matrixsubstanzen
bekannt, die jeweils auf bestimmte Gruppen von Analytsubstanzen
abgestimmt sind und diese besonders gut ionisieren.
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Für
die bildgebende Massenspektrometrie an histologischen Dünnschnitten
können ebenfalls die dafür entwickelten Belegungsverfahren
für Matrixmaterialien eingesetzt werden. Die bildgebende Massenspektrometrie
wird zur Zeit meist mit axialen MALDI-Flugzeitmassenspektrometern
durchgeführt. Das erfindungsgemäße Kurzzeit-MALDI
verspricht hier bessere Nachweisgrenzen bei gleicher Zeitdauer des
Rasterverfahrens für die Spektrenaufnahme. Es sind aber
auch Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss
für diesen Zweck interessant, weil die Abrasterung der
Proben um ein Vielfaches schneller zu werden verspricht als mit
klassischer MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie.
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Die
Ionenquellen der Erfindung können in Massenspektrometern
verschiedener Art ihre Anwendung finden, aber auch in ganz anderen
Arten von Spektrometern, beispielsweise in Ionenmobilitätsspektrometern.
Besonders interessant ist beispielsweise eine Anwendung als höchstempfindliche Ionenquelle
in einem Tandem-Massenspektrometer, das als erstes Trennsystem ein
Quadrupolfilter und als Massenanalysator einen Flugzeitmassenanalysator
mit orthogonalem Ioneneinschuss (Q-OTOF) enthält. Diese
Art von Massenanalysator hat höchste Empfindlichkeit, großen
dynamischen Messbereich, und eine hervorragende Massengenauigkeit
auch für Tochterionenspektren. Als Fragmentierungs-Einheit kann
sowohl eine Stoßzelle wie auch eine beliebige andere Fragmentierungsstufe
verwendet werden.
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Dieses
Beispiel ist aber nur eines von vielen. Es ließen sich
hier weitere spektrometrische Verwendungen aufzählen. Dem
Fachmann ist es mit Kenntnis dieser Erfindung möglich,
weitere nahe liegende Ausführungsformen und Anwendungen
zu schaffen, die aber immer dem prinzipiellen Erfindungsgedanken
und damit dem Schutzumfang unterliegen sollen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 102004044196
A1 [0012, 0018, 0029]
- - GB 2421352 A [0012]
- - US 7235781 C1 [0012]
- - WO 99/38185 A2 [0013]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - „The
Desorption Process in MALDI" von Klaus Dreisewerd (Chem. Rev. 2003,
103, 395–425) [0008]