DE19635643C2 - Verfahren zur Spektrenaufnahme und lineares Flugzeitmassenspektrometer dafür - Google Patents
Verfahren zur Spektrenaufnahme und lineares Flugzeitmassenspektrometer dafürInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein lineares Flugzeitmassenspektrometer, das mit einer Ionisiserung o
berflächlich adsorbierter Analytsubstanzen und einer Verbesserung der Massenauflösung durch
zeitlich verzögerten Einsatz der Ionenbeschleunigung im Raum vor dem Probenträger arbeitet.
Im besonderen betrifft es die Ausbildung eines Massenspektrometers und massenspektrometri
sche Meßverfahren für höchste Massenauflösung im Spektrum.
Die Erfindung besteht darin, die Flugzeit der Ionen dadurch in zweiter Ordnung zu fokussie
ren, daß mindestens eine der in der Ionenquelle angelegten Beschleunigungsspannungen nach
dem verzögerten Einschalten der Ionenbeschleunigung dynamisch verändert wird. Besonders
einfach kann eine leicht zu erzeugende exponentielle Abnahme der Teilbeschleunigungsspan
nung zwischen Probenträger und einer Zwischenblende eingesetzt werden. In Computersimu
lationen werden Auflösungsvermögen von weit über eine Million erhalten.
Unter den Verfahren zur Ionisierung von großmolekularen Substanzen auf Probenträgern hat
die matrixunterstützte Desorption durch einen Laserblitz (MALDI = matrix assisted laser de
sorption and ionization) weiteste Verbreitung gefunden. Die Ionen haben nach Verlassen der
Oberfläche in der Regel eine nicht vernachlässigbare mittlere Geschwindigkeit, die weitgehend
für Ionen aller Massen gleich ist, und eine starke Streuung um die mittlere Geschwindigkeit.
Die mittlere Geschwindigkeit führt zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Flugzeit und
Wurzel aus der Masse, also der Massenskala. Die Streuung führt zu einer Unschärfe beim
Messen der Signale der einzelnen Ionenmassen, also zu einem schlechten Massenauflösungs
vermögen; es gibt jedoch ein Verfahren und ein Massenspektrometer, diese Unschärfe wieder
in erster Ordnung zu fokussieren, wie in der Veröffentlichung "Mass Resolution Improvement
by Incorporation of Pulsed Ion Extraction in a Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Linear Time-of-Flight Mass Spectrometer" von R. S. Brown und J. J. Lennon in Anal. Chem.
67, (1995) 1998 beschrieben wurde.
Ähnliche Verhältnisse gelten aber auch für andere Verfahren der Ionisierung von Substanzen,
die auf einer Oberfläche aufgebracht sind. Beispiele dafür sind die Sekundärelektronenmas
senspektrometrie (SIMS), die normale Laserdesorption (LD) oder die sogenannte Plasmade
sorption (PD), die durch hochenergetische Spaltungsprodukte an dünnen Folien erhalten wird.
Im Folgenden wird das MALDI-Verfahren in den Mittelpunkt gestellt, die Erfindung ist aber
nicht auf dieses Verfahren allein beschränkt, sondern bezieht sich auf alle Verfahren, mit denen
Ionen erzeugt werden, die eine Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten besitzen, auch wenn
sie in der Regel nicht so groß ist wie beim MALDI-Prozess.
Für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) werden die großen
Probenmoleküle auf einem Probenträger in oder auf eine Schicht einer niedermolekularen Mat
rixsubstanz gelagert. Ein Lichtpuls von wenigen Nanosekunden Dauer aus einem Laser, der auf
die Probenoberfläche fokussiert wird, verdampft in einem quasi-explosiven Prozess eine gerin
ge Menge der Matrixsubstanz, wobei auch die Probenmoleküle in die zunächst winzige
Dampfwolke überführt werden.
Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung
nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch
die Moleküle und Ionen der Probensubstanz, die dabei höhere kinetische Energien erhalten, als
sie dem thermischen Gleichgewicht entsprächen. Selbst ohne ein beschleunigendes Feld errei
chen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 500 bis 1000 Metern pro Sekunde, ab
hängig von der Energiedichte des Laserstrahls; die Geschwindigkeiten sind dabei weitgehend
unabhängig von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwindigkeitsstreuung, die
von etwa 200 bis zu 1500 Metern pro Sekunde reicht.
Die Ionen werden in der Ionenquelle mit elektrischen Feldern auf Energien von rund 5 bis 30
keV beschleunigt, in die Flugstrecke des Massenspektrometers eingeschossen und am Ende der
Flugstrecke zeitaufgelöst detektiert. Aus ihrer Flugzeit kann ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis
bestimmt werden. Da diese Art der Ionisierung praktisch nur einfach geladene Ionen liefert,
wird im Folgenden meist nur von der Massenbestimmung gesprochen, nicht von der Bestim
mung des Masse-zu-Ladungsverhältnisses.
Die Umrechnung der Flugzeiten in Massen wird über eine Kalibrierkurve vorgenommen, die
als tabellarische Punktfolge im Speicher des Datenverarbeitungssystems abgelegt sein kann, sie
kann aber auch in Form von Parameterwerten für eine mathematische Funktion der Masse in
Abhängigkeit von der Flugzeit gespeichert werden.
