DE19911801C1 - Verfahren und Vorrichtung zur matrixunterstützten Laserdesorptions-Ionisierung von Substanzen - Google Patents

Abstract

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur matrixunterstützten Laserdesorptions-Ionisierung, wobei die Probe, einem zeitlich mit dem Laserpuls korrelierbaren lokalen Gaspuls ausgesetzt wird. Auf diese Weise bildet sich gerade dort örtlich ein hoher Druck, wo die Laserdesorption stattfindet. Die Erfindung hilft zur stoßinduzierter Verminderung der überschüssigen kinetischen Energie der laserdesorbierten Ionen und verleiht der Ionen dadurch eine bessere Kontrollmöglichkeit bei der Übertragung in eine massenspektrometrische Vorrichtung und beim Auffangen in einer Ionenfalle. Gleichzeitig hilft die Erfindung zur Vermeidung des überschüssigen Drucks in der Ionenquelle und im Vakuumsystem des Massenspektrometers und vermindert deswegen die Abpumpzeiten sowie die Leistungsfähigkeitsabnahme speziell bei Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer. Weiterhin erlaubt die Erfindung die Verwendung gepulster reaktiver Gase im Zusammenhang mit direkter oder matrixunterstützter Laserdesorption, welche zur Entstehung neuartiger Produktionen führen können.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionisierung, wobei die Probe, die desorptiv ionisiert wird, lokalen Gaspulsen ausgesetzt wird, die mit dem Laserpuls zeitlich korreliert werden können.

Allgemeiner Stand der Technik

Konventionelle Verfahren zur Ionisierung der Substanzen für massenspektro­ metrische Analyse, wobei zum Beispiel eine feste Substanz erhitzt, in die Gas­ phase überführt und dort durch Elektronenstoß ionisiert wird, können auf die großen organischen und biologischen Moleküle nicht angewandt werden. Elek­ tronenstoß mit energetischen Elektronen (üblicherweise 70 eV) führt bei diesen Spezies zu einer starken Fragmentierung, wobei ausschließlich kleine Bruch­ stücke zu beobachten wären. Andererseits zersetzen sich schon bei einer lang­ samen Energiezufuhr, wie es beim Erhitzen einer festen Probe immer der Fall ist, große organische Moleküle, bevor sie überhaupt verdampfen. Nur bei einer extrem schnellen Energiezufuhr, wie z. B. mit einem Laserstrahl, passiert der meist langsamere Zerfallsprozeß der Moleküle nicht.

Laserdesorptions-Ionisierung ist schon in der letzten Dekade benutzt worden, um große organische Moleküle erfolgreich in die Gasphase zu bringen und zu ionisieren. Eine besondere Art der Laserdesorptions-Ionisierung (LDI) ist die matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionisierung (MALDI). Der ausführliche Review-Artikel von F. Hillenkamp, M. Karas, R. Beavis und B. Chait in der "Analytical Chemistry" Band 63, Jahrgang 1991, auf Seiten 1193A-1203A, berichtet über diese Technik. In MALDI werden die Analytmoleküle mit einer sogenannten Matrix gemischt. Das Molverhältnis Analyt-zu-Matrix beträgt dabei 1 : 10² bis 1 : 10⁴. Der Laserstrahl wird von Matrixmolekülen absorbiert und auf Analytmoleküle weitergeleitet. Diese bekommen somit die nötige Energie um in die Gasphase zu gelangen und werden dabei teilweise ionisiert. Die Ionisierung erfolgt meistens durch eine Protonenaufnahme. Die Substanzen, die größtenteils als Matrix verwendet werden, sind Protonendonatoren. In speziellen Fällen werden auch Alkalimetallsalze oder Silbersalze hinzugefügt, um eine Alkalimetall- oder Silber-Anlagerung zu erzielen. Bei manchen Proben werden sowohl protonierte Analytmoleküle, als auch kleine Mengen von Natrium- Addukten beobachtet. Letztere bilden sich oft wegen des Vorhandenseins von Natriumchloridresten in Bioproben.

