DE19544808A1 - Verfahren und Vorrichtungen zur Massenspektrometrie von Tochterionen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für die Strukturanalyse von großen Sub­ stanzmolekülen, vorzugsweise von Kettenmolekülen wie beispielsweise Peptiden, durch Auf­ nahme von Tochter- oder Fragmentionenmassenspektren in geeigneten Massenspektrometern, beispielsweise in Flugzeitmassenspektrometern mit Reflektoren.

Die Erfindung besteht darin, zwischen Tochterionen aus spontan induzierten Brüchen von Io­ nen und solchen aus verzögerten Brüchen zunächst metastabil werdender Ionen unterscheiden zu können, indem die Ionen durch elektrostatische Energiefilterung kurz hinter dem Ort der Fragmentierungseinwirkung getrennt nachgewiesen werden. Spontan zerfallende Ionen verlas­ sen die Fragmentierungszone wegen des Massenverlustes mit geringerer kinetischer Energie. Die Tochterionen aus spontanen Zerfällen einerseits und aus metastabilen Zerfällen andererseits zeigen charakteristische Unterschiede, die zur Strukturbestimmung verwendet werden können. Spontan zerfallende Peptid-Ionen zeigen zum Beispiel bevorzugt gleichzeitig auftretende Brü­ che der Haupt- und Seitenketten an den dann endständigen Kettengliedern, während metastabi­ le Zerfälle keine Brüche der Seitenketten zeigen. Dadurch läßt sich beispielsweise unterschei­ den, ob die endständige Aminosäure Leucin oder Isoleucin ist, obwohl beide Aminosäuren die gleiche Masse besitzen.

Allgemeiner Stand der Technik

Für die schonende Ionisierung großer Moleküle, also für die Erzeugung von Molekülionen mit nur äußerst geringen Anteilen an Fragmentionen, sind in den letzten Jahren mehrere Verfahren bekannt geworden. Das Elektrosprühen (ESI = electrospray ionization) erzeugt Ionen der Un­ tersuchungssubstanzen aus der Lösung heraus in Luft bei Atmosphärendruck, und die Ionen lassen sich dann in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers überführen. Die matrix­ unterstützte Ionisierung durch Laserdesorption (MALDI = matrix assisted laser desorpti­ on/ionization) erzeugt die Ionen im Vakuum durch Beschuß der in winzige Matrixkristalle ein­ gelagerten Substanzen auf einem Probenträger mit Lichtpulsen aus Lasern. Beide Arten der Ionisierung sind in Verbindung mit jeweils mehreren Arten von Massenspektrometern, wie Quadrupolmassenspektrometern, magnetischen Sektorfeldgeräten oder Flugzeitmassenspek­ trometern, angewandt worden, wobei es aber besonders bevorzugte Paarungen, beispielsweise MALDI mit Flugzeitspektrometern, gibt.

Für Strukturuntersuchungen der Ionen ist aber die Kenntnis des Molekulargewichts nicht aus­ reichend, sie verlangt weitergehende Kenntnisse, die über reaktive Veränderungen der Ionen erhalten werden können. Solche Strukturuntersuchungen können verschiedene Aspekte betref­ fen, hier wird der Blick vornehmlich auf die Sequenzanalyse von größeren Kettenmolekülen, beispielsweise Peptiden oder Proteinen, gerichtet. Eine dafür besonders wichtige Reaktion ist der monomolekulare Zerfall der Ionen, der durch das Einbringen von Energie in das Bindungs- und Schwingungssystem des ionisierten Moleküls eingeleitet wird.

