-
Die
Erfindung bezieht sich auf die Messung der Tochterionenspektren
von Analytsubstanzen, die mit matrixunterstützter Laserdesorption ionisiert
werden.
-
Die
Erfindung besteht darin, pro Laserlichtpuls, also pro Desorptionsereignis,
durch räumliche Aufspaltung
der Ionenstrahlen oder durch zeitliche Schachtelung der Spektrenmessung
jeweils von mehreren Elternionen mehrere Tochterionen-Einzelspektren
aufzunehmen, wobei die verschiedenen Elternionen durch mehrere Schaltvorgänge des
Eltemionenselektors nacheinander durchgelassen werden. Die Addition
der Tochterionen-Einzelspektren aus vielen Laserlichtpulsen führt zu mehreren
praktisch synchron mit der gleichen Serie von Laserlichtpulsen aufgenommenen
Tochterionen-Summenspektren mit entsprechend verringertem Probenverbrauch
und verringerter Aufnahmezeit.
-
Stand der Technik
-
Für die Ionisierung
von Analytionen durch matrixunterstützte Laserdesorption werden
die Proben, die überwiegend
aus Matrixsubstanz mit wenigen eingelagerten Analytmolekülen bestehen,
mit kurzen Lichtpulsen eines UV-Lasers beschossen, wobei durch jeden
Laserlichtpuls eine Plasmawolke aus desorbiertem Probenmaterial
entsteht. Bei mäßiger Stärke der
Laserlichtpulse entstehen dabei aus den Analytmolekülen in der
Plasmawolke praktisch nur Molekülionen
und keine Fragmentionen, daher können
mehrere Sorten von Analytsubstanzen gleichzeitig in der Probe vorhanden
sein und analysiert werden, also Mischungsanalysen vorgenommen werden.
-
Im
Allgemeinen werden mit diesem Verfahren der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption
große
Biomoleküle
untersucht, besonders große
Biopolymere wie vorzugsweise Proteine oder aus ihnen durch enzymatischen
Verdau gewonnene Peptide, die oberhalb von 1000 Dalton gut auswertbare
Massenspektren ergeben. Auch ihre Konjugate mit Zuckern (Glycopeptide)
oder Fetten (Lipopeptide) können
so untersucht werden.
-
Die
Massenspektren der Molekülionen
enthalten als einzige Information nur das Molekülgewicht der Analytmoleküle, aber
keine Informationen über
Identität
und innere Struktur. Aus den Molekülgewichten der Verdaupeptide
kann zwar durch Vergleiche mit virtuell verdauten Proteinen einer
Proteindatenbank auf die Identität
des Proteins geschlossen werden, aber eine hohe Sicherheit bietet
diese Identifizierung nicht. Auch können Modifikationen der Proteine
so in nur sehr grober Weise gefunden werden. Nur durch die Aufnahme
der Massenspektren von Tochterionen, die durch gewollte Fragmentierungen
der Analytionen gewonnen werden, lassen sich die Proteinsequenzen,
aber auch die Strukturen der Konjugate aufklären. In besonderen MALDI-Flugzeitmassenspektrometem
lassen sich dabei zwei voneinander verschiedene Arten von Fragmentierungen zur
Erzeugung der Tochterionen durchführen, die besonders bei Proteinen
und Peptiden zu verschiedenartigen Fragmentierungsmustern führen. Die
beiden Arten von Fragmentierungen werden ISD („in-souce decay") und PSD („post source
decomposition")
genannt, dabei ist die Aufnahme der Tochterionen aus PSD die vorherrschende
Technik.
-
Für die Aufnahme
von Tochterionenspektren durch PSD wird die Laserlichtstärke (Beleuchtungsstärke oder
Fluenz) erhöht.
Dadurch werden viele instabile Analytionen erzeugt, die nach ihrer
Beschleunigung im Massenspektrometer mit charakteristischen Halbwertszeiten
zerfallen und so Tochterionen bilden (auch Fragmentionen genannt).
Die instabilen Ionen, die in den Flugstrecken der Massenspektrometer
zerfallen, werden als „metastabile" Ionen bezeichnet.
Die Aufnahme der PSD-Tochterionenspektren, die früher sehr
kompliziert war und nur stückweise
durchgeführt
werden konnte, wird heute in besonders dazu konstruierten Flugzeitmassenspektrometern
in einem Zuge vorgenommen, wie es beispielsweise im Einzelnen in
der Patentschrift
DE
198 56 014 C2 beschrieben ist (C. Köster et al., entsprechend
GB 2 344 454 B und
US 6,300,627 B1 ).
-
In 1 ist
ein solches modernes MALDI-Flugzeitmassenspektrometer für die Aufnahme von
Tochterionenspektren schematisch dargestellt. Ein UV-Pulslaser (3)
sendet einen Laserlichtpuls durch eine fokussierende Linse (4)
und einen Ablenkspiegel (5) auf die Probe (6),
die sich eingetrocknet auf einem Probenträger (1) befindet.
Ein wenig Material der Probe verdampft schlagartig und bildet eine Plasmawolke.
Unter den Ionen der Plasmawolke befinden sich in einem riesigen Überschuss
von Matrix-Komplex-Ionen aller Massen bis zu etwa 1000 Dalton, die
einen kaum durchdringbaren Untergrund bilden, auch die Analytionen,
die im höheren
Massenbereich von etwa 1000 Dalton bis 5000 Dalton gut messbar sind.
