DE19544808C2

DE19544808C2 - Verfahren zur Untersuchung der Struktur von Ionen in einem Flugzeitmassenspektrometer

Info

Publication number: DE19544808C2
Application number: DE19544808A
Authority: DE
Inventors: Claus Koester
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 1995-12-01
Filing date: 1995-12-01
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2015-12-02
Also published as: GB9624948D0; DE19544808A1; GB2307782A; GB2307782B; US5734161A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1; ein derartiges Verfahren ist aus der EP 0403965 A2 bekannt.

Für die schonende Ionisierung großer Moleküle, also für die Erzeugung von Molekülionen mit nur äußerst geringen Anteilen an Fragmentionen, sind in den letzten Jahren mehrere Verfahren bekannt geworden. Das Elektrosprühen (ESI = electrospray ionization) erzeugt Ionen der Un tersuchungssubstanzen aus der Lösung heraus in Luft bei Atmosphärendruck, und die Ionen lassen sich dann in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers überführen. Die matrix unterstützte Ionisierung durch Laserdesorption (MALDI = matrix assisted laser desorpti on/ionization) erzeugt die Ionen im Vakuum durch Beschuss der in winzige Matrixkristalle eingelagerten Substanzen auf einem Probenträger mit Lichtpulsen aus Lasern. Beide Arten der Ionisierung sind in Verbindung mit jeweils mehreren Arten von Massenspektrometern, wie Quadrupolmassenspektrometern, magnetischen Sektorfeldgeräten oder Flugzeitmas senspektrometern, angewandt worden, wobei es aber besonders bevorzugte Paarungen, bei spielsweise MALDI mit Flugzeitspektrometern, gibt.

Für Strukturuntersuchungen der Ionen ist aber die Kenntnis des Molekulargewichts nicht aus reichend, sie verlangt weitergehende Kenntnisse, die über reaktive Veränderungen der Ionen erhalten werden können. Solche Strukturuntersuchungen können verschiedene Aspekte betreffen, hier wird der Blick vornehmlich auf die Sequenzanalyse von größeren Kettenmole külen, beispielsweise Peptiden oder Proteinen, gerichtet. Eine dafür besonders wichtige Reak tion ist der monomolekulare Zerfall der Ionen, der durch das Einbringen von Energie in das Bindungs- und Schwingungssystem des ionisierten Moleküls eingeleitet wird.

Die Energie für monomolekulare Zerfälle kann in vielfältiger Weise durch Stöße mit Molekü len, Photonen oder Elektronen in ein Ion eingebracht werden: Einzelne hochenergetische Stöße mit Stoßgasmolekülen, eine Vielzahl an niederenergetischen Stößen mit Aufsammeln der Ener gie im Schwingungssystem des Ions, ein Beschuss mit Photonen verschiedenster Wellenlänge und Dichte oder ein Beschuss mit Elektronen unterschiedlicher Energie können die Zerfalle einleiten. Die Zerfälle können daher auch sehr verschieden erfolgen: es werden sofortige ("spontane") Zerfälle ohne massenspektrometrisch erkennbare Zerfallszeit, aber auch "meta stabile" Zerfälle mit einer endlichen (messbaren) Zerfallszeit beobachtet. Die hier als "spontan" bezeichneten Zerfälle müssen Zerfallszeiten unter 10 bis 100 Nanosekunden haben, dann sind sie massenspektrometrisch nicht mehr ohne besondere Maßnahmen erkennbar.

Es ist nun seit längerer Zeit bekannt, dass Tochterionenspektren aus hochenergetischen Stößen etwas anders aussehen als solche aus niederenergetischen Stößen. Über Größe und Signifikanz der Unterschiede herrschen aber unterschiedliche Auffassungen. Die Unterschiede sind im we sentlichen durch die benutzten Massenspektrometer mitbestimmt, da die Massenspektrometer nicht von sich aus für die Trennung zwischen Spontanzerfällen und metastabilen Zerfällen nach Verlassen der Stoßkammer eingerichtet sind, aber dennoch das relative Mischungsverhältnis der Ionen aus spontanen und aus metastabilen Zerfällen im Spektrum beeinflussen.