Für die Massenbestimmung muß die Flugzeit t auf Bruchteile einer Nanosekunde genau be
stimmt werden. Da das Massensignal als Linienprofil vorliegt, wird üblicherweise eine Schwer
punktsbildung dieses Linienprofils für die genaue Bestimmung der Flugzeit herangezogen. Das
Linienprofil wird nach heutiger Technik durch einen Transientenrekorder mit 1 oder 2 Giga
hertz abgetastet. Transientenrekorder mit 4 Gigahertz Abtastrate (und mehr) befinden sich in
der Entwicklung. In der Regel werden die Messungen aus mehreren Meßzyklen aufaddiert,
bevor die Schwerpunktsbildung vorgenommen wird.
Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der
Matrix- wie auch der Probenmoleküle, ionisiert. Aber auch während der explosiven Ausdeh
nung der Dampfwolke findet durch weitere Ionen-Molekül-Reaktionen eine fortlaufende Ioni
sierung der großen Moleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt. Die große Streuung
der Geschwindigkeiten und der zeitverschmierte Bildungsprozess der Ionen beeinträchtigen
und begrenzen die Massenauflösung sowohl von linearen wie auch von energiefossierend re
flektierenden Flugzeitmassenspektrometern.
Es ist jedoch, wie eingangs zitiert, ein Verfahren für eine Erhöhung des Massenauflösungsver
mögens unter diesen Bedingungen bekannt. Die Ionen der Wolke werden zunächst für eine
kurze Zeit τ in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleunigung fliegen gelassen.
Die schnelleren Ionen entfernen sich dabei weiter von der Probenträgerelektrode als die lang
samen, aus der Geschwindigkeitsverteilung der Ionen ergibt sich dabei eine Ortsverteilung.
Erst dann wird die Beschleunigung der Ionen durch ein zeitlich konstantes homogenes Be
schleunigungsfeld, also mit einem räumlich linear abfallenden Beschleunigungspotential, einge
schaltet. Die schnelleren Ionen befinden sich dann weiter von der Probenträger-Elektrode ent
fernt, somit auf einem etwas geringeren Beschleunigungspotential, das ihnen eine etwas gerin
gere Endgeschwindigkeit für die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu
Beginn langsameren Ionen. Bei richtiger Wahl der Verzögerungszeit τ und des Potentialabfalls
(also der Stärke des Beschleunigungsfeldes) können die zu Beginn langsameren, aber nach
Beschleunigung schnelleren Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung lang
sameren Ionen genau am Detektor wieder einholen. Es werden somit Ionen am Ort des De
tektors in bezug auf die Masse dispergiert, aber bei gleicher Masse in bezug auf die Flugzeit in
erster Ordnung fokussiert. Damit erreicht man eine relativ hohe Massenauflösung selbst in ei
nem linearen Flugzeitmassenspektrometer. Es gibt ein ähnliches Verfahren für Flugzeit
spektrometer mit Reflektoren, bei denen sogar eine Fokussierung zweiter Ordnung erzielt
wird.
Das verzögerte Einschalten der Beschleunigung ist in der Regel nicht mit einem Schalten der
gesamten Beschleunigungsspannung U verbunden. Die Schaltung so hoher Spannungen in ex
trem kurzen Zeiten von wenigen Nanosekunden ist auch heute noch fast unerreichbar und mit
hohen Kosten verbunden. Man kommt mit dem Schalten einer Teilbeschleunigungsspannung
U1 aus, wenn man in die Beschleunigungsstrecke eine Zwischenelektrode einbaut. Es braucht
dann nur der Raum zwischen Probenträgerelektrode und Zwischenelektrode, die einen relativ
geringen Abstand d voneinander haben, zunächst feldfrei sein und nach Zeitverzögerung in ein
Beschleunigungsfeld der Stärke U1Id umgeschaltet werden. Der Abstand d des Probenträgers
zur Zwischenelektrode soll möglichst klein sein, um möglichst geringe Spannungen U1 schalten
zu können. Es besteht eine Untergrenze für diesen Abstand bei etwa einem Millimeter, der aber
für praktische Konstruktionen von Ionenquellen kaum infrage kommt. In der Praxis beträgt
dieser Abstand d etwa drei Millimeter.
Eine Ionenquelle für verzögert einschaltende Beschleunigung besitzt also in der Regel mindes
tens eine Zwischenblende zwischen dem Probenträger und der Grundelektrode, die sich auf
dem Potential der feldfreien Flugstrecke befindet. Die Ionenquelle wird also mit mindestens
zwei Beschleunigungsspannungen betrieben, von denen die erste zwischen dem Probenträger
und der ersten Zwischenelektrode, und die letzte zwischen der letzten Zwischenelektrode und
der Grundelektrode angelegt ist. Normalerweise wird nur eine Zwischenelektrode verwendet,
dementsprechend gibt es dann zwei Beschleunigungsspannungen. In einigen Fällen werden
zwei Zwischenblenden benutzt. Vom Prinzip her ist es auch möglich, ohne Zwischenblende mit
nur einer einzigen (voll schaltbaren) Beschleunigungsspannung auszukommen.
Das Verfahren der verzögert einsetzenden Beschleunigung hat jedoch auch Nachteile. So lie
fert es das optimale Massenauflösungsvermögen nur in einem schmalen Massenbereich. In den
anderen Teilen des gesamten Spektrums ist das Auflösungsvermögen zwar immer noch deut
lich verbessert, doch nicht bis zum optimalen Grenzwert. Dieser Bereich optimaler Auflösung
kann aber durch Änderungen der Verzögerungszeit τ oder durch Änderungen der Teilbeschleu
nigungsspannung U1 auf eine beliebige Stelle des Massenbereichs verschoben werden, so daß
dieser Nachteil nicht zu schwer wiegt.