Die Ionen werden durch Beschleunigungspotentiale an den Beschleunigungsblenden
(7) und (8) zu einem Ionenstrahl (9)
geformt, wobei die Ionen für
die Aufnahme von Tochterionenspektren durch mäßige Beschleunigungsspannungen
eine relativ niedrige Energie von beispielsweise nur sechs Kiloelektronenvolt
erlangen. Durch eine gegenüber dem
Laserlichtblitz verzögert
eingeschalteten Beschleunigung wird eine zeitliche Fokussierung
der Ionen einer Masse an der Stelle des Elternionenselektors (10)
eingestellt. Dieser Elternionenselektor ist ein bipolares Schaltgitter,
das nur Ionen in einem einstellbaren Schaltzeitfenster geradeaus
durchlässt und
so für
die weitere analytische Untersuchung zur Verfügung stellt. Mit diesem Elternionenselektor
werden also die Elternionen ausgewählt, deren Tochterionen gemessen
werden sollen. Sind metastabile Elternionen bereits zwischen der
Beschleunigungsblende (8) und dem Elternionenselektor (10)
zerfallen, so können
die hier bereits gebildeten Tochterionen ebenfalls den Elternionenselektor
passieren, da sie ja die gleiche Geschwindigkeit wie die unzerfallenen
Elternionen besitzen und somit gleichzeitig mit ihnen am Elternionenselektor
ankommen.
-
Die
unzerfallenen Elternionen und die aus zerfallenen Elternionen entstandenen
Tochterionen fliegen jetzt weiter zu einer Nachbeschleunigungseinheit
(12), in der sie mit etwa 20 Kilovolt nachbeschleunigt
werden. Die Tochterionen besitzen vor der Nachbeschleunigung nur
einen Bruchteil der Energie der Elternionen, der ihrem Massenbruchteil
im Verhältnis
zum Elternion entspricht. Durch die Nachbeschleunigung erhalten
jetzt alle Ionen eine zusätzliche
Energie, wodurch ihre gesamte kinetische Energie auf 20 bis 26 Kiloelektronenvolt
ansteigt und somit für
eine Massenanalyse weiteren Flugverlauf des Flugzeitmassenspektrometers
besonders günstig
ist. Die Massenanalyse wird wiederum als Flugzeitanalyse am Detektor
(17) durchgeführt,
weil die leichteren, wenn auch etwas energieärmeren Ionen schneller sind
und außerdem
längs des
kürzeren
Strahles (15) den Detektor schneller erreichen als die
energiereicheren, aber langsameren Ionen längs des tiefer in den Reflektor
(14) eintauchenden Strahles (16).
-
Die
Nachbeschleunigung kann in verschiedener Weise erreicht werden.
Zum ersten ist es möglich,
die ausgewählten
Ionen durch ein kleines Gehäuse
(12) fliegen zu lassen, dessen Potential um etwa 20 Kilovolt
angehoben wird, während
die Ionen hindurchfliegen, so dass sie beim Aus tritt aus diesem Gehäuse ihre
Beschleunigung erhalten. Zum zweiten kann aber auch die gesamte
Flugstrecke bis zur Nachbeschleunigung auf einem hohen Grundpotential
von 20 Kilovolt gehalten werden. Die anfängliche Beschleunigung von
sechs Kilovolt muss sich also noch über dieses Grundpotential erheben.
In diesem Fall braucht die Nachbeschleunigungsspannung nicht geschaltet
zu werden. Andererseits muss sich die erste Flugstrecke einschließlich des
Elternionenselektors und gegebenenfalls einer Stoßzelle dauernd
auf einem hohen Potential befinden. Das wird dadurch erreicht, dass
sich die Flugbahn der Ionen hier in einem rundum abgeschlossenen
langen Gehäuse
befindet, also in einem Rohr (20), das sich auf diesem
Potential befindet. Das Potential dieses langen Rohrs bleibt über die
Zeit konstant und wird nicht geschaltet.
-
Damit
diejenigen Tochterionen, die sich aus Zerfällen der nachbeschleunigten,
bisher nicht zerfallenen Elternionen ergeben, nicht den Reflektor
(
14) erreichen können,
ist in den Ionenweg zwischen Nachbeschleunigungseinheit (
12 oder
20)
und Reflektor (
14) noch ein weiterer Ionenselektor (
13)
zur Unterdrückung
der Elternionen und ihrer gleich schnell fliegenden späten Tochterionen
eingebaut, wie in der Patentschrift
DE 101 50 559 C2 (A. Holle et al.; entsprechend
GB 2 386 248 B ;
US 6,717,131 B2 )
beschrieben. Dieser Elternionenunterdrücker (
13) ist nicht
nur zur Unterdrückung
der schon nach der Nachbeschleunigung entstandenen Tochterionen notwendig,
sondern auch zur Unterdrückung
eines kontinuierlichen Untergrundes, der sich aus den Tochterionen
solcher Elternionen ergeben würde,
die auf einem zufälligen
Potential im Reflektor (
14) zerfallen. Aus der Offenlegungsschrift
DE 196 35 645 A1 (Franzen)
ist zudem ein Flugzeit-Massenspektrometer ohne Reflektor bekannt,
in dem der Ionenstrahl in einem Plattenkondensator seitlich ausgelenkt
und durch eine richtungsfilternde Blende von zerfallenen Fragmentionen
befreit wird. Die nichtzerfallenen Ionen werden in einem ersten
Detektor nachgewiesen, während
nicht ausgelenkte neutrale Fragmente in einem zweiten raumlich getrennten
Detektor ebenfalls gemessen werden.
