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Die
Erfindung bezieht sich auf die genaue Massen- und Mengenbestimmung
von Analytionen in hochauflösenden
Flugzeitmassenspektrometern, in denen die Analytionen durch eine
Ionisierung einer Probe mit Analytsubstanzen erzeugt werden, die
sich zusammen mit einer Vielzahl von anderen Proben auf einem beweglichen
Probenträger
befindet. Die Probe kann beispielsweise durch matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI) ionisiert werden.
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Die
Erfindung besteht darin, den für
die Bestimmung der Masse und Menge der Ionen kritischen Abstand
der Probenoberfläche
zu einer ersten Beschleunigungsblende in der Ionenquelle durch eine Analyse
der Bilder einer Videokamera, die auf die Probe gerichtet ist, zu
erfassen und diesen Abstand zu regeln. Die Regelung kann beispielsweise über elektromechanische
Stellglieder erfolgen. Die Bildanalyse kann durch ein schräg auf die
Probenoberfläche
eingestrahltes Lichtmuster vereinfacht werden.
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Stand der Technik
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Es
gibt verschiedenartige Verfahren, mit denen Analytsubstanzen ionisiert
werden können,
die sich auf der Oberfläche
eines Probenträgers
befinden. Dazu gehören
der Ionenbeschuss (Sekundärionen-Massenspektrometrie
= SIMS), die Laserdesorption (LD), die Schockwellenerzeugung im
Probenträger
und die Plasmadesorption (PD), die durch hochenergetische Spaltungsteilchen
ausgelöst
wird. Weiteste Verbreitung hat die Ionisierung von besonders präparierten
Proben auf Oberflächen
durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) gefunden. Die Ionen haben bei allen Verfahren
nach Verlassen der Oberfläche
in der Regel eine nicht vernachlässigbare
Geschwindigkeit mit starker Streuung um eine mittlere Geschwindigkeit.
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Soll
ein solches Verfahren mit direktem axialen Einschuss in ein Flugzeitmassenspektrometer gekoppelt
werden, so ist eine kurzzeitige Ionenerzeugung mit nachfolgender
Beschleunigung durch elektrische Ziehfelder erforderlich. Die mittlere
Anfangsgeschwindigkeit, die meist für Ionen aller Massen in etwa
gleich ist, führt
zu einer nichtlinearen Verzerrung der an sich linearen Beziehung
zwischen Flugzeit und Wurzel aus der Masse. Die Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten
führt zu
einer Unschärfe beim
Messen der Signale der einzelnen Ionenmassen und damit zu einer
schlechten Massenauflösung; es
gibt jedoch Verfahren, diese Unschärfe wieder zu kompensieren.
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Im
Folgenden werde insbesondere auf die Ionisierung organischer Analytmoleküle durch
matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) eingegangen, ohne dass aber die Schlussfolgerungen
und Problemlösungen
auf dieses Verfahren allein beschränkt sein sollen.
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Für das MALDI-Verfahren
werden die Analytmoleküle
zusammen mit einem großen Überschuss an
Matrixsubstanz auf einen Probenträger aufgebracht und molekular
getrennt in eine kristalline Schicht der niedermolekularen Matrixsubstanz
eingelagert. In der Regel werden die Substanzen in Lösung aufgebracht
und dann getrocknet. Die präparierte
und getrocknete Mischung aus Analytmolekülen und Matrixsubstanzkristallen
auf dem Probenträger
werde hier die „Probe” genannt.
Ein Lichtpuls von wenigen Nanosekunden Dauer aus einem Laser, der auf
die Probenoberfläche
fokussiert wird, verdampft in einem quasi-explosiven Prozess eine
geringe Menge der Matrixsubstanz, wobei auch die Analytmoleküle in die
zunächst
winzige Dampfwolke überführt werden.