Das gilt nicht für einen weiteren, ganz entscheidenden Nachteil für genaue Massenbestimmun
gen im höheren Massenbereich: Das optimale Massenauflösungsvermögen nimmt zu höheren
Massen hin schnell ab. Aus Gründen der Fokussierung der Anfangsionengeschwindigkeit in
erster Ordnung ist das Massenauflösungsvermögen von der Geschwindigkeitsstreubreite der
Ionen vor dem Probenträger abhängig. Für ein Flugzeitmassenspektrometer mittlerer Länge
(1,6 Meter) und einer Geschwindigkeitsverteilung zwischen 200 und 1300 Metern pro Sekun
de ist die Massenauflösung nach einer durch Simulationen ermittelten Faustregel auf maximale
Werte von etwa Rm = 40000000 u/m beschränkt. Unter Massenauflösung wird hier, abwei
chend von der üblichen Definition, die Flugzeit der Ionen geteilt durch die volle Linienbreite
am Fuß der Linie (gemessen in denselben Zeiteinheiten) verstanden, nicht durch die übliche
Breite in halber Höhe. Für Ionen der Masse m = 1000 u wird somit ein Auflösungvermögen
von etwa Rm = 40000 erreicht, das aber für Ionen der Masse m = 8000 u schon auf Rm = 5000
abfällt. Das bedeutet, daß sich zwei Ionen der Massen m1 = 8000 u und m2 = 8001 u nicht mehr
voneinander trennen lassen. Zu höheren Massen hin können also die bekannten Isotopenmuster
organischer Ionen keinesfalls mehr aufgelöst werden. In der Praxis sehen diese Werte noch
etwas schlechter aus.
Das schlechte Massenauflösungsvermögen für Ionen höherer Masse führt auch zu einem
schlechteren Verhältnis des Signals zum Rauschen, und damit zu einer schlechteren Empfind
lichkeit und zu einem schlechteren Nachweisvermögen.
Eine Fokussierung zweiter Ordnung in bezug auf variierende Anfangsgeschwindigkeiten ist für
ein lineares Massenspektrometer nicht explizit bekannt geworden. Es sind jedoch in der Ver
öffentlichung "Space-Velocity Correlation Focusing" von S. M. Colby und J. P. Reilly, Anal.
Chem. 1996, 68, 1419-1428, Kurven der Abweichungen der Flugzeiten für variierende An
fangsgeschwindigkeiten dargestellt, die auf eine Fokussierung zweiter Ordnung hinweisen,
ohne daß die Autoren sie als solche bezeichnet haben. Diese Kurven wurden durch Simulati
onsprogramme berechnet, deren Grundlagen jedoch nicht so ausführlich dargestellt wurden,
daß sie sich ohne weitere Kenntnisse nachprüfen lassen. Da es sich um ein ungewöhnliches
Massenspektrometer mit zwei weiteren Nachbeschleunigungsstrecken nach der feldfreien
Flugstrecke handelt, liegt der Verdacht nahe, daß die Kombination von vier Beschleunigungs
strecken, eine davon mit verzögert einschaltender Beschleunigung, diese Art der Fokussierung
bewirkt. Die Spannungen wurden nach dem Einschalten der Beschleunigung nicht zeitlich ver
ändert, außer einer Untersuchung eines Einschaltens mit endlicher Anstiegszeit, die jedoch
nach Aussage der Autoren keine wesentliche Änderung der Fokussierung bewirkt.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, besonders im höheren Massenbereich das erzielbare Massen
auflösungsvermögen linearer Flugzeitmassenspektrometer durch eine Zeitfokussierung 2. Ord
nung für eine Masse des Massenspektrums deutlich zu verbessern.
Die Fokussierung der Anfangsgeschwindigkeiten in erster Ordnung, die durch die verzögert
einsetzende Beschleunigung bewirkt wird, zeigt eine bestimmte Form der Abweichung der
Flugzeiten derjenigen Ionen, deren Anfangsgeschwindigkeit nicht mit der mittleren Geschwin
digkeit der Ionen übereinstimmt. Diese Abweichung ist proportional zum Quadrat der Diffe
renz der Anfangsgeschwindigkeiten von einer mittleren Anfangsgeschwindigkeit, bildet also
eine Parabel, wie sie in den Fig. 3 und 5 zu sehen ist. Diese Parabel ist typisch für Fokussie
rungen erster Ordnung. Sowohl langsamere wie auch schnellere Ionen haben dabei etwas kür
zere (oder in anderen Fällen längere) Flugzeiten als die Ionen mittlerer Anfangsgeschwindig
keit. Sie bilden also am Profil des Ionensignals einen einseitigen Ausläufer. Schon dieser ein
seitige Ausläufer ist nicht günstig für eine genaue Bestimmung der Masse, da er eine stark un
symmetrische Form des Massensignals erzeugt und so die Bestimmung des Signalzentrums
erschwert.
Es ist nun die Grundidee der Erfindung, diese Abweichungen der Flugzeiten durch eine dyna
mische Veränderung einer der (oder mehrerer) Beschleunigungsspannungen nach dem Ein
schalten der Beschleunigung so zu kompensieren, daß eine Fokussierung zweiter Ordnung
entsteht.