Die Erfahrung zeigt, daß die Ionen, die durch den MALDI-Prozeß gebildet werden, über eine nicht vernachlässigbare kinetische Energie verfügen, die bis über 10 eV reichen kann. Da in der klassischen Flugzeitmassenspektrometrie die MALDI-generierten Ionen normalerweise mit Spannungen 15-30 kV extrahiert und beschleunigt werden, ist eine Energiestreuueng von etwa 10 eV hier relativ unwichtig. In Ionenfallen-Massenspektrometern, wie z. B. Fourier-Transform- Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (FTICR) müssen jedoch die in einer externen Ionenquelle hergestellten Ionen in die Falle überführt und dort eingefangen werden. Die Extraktion der MALDI-erzeugten Ionen findet hier deswegen nicht mehr mit einer Potentialdifferenz von mehreren Kilovolt statt. Im Bereich niedriger Ionenextraktionsenergie, die 10-20 V nicht überschreitet, ist jedoch eine Fluktuation der überschüssigen Energie im Bereich von 10 eV zu hoch und bereitet deshalb größte Schwierigkeiten. Sie führt zu einer starken Streuung der erzeugten Massensignalen und deshalb zu unreproduzierbaren analytischen Ergebnissen.

In der Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometrie (FTICR-MS) versucht man durch diverse Methoden, Ionen in der Falle mög­ lichst verlustfrei aufzufangen und deren Energie für die ICR-Messungen erst einmal effektiv zu reduzieren. Dies geschieht zum Beispiel durch ein dynami­ sches Auffangen, wobei auch ein inertes Gas in die Ionenzyklotronresonanz- Falle (ICR-Falle) eingepulst wird, um die kinetische Energie der Ionen durch Stöße mit Gasmolekülen oder -atomen zu absorbieren.

Man kann auch versuchen, die Ionen schon in der Ionenquelle abzukühlen. Diese Methode verwendet einen erhöhten statischen Druck in der Quelle, so daß die durch MALDI entstandenen Ionen deren Energie gleich durch Stöße abgeben. Nach einem anderen Verfahren ist der MALDI-Prozeß sogar im Atmosphärendruck durchzuführen. Die Patentanmeldung DE 196 08 963 A1 beschreibt eine solche Vorrichtung für eine Atmosphärendruck-Laserdesorp­ tions-Ionisation. In diesem Fall werden Matrixsubstanzen verwendet, die sich photolytisch oder thermolytisch zersetzen können. Allerdings sollen hier, anders als bei MALDI, die bei der Desorption bei Atmosphärendruck freiwerdende Gase nicht die Aufgabe übernehmen, die großen Analytmoleküle zu ionisieren. Die Auswahl der Matrixmoleküle richtet sich daher nur nach deren Fähigkeit zur desorptiven Befreiung der großen Moleküle. Die auf diese Weise in die Gasphase katapultiv überführten Analytmoleküle werden zum Beispiel durch eine Corona-Entladung ionisiert. Die Corona-Entladung bildet eigentlich primär Stickstoffionen, die ihrerseits in feuchter Luft Wassermoleküle ionisieren, welche dann die Ionisierung der Analytmoleküle übernehmen.

