DE19635646C1 - Korrektur der Massenbestimmung mit MALDI-Flugzeitmassenspektrometern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die genaue Massenbestimmung von Analytionen in Flugzeitmassenspek­ trometern, die mit einer Ionisiserung der Analytsubstanzen auf Probenträgern durch matrix­ unterstützte Laserdesorption (MALDI) und einer Verbesserung der Massenauflösung durch zeitlich verzögerten Einsatz der Beschleunigung im Feld zwischen Probenträger und einer Zwi­ schenelektrode arbeiten. Vergleiche dazu "Anal. Chem." 67 (1995) 1998-2003.

Unter den Verfahren zur Ionisierung von großmolekularen Substanzen auf Probenträgern hat die matrixunterstützte Desorption durch einen Laserblitz (MALDI) weiteste Verbreitung ge­ funden. Die Ionen haben nach Verlassen der Oberfläche in der Regel eine nicht vernachlässig­ bare mittlere Geschwindigkeit, die weitgehend für Ionen aller Massen gleich ist, und eine star­ ke Streuung um die mittlere Geschwindigkeit. Die mittlere Geschwindigkeit führt zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Flugzeit und Wurzel aus der Masse. Die Beziehung zur Um­ rechnung der Flugzeit in die Masse wird hier der Einfachheit halber mit "Massenskala" be­ zeichnet. Die Streuung führt zu einer Unschärfe beim Messen der Signale der einzelnen Ionen­ massen, es gibt jedoch Verfahren, diese Unschärfe wieder zu kompensieren.

Für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) werden die großen Probenmoleküle auf einem Probenträger in oder auf eine Schicht einer niedermolekularen Ma­ trixsubstanz gelagert. Ein Lichtpuls von wenigen Nanosekunden Dauer aus einem Laser, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird, verdampft in einem quasi-explosiven Prozeß eine geringe Menge der Matrixsubstanz, wobei auch die Probenmoleküle in die zunächst winzige Dampfwolke überführt werden.

Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Probensubstanz, die dabei höhere kinetische Energien erhalten, als sie dem thermischen Gleichgewicht entsprächen. Selbst ohne ein beschleunigendes Feld errei­ chen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 500 bis 1000 Metern pro Sekunde, ab­ hängig von der Energiedichte des Laserstrahls; die Geschwindigkeiten sind dabei weitgehend unabhängig von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwindigkeitsstreuung, die von etwa 200 bis zu 2000 Metern pro Sekunde reicht.

Die Ionen werden in der Ionenquelle mit elektrischen Feldern auf Energien von rund 10 bis 30 Kiloelektronenvolt (keV) beschleunigt, in die Flugstrecke des Massenspektrometers einge­ schossen und am Ende der Flugstrecke zeitaufgelöst detektiert. Aus ihrer Flugzeit kann ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis bestimmt werden. Da diese Art der Ionisierung praktisch nur einfach geladene Ionen liefert, wird im Folgenden meist nur von der Massenbestimmung ge­ sprochen, nicht von der Bestimmung des Masse-zu-Ladungsverhältnisses.

Die Umrechnung der Flugzeiten in Massen wird über eine Kalibrierkurve vorgenommen, wobei die Aufnahme dieser Kalibrierkurve als "Kalibrierung der Massenskala" des Flugzeitspektrome­ ters bezeichnet wird. Die Kalibrierkurve kann als tabellarische Punktfolge im Speicher des Da­ tenverarbeitungssystems abgelegt sein, aber auch in Form der Speicherung von Parameterwer­ ten für eine mathematisch als Gleichung gegebene Funktion der Masse in Abhängigkeit von der Flugzeit.

Für diese Messungen muß die Flugzeit t für kleine Ionen auf Bruchteile einer Nanosekunde genau bestimmt werden. Für die Messungen wird üblicherweise eine Schwerpunktsbildung des Linienprofils herangezogen. Das Linienprofil wird nach heutiger Technik durch einen Transien­ tenrekorder mit 1 oder 2 Gigahertz abgetastet Transienterekorder mit 4 Gigahertz Abtastrate befinden sich in der Einführungsphase. In der Regel werden die Messungen aus mehreren Meßzyklen aufaddiert, bevor die Schwerpunktsbildung vorgenommen wird.

Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der Probenmoleküle, ionisiert. Aber auch während der Ausdehnung der Dampfwolke findet durch weitere Ionen-Molekül-Reaktionen eine fortlaufende Ionisierung der großen Moleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt. Die große Streuung der Ge­ schwindigkeiten und der zeitverschmierte Bildungsprozeß der Ionen beeinträchtigen und be­ grenzen die Massenauflösung sowohl von linearen wie auch von energiefossierend reflektie­ renden Flugzeitmassenspektrometern.

Es ist jedoch ein Verfahren für eine Erhöhung des Massenauflösungsvermögens unter diesen Bedingungen bekannt und in der zuvor erwähnten Arbeit "Mass Resolution Improvement by Incorporation of Pulsed Ion Extraction in a Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Linear Time-of-Flight Mass Spectrometer" von R. S. Brown und J. J. Lennon, Anal. Chem. 67, 1998 (1995) be­ schrieben. Die Ionen der Wolke werden zunächst für eine kurze Zeit τ in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleunigung fliegen gelassen. Die schnelleren Ionen entfernen sich dabei weiter von der Probenträgerelektrode als die langsamen, aus der Geschwin­ digkeitsverteilung der Ionen ergibt sich dabei eine Ortsverteilung. Erst dann wird die Be­ schleunigung der Ionen durch ein dann zeitlich konstantes homogenes Beschleunigungsfeld, also mit einem räumlich linear abfallenden Beschleunigungspotential, eingeschaltet. Die schnel­ leren Ionen befinden sich dann weiter von der Probenträger-Elektrode entfernt, somit auf ei­ nem etwas geringeren Beschleunigungspotential, das ihnen eine etwas geringere Endgeschwin­ digkeit für die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu Beginn langsameren Ionen. Bei richtiger Wahl der Verzögerungszeit τ und des Potentialabfalls (also der Stärke des Beschleunigungsfeldes) können die zu Beginn langsameren, aber nach Beschleunigung schnel­ leren Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung langsameren Ionen genau am Detektor wieder einholen. Es werden somit Ionen am Ort des Detektors in bezug auf die Mas­ se dispergiert, aber bei gleicher Masse in bezug auf die Flugzeit in erster Ordnung fokussiert. Damit erreicht man eine relativ hohe Massenauflösung selbst in linearen Flugzeitmassenspek­ trometern. Man kann das Verfahren auch für Flugzeitspektrometer mit Reflektoren anwenden und erzielt dann sogar eine Fokussierung zweiter Ordnung.

Das verzögerte Einschalten der Beschleunigung muß nicht mit einem Schalten der gesamten Beschleunigungsspannung U verbunden sein. Die Schaltung so hoher Spannungen in extrem kurzen Zeiten von wenigen Nanosekunden ist auch heute noch fast unerreichbar und mit hohen Kosten verbunden. Man kommt mit dem Schalten einer Teilbeschleunigungsspannung V aus, wenn man in die Beschleunigungsstrecke eine Zwischenelektrode einbaut. Es braucht dann nur der Raum zwischen Probenträgerelektrode und Zwischenelektrode, die einen relativ geringen Abstand d voneinander haben, zunächst feldfrei sein und nach Zeitverzögerung in ein Beschleu­ nigungsfeld der Starke V/d umgeschaltet werden. Der Abstand d des Probenträgers zur Zwi­ schenelektrode soll möglichst klein sein, um möglichst geringe Spannungen V schalten zu kön­ nen. Es besteht eine Untergrenze für diesen Abstand bei etwa einem Millimeter, der aber für praktische Konstruktionen von Ionenquellen kaum in Frage kommt. In der Praxis beträgt dieser Abstand d etwa drei Millimeter.