Die Energie für monomolekulare Zerfälle kann in vielfältiger Weise durch Stöße mit Molekü­ len, Photonen oder Elektronen in ein Ion eingebracht werden: Einzelne hochenergetische Stöße mit Stoßgasmolekülen, eine Vielzahl an niederenergetischen Stößen mit Aufsammeln der Energie im Schwingungssystem des Ions, ein Beschuß mit Photonen verschiedenster Wellen­ länge und Dichte oder ein Beschuß mit Elektronen unterschiedlicher Energie können die Zerfäl­ le einleiten. Die Zerfälle können daher auch sehr verschieden erfolgen: es werden sofortige ("spontane") Zerfälle ohne massenspektrometrisch erkennbare Zerfallszeit, aber auch "meta­ stabile" Zerfälle mit einer endlichen (meßbaren) Zerfallszeit beobachtet. Die hier als "spontan" bezeichneten Zerfälle müssen Zerfallszeiten unter 10 bis 100 Nanosekunden haben, dann sind sie massenspektrometrisch nicht mehr ohne besondere Maßnahmen erkennbar.

Es ist nun seit längerer Zeit bekannt, daß Tochterionenspektren aus hochenergetischen Stößen etwas anders aussehen als solche aus niederenergetischen Stößen. Über Größe und Signifikanz der Unterschiede herrschen aber unterschiedliche Auffassungen. Die Unterschiede sind im we­ sentlichen durch die benutzten Massenspektrometer mitbestimmt, da die Massenspektrometer nicht von sich aus für die Trennung zwischen Spontanzerfällen und metastabilen Zerfällen nach Verlassen der Stoßkammer eingerichtet sind, aber dennoch das relative Mischungsverhältnis der Ionen aus spontanen und aus metastabilen Zerfällen im Spektrum beeinflussen.

In der Flugzeitspektrometrie wird seit einigen Jahren das sogenannte PSD-Verfahrens für die Aufnahme von Tochterionenspektren aus MALDI-Ionen großer Moleküle angewandt (PSD = "post source decay"). In der Verdampfungswolke des Laserschusses finden bereits soviel nie­ derenergetische Stöße statt, daß viele der gebildeten Ionen bereits metastabil werden. Hinzu kommt ein gewisser Anteil an thermischer Energie, die im Molekülion gespeichert wird und zur Metastabilität beiträgt.

Zusätzlich zur Bildung von metastabilen Ionen kann man in Flugzeitspektrometern sehr günstig Stoßzellen einführen, die zur Fragmentierung der Ionen beitragen. Es hat sich nun durch unsere Untersuchungen herausgestellt, daß sich die Fragmentierungsmechanismen des PSD-Verfah­ rens für Kettenmoleküle wie beispielsweise Peptide oder Proteine und die der Stöße in der Stoßzelle voneinander recht deutlich unterscheiden. Diese Unterschiede sind bei den üblichen Verfahren zur Aufnahme der Tochterspektren kaum sichtbar, für die meisten Substanzen treten sie im Spektrum sogar gar nicht sichtbar in Erscheinung.

Bei dem PSD-Verfahren sammeln die großen Moleküle durch viele niederenergetische Stöße in der sich ausdehnenden Dampfwolke der Matrix innere Energie auf, die in Form von Schwin­ gungsenergie der verschiedensten im Molekül vorhandenen Schwingungssysteme gespeichert wird. Bei den stark gekoppelten Schwingungen des Molekülsystems ändert sich nachfolgend die Energieverteilung laufend und quasi-statistisch; tritt an einer Stelle des Kettenmoleküls eine Überhöhung der Energiedichte auf, so kann es hier zu einem Bruch kommen. Dabei werden ganz überwiegend nur Brüche der Hauptkette erzeugt, Brüche von kurzen Seitengliedern sind praktisch nicht zu beobachten. Die Brüche treten auch nicht sofort auf, die ionisierten Molekü­ le zeigen monomolekulare Zerfallsraten mit Zeitkonstanten von vielen Mikrosekunden. Das Molekül zerfällt also während seiner Laufzeit durch das Flugzeitmassenspektrometer.