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Die
ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische
Ausdehnung nicht nur die relativ leichten Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz,
sondern durch viskose Mitnahme auch die in der Regel viel schwereren
Moleküle
und Ionen der Analytsubstanz, die dabei höhere kinetische Energien erhalten,
als sie dem thermischen Gleichgewicht entsprächen. Selbst ohne ein beschleunigendes
Feld erreichen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 500
bis 1000 Metern pro Sekunde, abhängig
von der Energiedichte des Laserstrahls. Die Geschwindigkeiten sind
dabei weitgehend unabhängig
von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwindigkeitsstreuung,
die von etwa 200 bis zu 2000 Metern pro Sekunde reicht. Es ist anzunehmen,
dass auch die neutralen Moleküle der
Wolke diese Geschwindigkeiten besitzen.
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Die
Ionen werden in der Ionenquelle mit elektrischen Feldern auf Energien
von rund 10 bis 30 Kiloelektronenvolt beschleunigt, axial in die
Flugstrecke des Massenspektrometers eingeschossen und am Ende der
Flugstrecke zeitaufgelöst
detektiert. Im Allgemeinen genügt
es dabei nicht, nur ein einziges Flugzeitspektrum aufzunehmen. In
der Regel werden durch einige hundert Laserschüsse einige hundert einzelne
Flugzeitspektren aufgenommen, deren digitalisierte Ionenstromwerte
in einem elektronischen Datenspeicher addiert werden. Bei maximalen
Flugzeiten von jeweils etwa einhundert Mikrosekunden und Mess- und
Digitalisierungsraten von einigen Gigahertz muss der Datenspeicher
einige Hunderttausend Ionenstromwerte umfassen. Die Messraten liegen
heutzutage zwischen zwei und acht Gigahertz. In der Reihenfolge
der Flugzeiten gespeicherten Wertefolge der Ionenströme ragen
dann die Ionensignale für
die gemessenen Ionensorten heraus. Schwerpunkts-Flugzeiten und zugehörige Ionensignalhöhen können mit
Hilfe von Computerprogrammen durch so genannte Peakerkennungsverfahren
bestimmt werden.
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Aus
den Flugzeiten der Ionensignale kann ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis bestimmt
werden. Da diese Art der Ionisierung praktisch nur einfach geladene
Ionen liefert, wird im Folgenden meist nur von der Massenbestimmung
gesprochen, nicht von der Bestimmung des Verhältnisses von Masse zu Ladung.
Die Umrechnung der Flugzeiten in Massen wird über eine mathematische Funktion
vorgenommen, die im Folgenden als „Kalibrierkurve” bezeichnet
wird; das Ergebnis ist ein Massenspektrum mit einer kalibrierten „Massenskala”. Das Massenspektrum
enthält
die Werte der Signalhöhen
der Ionenströme
aufgetragen über
der Massenskala. Die Bestimmung dieser Kalibrierkurve wird mit Hilfe
einer Kalibriersubstanz, deren Ionenmassen genau bekannt sind, vorgenommen.
Dieser Vorgang wird „Kalibrierung
der Massenskala” des
Flugzeitspektrometers genannt. Die Kalibrierkurve kann als Folge
von Wertepaaren Flugzeit/Masse im Speicher des Datenverarbeitungssystems
abgelegt sein, aber auch in Form der Speicherung von Parameterwerten
für eine
mathematisch als Formel gegebene Funktion.
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Bei
der Bildung der Dampfwolke wird ein winziger Bruchteil der Moleküle, und
zwar sowohl der Matrix- wie auch der Probenmoleküle, ionisiert. Aber auch während der
Ausdehnung der Dampfwolke findet durch weitere Ionen-Molekül-Reaktionen
eine fortlaufende Ionisierung der großen Moleküle auf Kosten der kleineren
Matrixionen statt. Die große Streuung
der Geschwindigkeiten und der zeitverschmierte Prozess der Ionenbildung
beeinträchtigen und
begrenzen die Massenauflösung
sowohl in linearen wie auch in energiefossierend reflektierenden Flugzeitmassenspektrometern.
Eine Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten allein ließe sich
mit dem energiefokussierenden Reflektor ausfokussieren, die zeitverschmiert
entstehenden Ionen jedoch nicht.
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Ein
Verfahren für
eine Erhöhung
der Massenauflösung
unter diesen Bedingungen ist unter dem Namen „delayed extraction” (DE) bekannt.
Die Ionen der Wolke werden zunächst
für eine
kurze Zeit in einem feldfreien Raum vor der Probe fliegen gelassen.