Es stellt sich bei Untersuchungen mit Computersimulationen heraus, daß dieses Ziel durch ganz
verschiedenartige, beliebige glatte und stetige Veränderungsfunktionen für die Beschleuni
gungsspannungen erreicht werden kann, beispielsweise durch eine lineare Veränderung der
Beschleunigung, durch eine hyperbolische Veränderung, oder durch eine exponentielle Verän
derung. Dabei kann die Veränderung auf die erste Beschleunigungsspannungsspannung zwi
schen Probenträger und Zwischenblende wirken, aber auch auf eine andere Beschleunigungs
spannung zwischen erster Zwischenblende und Grundelektrode. Auch eine Veränderung meh
rerer Spannungen gleichzeitig kann in diesem Sinne verwendet werden, beispielsweise eine
Veränderung des Zwischenpotentials an der Zwischenblende bei konstanter Gesamtspannung,
wodurch beide Beschleunigungsfelder (und -spannungen) vor und hinter der Zwischenblende
gleichzeitig verändert werden.
Alle diese Veränderungen ergeben bei richtiger Wahl der Einstellparameter eine Fokussierung
zweiter Ordnung am Ort einer Masse im Spektrum. Dieser Ort kann durch Veränderung der
Einstellparameter mit leichten Einschränkungen an jede beliebige Masse des Massenbereichs
verschoben werden.
Ein einfaches, lineares Flugzeitmassenspektrometer ohne Nachbeschleunigungsstrecke mit ei
ner Ionenquelle, die nur eine Zwischenblende besitzt, hat drei geometrisch gegebene Bestim
mungsgrößen: den Abstand d1 zwischen Probenträger und Zwischenblende, den Abstand d2
zwischen Zwischenblende und Grundelektrode, und die Länge l der Flugstrecke bis zum De
tektor. Diese Bestimmungsgrößen sind fest. Bei einer einparametrigen Veränderungsfunktion,
die auf nur eine der Beschleunigungsspannungen einwirkt, ergeben sich zusätzlich folgende
vier Einstellparameter:
- 1. Die Verzögerungszeit τ für das Einschalten der Beschleunigung vor dem Probenträger,
- 2. der Wert der unveränderten Beschleunigungsspannung,
- 3. der Anfangswert für die zu verändende Beschleunigungsspannung, und
- 4. der Parameter für die zeitliche Veränderung der Beschleunigungsspannung, beispielsweise die absolute Spannungsabnahme pro Zeiteinheit für den linearen oder die relative Span nungsabnahme pro Zeiteinheit für den exponentiellen Abfall der Spannung nach dem Ein schalten (in diesem Fall kann beispielsweise auch die Halbwertszeit oder die Zeit des Abfalls auf den Wert 1/e verwendet werden).
Sind zwei dieser Einstellparameter fest vorgegeben, so kann durch Wahl der beiden anderen
der Punkt der Fokussierung zweiter Ordnung an eine beliebige Stelle des Massenbereichs ver
schoben werden. Die Vorgabe der beiden festeingestellten Einstellparameter muß allerdings in
einem günstigen Wertebereich liegen, andernfalls existiert eine untere Massenschwelle für den
Fokuspunkt zweiter Ordnung.
Sind beispielsweise die Anfangswerte beider Beschleunigungsspannungen fest gewählt, so kann
der Fokuspunkt durch Verzögerungszeit und die Zeitkontsante der Spannungsveränderung
eingestellt werden. Sind dagegen die unveränderte Beschleunigungsspannung und die Zeitkon
stante der Veränderung der anderen Beschleunigungsspannung fest eingestellt, so kann der
Fokuspunkt zweiter Ordnung durch Verzögerungszeit und Anfangswert der veränderlichen
Beschleunigungsspannung eingestellt werden, wenn die Zeitkonstante der Veränderung nur
eine genügend schnelle Änderung ergibt.
Es sei noch angemerkt, daß ein Fokuspunkt erster Ordnung jeweils durch Veränderung eines
einzigen Parameters eingestellt werden kann. Die Verschiebung dieses Fokuspunkts erster
Ordnung erfordert die Zuhilfenahme eines zweiten Einstellparameters. Dieser Fokuspunkt ist in
der Regel bereits schärfer als der Fokuspunkt ohne dynamische Veränderung einer Beschleuni
gungsspannung, bietet also ein höheres Auflösungsvermögen.
Im Fokuspunkt zweiter Ordnung können in Computersimulationen ganz außerordentlich hohe
Auflösungen erhalten werden, wobei die optimalen Auflösungen allerdings auch wieder zu
hohen Massen hin abfallen. Immerhin ist es möglich, bei Masse 32000 u noch eine Einheits
auflösung (Rm = 32000 im oben definierten Sinn) zu erreichen, d. h., es läßt sich das Signal der
Masse 32000 u noch vollständig vom Signal der Masse 32001 u trennen. Da die beiden Flug
zeiten dieser Massen (bei einer allerdings hohen Beschleunigungsspannung von 30 Kilovolt)
aber nur etwa 2 Nanosekunden auseinanderliegen, kann beim gegenwärtigen Stand der Tech
nik sowohl der Transientenrekorder wie auch der Ionendetektoren die Auflösung experimentell
nur knapp nachgewiesen werden.