Nachteile der bisherigen Technik

In der FTICR-Massenspektrometrie mit externer MALDI-Ionenquelle erfordert das dynamische Auffangen der Ionen, die in einer Niederspannungs-MALDI- Quelle erzeugt worden sind, ein elektrisches "Öffnen und Schließen" der dieser Ionenquelle zugewandten Trappingplatte der ICR-Falle. Dies ist meist kombi­ niert mit einer Erhöhung des Fallenpotentials der hinteren Trappingplatte. Das Auffangen der höherenergetischen Ionen in einer Falle ist immer problematisch. Besonders schwierig ist das verlustfreie Auffangen, wenn ein energetisch breit­ bandinger Ionenschwarm aus einer solchen MALDI-Quelle ankommt. Oft verwendet man in der FTICR Massenspektrometrie gleichzeitig ein gepulstes Inertgas in der ICR-Falle. Die Stöße mit diesen Gasmolekülen entnehmen den MALDI-erzeugten Ionen die überschüssige Energie. Auf diese Weise erhält man energiereduzierte Ionen, die man in der ICR-Falle resonant anregen und nachweisen kann. Allerdings braucht die FTICR-Massenspektrometrie ein sehr gutes Vakuum im Bereich von ≦ 10^-9 mbar im Analysatorbereich, besonders um die hohe Auflösung zu erreichen. In der FTICR vermeidet man den Betrieb bei Drücken über 10^-8 mbar, da die Verbreiterung der Ionencyclotronesonanzsignale die Messungen stören. Wenn das Auffangen der Ionen mit einem Gaspuls assoziiert wird, muß man nach jedem Gaspuls-unterstützten Ioneneinfang eine Zeit lang warten, daß das eingepulste Gas abgepumpt wird. Diese Zeitspanne kann 5-10 Sekunden oder auch länger dauern. Das bedeutet, daß zum Aufaddieren von mehreren Spektren eine wesentlich längere Zeit benötigt wird.

Diese Probleme entstehen, wenn die Ionen in der MALDI-Quelle durch Niederspannungsextraktion und -Beschleunigung in die ICR-Falle überführt werden. Es scheint deswegen einfacher zu sein, die überschüssige kinetische Energie der MALDI-erzeugten Ionen schon in der Quelle durch Stöße mit Gasmolekülen zu absorbieren.

Die Alternative zur Druckerhöhung in der ICR-Falle ist ein statisch erhöhter Druck in einer Ionenquelle eines FTICR-Massenspektrometers. Wie oben be­ schrieben würden die Stöße mit Gasmolekülen den MALDI generierten Ionen schon am Entstehungsort die überschüssige Energie abnehmen. Eine MALDI- Ionenquelle mit statisch erhöhtem Druck, allerdings im Zusammenhang mit Flugzeitmassenspektrometrie, ist in der Publikation von A. N. Krutchinsky, A. V. Loboda, V. L. Spicer, R. Dworschak, W. Ens, K. G. Standing in der "Rapid Communications in Mass Spectrometry" Band 12, Jahrgang 1998 auf den Seiten 508 bis 518 beschrieben. Ein statisch erhöhter Quellendruck angewandt auf FTICR-Massenspektrometrie, um eine höhere Analytenausbeute bei MALDI zu erzielen, hat jedoch die Folge, daß der ICR-Fallendruck auch einen höheren statischen Wert annimmt. Eine gewisse Erhöhung des Fallendrucks passiert trotz eines differentiell gepumpten Systems, wenn der Quellendruck sich auf Werte wie 0,01 oder 0,1 mbar erhöht, welches wiederum die Leistungsfähigkeit des FTICR-Systems stark beeinträchtigen kann (Peakverbreiterung, Abnahme der Auflösung).

Schließlich sehen die bisher vorgeschlagenen Methoden mit hohem statischen Druck in der Laserdesorptions-Ionenquelle, z. B. Atmosphärendruck (4 oder 5 Zehnerpotenzen höher als ein statisch auf 0,1 oder 0,01 mbar erhöhter Quellen­ druck) auch keine klassischen MALDI-Prozesse vor. Vielmehr sind das neue Techniken verbunden mit einer Atmosphärendruck-Ionisation mit Hilfe eines zusätzlichen Reaktantgases, wobei man normalerweise die klassichen Matrixsubstanzen nicht verwendet.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu finden, um die überschüssige kinetische Energie der Ionen, die in einer MALDI-Ionen­ quelle entstehen, gleich nach ihrer Entstehung, schon in der Ionenquelle lokal zu absorbieren. Bei der Abkühlung der Ionen sollte das Vakuum des restlichen Massenspektrometers möglichst nicht beeinflußt werden.