-
In
diesen Massenspektrometern müssen aber
nicht unbedingt durch verstärkte
Laserfluenz metastabile Ionen für
die Erzeugung von Tochterionen erzeugt werden. Statt dessen können die
Tochterionen auch durch Stöße in einer
Stoßkammer
generiert werden, wobei die Stoßkammer
irgendwo zwischen erster Beschleunigung der Ionen durch die Blende
(8) und der Nachbeschleunigungseinheit (12) angeordnet
sein kann. Die Stoßkammer
ist mit einem Stoßgas
geeigneten Drucks gefüllt
und erzeugt die Fragmentionen durch Energieaufnahme durch eine Anzahl
von Stößen (CID
= collisionally induced decomposition).
-
In
beiden Arten dieser modernen PSD-MALDI-Massenspektrometer für die Aufnahme
von Tochterionenspektren ist also eine Auswahl derjenigen Elternionen
notwendig, deren Tochterionenspektren aufzunehmen sind. In jedem
Laserlichtpuls werden bei diesem Verfahren aber nur relativ wenige
Tochterionen gebildet, so dass es nach dem Stand der Technik üblich ist,
mit einigen Hundert bis zu einigen Tausend Laserlichtpulsen entsprechend
viele Tochterionen-Einzelspektren aufzunehmen, die dann nach Verstärkung und
Digitalisierung der Ionensignale zu einem Tochterionen-Summenspektrum
aufaddiert werden. Das Tochterionen-Summenspektrum umfasst dann einen genügend großen Intensitätsbereich
für die
Messung von verschiedenartigen Ionen mit größeren Konzentrationsunterschieden.
-
Wenn
im Folgenden in einigen Fällen
einfach der Begriff „Tochterionenspektren" verwendet wird, so
ist sinngemäß immer
dann ein Tochterionen-Einzelspektrum gemeint, wenn ein Vorgang beschrieben wird,
der sich aus einem einzigen Laserlichtpuls ergibt, und ein Tochterionen-Summenspektren,
wenn von der Spektrenaufnahme im Allgemeinen die Rede ist, wobei
hier immer eine Vielzahl von Laserlichtpulsen zur Anwendung kommt.
-
Bei
Gemischanalysen, beispielsweise bei Analysen der etwa 20 bis 30
Verdaupeptide eines enzymatisch verdauten größeren Proteins, ist es oft wünschenswert,
für jede
Analytsubstanz, also hier für jedes
Verdaupeptid, ein Tochterionenspektrum aufzunehmen. Werden für jedes
Tochterionenspektrum etwa 1000 Laserlichtpulse benötigt, so
bedeutet das, dass die Probe für
die Erzeugung von 20 000 bis 30 000 Desorptionsplasmawolken durch
jeweils starke Laserlichtpulse reichen muss. Das ist bei geringen Probenmengen
häufig
nicht der Fall.
-
Außerdem braucht
die Aufnahme so vieler Tochterionenspektren sehr viel Zeit. Für die Analyse ganzer
Proteome mit sicherer Identifizierung aller Proteine und ihrer posttranslationalen
Modifizierungen durch Tochterionenspektren werden häufig mehrere
Tage Messzeit benötigt.
-
Aus
der Offenlegungsschrift
GB
2 390 935 A (Verentchikov) ist ein Tandem-Massenspektrometer zur
Messung von Tochterionenspektren bekannt, in dem zwei Flugzeit-Massenspektrometer
gekoppelt sind, wobei die Flugzeit im ersten Flugzeit-Massenspektrometer
um soviel größer als
die Flugzeit im zweiten Flugzeit-Massenspektrometer ist, dass sich Tochterionen,
die in einer zwischen den beiden Flugzeit-Massenspektrometern angeordneten
Kollisionszelle erzeugt werden und von verschiedenen Elternionen
stammen, am Ionendetektor im zweiten Flugzeit-Massenspektrometer
nicht mehr zeitlich überlappen.
In dieser speziellen Art von Tandem-Massenspektrometer ist kein
Elternionenselektor notwendig.
-
Aus
der Offenlegungsschrift
WO 2005/043575
A2 (Fuhrer et al.) ist ein Hybridmassenspektrometer bekannt,
in dem ein Ionenmobilitätsspektrometer
mit einem Flugzeit-Massenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss
gekoppelt wird, wobei Elternionen im Ionenmobilitätsspektrometer zeitlich
getrennt und nach dem Ionenmobilitätsspektrometer zu Tochterionen
fragmentiert werden. Die so erzeugten Tochterionen werden anschließend im Flugzeit-Massenspektrometer
analysiert. Der orthogonale Einschuss der Ionen in der orthogonalen
Ablenkeinheit des Flugzeitmassenspektrometers dient als Elternionenselektor.