Das Bestreben nach einer guten Massenauflösung hat ganz wesentlich seinen Sinn darin, zu einer guten Massenbestimmung zu gelangen. Es hat sich aber seit der Einführung dieser Me­ thode gezeigt, daß die prinzipiell gegebene Möglichkeit für eine gute Massenbestimmung nicht immer auch zu einer richtigen Massenbestimmung führt. Die Funktion, die die Masse in Ab­ hängigkeit von der Flugzeit beschreibt, also die einkalibrierte Massenskala, führt bei der Ioni­ sierung durch MALDI häufig zu fehlerhaften und nichtreproduzierbaren Massenbestimmungen. Für ein Ion der Masse 5000 atomarer Masseneinheiten (u) kann das Ergebnis der Massenberech­ nung von Spektrenaufnahme zu Spektrenaufnahme im Extremfall um mehrere Masseneinheiten schwanken.

Es ist daher für genaue Massenbestimmungen üblich geworden, die Massen der zu bestimmen­ den Analytionen durch gleichzeitige Aufnahme der Ionen beigemischter bekannter Substanzen (sogenannter "interner Referenzsubstanzen") zu korrigieren. Als einfachste Methode wurde dabei die Masse der Analytsubstanzen durch lineare Extrapolation auf einer als linear ange­ nommenen Beziehung zwischen Flugzeit und der Wurzel aus der Masse korrigiert. Als Refe­ renzmassen wurden die bekannten Ionen der Matrix, besonders deren dimeres Ion, genommen. Diese Methode führt zu einer wesentlich verbesserten Genauigkeit der Massenbestimmung, die in der Größenordnung von etwa 200 ppm liegt. Damit ergibt sich für das Ion der Masse 5000 u aber immer noch eine Unsicherheit von einer Masseneinheit.

In einer Untersuchung der Kritizität aller Geräteparameter konnten wir feststellen, daß ein in­ strumentell nicht völlig konstant zu haltender Parameter einen überragenden Einfluß hat: der Abstand d des Probenträgers von der ersten Beschleunigungsblende, also der Zwischenelek­ trode. Von kleineren Einfluß ist die mittlere Geschwindigkeit ν der Ionen beim Einsetzen der Beschleunigung. Alle übrigen Parameter sind Spannungen oder geometrische Abmessungen, die sehr präzise konstant gehalten werden können.

Eine Änderung des Abstandes d um nur 100 Mikrometer verändert das Ergebnis einer Massen­ bestimmung um etwa 500 ppm, ein Ion der Masse 10 000 u wird also bereits um fünf atomare Masseneinheiten falsch gemessen.

Unsere Untersuchungen zeigen, daß sich Verschiebungen der Massenskala gegenüber der Ka­ libration nun teilweise bereits dadurch ergeben, daß die Probenaufträge verschieden dick aus­ fallen. Nach der heute noch weitestverbreiteten Methode werden die Proben in Lösung, zu­ sammen mit gelöster Matrixsubstanz, auf den Probenträger aufgebracht. Es ist dabei das Ziel, kleine Kristalle der Matrix zu erzeugen, die Probenmoleküle aufnimmt. Das Wachstum dieser Kristalle läßt sich dabei nicht steuern; es entstehen einmal große Kristalle, ein anderes Mal kleine.

Aber auch andere Probleme führen dazu, daß der Abstand d nicht immer konstant ist und dem bei der Kalibration der Massenskala gegebenen Wert entspricht. Die Probenträger werden über Schleusen ins Vakuumsystem des Massenspektrometers eingeführt und werden dort von einer Halterung aufgenommen, die von einer Bewegungsvorrichtung bewegt wird. Die Auf­ nahme in Gleitschienen der Halterung mit Positionierung durch Federdruck kann dabei wegen der Vakuumbedingungen nicht immer so präzise erfolgen wie erforderlich. Enge Toleranzen der Gleitschienen und Gleitmittel können im Vakuum nicht angewandt werden. Bei der Rei­ bung von Metall auf Metall kann im Vakuum leicht ein Festfressen erfolgen, daher wird für die Gleitschienen häufig Kunststoff verwendet, dessen Maßhaltigkeit nicht so gut wie die des Me­ talls ist. Auch bei einer parallelen Verschiebung dieser Probenträger zur Spektrenaufnahme der verschiedenen Proben kann leicht eine Änderung des Abstandes d zur Zwischenelektrode in der Größenordnung von einigen Zehnteln Millimeter eintreten.