Der Erfindungsgedanke

Die Erfindung besteht darin, die überschüssige kinetische Energie der durch MALDI erzeugten Ionen in der Ionenquelle durch Stöße mit eingeführten Gasmolekülen zu absorbieren. Die Erfindung sieht eine Vorrichtung vor, worin die Stoßgase durch ein dünnes Rohr oder eine Kapillare mit Hilfe eines Puls­ ventils direkt auf die MALDI-Probe gepulst werden. Ein Gaspuls, der zum Laserpuls synchronisiert wird (eine bestimmte Zeitperiode vor oder nach dem Laserpuls, bzw. während des Laserpulses), erzeugt unmittelbar auf der Ober­ fläche der aufgetragenen Substanz eine kurzzeitige örtliche Druckerhöhung. Die mit überschüssiger Energie erzeugten Analyt-Ionen stoßen mit den Pulsgasmo­ lekülen zusammen und verlieren ein Teil ihrer Energie, bevor sie überhaupt die Ionenquelle verlassen. Diese Ionen können jetzt mit einer niedrigen Spannung aus dem Ionenquellenbereich extrahiert und in den massenspektrometrischen Analysator weitergeleitet werden. Bei einer effektiven Absorption der Überschußenergie werden andere Probleme, die mit einer Energiestreuung der Ionen zusammenhängen, natürlich auch beseitigt. Die lokale Druckerhöhung auf der Oberfläche der Probe ist mit viel weniger Stoßgas zu erreichen, als wenn man die Ionenquelle auf einen erhöhten Druck bringen würde. Dies erreicht den gleichen Effekt, benötigt jedoch eine unvergleichlich kleinere Menge Stoßgas und verursacht keine unnötige Druckerhöhung in dem restlichen Vakuumsystem des Massenspektrometersystems, die zu einer Reduktion der Leistungsfähigkeit führen könnten.

Eine andere Perspektive der Erfindung ist, daß durch weitere Gasleitungen Reaktionsgase in die unmittelbare Nähe der zu desorbierenden Substanz geleitet werden können. Auf diese Weise können primäre Ionen, die durch matrixassis­ tierte Laserdesorption entstehen, mit reaktiven neutralen Molekülen reagieren. Produkt-Ionen dieser Reaktionen werden genauso wie die primär desorbierten Ionen in den massenspektrometrischen Analysator weitergeleitet und nachgewiesen. Ionen-Molekül-Reaktionen in einer MALDI-Ionenquelle sind nicht nur im Hinblick auf die Ionenchemie interessant. Diese können auch im analytischen Sinne nützlich sein. Mit einer geschickten Wahl des Reaktionsgases können solche Reaktionen der desorbierten Ionen eine Art "Derivatisierungseffekt" hervorrufen und deshalb eine weitere Informations­ dimension für die zu untersuchende Substanz liefern.

Beobachtungen zeigen, daß nach einem MALDI-Prozeß mit erhöhtem Druck (durch ein Inertgas) in der Nähe des Desorptionspunktes mehr Analytionen nachzuweisen sind. Es ist anzunehmen, daß die stoßinduzierte Abkühlung der desorbierten Ionen, die sonst eine Überschußenergie aufweisen, die Verluste beim Auffangen und bei der Übertragung der Ionen verhindert. Möglicherweise erlaubt auch die langsamere Expansion des desorbierten Schwarms aus Matrix-, und Analytionen, sowie Matrix- und Analytmolekülen überhaupt eine stärkere Produktion der Analytionen in der Quelle, da mehr Zeit für post-desorptive Ionen-Molekül-Wechselwirkungen (z. B. Protonentransfer) zur Verfügung steht.