Dabei bildet sich eine recht streng eingehaltene Korrelation zwischen
Geschwindigkeit der Ionen und ihrem Abstand von der Probe, aus der
Geschwindigkeitsverteilung der Ionen ergibt sich eine dazu korrelierte
Ortsverteilung. Erst dann wird die Beschleunigung der Ionen durch
ein homogenes Beschleunigungsfeld, also mit einem linear abfallenden
Beschleunigungspotential, eingeschaltet. Die schnelleren Ionen befinden
sich dann weiter von der Probenträger-Elektrode entfernt, somit
auf einem etwas geringeren Beschleunigungspotential, das ihnen eine etwas
geringere Endgeschwindigkeit für
die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu Beginn
langsameren Ionen. Bei richtiger Wahl der Verzögerungszeit („time lag”) und des
Potentialabfalls (also des Beschleunigungsfeldes) können die
zu Beginn langsameren, aber nach Beschleunigung schnelleren Ionen
die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung langsameren
Ionen genau am Detektor wieder einholen (oder an einem Zwischenfokus,
der dann auf den Detektor abgebildet wird). Es werden somit Ionen
am Ort des Detektors in Bezug auf die Masse dispergiert, aber bei
gleicher Masse in Bezug auf die Flugzeit in erster Ordnung fokussiert. Damit
erreicht man eine hohe Massenauflösung im Flugzeitspektrometer,
besonders in Flugzeitspektrometern mit zusätzlichen energiefokussierenden
Reflektoren.
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Die
Einschaltung des Beschleunigungsfeldes vor dem Probenträger muss
nicht mit einem Schalten der gesamten Beschleunigungsspannung verbunden
sein. Die gesamte Beschleunigungsspannung beträgt etwa 20 bis 30 Kilovolt.
Die Schaltung so hoher Spannungen in extrem kurzen Zeiten von wenigen
Nanosekunden ist auch heute noch technisch schwer möglich und
mit hohen Kosten verbunden. Man kommt aber mit dem Schalten einer
relativ kleinen Teilspannung aus, wenn man in die Beschleunigungsstrecke
eine Zwischenelektrode einbaut. Es braucht dann nur der Raum zwischen
Probenträgerelektrode
und Zwischenelektrode zunächst feldfrei
sein und nach Zeitverzögerung
in ein Beschleunigungsfeld umgeschaltet werden. Da der Potentialabfall
im Wesentlichen vorgegeben ist, brauchen nur geringe Spannungen
von einigen hundert Volt geschaltet werden, wenn der Abstand des
Probenträgers
zur Zwischenelektrode entsprechend nur einige Millimeter klein ist.
Es besteht wegen der Ausdehnung der Dampfwolke im feldfreien Raum
eine Untergrenze für
diesen Abstand bei etwa einem Millimeter, der aber für praktische
Konstruktionen von Ionenquellen kaum infrage kommt.
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Das
Bestreben nach einer hohen Massenauflösung hat primär seinen
Sinn darin, zu einer guten und nicht durch Überlagerungen gestörten Massenbestimmung
zu gelangen; die hohe Massenauflösung
dient aber auch zur Erhöhung
des Verhältnisses von
Signal zu Rausch und damit zur Erhöhung der Empfindlichkeit. Es
werden für
gute MALDI-Flugzeitmassenspektrometer heute Massengenauigkeiten von
unter fünf,
möglichst
von nur einem Millionstel der Masse (ppm) angestrebt. Es hat sich
aber seit der Einführung
dieser Methode gezeigt, dass die prinzipiell gegebene Möglichkeit
für eine
genaue Massenbestimmung nicht immer gelingt. Die Funktion, die die Masse
in Abhängigkeit
von der Flugzeit beschreibt, also die Kalibrierkurve, ist bei der
Ionisierung durch MALDI häufig
nicht von Probe zu Probe konstant, selbst wenn sich die Proben auf der
gleichen Probenträgerplatte
befinden. Für
ein Ion der Masse 5000 atomaren Masseneinheiten kann das Ergebnis
der Massenberechnung von Spektrenaufnahme zu Spektrenaufnahme im
Extremfall um mehrere Masseneinheiten schwanken.