Anders wirken dagegen die hochenergetischen Stöße zwischen einem hochbeschleunigten Molekülion und einem quasi ruhenden Stoßgasmolekül in der Stoßzelle. Hier führt ein harter, zentraler Stoß in der Regel spontan zum Bruch des Moleküls. (Es sind nicht alle Stöße hoch­ energetischer Ionen hart und zentral, auch bei hochenergetischen Stößen werden metastabile Ionen gebildet). Die spontan auftretenden Brüche betreffen überwiegend gleichzeitig Seitenket­ te wie auch Hauptkette. Durch einen Fragmentierungsmechanismus, der noch nicht voll auf­ geklärt ist, brechen bei spontanen Brüchen gleichzeitig Seitenkette und Hauptkette eines einzi­ gen Aminosäuremoleküls. Dabei wird strukturabhängig nur ein charakteristischer Teil der Sei­ tenkette abgespalten. Es entsteht ein Ion durch einen sogenannten A-Bruch einer Aminosäure der Hauptkette, und die endständige Aminosäure verliert zusätzlich einen Teil der Seitenkette. Das so entstehende Ion wird in der Protein-Nomenklatur ein D-Ion genannt. In ähnlicher Wei­ se können auch X-Brüche der Hauptkette zu W-Ionen mit Bruch eines Teils der endständigen Seitenkette führen.

In der Massenspektrometrie der Peptide und Proteine hat sich eine eigene Nomenklatur für die Entstehung von Tochterionen aus den Molekülen gebildet. Danach werden die Brüche zwi­ schen verschiedenen Gruppen der Aminosäuren längs der Hauptkette mit A, B und C bezeich­ net, wenn es sich um N-terminale Ionen handelt A, B und C bezeichnet dabei die drei mögli­ chen Brüche C-CO, CO-N und N-C der Hauptkette innerhalb einer Aminosäure oder zwischen einer Aminosäure und der nächstfolgenden. Ein Index an den Buchstaben A, B und C bezeich­ net die Nummer der Aminosäure beim Durchzählen in der Kette. Für C-terminale Ionen wer­ den die gleichen Brüche mit X, Y und Z bezeichnet. Für die Brüche der Seitenketten, die nicht für alle Aminosäuren möglich sind, hat sich die Bezeichnung D für N-terminale Ionen, und W für C-terminale Ionen eingebürgert. Beispielsweise ist das D-Ion des Leucins um 42 Massen­ einheiten, des Isoleucins um 28 Masseneinheiten kleiner als das der A-Ionen.

Wenn es gelingt, die spontanen und die metastabilen Ionen zu trennen, kann man die gebildeten D-Ionen einfacher erkennen und damit beispielsweise zwischen endständigem Leucin und Iso­ leucin unterscheiden, was anhand der Brüche A, B, C, X, Y und Z prinzipiell nicht möglich ist. Die Fragmentionen, die durch Teilverlust endständiger Seitenketten entstehen, sind daher ana­ lytisch besonders wichtig.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu finden, das spontan erzeugte Tochterionen und zeitverzögert metastabil entstehende Tochterionen getrennt zu messen gestattet. Die Er­ findung soll es beispielsweise möglich machen, D- und W-Ionen zu erkennen und zu messen. Es soll weiterhin möglich sein, auch die metabilen Enkelionen der spontan gebildeten Tochter­ ionen ungestört zu messen.

Beschreibung der Erfindung

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, die spontan am Ort der Fragmentierungsstöße zerfal­ lenden Ionen von den später in einer Laufstrecke metastabil zerfallenden Ionen durch eine praktisch sofort nach der Fragmentierung stattfindende Energiefilterung zu trennen und diese Trennung für eine Erkennung und Messung der verschiedenartigen Tochterionen auszunutzen. Der Zerfall von Ionen ist immer mit der Abspaltung eines Neutralbruchstücks verbunden, wo­ bei beide Bruchstücke im wesentlichen die gleiche Geschwindigkeit behalten. Die kinetische Energie wird also beim Bruch im Verhältnis der Massen aufgeteilt, und die veränderte kineti­ sche Energie kann zur Erkennung der spontan zerfallenen Ionen herangezogen werden. Die metastabil im Raum nach dem Energiefilter zerfallenden Ionen haben im Energiefilter noch ihre ursprüngliche Energie.