Eine RF-Multipol-Ionenleitvorrichtung, die unmittelbar vor dem Laserdesorp­ tionspunkt vorgeschaltet ist, kann einen Ionenschwarm zusätzlich vor einem schnellen Expandieren schützen. Wenn der MALDI-Prozeß mit Hilfe eines Inertgaspulses unterstützt wird, und die Ionen gleichzeitig auch direkt in einer Multipol-Ionenleitvorrichtung eingefangen werden, sind die oben erwähnten Effekte verstärkt. Hier kann die Multipol-Ionenleitvorrichtung z. B. ein Quadrupol, ein Hexapol oder ein Octopol sein.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt eine matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionenquelle mit zwei Gaszuleitungen, wobei das Stoßgas oder das Reaktionsgas direkt auf die Probe gepulst werden kann.

Fig. 2 zeigt eine Ausführung der matrixunterstützten Laserdesorptions-Ionen­ quelle, wobei die zugeführten Gase durch einen ringförmigen flachen Schlitz flächenhaft auf die Probe gepulst werden, um genügend freien Raum für die laseroptische oder beobachtungsoptische Elemente zu lassen.

Fig. 3 zeigt eine matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionenquelle, in der die zugeführten Gase wie in Fig. 2 durch einen flachen und ringförmigen Schlitz auf die Probe gepulst werden. Hier werden jedoch die desorbierten Ionen nicht in ein Ionenlinsensystem extrahiert, sondern die Laserdesorption liefert die Ionen praktisch direkt in eine Multipol-Ionenleitvorrichtung.

Einige besonders vorteilhafte Ausführungsformen

Fig. 1 beschreibt eine matrixunterstützte Laserdesorptionsquelle mit Stoßgas- und Reaktionsgasleitungen. Die Probe (1) befindet sich auf dem Probenträger (2). Der Strahl (3) des Lasers (4) wird je nach Bedarf mit Hilfe eines Abschwä­ chers (5) abgeschwächt, durch die Linse (6) fokussiert, und durch einen Laser­ fenster (7) auf die Probe (1) gerichtet. Genauso sind zwei Kapillarrohre (8 und 9) auf die Probenoberfläche gerichtet. Das Stoßgasrohr (8) leitet das Stoßgas (10), das Reaktionsgasrohr (9) das Reaktionsgas (11). Um die Ionen (12), die bei der matrixunterstützten Laserdesorption entstehen, zu extrahieren und in Richtung des massenspektrometrischen Analysators zu leiten, sind eine Ziehblende (13) und ein ionenoptisches System (14) angebracht worden.

Fig. 2 beschreibt eine andere Ausführung einer matrixunterstützten Laser­ desorptionsquelle mit Stoßgas- und Reaktionsgaszufuhr. Hier ist eine Platte (15) parallel zu der Oberfläche sehr nahe an den Probenträger angebracht. Eine Abdeckplatte (16) sorgt dafür daß zwischen diesen beiden Platten ein kreis­ förmiger "Flächenschlitz" entsteht. Dieser Schlitz wird dazu verwendet, Gase auf die Probenoberfläche zu pulsen. Sowohl inerte Stoßgase zur Abkühlung der MALDI-generierten Ionen als auch die Reaktionsgase werden anstelle der Kapillarrohre durch diesen Schlitz auf die Probe gepulst. Durch diese flache Bauweise bilden sich keine Hindernisse für die Ionenoptik oder auch zum Beispiel für die Beobachtungsoptik. Hier ist 17 der Lichtstrahl, der durch den Teleskop (18) in die Kamera (19) führt.