Nach jedem Zyklus des Ionenmobilitätsspektrometers wird die Phasenlage
der Zeitfenster für
den Ioneneinschuss gegenüber
dem Zyklus des Ionenmobilitätsspektrometers
verändert, um
sukzessiv alle Tochterionen nachzuweisen („Interleaved Method"). Um die Wiederholrate
des orthogonalen Einschusses zu erhöhen, ohne dass sich die Tochterionenspektren
auf dem Ionendetektor des Flugzeitmassenspektrometers zeitlich überlappen, werden
die Ionen von aufeinanderfolgenden Einschüssen an jeweils unterschiedlichen
Positionen in der orthogonalen Ablenkeinheit eingeschossen und ein
positionsabhängiger
Ionendetektor verwendet.
-
Dadurch
gelingt es, die Ionen von aufeinanderfolgenden Pulsen räumlich zu
trennen und damit auch zeitlich getrennt nachzuweisen.
-
Unter
dem Begriff „Masse" werde hier immer die „ladungsbezogene
Masse" m/z verstanden,
die allein in der Massenspektrometrie eine Rolle spielt, und nicht
einfach die „physikalische
Masse" m. Die dimensionslose
Zahl z gibt die Anzahl der Elementarladungen des Ions an, also die
Anzahl der überschüssigen und
nach außen
als Ionenladung wirksamen Elektronen oder Protonen des Ions. Ausnahmslos
kann in allen Massenspektrometern immer nur die ladungsbezogene
Masse m/z gemessen werden, nicht die physikalische Masse m selbst.
Die ladungsbezogene Masse ist der Massenbruchteil pro Elementarladung
des Ions. Unter „leichten" oder „schweren" Ionen werden hier
sinngemäß immer
Ionen mit geringer oder hoher ladungsbezogener Masse m/z verstanden.
Auch der Begriff „Massenspektrum" bezieht sich grundsätzlich immer
auf die ladungsbezogenen Massen m/z.
-
Aufgabe der Erfindung
-
Es
ist die Aufgabe der Erfindung, den Probenverbrauch und die Aufnahmezeit
bei der Aufnahme von mehreren Tochterionenspektren pro Probe zu
verringern. Gelöst
wird diese Aufgabe durch die Merkmale eines Verfahrens gemäß Anspruch
1 und der Flugzeitmassenspektrometer nach Anspruch 5 oder 6.
-
Kurze Beschreibung der Erfindung
-
Die
Erfindung besteht darin, aus dem Ionenstrahl eines jeden Laserlichtpulses
im Elternionenselektor nacheinander mehrere Elternionen auszuwählen, und
die Tochterionen-Einzelspektren dieser verschiedenen Elternionen
entweder durch Ablenkung des jeweiligen Ionenstrahles räumlich getrennt
oder durch zeitliche Schachtelung der Messung nacheinander zu messen.
Die mehreren Tochterionen-Einzelspektren aus jedem Laserlichtpuls
werden über viele
Laserlichtpulse hinweg jeweils zu Tochterionen-Summenspektren addiert.
Es werden somit mehrere Tochterionen-Summenspektren praktisch synchron
gewonnen, statt wie bisher alle Tochterionen-Summenspektren nacheinander
aufzunehmen.
-
Durch
einfache oder gekreuzte Ablenkkondensatoren direkt nach der Nachbeschleunigungsstation
können
die Ionenstrahlen der jeweils ausgewählten Eltern- und Tochterionen
durch den Reflektor hindurch auf mehrere, beispielsweise zwei, vier
oder neun räumlich
getrennte Ionendetektoren gelenkt werden, die in der gleichen Ebene
nebeneinander liegen. Insbesondere in gitterlosen Reflektoren mit räumlich fokussierendem
Eingangsbereich können die
Einzelionenstrahlen gut auf recht kleine Gebiete fokussiert werden,
so dass eine solche räumliche Aufteilung
des Detektors sinnvoll und möglich
wird. Die einzelnen Ionendetekto ren können auch räumlich getrennte Segmente eines
Ionendetektors sein, die jeweils getrennt Ionenströme messen
können.
-
Andererseits
sind die Aufnahmezeiten von Tochterionen-Einzelspektren relativ
kurz, Tochterionen-Einzelspektren von kleinen Molekülen natürlicherweise
kürzer
als die von großen
Molekülen,
da das Spektrum nur bis zur Masse der Elternionen (oder etwas weniger)
aufgenommen zu werden braucht. Außerdem sind die Flugzeiten
der Tochterionen etwas zusammengedrückt, da die Tochterionen geringer
Masse auch eine etwas geringere kinetische Energie besitzen. Andererseits
fliegen vor Erreichen des Elternionenselektors die nur einmal beschleunigten
Elternionen, die ja nur eine geringe kinetische Energie besitzen,
relativ langsam. Ist insbesondere die Strecke bis zur Nachbeschleunigungsstation
lang, und die die Strecke von hier bis zum Detektor relativ kurz,
so wird es möglich,
durch Auswahl verschiedener Elternionensorten mehrere Tochterionen-Einzelspektren
hintereinander aufzunehmen, ohne dass sich die Tochterionenspektren überlappen. Überstreichen
die Analytionen einen größeren Massenbereich,
so können
bei günstig
niedriger erster Beschleunigungsspannung und geeigneter Längen der Flugstrecken
durchaus etwa drei bis sechs Tochterionen-Einzelspektren aus einem
einzigen Desorptionsereignis hintereinander aufgenommen werden.