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Es
ist daher für
Massenbestimmungen mit angestrebten ein bis fünf Millionstel Genauigkeit üblich geworden,
die Massen der zu bestimmenden Analytionen durch gleichzeitige Aufnahme
der Ionen beigemischter bekannter Substanzen zu korrigieren. Dieser
Vorgang wird „Rekalibrierung
durch interne Referenzmassen” genannt.
Als einfachste Methode wurde dabei die Masse der Analytsubstanzen
durch lineare Extrapolation auf einer als linear angenommenen Beziehung
zwischen Flugzeit und der Wurzel aus der Masse korrigiert. Dieses
Verfahren verlangt aber, dass die Funktion zwischen Masse und Flugzeit von
Probe zu Probe in sich ähnlich
bleibt, was aber aus bisher nicht bekannten Gründen häufig nicht der Fall ist. Das
Verfahren zwingt darüber
hinaus dazu, der Probe jeweils Referenzsubstanzen beizumischen,
und zwar in Konzentrationen, die denen der Analytmoleküle möglichst ähnelt, die
aber im Allgemeinen nicht bekannt sind.
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Moderne
Probenträger
können
sehr viele Proben aufnehmen, so sind Probenträger mit 100, 384 oder 1536
Proben im Gebrauch. Die Probenträger
sind daher räumlich
recht ausgedehnt. Es sind Probenträger von zwei Zoll mal zwei
Zoll, aber auch von acht mal zwölf
Zentimetern im Gebrauch. Die Größe bringt
es mit sich, dass bei der Bewegung des Probenträgers, um eine Probe nach der
anderen in den Fokus des Lasers zu bringen, auch der Abstand zwischen
Probenträger
und der Zwischenelektrode geringfügig variiert. Damit ändern sich
Fluglänge
der Ionen und der Potentialabfall in der ersten Beschleunigungsstrecke
zwischen Probenträger
und Zwischenelektrode. Die Auswirkung kann dramatisch sein. Zur
Verdeutlichung: Ein Mikrometer Vergrößerung des Abstandes macht
für ein
Flugzeitspektrometer mit zwei Meter Fluglänge bereits ein halbes Millionstel
Verlängerung
der Flugstrecke und der Flugzeit und damit (wegen des quadratischen
Zusammenhangs) ein volles Millionstel scheinbarer Vergrößerung der
Ionenmasse aus. Selbst bei höchster
Präzision
in der Fertigung metallischer Probenträger und ihrer Führungen
ist es kaum möglich, eine
Fertigungs- und Abstandstoleranz von einem Mikrometer einzuhalten.
Hinzu kommt, dass bei einer Änderung
des Abstands zur ersten Beschleunigungselektrode auch eine Änderung
des beschleunigenden Feldes vorliegt, die den Effekt noch verstärkt. Sowohl
in Simulationen wie auch in praktischen Experimenten konnte gezeigt
werden, dass pro Mikrometer Änderung
des Abstandes etwa zwei bis vier ppm scheinbare Änderungen der Massen zu beobachten
sind.
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Hinzu
kommt, dass der Abstand auch kritisch in die Fokussierung des entstehenden
Ionenstrahls eingeht. Eine Abstandsänderung von nur 20 Mikrometer
kann bedeuten, dass durch veränderte
Fokussierung die Stromstärke
des Ionenstrahls am Detektor bereits um weit mehr als die Hälfte abfällt. Zudem ändert sich
dabei die Kalibrierkurve in komplizierter Weise, nicht einfach in
Form einer homogenen Dehnung, so dass eine Rekalibrierung nicht
mehr einfach durch einen Dehnungsfaktor vorgenommen werden kann.
Es muss eine Mehrpunkt-Rekalibrierung vorgenommen werden. Außerdem wird
die Massenauflösung
deutlich schlechter, so dass eine Rekalibrierung zwar hilfreich
ist für
eine genauere Massenbestimmung, aber die idealen Verhältnisse
in Bezug auf Empfindlichkeit und Massenauflösung können nicht mehr hergestellt
werden.