Fig. 3 beschreibt eine Ionenquelle, für matrixunterstützte Laserdesorption mit Stoßgas- und Reaktionsgaszufuhr. Wie in Fig. 2, werden hier diese Gase durch einen Flächenschlitz auf die Probe (1) eingeleitet. Ionen, die in dieser Quelle durch eine matrixassistierte Laserdesorption entstehen, werden in der Multipol- Ionenleitvorrichtung (20) eingefangen. In dieser Quelle kann die überschüssige kinetische Energie der Ionen von einem Stoßgas absorbiert werden. Gleichzeitig können Ionenverluste durch eine Desorption in eine Multipol-Ionenleitvorrich­ tung größtenteils verhindert werden. Ionen, die in den Multipol desorbiert wer­ den, können hier eingefangen werden. Als Multipol-Ionenleitvorrichtung kann hier irgendein Multipolsystem verwendet werden, wie zum Beispiel ein Quadru­ pol, ein Hexapol, ein Octopol, etc. Eine Akkumulation der durch mehrere Laserschüsse desorbierten positiven Ionen im Multipol kann dadurch erreicht werden, daß auf die Ionenextraktorplatte (21) ein positives Potential (z. B. 10 V) angelegt wird. Wenn diese Ionen analysiert werden sollen, legt man eine negative Spannung auf die Ionenextraktorplatte (21) und schießt sie durch die Ionenlinsen (22) und die Ionentransferoptik (23) des Fourier-Transform- Ionencyclotronresonanz (FTICR) Massenspektrometer. Die ICR-Falle (24) ist in die Mitte des Magnetfeldes des supraleitenden Magneten (25) plaziert. Es gibt viele Fälle, wo ein einziger Laserschuß keine große Anzahl von Ionen erzeugt, so daß Ionen von mehreren Laserschüssen gesammelt werden. Eine Akkumu­ lierung der Ionen, die durch mehrere einander folgende Laserschüsse hergestellt werden, sorgt für die Erhöhung der Intensität des Massensignals.

Es hat grundsätzliche Vorteile, für MALDI-Prozesse einen Mehrfachprobenträ­ ger zu verwenden, wenn Untersuchungen mit einer großen Anzahl von korrelie­ renden Proben gemacht werden. Um einen hohen Durchsatz zu erzielen, können robotische Probenvorbereitungssysteme in Anspruch genommen werden, die z. B. die MALDI-Proben direkt von einer Serie von vorbereiteten Lösungen ent­ nehmen und auf die MALDI Probenträgerplatte applizieren. Diese Lösungen sind meistens in einer sogenannten Mikrotiterplatte prepariert, die auf einer rechteckigen Fläche 96 (8 × 12) oder 384 (16 × 24) oder sogar 1536 (32 × 48) etc. Proben enthält. Eine analoge Ausführung des MALDI-Probenträgers wird vom Standpunkt der Automatisierung große Vorteile bringen. Deshalb wird die Erfin­ dung diese Alternative des Multi-Probenträgers in Form einer Mikrotiterplatte einsetzen, wodurch eine Automatisierung vereinfacht und ein großer Durchsatz dadurch ermöglicht wird.

Claims (8)

1. Verfahren zur Erzeugung von Analytionen aus einer Probe auf einem Probenträger durch gepulste matrixunterstützte Laserdesorption, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe einem lokalen, zum Laserschuß synchroni­ sierbaren Gaspuls, bestehend aus Inertgas und/oder Reaktionsgas, ausgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Laserschuß gebildeten Ionen in einer Multipol-Ionenleitvorrichtung eingefangen werden, die vor dem Probenträger angebracht ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die aus der Probe gebildeten Ionen dem Gaspuls ausgesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als Probenträger eine Mehrprobenträgerplatte in Form einer Mikrotiterplatte benutzt wird.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Leitung zur Gaszufuhr in unmittelbare Nähe des Laserdesorptionspunktes führt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gaszufuhrleitungen aus einem Kapillarrohr besteht.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Proben­ träger eine flache Gaszuleitung in Form eines Flächenschlitzes um die Probe angebracht ist, um das Inertgas und/oder Reaktionsgase pulsweise auf die Probe leiten zu können.

8. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Probenträger eine Multipol-Ionenleitvorrichtung angebracht ist.