Bei der Analyse von biogenem Material ist aber nun sehr häufig sehr wenig Analytmaterial vorhanden. Es ist auch unbekannt, ob die gewählte Matrix überhaupt zu effektiver Ionisierung führt. Es wird daher oft ein Probespektrum aufgenommen, bevor eine genaue Einstellung des Massenspektrometers und eine Korrektur für einen Fehlabstand d erfolgte. Für dieses Spek­ trum ist die kalibrierte Massenskala nicht gültig. Wenn sich danach zeigt, daß die Probe durch das Probespektrum bereits aufgebraucht wurde, muß man für die Massenbestimmung mit die­ sem Probespektrum auskommen. Es ist nun das Problem, dieses Probespektrum, von dessen Ionen die genauen Flugzeiten, aber nicht die genauen Massen bekannt sind, rechnerisch anhand bekannter Referenzionen im Spektrum möglichst gut nachzukorrigieren, so daß trotz der Fehl­ justierung noch genaue Massen bestimmt werden können.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Korrektur der Flugzeiten zu finden, die unter einem fehlerhaft veränderten Abstand d zwischen Probenträger und Zwischenblende gemessen wur­ den, so daß die einkalibrierte Massenskala (= Beziehung für die Umrechnung der Flugzeiten in Massen) für die korrigierten Flugzeiten aller Ionenmassen des kalibrierten Massenbereichs gleichzeitig innerhalb enger Fehlertoleranzen gültig bleibt.

Die Erfindung besteht darin, die Flugzeit der Ionen einer Referenzsubstanz durch eine appara­ tiv vorgegebene quadratische Korrekturgleichung mit einem Steuerparameter, der multiplikativ sowohl auf das lineare wie auch auf das quadratische Korrekturglied wirkt, auf den Wert der Flugzeit zu korrigieren, der durch die einkalibrierte Massenskala gegeben ist. Wird die Korrek­ tur dann für alle Flugzeiten mit demselben Wert des Steuerparameters durchgeführt, so ist die Massenskala für alle Ionen des Spektrums wieder gültig. Als Referenzionen können beispiels­ weise oligomere Ionen der Matrix des MALDI-Verfahrens dienen.

Unter der Annahme, daß die Ionen keine Anfangsgeschwindigkeit haben, ist die Beziehung zwischen der Flugzeit der Ionen t und der Wurzel aus ihrer Masse √ streng linear. In diesem Fall könnte eine lineare Korrektur der Flugzeit t die Gültigkeit der Massenkalibrierung wieder­ herstellen. Durch die Existenz einer mittleren Anfangsgeschwindigkeit der Ionen ist diese Be­ ziehung jedoch nicht mehr linear, sondern besitzt ein schwaches quadratisches Glied, das nicht vernachlässigt werden kann. Das quadratische Glied wird auch durch die Verbesserung des Auflösungsvermögens durch eine zeitverzögert einsetzende Beschleunigung der Ionen (häufig mit "delayed extraction" bezeichnet) nicht beseitigt.

Führen wir für die Wurzel aus dem Masse-zu-Ladungsverhältnis die Abkürzung

ein, so nimmt die Beziehung zwischen der Flugzeit t (gemessen ab Einsetzen der Beschleuni­ gung, also um die Zeit τ später als die Ionenerzeugung durch den Laserblitz) und der Wurzel w folgende sehr einfache Form an, wobei alle nichtkritischen Parameter in der reduzierten Flug­ strecke l zusammengefaßt sind, und nur die Abhängigkeiten von den Beschleunigungsspannun­ gen, vom Abstand d und der mittleren Geschwindigkeit ν wiedergegeben werden:

wobei U die volle Beschleunigungsspannung, V die Teilbeschleunigungsspannung zwischen Probenträger und Zwischenblende, und l eine reduzierte Flugstrecke ist, die nur von der Geo­ metrie des Flugzeitspektrometers abhängt und in der alle übrigen geometrischen Abmessungen enthalten sind. Die Teilbeschleunigungsspannung V wird um die Zeit τ verzögert eingeschaltet, um die Massenauflösung zu verbessern. Wie bereits oben beschrieben, ist d der Abstand zwi­ schen dem Probenträger und der Zwischenblende, und ν ist die mittlere Geschwindigkeit der Ionen beim Einschalten der Beschleunigung. Der Term mit w² ist zwar klein gegenüber dem in w linearen Term, erlangt aber mit zunehmender Masse deutlichen Einfluß. Die Abkürzungen a, b und c werden nur eingeführt, um die Struktur der Gleichung und ihre Abhängigkeit vom Ab­ stand d zu verdeutlichen.