-
Wird
sowohl eine räumliche
wie auch eine zeitliche Trennung gleichzeitig vorgenommen, so ist es
möglich,
etwa 10 bis 20 Tochterionen-Einzelspektren aus derselben Plasmawolke
eines Laserlichtpulses aufzunehmen. Aus der Summierung über etwa 1000
Laserlichtpulse ergeben sich dann 10 bis 20 quasisynchron aufgenommene
Tochterionenspektren. Probenverbrauch und Zeitdauer der Tochterspektrenaufnahme
gehen um diese Faktoren zurück.
-
Kurze Beschreibung der Abbildungen
-
1 zeigt
das Schema eines MALDI-Flugzeitmassenspektrometers für die Aufnahme
von Tochterionenspektren nach dem Stande der Technik. Auf einer
Probenträgerplatte
(1) befinden sich eingetrocknete Portionen von Proben,
die durch eine Bewegungseinheit (2) nacheinander mechanisch
in den Fokus des UV-Lasers (3) eingeschoben werden können. Ein
UV-Pulslaser (3) sendet einen Laserlichtpuls durch eine
fokussierende Linse (4) und einen Ablenkspiegel (5)
auf eine Probe (6). Die Ionen, die sich im Desorptionsplasma
bilden, werden durch Potentiale an den Beschleunigungsblenden (7)
und (8) zu einem Ionenstrahl (9) geformt. Der
Elternionenselektor (10) lässt nur die ausgewählten Analytionen,
die „Elternionen" genannt werden,
und die gleich schnell fliegenden Zerfallsprodukte dieser Elternionen
durch. Die Elternionen und die aus zerfallenen Elternionen entstandenen
Tochterionen werden in einer Nachbeschleunigungseinheit (12)
mit etwa 20 Kilovolt nachbeschleunigt und durch Reflektion im Ionenreflektor (14)
nach Massen analysiert. Ein weiterer Ionenselektor (13)
unterdrückt
die Elternionen und ihre nach der Nachbeschleunigung gebildeten
Tochterionen, damit ihre weiteren, besonders auch im Reflektor gebildeten
Zerfallsprodukte nicht einen kontinuierlichen Untergrund bilden.
-
2 zeigt
eine andere Ausführungsform des
Standes der Technik, in der die Ionen auf einem hohen Potential
der Probenträgerplatte
(1) von etwa 26 Kilovolt erzeugt und zunächst durch
die Beschleunigungsblenden (7) und (8) mit nur
sechs Kilovolt in das Rohr (20) beschleunigt werden. Im
Rohr (20), das sich auf einem Potential von etwa 20 Kilovolt
befindet, ist der Elternionenselektor (10) angebracht. Die
ausgewählten
Elternionen und deren Tochterionen werden am Ende des Rohres (20)
nachbeschleunigt. Mit dieser Anordnung braucht die Nachbeschleunigungsspannung
nicht geschaltet zu werden.
-
3 zeigt
eine Ausführungsform
nach dieser Erfindung, in der zwei Serien von Tochterionen, die
von zwei verschiedenen Sorten von Elternionen stammen, nach ihrer
Nachbeschleunigung am Ende des Rohrs (20) durch ein Paar
von Ablenkkondensatoren (21) und (22) aus ihrer
Flugachse versetzt und damit für
die Aufnahme zweier verschiedener Tochterionenspektren auf zwei
verschiedene Ionendetektoren (23) und (24) gelenkt
werden.
-
4 zeigt
im oberen Teil schematisch die Ionensignale der Molekülionen aus
einer Mischung von Analytsubstanzen (1–12) als Funktion
der Zeit, wie sie am Elternionenselektor ankommen. Werden die Elternionensorten
(1), (3), (6) und (9) vom Elternionenselektor
durchgelassen, so werden am Ionendetektor ohne weitere Maßnahmen
nacheinander und ohne Überlappung
die Tochterionen-Einzelspektren (T1), (T3), (T6) und (T9) gemessen.
Diese sind (ebenfalls als Funktion der Zeit) symbolisch im unteren
Teil der Abbildung wiedergegeben.
-
5 zeigt
eine Anordnung mit zwei Reflektoren (18) und (19)
und zusätzlichen
Ablenkkondensatoren, mit der die Strecke bis zum Elternionenselektor
(10) verlängert
wird, um mehr Zeit für
die Aufnahme von Tochterionenspektren zu erhalten. Durch diese Anordnung
wird auch die Massenauflösung
des Elternionenselektors (10) verbessert und es werden
die Tochterionenspektren von Geistersignalen gereinigt.
-
Beste Ausführungsformen
-
Das
MALDI-Flugzeitmassenspektrometer nach dem Stande der Technik, das
in 2 dargestellt ist, kann am besten als Ausgangsbasis
für diese Erfindung
verwendet werden, da hier die Nachbeschleunigung für die Tochterionen
nicht geschaltet werden muss, wie es in dem Massenspektrometer nach 1 mit
kurzer Nachbeschleunigungseinheit (12) der Fall ist. Im
MALDI-Flugzeitmassenspektrometer der 2 werden
die Ionen auf hohem Potential erzeugt und nach ihrer ersten Beschleunigung
in der Ionenquelle durch die Blenden (7) und (8)
im Rohr (20) auf hohem Potential gehalten. Die mit dem Elternionenselektor
(10) ausgewählten
Elternionen und ihre Tochterionen werden dann am Ende des Rohres
(20) durch das stationär
anliegende Potentialgefälle
gegen Massepotential beschleunigt. Die Elternionen können dann
im Elternionenunterdrücker (13)
ausgeblendet werden, so dass ihre nach der zweiten Beschleunigung
entstehenden Zerfallsprodukte nicht mehr das Tochterionenspektrum
stören.