Diese Energiefilterung kann praktisch durch jedes elektrisch ablenkende Feld in Verbindung mit einer Orts- oder Winkelauswahl für den abgelenkten Strahl erreicht werden. Es kann bei­ spielsweise ein kurzer Ablenkkondensator in Verbindung mit einem Spalt, der im weiteren Verlauf der Flugbahn angebracht ist, für die Energiefilterung verwendet werden. Die Orts- oder Winkelauswahl ist aber auch durch einen kleinen, räumlich ausgrenzenden Detektor am Ende der Flugbahn im Massenspektrometer möglich. Für die Energiefilterung kann auch eine elektrostatische Einzellinse Verwendung finden, wenn der Ionenstrahl divergent in die Frag­ mentierungszone eingeschossen wird. Die Einzellinse bewirkt eine energieabhängige Fokussie­ rung des Strahles. Durch eine kleine Apertur können dann diejenigen Ionen ausgewählt wer­ den, deren Energie einen Brennpunkt ihres Ionenstrahls in der Apertur erzeugt. Statt der Apertur kann ein kleinflächiger Detektor verwendet werden.

Die Energiefilterung muß unmittelbar nach dem spontanen Zerfall stattfinden, sonst wird be­ reits ein Teil der metastabil zerfallenden Ionen mitgemessen. Für einen Ionenstrahl bedeutet das, daß die elektrostatische Ablenkung für die Energiefilterung unmittelbar benachbart zur Fragmentierungszone anschließen muß. Unmittelbar heißt etwa einige wenige Zentimeter Ab­ stand zwischen Stoßzelle und Ablenkeinheit, und auch die Ablenkeinheit selbst sollte kurz ge­ halten werden. Dabei gilt, daß die Abstände für einen schnellen Strahl mit Ionen, die auf 30 Kilovolt beschleunigt wurden, etwas größer sein können, als die für einen langsamen Strahl aus 6 keV-Ionen. Für einen schnellen Strahl können etwa 10 Zentimeter in Kauf genommen wer­ den, für einen langsamen Strahl sollten 3 bis 4 Zentimeter nicht überschritten werden. Kürzere Abstände sind besser.

Die Ablenkeinheit selbst sollte ebenfalls keine große Länge haben, da sonst eine zu starke Vermischung mit metastabil zerfallenden Ionen eintreten kann. Ein Ablenkkondensator von 10 Zentimeter Länge kann für schnelle Ionen zur Not in Kauf genommen werden, günstiger ist aber ein Ablenkelement, das weniger als ein Zentimeter lang ist. Ein günstige Ausführungsform ist hier eine starke, kurze Einzellinse, möglichst in Verbindung mit einem vorher divergenten Ionenstrahl, auch wenn die Einzellinse nicht ein völlig "sauberer" Energieanalysator ist, da ja grundsätzlich "falsche" Ionen des Achsenstrahles nicht ausgeblendet werden.

Die Energiefilterung kann, beispielsweise durch die Öffnungsweite des Spaltes oder die Größe des Detektors, mehr oder weniger stark energieselektiv ausgeführt werden. Eine scharfe Ener­ gieselektivität mit hohem Energieauflösungsvermögen führt dazu, daß nur noch diejenigen Io­ nen gemessen werden, deren Energiebruchteil genau dem Massenverhältnis von Tochter- zu Elternion entspricht. Es wird also nur noch ein einziges Tochterion aus dem gesamten Spek­ trum der spontan gebildeten Tochterionen gemessen.

Es ist nun ein weiterer Grundgedanke der Erfindung, diese Art scharfer Energiefilterung dazu auszunutzen, auch die Enkelionen, die durch weiteren metastabilen Zerfall der ausgewählten spontan erzeugten Tochterionen gebildet werden, in an sich bekannter und üblicher Weise mit dem Reflektor zu messen. Diese Messung bildet nach üblicher Nomenklatur eine MS/MS/MS-Messung.