Um zu einer Korrekturgleichung für die Flugzeit t zu kommen, bilden wir nun die partielle Ableitung der Flugzeit t nach dem Abstand d:

woraus mit der Näherung

w ≈ kt (4)

die näherungsweise gültige Differenzengleichung

t + Δt ≈ t + Δd × b × k × t + Δd × c × k² × t² = t + Δd × c₁ × t + Δd × c₂ × t² (5)

erhalten wird. In dieser Gleichung können wir nun die unbekannte Änderung Δd durch den Steuerparameter p ersetzen und erhalten die Korrekturgleichung

t_korr = t + Δt ≈ t + p × c₁ × t + p × c₂ × t², (6)

wobei der Parameter p aus der Abweichung Δt der Flugzeit einer Referenzionenmasse von der "richtigen" Flugzeit nach kalibrierter Massenskala berechnet werden kann. Wendet man die Gleichung (6) mit dem selben Wert für den Parameter p auf die anderen Flugzeiten t an, so erhält man die korrigierten Flugzeiten für alle anderen Ionen, und über die Massenskala auch die (näherungsweise) richtigen Massen. Die beiden Apparatekonstanten c₁ und c₂ können für einen Typ von Massenspektrometer und für ein festgelegtes Meßverfahren einmalig bestimmt werden.

Für ein Flugzeitmassenspektrometer mit einem Abstand d = 3 Millimeter, einer zweiten Be­ schleunigungstrecke von 30 Millimeter, und einer Flugstrecke von 1,6 Meter betragen die Konstanten etwa c₁ = 0,013 und c₂ = -0,000019, wenn p etwa die proportionale Änderung von d widergibt (beide Konstanten werden mit p multipliziert, hängen also von der Wahl von p ab).

Es ist also der Grundgedanke der Erfindung, nach einmaliger Bestimmung der Apparatekon­ stanten c₁ und c₂ die Flugzeiten der Ionen eines mit fehljustiertem Abstand d aufgenommenen Spektrums durch die Gleichung (6) zu korrigieren, und die wahren Massen der Ionen über die korrigierten Flugzeiten mit Hilfe der einkalibrierten Massenskala zu berechnen. Dabei wird der Parameter p aus der Abweichung der Flugzeit eines Referenzions bekannter Masse im Spek­ trum von der Sollflugzeit nach Kalibrierung gewonnen. Als Referenzionen können insbesonde­ re die Ionen der Matrixsubstanz verwendet werden, vorzugsweise oligomere Ionen.

Bei einer experimentell herbeigeführten Abstandsänderung um 10% ließen sich die Flugzeiten durch richtige Wahl des Wertes für den Steuerparameter p so korrigieren, daß die einkalibrierte Massenskala mit einem maximalen Fehler von etwa 20 ppm der Masse über einen weiten Mas­ senbereich von 500 u bis 10 000 u wieder gültig wurde. Dieser Wert von 20 ppm der Masse entspricht etwa der Meßgenauigkeit für die Flugzeit unter diesen Verhältnissen, die etwa 10 ppm beträgt.

Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines Flugzeitmassenspektrometers mit der Probenträ­ gerelektrode 1 auf dem Beschleunigungspotential U, der Zwischenelektrode 2 auf einem schaltbaren Potential, der Grundelektrode 3 auf Erdpotential, einer ionenoptischen Ionenstrahl­ einzellinse 4, und dem Ionendetektor 10. Ein Lichtblitz aus dem Laser 5 wird von der Linse 6 in einem konvergenten Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 fokussiert, die sich auf dem Probenträger 1 befindet. Zu dieser Zeit befindet sich die Zwischenelektrode ebenfalls auf dem Beschleuni­ gungspotential U. Der Lichtblitz erzeugt in einem MALDI-Prozeß Ionen der Analytsubstanz mit einer Anfangsgeschwindigkeit ν und großer Geschwindigkeitsstreuung. Nach einer Verzö­ gerungszeit τ wird die Zwischenelektrode 2 vom Potential U auf das Potential U - V herabge­ schaltet, und die Ionen werden beschleunigt. Sie bilden den Strahl 9 des Ionenstromes, der nach Durchlaufen der Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10 vom Detektor 10 zeitaufgelöst gemessen wird.

Die hier gezeigte Anordnung hat gitterlose Blenden als Zwischenelektrode 2 und Grunde­ lektrode 3 und braucht daher die Einzellinse 4. Bei Einführung von Gittern in Zwischenelek­ trode 2 und Grundelektrode 3 kann die Einzellinse 4 entfallen.

Das hier vorgestellte Verfahren der präzisen Massenbestimmung nach dieser Erfindung stützt sich auf ein lineares Flugzeitmassenspektrometer, das in Fig. 1 gezeigt wird. Das Verfahren der Korrektur Gleichung (6) ist jedoch mit anderen Werten für die Konstanten c₁ und c₂ auch für Flugzeitspektrometer mit energiefokussierenden Reflektoren anwendbar.

Bei Benutzung der oben bereits geschilderten verzögert einsetzenden Beschleunigung befindet sich die Zwischenelektrode 2 zunächst auf dem Potential U des Probenträgers 1, und wird nach der Verzögerungszeit τ von einigen zehn bis hundert Nanosekunden auf das Potential U - V herabgeschaltet. Es ist auch ein Betrieb möglich, bei dem sich Probenträger und Zwischenblen­ de beide zunächst auf dem Potential U - V befinden, wobei der Probenträger 1 nach der Ver­ zögerungszeit τ auf das Potential U angehoben wird.

Mit dieser Anordnung eines Flugzeitmassenspektrometers können wie gewöhnlich Spektren der Probesubstanzen aufgenommen werden. Die Spektrenaufnahme beginnt mit der Ionisie­ rung der Probensubstanzen 8 auf dem Probenträger 1, wobei hier das MALDI-Verfahren zur Ionisierung beschrieben wird. Die Ionen werden durch einen Lichtblitz von etwa 3 bis 5 Nano­ sekunden Dauer aus dem Laser 5 erzeugt. Gewöhnlich wird UV-Licht mit einer Wellenlänge von 337 Nanometer aus einem preiswerten Stickstoff-Laser benutzt. Der Lichtblitz ist durch die Linse 6 als konvergenter Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 auf der Oberfläche des Probenträgers 1 fokussiert. Die in der Dampfwolke, die durch den Laserfokus erzeugt wird, gebildeten Ionen werden nach der Verzögerungszeit τ zunächst im elektrischen Feld zwischen Probenträger 1 und Zwischenelektrode 2 beschleunigt, und dann im elektrischen Feld zwischen Zwischenelek­ trode 2 und Grundelektrode 3. Die in der Elektrodenanordnung leicht defokussierte Ionen­ strahl wird zu Beginn der Flugstrecke in der Einzellinse 4 auf den Detektor 10 fokussiert. Die fliegenden Ionen bilden einen zeitlich stark variierenden Ionenstrom 9, der am Ende der Flug­ strecke vom Ionendetektor 10 mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen wird.

Der durch den Ionenstrahl gegebene zeitvariable Ionenstrom wird am Detektor gewöhnlich mit einer Abtastrate von 1 oder 2 Gigahertz gemessen und digitalisiert. Üblicherweise werden die zeitgleichen Meßwerte aus mehreren Spektrenaufnahmen addiert, bevor die Mas­ senlinien in den gespeicherten Daten gesucht und über die Datenauswertung von der Zeitskala über die Massenkalibrierkurve in die Massenwerte transformiert werden.