In der Flugzeitspektrometrie wird seit einigen Jahren das sogenannte PSD-Verfahrens für die Aufnahme von Tochterionenspektren aus MALDI-Ionen großer Moleküle angewandt (PSD = "post source decay"). In der Verdampfungswolke des Laserschusses finden bereits soviel nie derenergetische Stöße statt, dass viele der gebildeten Ionen bereits metastabil werden. Hinzu kommt ein gewisser Anteil an thermischer Energie, die im Molekülion gespeichert wird und zur Metastabilität beiträgt.

Zusätzlich zur Bildung von metastabilen Ionen kann man in Flugzeitspektrometern sehr günstig Stoßzellen einführen, die zur Fragmentierung der Ionen beitragen. Es hat sich nun durch unsere Untersuchungen herausgestellt, dass sich die Fragmentierungsmechanismen des PSD-Verfah rens für Kettenmoleküle wie beispielsweise Peptide oder Proteine und die der Stöße in der Stoßzelle voneinander recht deutlich unterscheiden. Diese Unterschiede sind bei den üblichen Verfahren zur Aufnahme der Tochterspektren kaum sichtbar, für die meisten Substanzen treten sie im Spektrum sogar gar nicht sichtbar in Erscheinung.

Bei dem PSD-Verfahren sammeln die großen Moleküle durch viele niederenergetische Stöße in der sich ausdehnenden Dampfwolke der Matrix innere Energie auf, die in Form von Schwin gungsenergie der verschiedensten im Molekül vorhandenen Schwingungssysteme gespeichert wird. Bei den stark gekoppelten Schwingungen des Molekülsystems ändert sich nachfolgend die Energieverteilung laufend und quasi-statistisch; tritt an einer Stelle des Kettenmoleküls eine Überhöhung der Energiedichte auf, so kann es hier zu einem Bruch kommen. Dabei werden ganz überwiegend nur Brüche der Hauptkette erzeugt, Brüche von kurzen Seitengliedern sind praktisch nicht zu beobachten. Die Brüche treten auch nicht sofort auf, die ionisierten Mole küle zeigen monomolekulare Zerfallsraten mit Zeitkonstanten von vielen Mikrosekunden. Das Molekül zerfällt also während seiner Laufzeit durch das Flugzeitmassenspektrometer.

Anders wirken dagegen die hochenergetischen Stöße zwischen einem hochbeschleunigten Molekülion und einem quasi ruhenden Stoßgasmolekül in der Stoßzelle. Hier führt ein harter, zentraler Stoß in der Regel spontan zum Bruch des Moleküls. (Es sind nicht alle Stöße hoch energetischer Ionen hart und zentral, auch bei hochenergetischen Stößen werden metastabile Ionen gebildet). Die spontan auftretenden Brüche betreffen überwiegend gleichzeitig Seiten kette wie auch Hauptkette. Durch einen Fragmentierungsmechanismus, der noch nicht voll aufgeklärt ist, brechen bei spontanen Brüchen gleichzeitig Seitenkette und Hauptkette eines einzigen Aminosäuremoleküls. Dabei wird strukturabhängig nur ein charakteristischer Teil der Seitenkette abgespalten. Es entsteht ein Ion durch einen sogenannten A-Bruch einer Amino säure der Hauptkette, und die endständige Aminosäure verliert zusätzlich einen Teil der Sei tenkette. Das so entstehende Ion wird in der Protein-Nomenklatur ein D-Ion genannt. In ähnli cher Weise können auch X-Brüche der Hauptkette zu W-Ionen mit Bruch eines Teils der end ständigen Seitenkette führen.

In der Massenspektrometrie der Peptide und Proteine hat sich eine eigene Nomenklatur für die Entstehung von Tochterionen aus den Molekülen gebildet. Danach werden die Brüche zwi schen verschiedenen Gruppen der Aminosäuren längs der Hauptkette mit A, B und C bezeich net, wenn es sich um N-terminale Ionen handelt. A, B und C bezeichnet dabei die drei mögli chen Brüche C-CO, CO-N und N-C der Hauptkette innerhalb einer Aminosäure oder zwischen einer Aminosäure und der nächstfolgenden. Ein Index an den Buchstaben A, B und C bezeich net die Nummer der Aminosäure beim Durchzählen in der Kette. Für C-terminale Ionen wer den die gleichen Brüche mit X, Y und Z bezeichnet. Für die Brüche der Seitenketten, die nicht für alle Aminosäuren möglich sind, hat sich die Bezeichnung D für N-terminale Ionen, und W für C-terminale Ionen eingebürgert. Beispielsweise ist das D-Ion des Leucins um 42 Massen einheiten, des Isoleucins um 28 Masseneinheiten kleiner als das der A-Ionen.