Wird andererseits die Energiefilterung nur schwach ausgeführt, so gelingt es, ein größeres Stück des Spektrums der spontanen Tochterionen auf einmal zu messen. Mit mehreren über­ lappenden Messungen, wie sie beispielsweise in der Flugzeitmassenspektrometrie bereits für die PSD-Spektren üblich sind, kann damit in wenigen Aufnahmen das ganze Spektrum der spontan gebildeten Tochterionen gemessen werden.

Die hier geschilderte Anordnung des Energiefilters ist deutlich verschieden von den Anordnun­ gen, die man normalerweise für die Tandem-Massenspektrometrie verwendet, selbst wenn, wie bei magnetischen Sektorfeldern häufig üblich, auch elektrostatische Ablenkfelder benutzt werden. Tandem-Massenspektrometer werden normalerweise zur Messung von Tochterionen­ spektren verwendet. In der Tandem-Massenspektrometrie mit Sektorfeldgeräten, bei der zwei Massenspektrometer hintereinandergeschaltet werden, ist die Stoßkammer gewöhnlich an der Stelle des Austrittsspaltes des ersten Spektrometers angeordnet, die mit dem Eintrittsspalt für das zweite Massenspektrometer identisch ist. Dabei sind aber nach der Stoßkammer lange, gerade Wegstrecken vorhanden, in der metastabile Zerfälle solcher Moleküle stattfinden, die in der Stoßkammer weniger harte Stöße erlitten haben oder bereits durch ihre Erzeugung meta­ stabil sind. Die so gebildeten Ionen vermischen sich untrennbar mit den spontan gebildeten Ionen, und da in der Regel die metastabilen Ionen weit in der Überzahl sind, wird das Spek­ trum in der Regel von den metastabilen Ionen beherrscht. Die spontan gebildeten Ionen bilden häufig nur sehr kleine, oft kaum entdeckbare Signale im Spektrum.

Tandem-Massenspektrometer mit Quadrupolfiltern sind in der Regel für den vorliegenden Zweck nicht gut geeignet, da sie keine sehr hochenergetischen Stöße erlauben. Zwischenbe­ schleunigungen von 30 oder 100 Volt, wie sie in sogenannten "Triple-Quads" üblich sind, rei­ chen für die hier interessierende Art besonderer Brüche nicht aus.

Es ist nun ein weiterer Grundgedanke der Erfindung, die spontan gebildeten Ionen - also bei Peptidionen solche mit Verlust der Seitenglieder - dadurch besonders kenntlich zu machen, daß jeweils zwei Tochterionenspektren unter verschiedenen Bedingungen aufgenommen werden. Beispielsweise kann man zwei aufeinanderfolgende Spektren mit verschiedenen Spannungen der Ablenkelemente aufnehmen, etwa mit zwei verschiedenen Linsenspannungen. Oder man kann die Linse auf die bevorzugte Abbildung der stoßfragmentierten Ionen einstellen, und zwei Spektren mit und ohne Zuführung von Stoßgas aufnehmen. Die beiden Spektren zeigen dabei ein starke Änderung in der Intensität einiger Ionensorten, und diese Ionensorten sind genau die gesuchten Ionen, die unter Verlust der Seitenketten entstehen.

Im Folgenden wird besonders auf die Verwendung von MALDI-Ionenquellen und Flugzeit­ massenspektrometern eingegangen. Für diese Anordnung ist die Verwendung einer Linse sehr naheliegend, wenn die Ionenquelle selbst gitterlos betrieben wird und daher einen leicht diver­ genten Ionenstrahl liefert, der durch eine Einzellinse wieder fokussiert werden muß. Hier ist es besonders günstig, die Stoßzelle direkt vor der Linse des Massenspektrometers anzuordnen, und die Linse zur Auswahl der Ionen zu benutzen. Durch eine Verstellung der Linsenspannung, und damit der energieabhängigen Brennweite der Linse, können nun gerade diejenigen Ionen, die in der Stoßzelle fragmentiert wurden, auf den Detektor abgebildet werden.