-
Werden
jetzt im Elternionenselektor (10) nacheinander mehrere
Elternionensorten durchgelassen, die aus der Plasmawolke eines einzigen
Laserlichtpulses stammen, so können
ihre Tochterionen-Einzelspektren am Ionendetektor (17)
nacheinander gemessen werden, wenn die Aufnahmezeit für die Tochterionen-Einzelspektren
nur kurz genug ist. Da die Elternionen nach ihrer ersten Beschleunigung noch
relativ langsam fliegen, die nachbeschleunigten Tochterionen dagegen
sehr schnell, so können durchaus
die Tochterionen-Einzelspektren mehrerer Elternionensorten ungestört nacheinander
aufgenommen werden.
-
Für die Aufnahme
mehrerer Tochterionenspektren in zeitlicher Reihenfolge kann die
Konstruktion und Betriebsweise des Massenspektrometers in besonderer
Weise helfen. So ist es günstig,
wenn durch die Wahl einer niedrigen ersten Beschleunigungsspannung
in der Ionenquelle, einer langen Weglänge von der Ionenquelle bis
zur Nachbeschleunigungseinheit, einer hohen Nachbeschleunigungsspannung
und einer kurzen Weglänge
von der Nachbeschleunigungseinheit bis zum Ionendetektor erreicht
wird, dass die Flugzeit der Ionen von der Ionenquelle bis zur Nachbe schleunigungseinheit
mehr als zweimal länger
ist, als die Flugzeit der gleichen Ionen von den Nachbeschleunigungseinheit
bis zum Ionendetektor sein würde.
Besser noch ist eine mindestens dreifach längere Flugzeit in der ersten
Flugstrecke bis zur Nachbeschleunigungsstation.
-
Sind
die Aufnahmezeiten für
Tochterionenspektren jedoch länger
als der Zeitunterschied zweier zu untersuchender Elternionen, so
werden sich die Tochterionenspektren überlappen. In den Tochterionenspektren
nimmt die Signalbreite jeweils mit wachsender Masse zu. Diese Zunahme
kann ausgenutzt werden, um bei Vorliegen von Überlappungen die Signale den
einzelnen Tochterionenspektren zuzuordnen. Leichte Überlappungen
können
so durch Daten verarbeitende Verfahren recht einfach wieder auseinandergerechnet
werden. Auch die Isotopengruppen ändern sich charakteristisch
in jedem Massenspektrum mit der Masse, so auch in Tochterionenspektren. Auch
diese Muster der Isotopengruppen können dazu verwendet werden,
die Zugehörigkeit
der einzelnen Ionensignale zu den Tochterionenspektren zu erkennen
und überlappungsfreie
Tochterionenspektren zu berechnen. Ein Auseinanderrechnen von überlappt
aufgenommenen Massenspektren ist bereits in der Patentschrift
DE 102 47 895 B4 (J.
Franzen, entsprechend
US
6,861,645 B2 ) beschrieben worden.
-
In 4 ist
eine Schachtelung der Aufnahme für
vier Tochterionenspektren (T1, T3, T6 und T9) schematisch gezeigt,
wobei hier ideale Verhältnisse ohne Überlappung
vorliegen. Das Diagramm der 4 zeigt
oben die Signale (1 bis 12) der Elternionen als
Funktion der Zeit, wie sie am Elternionenselektor ankommen. Diese
Signale können
beispielsweise von den ungetrennten Verdaupeptiden eines Proteins
stammen, die gemeinsam zu einer Probe verarbeitet wurden. Durch
eine erste Spektrenaufnahme ist diese Signalfolge und ihre zeitliche
Aufeinanderfolge bekannt, es kann also durch ein Computerprogramm
relativ einfach bestimmt werden, welche der Signale für eine ungestörte Aufnahme
der Tochterionenspektren ausgewählt
werden können. Das
sind in diesem Fall die Ionensignale (1), (3),
(6) und (9). Ihre Tochterionenspektren (T1), (T3),
(T6) und (T9) werden ungestört
nacheinander am Ionendetektor (17) gemessen. Die jeweiligen
Elternionen werden dabei durch ein Schalten des Elternionenunterdrückers (13)
ausgeblendet. Auch diese Schaltzeiten können leicht berechnet werden.