Wenn es gelingt, die spontanen und die metastabilen Ionen zu trennen, kann man die gebildeten D-Ionen einfacher erkennen und damit beispielsweise zwischen endständigem Leucin und Iso leucin unterscheiden, was anhand der Brüche A, B, C, X, Y und Z prinzipiell nicht möglich ist. Die Fragmentionen, die durch Teilverlust endständiger Seitenketten entstehen, sind daher ana lytisch besonders wichtig.

Aufgabe der Erfindung ist es, spontan erzeugte Tochterionen und zeitverzögert entstehende Tochterionen getrennt zu messe.

Diese Aufgabe wird durch das im Anspruch 1 angegebene Verfahren gelöst.

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, die spontan am Ort der Fragmentierungsstöße zerfal lenden Ionen von den später in einer Laufstrecke metastabil zerfallenden Ionen durch eine praktisch sofort nach der Fragmentierung stattfindende Energiefilterung zu trennen und diese Trennung für eine Erkennung und Messung der verschiedenartigen Tochterionen auszunutzen. Der Zerfall von Ionen ist immer mit der Abspaltung eines Neutralbruchstücks verbunden, wo bei beide Bruchstücke im wesentlichen die gleiche Geschwindigkeit behalten. Die kinetische Energie wird also beim Bruch im Verhältnis der Massen aufgeteilt, und die veränderte kineti sche Energie kann zur Erkennung der spontan zerfallenen Ionen herangezogen werden. Für die Energiefilterung wird eine elektrostatische Einzellinse verwendet, nachdem der Ionenstrahl divergent in die Frag mentierungszone eingeschossen wurde. Die Einzellinse bewirkt eine energieabhängige Fokussie rung des Strahles. Durch eine kleine Apertur können dann diejenigen Ionen ausgewählt wer den, deren Energie einen Brennpunkt ihres Ionensstrahls in der Apertur erzeugt. Statt der A pertur kann ein kleinflächiger Detektor verwendet werden.

Die Energiefilterung muss unmittelbar nach dem spontanen Zerfall stattfinden, sonst wird be reits ein Teil der metastabil zerfallenden Ionen mitgemessen. Unmittelbar heißt etwa einige wenige Zentimeter Ab stand zwischen Stoßzelle und Einzellinse.

Ein günstige Ausführungsform ist hier eine starke, kurze Einzellinse, in Verbindung mit einem vorher divergenten Ionenstrahl, auch wenn die Einzellinse nicht ein völlig "sauberer" Energieanalysator ist, da ja grundsätzlich "falsche" Ionen des Achsenstrahles nicht ausgeblendet werden.

Es ist ein Vorteil der Erfindung, die spontan gebildeten Ionen - also bei Peptidionen solche mit Verlust der Seitenglieder - dadurch besonders kenntlich zu machen, dass jeweils zwei Tochterionenspektren unter verschiedenen Bedingungen aufgenommen wer den. Beispielsweise kann man zwei aufeinanderfolgende Spektren mit zwei verschiedenen Linsenspannungen aufnehmen. Oder man kann die Linse auf die bevorzugte Abbildung der stoßfragmentierten Ionen einstellen, und zwei Spektren mit und ohne Zuführung von Stoßgas aufnehmen. Die beiden Spektren zeigen dabei ein starke Änderung in der Intensität einiger Ionensorten, und diese Ionensorten sind genau die gesuchten Ionen, die unter Verlust der Seitenketten entstehen.

Im Folgenden wird besonders auf die Verwendung von MALDI-Ionenquellen und Flugzeit massenspektrometern eingegangen. Für diese Anordnung ist die Verwendung einer Linse sehr geeignet, wenn die Ionenquelle selbst gitterlos betrieben wird und daher einen leicht diver genten Ionenstrahl liefert, der durch eine Einzellinse wieder fokussiert werden muss. Hier wird die Stoßzelle direkt vor der Linse des Massenspektrometers angeordnet, und die Linse zur Auswahl der Ionen zu benutzt. Durch eine Verstellung der Linsenspannung, und damit der energieabhängigen Brennweite der Linse, können nun gerade diejenigen Ionen, die in der Stoßzelle fragmentiert wurden, auf den Detektor abgebildet werden.