Es ist nun ein weiterer Erfindungsgedanke, keine eng begrenzte Stoßkammer zu benutzen, die im allgemeinen mit differentiell arbeitenden Pumpsystemen betrieben werden muß, sondern eine Austrittsdüse für das Stoßgas nahe an der Flugbahn anzuordnen, und nur pulsmäßig im Takt des Desorptionslasers mit Gas zu beschicken. Diese Ausführung ist mit niedrigen Herstel­ lungskosten verbunden, und es lassen sich kurze Abstände zwischen Stoßraum und Linse ver­ wirklichen. Die meisten kommerziellen Flugzeitspektrometer sind bereits in gesondert bepump­ te Vakuumkammern für Ionenquelle und Flugzeitstrecke geteilt, so daß die Flugstrecke nicht stark mit dem Stoßgas belastet wird.

Selbstverständlich können ähnliche Anordnungen benutzt werden, wenn die Fragmentierung nicht durch ein neutrales Stoßgas, sondern durch Photonen aus einem Laserstrahl oder durch Elektronen aus einer Elektronenquelle eingeleitet wird.

Beschreibung der Bilder

Fig. 1 zeigt eine MALDI-Ionenquelle für das Verfahren des Nachweises von spontan gebilde­ ten Fragmentionen mit Stoßzone und Einzellinse:
1 = elektrisch leitender Probenträger auf Hochspannungspotential
2 = Zwischenelektrode mit geschaltetem Potential
3 = Grundelektrode auf Erdpotential
4, 6 = äußere Elektroden der Einzellinse, beide auf Erdpotential,
5 = mittlere Elektrode der Einzellinse, auf Linsenpotential,
7 = Fokussierungslinse für den Laserlichtpuls,
8 = Strahl des Laserlichtpulses,
9 = Probenauftrag auf dem Probenträger,
10 = gitterlose Öffnung in der Zwischenelektrode,
11 = gitterlose Öffnung in der Grundelektrode,
12 = Ionenstrahl, durch die Öffnungen defokussiert und durch die Linse fokussiert,
13 = Beobachtungsblickfeld,
14 = Beobachtungsspiegel,
15 = Beobachtungsobjektiv,
16 = Ionenstrahl im Flugrohr des Flugzeitmassenspektrometers
17 = Zuführungsrohr für ein Stoßgas mit Düse
18 = Zuführung des Stoßgases
19 = Stoßgaswolke.

Fig. 2 zeigt zwei nach dieser Erfindung gemessene Tochterionenspektren 28 und 29 von ei­ nem Peptid namens "Substanz P". Das Spektrum 28 zeigt ein Spektrum der spontan gebildeten Ionen mit den dabei sichtbar werdenden D-Ionen, die sich hier in Teilbereichen (außer in der Region der Molekülionen) als stärkste Ionen darstellen. Die Ionen D₂, D₄ und D₉ können nicht gebildet werden, da ihre Aminosäuren Prolin und Glycin keine oder keine spaltbaren Seitenket­ ten besitzt. Die Ionen D₇ und D₈ sind in ihrer Bildung benachteiligt, da es sich um seitliche Phenylketten handelt. Das Spektrum 29 gibt das PSD-Spektrum der metastabil zerfallenden Ionen wieder, das signifikant anders aussieht. Die D-Ionen sind hier nicht vorhanden. Es soll nur angemerkt werden, daß alle hier auftauchenden Ionensorten identifiziert werden können.

Fig. 3 zeigt in den Spektren 30 und 31 einen Ausschnitt aus den beiden obigen Spektren mit den Ionen D₃, D₅ und D₆.