Die Polarität der verwendeten Hochspannung für die Ionenbeschleunigung muß gleich der Po­ larität der untersuchten Ionen sein: Positive Ionen werden durch einen positiv geladenen Pro­ benträger abgestoßen und beschleunigt, negative Ionen durch einen negativ geladenen Proben­ träger.

Selbstverständlich kann man das Flugzeitmassenspektrometer auch so betreiben, daß sich die Flugstrecke in einem (nicht in Fig. 1 gezeigten) Rohr befindet, das sich auf dem Beschleuni­ gungspotential U befindet, während der Probenträger 1 auf Grundpotential liegt. In diesem besonderen Fall liegt das Flugrohr auf positivem Potential, wenn negativ geladene Ionen unter­ sucht werden sollen, und umgekehrt. Dieser Betrieb vereinfacht die Konstruktion der Ionen­ quelle, da die Isolatoren für den Halter des auswechselbaren Probenträgers 1 entfallen können, bringt jedoch an anderen Stellen Nachteile mit sich.

Es ist erforderlich, eine Referenzsubstanz bekannter Masse mitzumessen. In den meisten Fällen liegen solche Referenzionen in Form von Ionen der Matrixsubstanz vor. Dabei hat es sich gezeigt, daß die monomeren Ionen wegen ihrer viel zu hohen Intensität und der dadurch gegebenen Überladung der Meßeinrichtung nicht gut geeignet sind, außerdem liegt ihre Masse so weit am unteren Rande des nutzbaren Massenbereichs, daß die Extrapola­ tion in den gewünschten Massenbereich hinein ungünstig wird. Es treten aber in den meisten Spektren dimere Ionen im richtigen Intensitätsbereich, manchmal sogar trimere oder noch hö­ here oligomere Ionen auf. Diese Linien sind sehr scharf und eignen sich auch besser wegen ihrer höheren Masse. Anhand dieser Referenzionen kann nun eine Korrektur aller Flugzeiten aller Ionensignale vorgenommen werden, die so beschaffen ist, daß die Flugzeiten der Refe­ renzionen ihre während der Kalibrierung gültige Flugzeit wieder annehmen. Die Korrektur folgt der quadratischen Gleichung (6).

Dabei kann der Korrekturparameter p der Gleichung (6) zunächst aus der Abweichung Δτ der Referenzionenflugzeit ermittelt werden. Sodann werden die Flugzeiten aller interessierenden Ionenmassen mit dem demselben Wert für den Korrekturparameter p korrigiert. Die korrigier­ ten Flugzeiten werden dann über die Kalibrierkurve der Massenskala in Massen umgerechnet. Die so bestimmten Massen stimmen bis auf sehr geringe Fehler (unter 20 ppm) mit den wahren Massen überein.

Claims (4)

1. Verfahren für die genaue Massenbestimmung von Analytionen in einem Flugzeitmassen­ spektrometer anhand einer einmal kalibrierten Massenskala, mit Ionisierung der auf einen Probenträger aufgebrachten Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) und mit Verbesserung der Massenauflösung im Flugzeitspektrometer durch eine zeitverzö­ gert einsetzende Beschleunigung in einer ersten Teilbeschleunigungsstrecke zwischen Pro­ benträger und Zwischenblende, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Massenbestimmung die Flugzeiten aller Ionen über eine quadratische Korrek­ turgleichung durch Veränderung eines gemeinsamen Korrekturparameters im linearen und quadratischen Korrekturglied so korrigiert werden, daß die korrigierte Flugzeit einer von der Probe desorbierten Referenzionenmasse mit ihrem Wert bei der Kalibration der Mas­ senskala übereinstimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die korrigierte Flugzeit t_korr aus der gemessenen Flugzeit t nach der Gleichung t_korr = t + Δt ≈ t + p × c₁ × t + p × c₂ × t²berechnet wird, wobei p der Korrekturparameter, und c₁ und c₂ zwei Apparatekonstanten sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstanten c₁ und c₂ durch eine einmalige Eichung eines Massenspektrometers gleichen Typs festgelegt werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß monomere, dimere oder oligomere Ionen der MALDI-Matrixsubstanz als Referenzio­ nen verwendet werden.