Es sei hier ein erstes Beispiel für simulativ zu erzielende Auflösungen gegeben. Das Mas
senspektrometer sei durch folgende geometrische Bestimmungsgrößen charakterisiert:
d1 = 3 Millimeter (Abstand zwischen Probenträger und Zwischenblende),
d2 = 30 Millimeter (Abstand zwischen Zwischenblende und Grundelektrode),
l = 1,6 Meter (feldfreie Flugstrecke zwischen Grundelektrode und Detektor).
d1 = 3 Millimeter (Abstand zwischen Probenträger und Zwischenblende),
d2 = 30 Millimeter (Abstand zwischen Zwischenblende und Grundelektrode),
l = 1,6 Meter (feldfreie Flugstrecke zwischen Grundelektrode und Detektor).
Folgende Einstellparameter seien ebenfalls fest vorgegeben:
ta = 1 Mikrosekunde (exponentieller Abfall auf 1/e),
U = 30 Kilovolt (gesamte Beschleunigungsspannung).
ta = 1 Mikrosekunde (exponentieller Abfall auf 1/e),
U = 30 Kilovolt (gesamte Beschleunigungsspannung).
Für dieses Massenspektrometer können in Computersimulationen folgende Auflösungsvermö
gen erreicht werden:
Wird stattdessen die Zeitkonstante des exponentiellen Abfalls auf ta = 2 Mikrosekunden er
höht, so kann für die unteren Massen die Fokussierung zweiter Ordnung nicht mehr erreicht
werden:
Die Massenauflösung Rm wurde aus der Zeitauflösung Rt berechnet. Die Zeitauflösung ist da
bei die Differenz zwischen der größten und der kleinsten Flugzeit, geteilt durch die Flugzeit,
gerechnet für Ionen der Anfangsgeschwindigkeiten von 250 bis 1150 Meter pro Sekunde. Die
Massenauflösung ist wegen des quadratischen Zusammenhangs gleich der halben Zeitauflö
sung. Da die Zeitauflösung die gesamte Linienbreite, gemessen am Fuß, berücksichtigt, ist
auch die Massenauflösung (entgegen der Konvention) so definiert.
Der Bereich hohen Auflösungsvermögens ist dabei recht schmal. Bei Masse m = 32000 u, bei
der im ersten Beispiel eine Massenauflösung von Rm ≈ 44 000 errechnet wurde, erstreckt sich
der Bereich der Einheitsauflösung (Rm ≧ 32000) nur über etwa 40 Masseneinheiten, etwa von
31980 bis 32020 u. Im zweiten Beispiel (Rm ≈ 105000) reicht der Bereich der Einheitsauflö
sung über 100 Masseneinheiten von 31955 u bis 32055 u.
Die hohen Auflösungen sind allerdings reine Rechenwerte, die in der Realität nicht erreicht
werden können, da der MALDI-Prozess, Feldfehler und insbesondere die heute erhältlichen
Detektoren die Signalbreiten auf schmalste Linien von bestenfalls 2 Nanosekunden begrenzen.
Damit lassen sich in Flugzeitmassenspektrometern bei 30 Kilovolt Gesamtbeschleunigung und
1,6 Meter Länge bestenfalls folgende Werte erhalten:
Alle rechnerischen Werte, die darüberliegen, können daher heute in Experimenten noch nicht
verifiziert werden. Es ist jedoch mit dem Verfahren und Gerät nach dieser Erfindung möglich,
die hier gegebenen Werte einzustellen. Es ist auch zu erwarten, daß neue Generationen von
Detektoren zu besseren Auflösungen befähigen werden.
Im Gegensatz zur normalen verzögert einschaltenden Beschleunigung sind im Falle der hier
vorgestellten "verzögert einschaltenden dynamischen Beschleunigung" stets zwei Parameter
optimal einzustellen, um die Fokussierung zweiter Ordnung zu erhalten.
Es sei hier ein drittes Beispiel für simulativ zu erzielende Auflösungen gegeben, wobei dieses
Mal ein linearer Abfall der Beschleunigungspannung programmiert wird. Das Massenspektro
meter sei wie vor durch folgende geometrische Bestimmungsgrößen charakterisiert:
d1 = 3 Millimeter (Abstand zwischen Probenträger und Zwischenblende),
d2 = 12 Millimeter (Abstand zwischen Zwischenblende und Grundelektrode),
l = 1,6 Meter (feldfreie Flugstrecke zwischen Grundelektrode und Detektor).
d1 = 3 Millimeter (Abstand zwischen Probenträger und Zwischenblende),
d2 = 12 Millimeter (Abstand zwischen Zwischenblende und Grundelektrode),
l = 1,6 Meter (feldfreie Flugstrecke zwischen Grundelektrode und Detektor).
Folgende Einstellparameter seien dieses Mal fest vorgegeben:
a = 0,5 (voller linearer Abfall in zwei Mikrosekunden),
U2 = 30 Kilovolt (zweite Beschleunigungsspannung).
a = 0,5 (voller linearer Abfall in zwei Mikrosekunden),
U2 = 30 Kilovolt (zweite Beschleunigungsspannung).
Für dieses Massenspektrometer können in Computersimulationen folgende Auflösungsvermö
gen erreicht werden:
Wird ein voller linearer Abfall in nur einer Mikrosekunde gewählt, so können wieder für alle
oben angegebene Massen Fokuspunkte zweiter Ordnung gefunden werden, mit Auflösungver
mögen über 30 Millionen für die Massen 1000 und 2000 u. Der Abfall des Auflösungsvermö
gens zu hohen Massen hin ist dabei etwas größer, wie es auch schon bei den beiden ersten Bei
spielen sichtbar wurde.
Zweites und drittes Beispiel zeigen, daß es eine Massenschwelle für das Auftreten der Fokus
sierung zweiter Ordnung gibt, die von der Zeitkonstante der Spannungsveränderung abhängt.