Besonders günstige Ausführungsformen

Eine günstige Ausführungsform einer Ionenquelle für ein Flugzeitmassenspektrometer mit Ein­ richtungen nach dieser Erfindung ist schematisch in Fig. 1 gezeigt. Die Probensubstanz 9 ist zusammen mit einer Matrixsubstanz in Form einer dünnen Kristallschicht auf der Oberfläche eines metallischen Probenträgers 1 aufgebracht. Der Probenträger kann durch eine Vakuum­ schleuse in das Vakuum des Massenspektrometers gebracht und dort automatisch mit der (nicht gezeigten) Zuführung der Hochspannung kontaktiert werden. Der Probenträger läßt sich durch eine (nicht gezeigte) Bewegungsvorrichtung parallel zu seiner Probenoberfläche ver­ schieben, dadurch können mehrere Probenaufträge 9 nebeneinander aufgebracht und nachein­ ander analysiert werden.

Die Ionenquelle besteht neben dem Probenträger 1 aus der Zwischenelektrode 2, deren Poten­ tial nach einem bekannten Verfahren zur Verbesserung des Massenauflösungsvermögens in den Tochterionenspektren mit einer Zeitverzögerung geschaltet wird, und aus der Grundelektrode 3, die auf dem Potential des Flugrohrs liegt. Das (nicht gezeigte) Flugrohr umfaßt die Flug­ strecke des Flugzeitspektrometers. Es liegt in der Regel auf Erdpotential. Zu Beginn der Flug­ strecke, relativ nahe zur Grundelektrode, ist eine Einzellinse angebracht, die aus Frontelektro­ de 4, Abschlußelektrode 6, beide auf dem Potential des Flugrohres, und aus der Mittelelektrode 5 auf Linsenpotential besteht.

Das Potential zwischen Probenträger 1 und Zwischenelektrode 2 kann auch zur Vermeidung von Stößen der Ionen mit den Molekülen der Verdampfungswolke für eine kurze Zeitdauer während des Ausdehnungsprozesse der Verdampfungswolke ausgeschaltet werden, um auf diese Weise die Erzeugung von metastabilen Ionen (sogenannte PSD-Ionen) ganz zu vermei­ den oder zumindestens zu verringern.

Nach dieser Erfindung ragt ein Zuführungsrohr 17 für das Stoßgas in den kurzen Zwischen­ raum zwischen Grundelektrode und Linse hinein, mit einer Düse am Ende des Zuführungsroh­ res, die sich nahe am Flugort des Ionenstrahles befindet. Die Zuführung des Stoßgases kann (durch ein nicht gezeigtes Ventil) ein- und ausgeschaltet werden. Die Zufuhr des Stoßgases erfolgt dabei zweckmäßigerweise in kurzdauernden Gasschüben. Kurz vor dem Zünden des Lasers wird das Pulsventil für eine möglichst kurze Zeit - in der Regel weniger als eine Millise­ kunde - geöffnet. Auf diese Weise wird das Pumpsystem sehr wenig durch das Stoßgas bela­ stet. Wenn im Folgenden ein Spektrum "unter Zuführung von Stoßgas" aufgenommen wird, ist immer diese pulsförmige Zufuhr gemeint.

Unter Zufuhr von Stoßgas nimmt man nun Tochterionenspektren auf, die man sich auf einem Bildschirm des Steuercomputers anzeigen läßt. Dabei verstellt man die Linsenspannung so, daß die gewünschten Ionen, die durch Abspaltung einer Seitenkette gewonnen wurden, ein relati­ ves Maximum der Intensität zeigen. Diese Einstellung wird am besten mit einer Substanz vor­ genommen, deren Fragmentierungsverhalten bekannt ist, und man beobachtet dabei beispiels­ weise eine D-Ionensorte, die durch spontane Abspaltung einer Seitenkette in Verbindung mit einem Hauptkettenbruch entsteht.

Mit dieser optimalen Linsenspannung werden nun jeweils zwei Tochterionenspektren aufge­ nommen, wobei bei einem Spektrum das Stoßgas zugeführt wird, und bei dem anderen nicht. Die Intensitätsdifferenzen in diesen Spektren zeigen sofort diejenigen Ionen auf, die durch Bruch von Seitenketten erzeugt worden sind.