Die Erfindung wird nunmehr anhand der Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine MALDI-Ionenquelle für das Verfahren des Nachweises von spontan gebil deten Fragmentionen mit Stoßzone und Einzellinse:
1 = elektrisch leitender Probenträger auf Hochspannungspotential
2 = Zwischenelektrode mit geschaltetem Potential
3 = Grundelektrode auf Erdpotential
4, 6 = äußere Elektroden der Einzellinse, beide auf Erdpotential,
5 = mittlere Elektrode der Einzellinse, auf Linsenpotential,
7 = Fokussierungslinse für den Laserlichtpuls,
8 = Strahl des Laserlichtpulses,
9 = Probenauftrag auf dem Probenträger,
10 = gitterlose Öffnung in der Zwischenelektrode,
11 = gitterlose Öffnung in der Grundelektrode,
12 = Ionenstrahl, durch die Öffnungen defokussiert und durch die Linse fokussiert,
13 = Beobachtungsblickfeld,
14 = Beobachtungsspiegel,
15 = Beobachtungsobjektiv,
16 = Ionenstrahl im Flugrohr des Flugzeitmassenspektrometers
17 = Zuführungsrohr für ein Stoßgas mit Düse
18 = Zuführung des Stoßgases
19 = Stoßgaswolke.

Fig. 2 zeigt zwei nach dieser Erfindung gemessene Tochterionenspektren 28 und 29 von ei nem Peptid namens "Substanz P". Das Spektrum 28 zeigt ein Spektrum der spontan gebildeten Ionen mit den dabei sichtbar werdenden D-Ionen, die sich hier in Teilbereichen (außer in der Region der Molekülionen) als stärkste Ion darstellen. Die Ionen D₂, D₄ und D₉ können nicht gebildet werden, da ihre Aminosäuren Prolin und Glycin keine oder keine spaltbaren Seiten ketten besitzt. Die Ionen D₇ und D₈ sind in ihrer Bildung benachteiligt, da es sich um seitliche Phenylketten handelt. Das Spektrum 29 gibt das PSD-Spektrum der metastabil zerfallenden Ionen wieder, das signifikant anders aussieht. Die D-Ionen sind hier nicht vorhanden. Es soll nur angemerkt werden, dass alle hier auftauchenden Ionensorten identifiziert werden können.

Fig. 3 zeigt in den Spektren 30 und 31 einen Ausschnitt aus den beiden obigen Spektren mit den Ionen D₃, D₅ und D₆.

Eine günstige Ausführungsform einer Ionenquelle für ein Flugzeitmassenspektrometer ist schematisch in Fig. 1 gezeigt. Die Probensubstanz 9 ist zusammen mit einer Matrixsubstanz in Form einer dünnen Kristallschicht auf der Oberfläche eines metallischen Probenträgers 1 aufgebracht. Der Probenträger kann durch eine Vakuum schleuse in das Vakuum des Massenspektrometers gebracht und dort automatisch mit der (nicht gezeigten) Zuführung der Hochspannung kontaktiert werden. Der Probenträger lässt sich durch eine (nicht gezeigte) Bewegungsvorrichtung parallel zu seiner Probenoberfläche verschieben, dadurch können mehrere Probenaufträge 9 nebeneinander aufgebracht und nach einander analysiert werden.

Die Ionenquelle besteht neben dem Probenträger 1 aus der Zwischenelektrode 2, deren Poten tial nach einem bekannten Verfahren zur Verbesserung des Massenauflösungsvermögens in den Tochterionenspektren mit einer Zeitverzögerung geschaltet wird, und aus der Grundelektrode 3, die auf dem Potential des Flugrohrs liegt. Das (nicht gezeigte) Flugrohr umfasst die Flugstrecke des Flugzeitspektrometers. Es liegt in der Regel auf Erdpotential. Zu Beginn der Flugstrecke, relativ nahe zur Grundelektrode, ist eine Einzellinse angebracht, die aus Front elektrode 4, Abschlußelektrode 6, beide auf dem Potential des Flugrohres, und aus der Mitte lektrode 5 auf Linsenpotential besteht.