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Es
gibt heute Bestrebungen, besonders für medizinische Anwendungen,
Probenträger
aus Gründen
der Analysensicherheit nur einmal zu verwenden. Hochpräzise Probenträger aus
Metall sind hierfür
zu teuer. Es werden statt dessen relativ dünne und einfach herzustellende
Probenträger
aus elektrisch leitendem Plastikmaterial hergestellt, die bereits
mit Matrixschichten vorpräpariert
sind. Hier liegen die unvermeidlichen Änderungen des Abstands zur
ersten Beschleunigungselektrode eher bei einem Zehntel Millimeter,
und damit treten scheinbare Massenänderungen von einigen Hundert
Millionsteln (ppm) auf. In Bezug auf die angestrebten Massengenauigkeiten
von einem Millionstel wird deutlich, dass hier besondere Maßnahmen
zu treffen sind.
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Es
ist also notwendig, den Abstand des Probenträgers sehr genau zu regeln.
In Patentschrift
DE 196
33 441 C1 (Köster
et al., äquivalent
zu
US 5910656 A und
GB 2 316 529 B )
wird ein Verfahren vorgeschlagen, den Abstand durch elektromechanische
Stellglieder so einzuregeln, dass die Flugzeiten einer bekannten
Referenzsubstanz mit der vorbestimmten Kalibrierkurve die richtigen
Massenwerte ergeben. Dieses Verfahren zwingt aber wiederum dazu,
den Proben neben den Analytsubstanzen auch jeweils Referenzsubstanzen
bekannter Massen beizumischen. Diese Beimischung ist häufig schwierig, da
sie mit ungefähr
der gleichen Konzentration erfolgen muss wie die die der Analytsubstanz;
deren Konzentration ist aber unbekannt. Das Verfahren ist daher
kaum korrekt auszuführen.
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Außerdem ist
es bei dem vorgeschlagenen Verfahren notwendig, der eigentlichen
Aufnahme analytisch verwertbarer Massenspektren jeweils mindestens
eine Spektrenaufnahme zur Abstandsregelung voranzustellen. Das erhöht den Verbrauch
der manchmal sehr wertvollen und knappen Probe. Das Massenspektrum
zur Abstandsregelung muss außerdem
durch entsprechende Softwareprogramme ausgewertet werden, was zusätzliche
Zeit erfordert. Ist der anfängliche
Abstand um mehr als zehn Mikrometer falsch, so hat das erste Massenspektrum
eine deutlich verschlechterte Massenauflösung, die keine genaue Massenbestimmung
erlaubt. Es muss daher in der Regel ein weiteres Massenspektrum
zur Abstandsregelung in der Nähe
des richtigen Abstandes aufgenommen werden.
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Im
genannten Patent wird auch vorgeschlagen, auf dem Probenträger neben
den Analytproben in enger räumlicher
Nähe eine
Vielzahl von Proben ohne Analytmoleküle, aber mit Referenzsubstanzen aufzubringen.
Das setzt voraus, dass der Probenträger wenigstens über kurze
Strecken hinweg so bewegt werden kann, dass der Abstand hinreichend gleich
bleibt. Es setzt ferner voraus, dass die Präparation Proben liefert, deren
kristalline Strukturen alle genau die gleiche Dicke haben. Das lässt sich
für so genannte
Dünnschichtpräparationen,
die nur eine einzige Schicht von Matrixkriställchen mit nur wenigen Mikrometer
Dicke haben, relativ leicht bewerkstelligen. Die Kriställchen liegen
hier alle nebeneinander auf der Probenträgerplatte. Ob sich eine Dünnschicht
herstellen lässt,
hängt aber
von der Matrixsubstanz und ihren Kristallisierungseigenschaften ab.
Viele Matrixsubstanzen kristallisieren nur schwer auf der Oberfläche des
Probenträgers,
sondern liefern aufeinander aufwachsende Kristallkonglomerate von
durchaus 10 bis 50 Mikrometer Dicke; hier ist es praktisch unmöglich, die
Dicke von Probe zu Probe auf etwa ein Mikrometer genau einzuhalten.
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Hinzu
kommt, dass in manchen MALDI-Flugzeitmassenspektrometern der Laserstrahl
zur Ionisierung der Probe schräg
eingestrahlt wird, unter Winkeln von etwa 30 bis 60 Grad. Eine Abstandsänderung
bringt dann auch eine Querverschiebung des Fokuspunktes mit sich,
und damit, insbesondere bei gitterlosen Beschleunigungsoptiken,
eine weitere Änderung
der Abbildungseigenschaften für
die Ionen.