Wie weithin bekannt, erfolgt die Aufnahme eines vollen Tochterionenspektrums in einem Flug­ zeitmassenspektrometer aus einzelnen Teilstücken. Jede Teilaufnahme wird bei einer anderen Einstellung des Reflektors erzeugt. Für diese Teilaufnahmen ist nun wichtig, die Spannung der Linse proportional zur Spannung des Reflektors zu verstellen. Das ist durch die digitale Steue­ rung der Flugzeitspektrometer sehr leicht durchzuführen.

Es ist aber auch möglich, zwischen den beiden Aufnahmen jeweils die Linsenspannung zu ver­ stellen. Dabei kann die Zufuhr des Stoßgases eingeschaltet bleiben, um alle Aufnahmeparame­ ter konstant zu lassen, es kann aber auch die Zufuhr des Stoßgases für die Spektren unterblei­ ben, die kein Seitenkettenabspaltung zeigen sollen.

Die hier geschilderte Ausführungsform ist nur ein Beispiel. Dem Fachmann in der Entwicklung von Massenspektrometern ist es mit den hier gegebenen Angaben über die Erfindungsidee möglich, die Energiefilterung auch in andere Arten von Massenspektrometern einzubauen. Es sind dabei viele andere Anordnungen möglich, die die Grundidee wiedergeben, die spontan entstehenden Ionen durch eine sofortige Energiefilterung von der Vermischung mit größeren Mengen an metastabilen Ionen zu bewahren.

Claims (12)

1. Verfahren zur Untersuchung der Struktur von Ionen durch eine massenspektrometrische Messung der Tochterionen, die aus einem Strahl dieser Ionen in einer Fragmentierungszo­ ne durch Stöße mit Gasmolekülen, Photonen oder Elektronen erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, daß durch ein Energiefilter, das unmittelbar hinter der Fragmentierungs­ zone beginnt, die spontan erzeugten Tochterionen von solchen Tochterionen getrennt werden, die aus metastabilen Zerfällen der Molekülionen hinter dem ablenkenden Teil des Energiefilters entstehen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Energiefilter aus einem elektrischen Ablenkfeld und einem selektierenden Spalt oder einem selektierenden, klein­ flächigen Ionendetektor besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ionenstrahl divergent in die Fragmentierungszone eintritt und daß das Energiefilter aus einer elektrostatischen Einzel­ linse und einer selektierenden Apertur oder einem selektierenden kleinflächigen Ionende­ tektor besteht.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Energieauflösung des Energiefilters so hoch gewählt wird, daß nur eine Tochterionensorte passieren kann, so daß deren durch metastabile Zerfälle im weiteren Verlauf des Fluges entstehenden Enkelionen ungestört durch andere Tochterionen gemessen werden können.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Energieauflösung des Energiefilters so niedrig gewählt wird, daß jeweils ein größe­ res Stück des vollen Spektrums der Tochterionen auf einmal gemessen werden kann.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Fragmentierungszone um eine Stoßzelle handelt, die sich mit einem Stoßgas in einem Druckbereich von 10^-5 bis 10^-2 Millibar füllen läßt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Fragmentierungszone um eine Stoßgaswolke handelt, die sich im Vakuumsy­ stem des Massenspektrometers vor einer gasbeschickten Düse ausbildet

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Düse pulsförmig mit Gas beschickt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Flugzeitmassenspektrometer handelt, mit einer MALDI-Ionenquelle und einem Ionenreflektor, der in an sich bekannter Weise für die Energieanalyse der Ionen und damit für die Aufnahme der Tochterionenspektren verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich das elektrische Beschleuni­ gungsfeld am Probenträger gegenüber dem Laserlichtblitz der MALDI-Ionenquelle verzö­ gert einschalten läßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich das elektrische Beschleuni­ gungsfeld zwischen Probenträger und einer Zwischenelektrode schwach einstellen läßt, und die Ionen erst in der Strecke zwischen Zwischenelektrode und Grundelektrode voll beschleunigt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Io­ nenreflektor die Ionen unter einem endlichen Winkel reflektiert.