-
In
nachfolgenden Messzyklen können
dann weitere Tochterionenspektren gemessen werden. Beispielsweise
können
im nächsten
Messzyklus die Tochterionenspektren der Ionensignale (2),
(4), (7) und (11) aufgenommen werden,
und im dritten Zyklus die Tochterionenspektren der Signale (5),
(8) und (12). Es bleibt in diesem Fall nur noch
das Tochterionenspektrum des Signals (10) in einem vierten
Messzyklus aufzunehmen. Es ist in diesem Fall also gelungen, die
zwölf Tochterionenspektren
in vier Messzyklen aufzunehmen statt in zwölf, somit also die Aufnahmezeit
und den Probenverbrauch zu dritteln. Werden leichte Überlappungen
zugelassen, so lassen sich diese Ergebnisse noch verbessern. Es
lassen sich dann die Tochterionenspektren leicht in nur drei Messzyklen,
bei Zulassen stärkerer Überlappungen
sogar in nur zwei Messzyklen messen. Unter einem Messzyklus soll
hier die Aufnahme von Tochterionen-Summenspektren verstanden werden,
in der viele, möglicherweise
Tausende, von Laserlichtpulsen eine entsprechende Anzahl von Plasmawolken
erzeugen.
-
Steht
somit ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer in einer Ausführung nach 2 zur
Verfügung,
so bedarf es nur einer angepassten Software zur Steuerung der Schaltungsabläufe und
Messaufnahme, um ein Verfahren nach dieser Erfindung durchzuführen.
-
Dieses
Verfahren lässt
sich natürlich
auch mit einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer nach 1 ausführen, wobei
aber die Nachbeschleunigungseinheit (12) für jedes
einzelne Tochterionen-Einzelspektrum zu schalten ist. Da hier etwa
20 Kilovolt zu schalten sind, verlangt dieses unregelmäßige und
mit hoher Frequenz wiederholte Schalten sehr stabile schaltbare
Spannungsversorgungen, die heute noch eine Herausforderung an die
Technik bilden. Für
die Mehrzahl der heute dazu verwendeten Spannungsversorgungseinheiten
verkürzt
sich unter diesem Betrieb die Lebensdauer; es ist jedoch auch möglich, längerlebige
schaltbare Spannungsversorgungen zu entwickeln.
-
Das
MALDI-Flugzeitmassenspektrometer nach
1 erlaubt
aber einen Betrieb mit einer verbesserten Fokussierung der Tochterionen,
die in der Patentschrift
US
6,703,608 B2 (A. Holle und J. Franzen) beschrieben ist.
Da durch die verzögert
eingeschaltete Beschleunigung die Elternionen und ihre Tochterionen
auf den Elternionenselektor (
10) fokussiert sind, den sie
aber mit einer Energiestreuung durchlaufen, sind sie bei Erreichen
der Nachbeschleunigungsstation (
12) nicht mehr zeitlich
fokussiert. Die mangelnde Zeitfokussierung kann auch durch den Reflektor
nicht mehr ausgeglichen (
14) werden. Es ist aber möglich, durch
eine leichte zeitliche Anhebung des Potentials der Nachbeschleunigungseinheit
(
12) den langsameren, also etwas hinterher fliegenden Ionen
etwas mehr Nachbeschleunigungsenergie zukommen zu lassen und so
eine verbesserte Fokussierung zu erzwingen.
-
Diese
Art der Nachfokussierung kann auch nach leichter konstruktiver Änderung
für MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
in der Ausführungsform
nach 2 eingeführt
werden. Dazu ist ein kurzer Abschnitt des Rohrs (20) am
Ende abzutrennen und mit einer eigenen Spannungsversorgung zu versehen.
Diese Spannungsversorgung ist beim Durchfliegen der Ionen mit einem
einstellbaren Zeitgradienten um einige zehn Volt anzuheben. Dadurch bekommen
die hinterher fliegenden Ionen etwas mehr Energie und können die
in der Front fliegenden Ionen wieder einholen. Es ist dabei zu berücksichtigen,
dass sich durch dieses Verfahren die Ionensignale der Isotopengruppen
leicht zusammenschieben, wenn im Elternionenselektor die mehr oder
weniger vollständigen
Isotopengruppen der Elternionen ausgewählt werden.
-
Sollen
noch mehr Tochterionenspektren quasisynchron aufgenommen werden,
als zeitlich nacheinander gemessen werden können, so kann man den Ionenstrahl
der ausgewählten
Elternionen auch räumlich
so ablenken, dass die Tochterionen der verschiedenen Elternionensorten
auf verschiedene Ionendetektoren fallen und dort gemessen werden.
In 3 ist ein solches MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
gezeigt. Durch zwei Ablenkkondensatoren (21) und (22)
können
die beiden Ionenstrahlen zweier verschiedener Tochterionenserien
so weit seitlich versetzt werden, dass sie auf zwei Ionendetektoren (23)
und (24) fallen und dort als getrennte Tochterionenspektren
gemessen werden. Durch die jeweils doppelte Ablenkung kommen die
Ionenstrahlen von zwei verschiedenen virtuellen Ausgangsorten und werden
durch den fokussierenden Reflektor auf zwei verschiedene Bildorte
abgebildet.
-
Bei
anderen Fokussierungsbedingungen des Reflektors (14), insbesondere
bei Reflektoren mit Gittern, ist es auch möglich, die Ionenstrahlen durch eine
einzige Ablenkung in nur einem Ablenkkondensator zu unterschiedlichen
Ionendetektoren zu lenken.
-
Die
in 3 gezeigte Anordnung mit nur zwei Detektoren (23)
und (24) ist nur ein Beispiel. Durch eine weitere Ablenkung,
die senkrecht zur Ablenkung in den Ablenkkondensatoren (21)
und (22) angeordnet ist, kann leicht eine Aufteilung in
vier Ionenstrahlen erzeugt werden, die auf vier Ionendetektoren
fallen und somit vier Tochterionenspektren synchron zu messen gestatten.