Das Potential zwischen Probenträger 1 und Zwischenelektrode 2 kann auch zur Vermeidung von Stößen der Ionen mit den Molekülen der Verdampfungswolke für eine kurze Zeitdauer während des Ausdehnungsprozesse der Verdampfungswolke ausgeschaltet werden, um auf diese Weise die Erzeugung von metastabilen Ionen (sogenannte PSD-Ionen) ganz zu vermei den oder zumindestens zu verringern.

Nach dieser Erfindung ragt ein Zuführungsrohr 17 für das Stoßgas in den kurzen Zwischen raum zwischen Grundelektrode und Linse hinein, mit einer Düse am Ende des Zuführungsroh res, die sich nahe am Flugort des Ionenstrahles befindet. Die Zuführung des Stoßgases kann (durch ein nicht gezeigtes Ventil) ein- und ausgeschaltet werden. Die Zufuhr des Stoßgases erfolgt dabei zweckmäßigerweise in kurzdauernden Gasschüben. Kurz vor dem Zünden des Lasers wird das Pulsventil für eine möglichst kurze Zeit - in der Regel weniger als eine Millise kunde - geöffnet. Auf diese Weise wird das Pumpsystem sehr wenig durch das Stoßgas be lastet. Wenn im Folgenden ein Spektrum "unter Zuführung von Stoßgas" aufgenommen wird, ist immer diese pulsförmige Zufuhr gemeint.

Unter Zufuhr von Stoßgas nimmt man nun Tochterionenspektren auf, die man sich auf einem Bildschirm des Steuercomputers anzeigen lässt. Dabei verstellt man die Linsenspannung so, dass die gewünschten Ionen, die durch Abspaltung einer Seitenkette gewonnen wurden, ein relatives Maximum der Intensität zeigen. Diese Einstellung wird am besten mit einer Substanz vorgenommen, deren Fragmentierungsverhalten bekannt ist, und man beobachtet dabei bei spielsweise eine D-Ionensorte, die durch spontane Abspaltung einer Seitenkette in Verbindung mit einem Hauptkettenbruch entsteht.

Mit dieser optimalen Linsenspannung werden nun jeweils zwei Tochterionenspektren aufge nommen, wobei bei einem Spektrum das Stoßgas zugeführt wird, und bei dem anderen nicht.

Die Intensitätsdifferenzen in diesen Spektren zeigen sofort diejenigen Ionen auf, die durch Bruch von Seitenketten erzeugt worden sind.

Wie weithin bekannt, erfolgt die Aufnahme eines vollen Tochterionenspektrums in einem Flug zeitmassenspektrometer aus einzelnen Teilstücken. Jede Teilaufnahme wird bei einer anderen Einstellung des Reflektors erzeugt. Für diese Teilaufnahmen ist nun wichtig, die Spannung der Linse proportional zur Spannung des Reflektors zu verstellen. Das ist durch die digitale Steue rung der Flugzeitspektrometer sehr leicht durchzuführen.

Es ist aber auch möglich, zwischen den beiden Aufnahmen jeweils die Linsenspannung zu ver stellen. Dabei kann die Zufuhr des Stoßgases eingeschaltet bleiben, um alle Aufnahmeparame ter konstant zu lassen, es kann aber auch die Zufuhr des Stoßgases für die Spektren unterblei ben, die kein Seitenkettenabspaltung zeigen sollen.

Claims

1. Verfahren zur Untersuchung der Struktur von Ionen in einem Flugzeitmassenspektrometer mit Ionenreflektor und Detektor durch Messung der Tochterionen, die aus einem Strahl dieser Ionen in einer Fragmentierungszone durch Stöße mit Gasmolekülen, Photonen oder Elektronen erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenstrahl vor der Fragmentierungszone defokussiert wird und die in der Frag mentierungszone erzeugten Tochterionen, deren Energie geringer ist als die der unzerfalle nen Ionen, durch eine Einzellinse unmittelbar hinter der Fragmentierungszone auf den De tektor fokussiert werden, während die unzerfallenen Ionen weniger gut fokussiert werden und die aus ihnen entstehenden Tochterionen den Detektor zu einem geringeren Bruchteil erreichen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in aufeinanderfolgenden Spektrenaufnahmen die Einzellinse zum einen die spontan zerfallenen Tochterionen, zum anderen die unzerfallenen Ionen auf den Detektor fokus siert.