Zwischen dem Massenbereich, der nur eine Fokussierung erster Ordnung erlaubt, und dem
darüberliegenden Bereich mit Fokussierung zweiter Ordnung liegt übrigens stets eine Masse,
die sich in dritter Ordnung fokussieren läßt. Hier lassen sich extreme Auflösungen erreichen.
Dieser Punkt kann durch Veränderung von drei Einstellparametern ebenfalls an jede beliebige
Stelle im Spektrum verschoben werden.
Aus der bekannten massenabhängigen Änderung der beiden Einstellparameter für optimales
Auflösungsvermögen kann nun nach dieser Erfindung eine Steuerung konstruiert werden, mit
der sich das optimale Auflösungsvermögen an eine beliebige Stelle im Massenspektrum ver
schieben läßt. Damit läßt sich ein Massenspektrometer bauen, mit dem sich an einer Stelle im
Spektrum, an dem ein besonderes Signal erwartet wird, die optimale Auflösung einstellen läßt.
Für die meisten analytischen Aufgaben in Industrie, Medizin und Forschung existiert ein sol
cher Erwartungswert für die Masse der zu bestimmenden Ionen. Es seien nur einige Gebiete
kurz erwähnt: Produktionskontrolle, Qualitätssicherung, medizinische Proteinanalysen, DNA-
Mutantenanalysen, Markierungen mit stabilen Isotopen. Aber es kommen auch immer wieder
Aufgaben vor, bei denen es darauf ankommt, einen größeren Massenbereich gleichzeitig zu
überschauen. Für solche Aufgaben stellt man das Massenspektrometer auf einen Kompromiss
leichter Defokussierung ein. Auch für diesen Kompromiss bietet diese Erfindung Vorteile. So
ist es möglich, den Massenbereich bis 4000 u gleichzeitig mit Einheitsauflösung aufzunehmen;
dabei ist also jede Masse von der nächsten getrennt.
Die Erfindung hat besondere Vorteile, die nicht nur in der hohen Auflösung liegen. Im Fokus
punkt zweiter Ordnung sind insbesondere die Profile der Massensignale symmetrisch, so daß
sich durch das Verfahren der Schwerpunktsbildung die Lage des Massensignals wesentlich
richtiger bestimmen läßt, als im Fokuspunkt erster Ordnung mit seiner unsymmetrischen Form.
Außerdem ist die Lage des Massensignals wesentlich unabhängiger von der mittleren Ge
schwindigkeit der Ionen. Wird durch zufällige Variation der Laserlichtstärke (oder durch ande
re Einflüsse) die mittlere Geschwindigkeit der Ionen in der entstehenden Dampfwolke geän
dert, so resultiert im Fokuspunkt zweiter Ordnung eine wesentlich kleinere Verschiebung der
Lage des Massensignals als im Fokuspunkt erster Ordnung. Das Verfahren ist viel stabiler ge
genüber zufälligen oder gewollten Eingriffen.
Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines Flugzeitmassenspektrometers mit ihren schema
tisch angedeuteten Versorgungseinheiten. Die Probenträgerelektrode 1 befindet sich auf dem
Beschleunigungspotential U = U1 + U2, die Zwischenelektrode 2 auf dem Potential U2, die
Grundelektrode 3 auf Erdpotential. In der feldfreien Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3
und Detektor 10 befindet sich hier eine ionenoptische Ionenstrahleinzellinse 4.
Die Beschleunigungsspannung U1 zwischen Probenträger 1 und Zwischenblende 2 ist schaltbar
und dynamisch veränderbar. Ein Lichtblitz aus dem Laser 5 wird von der Linse 6 in einem
konvergenten Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 fokussiert, die sich auf dem Probenträger 1 befin
det. Zu dieser Zeit hat die Beschleunigungsspannung den Wert U1 = 0. Der Lichtblitz erzeugt
in einem MALDI-Prozess Ionen der Analytsubstanz mit einer mittleren Anfangsgeschwindig
keit v ≈ 700 Meter pro Sekunde und großer Geschwindigkeitsstreuung. Nach einer Verzöge
rungszeit τ wird die Beschleunigungsspannung U1 auf den Anfangswert U1,0 geschaltet, worauf
sie exponentiell mit einer Halbwertszeit von θ1/2 abfällt. Ab der Zeit t = τ werden die Ionen be
schleunigt. Sie bilden den Strahl 9 des Ionenstromes, der nach Durchlaufen der feldfreien
Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10 vom Detektor 10 zeitaufgelöst ge
messen wird.
Die hier gezeigte Anordnung hat gitterlose Blenden als Zwischenelektrode und 2 und Grund
elektrode 3 und braucht daher die Einzellinse 4 zur Parallelisierung des Ionenstrahls 9. Bei
Einführung von Gittern in Zwischenelektrode 2 und Grundelektrode 3 kann die Einzellinse 4
entfallen, allerdings verringern die Zwischengitter wegen ihrer unvermeidlichen Kleinwinkel
streuung die erzielbare Auflösung.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm der zeitlichen Veränderung der Beschleunigungsspannung U1. Zur
Zeit t = 0 startet der Laserblitz den Ionisierungsprozess. Nach einer Verzögerungszeit τ wird
die Beschleunigungsspannung U1 auf den Anfangswert U1,0 geschaltet, worauf sie exponentiell
mit einer Halbwertszeit von θ1/2 abfällt.