Bei guter Fokussierung der einzelnen Ionenstrahlen auf kleine Detektorflächen kann
sogar eine Auffächerung
in neun Ionenstrahlen mit neun Detektoren erzeugt werden.
-
Als
Ionendetektoren werden gewöhnlich
Sekundärelektronenverstärker verwendet,
die als Multikanalplatten ausgeführt
sind. Die Ionendetektoren können
nun jeweils einzelne Multikanalplatten sein, es können aber
auch einfach hinter einer Multikanalplatte vier oder neun getrennte
Elektronenauffänger angebracht
sein. Dabei ist auf eine gute kapazitive Ankopplung zu achten, damit
jeder der Elektronenströme
ohne Überschwingungen
zu einem eigenen Verstärker
weitergeleitet werden kann.
-
Bereits
mit zwei Ionendetektoren und einer zeitlichen Aufteilung der Tochterspektrenmessung können leicht
etwa sechs bis zehn Tochterionenspektren quasisynchron gemessen
werden; bei vier Ionendetektoren somit etwa zwölf bis zwanzig Tochterionenspektren.
Das ist eine dramatische Verkürzung
der Messzeit für
die Aufnahme von Tochterionenspektren. Noch wichtiger ist aber die
bessere Ausnutzung der Probe. Als Faustregel galt bisher, dass man
aus einer recht gut konzentrierten Probe, die auf einer Dünnschicht
aus α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA)
als Matrixmaterial präpariert
ist, etwa fünf
bis fünfzehn
Tochterionenspektren messen konnte, bevor die Probe verbraucht war.
Mit einem Verfahren nach dieser Erfindung ist diese Anzahl nun vervielfacht.
Für Analytsubstanzen
niederer Konzentration mussten sehr viel längere Aufnahmezeiten und höherer Probenverbrauch
in Kauf genommen werden; häufig
waren Tochterionenspektren von solchen Analytsubstanzen niedriger
Konzentration gar nicht möglich,
weil durch die Aufnahme anderer Tochterionenspektren die Probe schon
aufgebraucht war. Diese Erfindung ermöglicht es, auch in diesen Fällen zu
guten Tochterionenspektren zu kommen.
-
Eine
kurze Laufstrecke der Ionen von der Beschleunigungsblende (8)
bis zum Elternionenselektor (10) ist ungünstig für eine saubere
Auswahl der Elternionen und für
die Schachtelung der Messungen. Es kann diese Wegstrecke aber leicht
verlängert
werden, entweder durch eine entsprechende Grundkonstruktion, aber
beispielsweise auch durch eine Doppelreflektion der Ionen in zwei
Reflektoren (18) und (19) zwischen der Beschleunigungsblende
(8) und dem Elternionenselektor (10), wie sie
in 5 dargestellt ist. Durch diese Doppelreflektion
wird nicht nur die Wegstrecke verlängert, es wird auch die zeitliche
Fokussierung der Ionen jeweils einer Masse verbessert, so dass das
Herausfiltern der Elternionen durch eine bessere Massenauflösung verbessert wird.
-
Für die Aufnahme
der Molekülionen
des originären
Massenspektrums, also nicht der Tochterionenspektren, sind alle
Einbauten in den Ionenweg, besonders die mit Gittern, hinderlich.
Alle diese Einrichtungen können
daher so gestaltet werden, dass sie zur Aufnahme normaler Molekülmassenspektren aus
dem Ionenweg herausbewegt werden. Es treten dann keine Ionenverluste
beim Durchlaufen der Gitter auf. Auch die Einheiten (12)
zur Nachbeschleunigung der Ionen und (13) zur Unterdrückung der
restlichen Elternionen können
aus dem Ionenweg bewegt werden. Alle diese Einheiten werden nur
für die Aufnahme
von Tochterionenspektren benötigt
und nur für
diesen Zweck in den Ionenweg eingefahren.
-
Für die Aufnahme
von Tochterionenspektren kann im Prinzip eine einzige Ionensorte
als Elternionen dienen. Nun bestehen aber alle organischen Materialien
aus einem Gemisch der Isotopen ihrer Elemente; bilden also im Massenspektrum
so genannte Isotopengruppen, die mehrere aufeinander folgende Massen
belegen. Werden durch den Elternionenselektor nur diejenigen Ionen
herausgefiltert, die nur aus den Hauptisotopen der Elemente, also
aus 1H, 12C, 14N, 16O oder 32S bestehen, so erscheint auch im Tochterionenspektrum
jeweils nur ein Signal für
jede Tochterionenart. Es ist jedoch üblich geworden, die ganze Isotopengruppe
im Elternionenselektor auszuwählen,
damit in den Tochterionenspektren auch jeweils die Isotopengruppen
sichtbar werden. Die Sichtbarkeit der Isotopengruppen in den Tochterionenspektren
erhöht
das Vertrauen in die richtige Identifizierung. Die Erfindung ist
für ein
solches Vorgehen nicht hinderlich; es kann wie bisher die gesamte
Isotopengruppe für
die Erstellung der Tochterionenspektren herangezogen werden.