Fig. 3, 4 und 5 zeigen drei Diagramme der Flugzeitabweichungen zu schneller und zu
langsamer Ionen von denen der mittleren Geschwindigkeit. Es wurden sieben Anfangsge
schwindigkeiten gewählt und durch die Indizes 1 bis 7 gekennzeichnet. Index 1 entspricht Io
nen einer Anfangsgeschwindigkeit von 250 Metern pro Sekunde, Index 7 einer Geschwindig
keit von 1150 Metern pro Sekunde. Die mittlere Geschwindigkeit (Index 4) entspricht 700
Metern pro Sekunde. Die Abweichungen der Flugzeit sind in Nanosekunden angegeben.
Alle Diagramme wurden für dieselbe Anfangsbeschleunigung U1,0 = 2,6 Kilovolt gerechnet und
für dieselbe exponentielle Abfallfunktion, die in jeweils einer Mikrosekunde auf 39,6% abfällt.
Es wurden für die Massen 4000 u, 8000 u und 16000 u jeweils durch die Wahl der Verzöge
rungszeit τ Fokussierungen eingestellt. Im Falle der Fig. 3 und 5 sind die Fokussierungen
von erster Ordnung, kenntlich an den parabelförmigen Kurven der Abweichungen. Im Falle der
Fig. 4 wird für die Masse 8000 u gerade ein Fokuspunkt dritter Ordnung erreicht, kenntlich
an der Parabel dritter Ordnung. In diesem Fall sind die absolut gemessenen Abweichungen
minimal, sie betragen hier weniger als ±0,03 Nanosekunden. Aus einer gesamten Flugzeit von
62 Mikrosekunden ergibt sich bei genauer Berücksichtigung der maximalen Abweichungen
eine Flugzeitauflösung von 1,3 Millionen.
Eine Ausführung eines linearen Flugzeitmassenspektrometer mit Hochauflösung nach dieser
Erfindung wird im Prinzip in Fig. 1 gezeigt.
Bei Benutzung der oben bereits geschilderten verzögerten dynamischen Beschleunigung befin
den sich Probenträgers 1 und Zwischenelektrode 2 zunächst auf dem Potential U2, Der Pro
benträger wird nach der Verzögerungszeit τ von einigen zehn bis tausend Nanosekunden nach
ionisierendem Laserblitz auf das Potential U1 + U2 heraufgeschaltet. Es setzt sofort ein expo
nentieller Abfall der Beschleunigungsspannung U1 ein, so daß sich der Probenträger nach eini
ger Zeit wieder auf dem Potential U2 befindet. Die zeitliche Veränderung der Beschleunigungs
spannung U1 ist im Diagramm der Fig. 2 wiedergegeben. Bei richtiger Wahl der Verzöge
rungszeit τ, der Spannungen U1 und U2, und der Halbwertszeit θ1/2 des exponentiellen Abfalls
erzielt man an einer Masse im Spektrum Hochauflösung durch Fokussierung zweiter Ordnung.
Dabei können zwei der vier Einstellparameter fest gewählt werden, für die Einstellung der
Hochauflösung genügen zwei der Einstellparameter.
Dieser Betrieb mit einer Variation allein von U1 ist aber nur eine von vielen möglichen Varian
ten. So kann beispielsweise auch die Beschleunigungsspannung U2 allein oder in Verbindung
mit einer Änderung von U1 variiert werden. Es kann beispielsweise auch die Gesamtspannung
U = U1 + U2 konstant gehalten werden, aber beide Spannungen U1 + U2 werden gegenläufig
verändert. Die Veränderungen brauchen auch nicht exponentiell erfolgen. Es ist jede Funktion
mit stetiger Veränderung anwendbar. So können mit linearer Veränderung ähnliche Werte der
Hochauflösung erreicht werden; die lineare Veränderung hat aber den Nachteil, daß ihr aktiv
ein Ende gesetzt werden muß. Auch verschiedene andere Funktionen, beispielsweise ein hy
perbolischer Abfall 1 - 1/(t - t0), können verwendet werden.
Die exponentielle Änderung hat die Vorteile, daß sie (a) elektronisch sehr leicht, beispielsweise
durch Kondensator und entladendem Widerstand, erzeugt werden kann, und daß sie (b) ein
natürliches Ende findet, das nicht aktiv gesetzt werden muß.
Mit dieser Anordnung eines Flugzeitmassenspektrometers können wie gewöhnlich Spektren
der Analytsubstanzen aufgenommen werden. Die Spektrenaufnahme beginnt mit der Ionisie
rung der Probensubstanzen 8 auf dem Probenträger 1, wobei hier das MALDI-Verfahren zur
Ionisierung beschrieben wird. Die Ionen werden durch einen Lichtblitz von etwa 3 bis 5 Nano
sekunden Dauer aus dem Laser 5 erzeugt. Gewöhnlich wird UV-Licht mit einer Wellenlänge
von 337 Nanometer aus einem preiswerten Stickstoff-Laser benutzt. Der Lichtblitz ist durch
die Linse 6 als konvergenter Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 auf der Oberfläche des Probenträgers
1 fokussiert. Die in der Dampfwolke, die durch den Laserfokus erzeugt wird, gebildeten Ionen
werden nach der Verzögerungszeit τ zunächst im elektrischen Feld zwischen Probenträger 1
und Zwischenelektrode 2 beschleunigt, jedoch nach dieser Erfindung zeitlich abnehmend, und
dann im elektrischen Feld zwischen Zwischenelektrode 2 und Grundelektrode 3. Der in der
gitterfreien Elektrodenanordnung leicht defokussierte Ionenstrahl wird zu Beginn der Flugstre
cke in der Einzellinse 4 auf den Detektor 10 fokussiert. Die fliegenden Ionen bilden einen zeit
lich stark variierenden Ionenstrom 9, der am Ende der Flugstrecke vom Ionendetektor 10 mit
hoher zeitlicher Auflösung gemessen wird.
Durch den besonderen MALDI-Prozess können Massensignale am Detektor erzeugt werden,
die eine zeitliche Breite haben, die weit unter einer Nanosekunde liegen, obwohl der Lichtblitz
des Lasers eine zeitliche Dauer von 3 bis 5 Nanosekunden hat. (Es existiert eine "virtuelle",
sehr scharf definierte Anfangszeit für die adiabatische Expansion).
Der durch den Ionenstrahl gegebene zeitvariable Ionenstrom wird am Detektor gewöhnlich mit
einer Abtastrate von 1 oder 2 Gigahertz gemessen und digitalisiert. Transientenrekorder mit
noch höherer zeitlicher Auflösung werden in Kürze eingesetzt werden können. Üblicherweise
werden die zeitgleichen Meßwerte aus mehreren Spektrenaufnahmen addiert, bevor die Mas
senlinien in den gespeicherten Daten gesucht und über die Datenauswertung von der Zeitskala
über die Massenkalibrierkurve in die Massenwerte transformiert werden.
Die Polarität der verwendeten Hochspannung für die Ionenbeschleunigung muß gleich der Po
larität der untersuchten Ionen sein: Positive Ionen werden durch einen positiv geladenen Pro
benträger abgestoßen und beschleunigt, negative Ionen durch einen negativ geladenen Proben
träger.
Selbstverständlich kann man das Flugzeitmassenspektrometer auch so betreiben, daß sich die
Flugstrecke in einem (nicht in Fig. 1 gezeigten) Rohr befindet, das sich auf dem Beschleuni
gungspotential U befindet, während der Probenträger 1 auf Erdpotential liegt. In diesem be
sonderen Fall liegt das Flugrohr auf positivem Potential, wenn negativ geladene Ionen unter
sucht werden sollen, und umgekehrt. Dieser Betrieb vereinfacht die Konstruktion der Ionen
quelle, da die Isolatoren für den Halter des auswechselbaren Probenträgers 1 entfallen können.
In diesem Fall ist es günstig, das Potential der Zwischenelektrode zu schalten und zu variieren.
Der Schärfebereich kann durch Steuerung zweier Einstellparameter, beispielsweise durch die
Verzögerungszeit τ und die Anfangsbeschleunigungsspannung U1,0 beliebig verschoben wer
den. Es ist dabei möglich, die Verschiebung so durchzuführen, daß die einkalibrierte Massen
skala gültig bleibt. Dazu ist die Beschleunigungspannung U2 in geeigneter Weise mitzuführen.
Wird diese Art der Verschiebung des Schärfebereichs fest in die Rechnersteuerung des Mas
senspektrometers eingebaut und keine andere Steuerung der Verschiebung zugelassen, so
schadet diese Verschiebung der Schärfebereichs einer Massenbestimmung nicht, da die Mas
senskala unter diesen Verhältnissen gültig bleibt.
Claims (9)
1. Verfahren für die Aufnahme von Analytionenspektren in einem linearen Flugzeitmas
senspektrometer mit gepulst laserdesorptiver Ionisierung der auf einer Oberfläche eines
Probenträgers aufgebrachten Analytsubstanzen in einer Ionenquelle, die mit mindestens
zwei elektrischen Beschleunigungsfeldern betrieben wird,
wobei das am Probenträger angreifende erste Beschleunigungsfeld
- a) gegenüber dem desorptiven Laserpuls verzögert eingeschaltet und
- b) nach dem Einschalten zeitlich stetig verringert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Beschleunigungsfeld
linear verringert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der volle lineare Abfall des ers
ten Beschleunigungsfeldes in einer Zeit zwischen 1 und 2 Mikrosekunden stattfindet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Beschleunigungsfeld
exponentiell verringert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitkonstante für den expo
nentiellen Abfall zwischen 0,5 und 5 Mikrosekunden liegt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für
die Veränderungen des ersten Beschleunigungsfeldes nur das Potential am Probenträger
verändert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Verän
derungen des ersten Beschleunigungsfeldes nur das Potential einer ersten Zwischenelekt
rode verändert wird, wobei sich auch eine Veränderung des zweiten Beschleunigungsfeldes
ergibt.
8. Lineares Flugzeitmassenspektrometer mit einer Ionenquelle, die eine Probenträgerelektro
de, mindestens eine Zwischenelektrode, und eine Grundelektrode auf dem Potential der
feldfreien Flugstrecke besitzt, mit einem Pulslaser für die desorptive Erzeugung von Ionen
aus Analytsubstanzen auf der Oberfläche des Probenträgers, mit Spannungsversorgungen
für die Potentiale der Probenträger- und Zwischenelektroden,
wobei die Versorgung für die Spannung zwischen Probenträger und erster Zwischenblende
so eingerichtet ist, daß sich die Spannung
- a) gegenüber dem Laserpuls verzögert einschalten läßt und
- b) anschließend exponentiell abnimmt.
9. Lineares Flugzeitmassenspektrometer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die
exponentielle Abnahme der Spannung durch ein RC-Glied erzeugt wird.
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