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Bei
solch dicken Proben ist es manchmal schwierig, die „Probenoberfläche”, deren
Abstand zur ersten Beschleunigungselektrode immer gleich groß gehalten
werden muss, genau zu definieren, da diese Probenoberfläche auch
einem unregelmäßig geformten
Gebirge gleichen kann. Es soll dann mit Probenoberfläche genau
der Teil der Probenoberfläche
gemeint sein, der im Fokus des Laserstrahles liegt und dort verdampft
wird.
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MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
besitzen regelmäßig eine
Ionenquelle, die neben einer Beschleunigungsoptik für die Ionen
auch eine Optik für
die Einstrahlung des Laserlichts, eine Videokamera für die Betrachtung
der Probe und dazu eine Einrichtung zur Beleuchtung der Probe enthält. Die
Videokamera beobachtet die Probe stets unter einem Winkel zwischen
etwa 30 bis 60 Grad zur Oberfläche der
Probenträgerplatte,
da sich Kamera oder Umlenkspiegel nicht im Weg des Ionenstrahles
befinden sollen. Die Videokamera arbeitet in einem Makro-Modus; in einem Videobild
werden etwa zwei Millimeter Probe abgebildet. Auch die Beleuchtung
der Probe, die für
die Bildaufnahme der Videokamera notwendig ist, findet unter einem
entsprechenden Winkel statt. Die Bilder der Videokamera werden in
der Regel in den Rechner des Massenspektrometers übertragen, um
sie auf dessen Bildschirm sichtbar zu machen. Aus der Offenlegungsschrift
EP 1 732 103 A2 ist
zu entnehmen, dass die Bilder einer Videokamera verwendet werden,
um bei einer seitlichen (horizontalen) Verschiebung des Probenträgers Probenstellen auf
dem Probenträger
zu identifizieren.
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Es
gibt MALDI-Ionenquellen in Ausführungen
mit und ohne Gitter. Bei Ionenquellen mit Gittern als Beschleunigungselektroden
müssen
auch Laserstrahl und Probenbeleuchtung das Gitter passieren und
es muss die Beobachtung durch die Videokamera ebenfalls durch das
Gitter erfolgen. Gitterfreie Ionenquellen enthalten eine Beschleunigungselektrode,
die neben einer Öffnung
für den
Durchlass des Ionenstrahls auch Öffnungen
für diese
lichtoptischen Einrichtungen enthält.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, eine Regelung für den Abstand der Probenoberfläche zur
ersten Beschleunigungselektrode zu finden, die gut und schnell durchzuführen ist
und ohne eine Vermessung der Ionensignale von Referenzsubstanzen
auskommt.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung besteht darin, durch eine Analyse des Videokamerabildes
der Probe zu einer Regelung des Abstandes der Probenoberfläche zur
ersten Beschleunigungselektrode zu kommen.
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Ist
die Probe an ihrer Oberfläche
eben und sichtbar strukturiert, so gibt die Lage der Linie bester Schärfe im Bild
einer schräg
auf die Probe blickenden Kamera bereits ein Maß für die Lage der Probenoberfläche wieder
und kann für
eine Regelung des Abstandes genutzt werden. Es kann aber auch eine schräg einstrahlende
Projektionsoptik ein leicht erkennbares Muster auf die Probenoberfläche projizieren,
und die laterale Versetzung des projizierten Musters, die durch
einen veränderten
Abstand der Probenoberfläche
zur ersten Beschleunigungselektrode bewirkt wird, kann analysiert
und zur Regelung herangezogen werden.
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Die
Lage der Linie bester Schärfe
oder die Lage des Musters in Bezug auf die Ränder des Videobildes ist bei
feststehender Videokamera (und feststehender Projektionsoptik) ein
Maß für die Entfernung
der Probenoberfläche
von der ersten Beschleunigungselektrode. Ein Kalibrierung kann sehr
einfach dadurch erfolgen, dass Massenspektren bei verschiedenen
Abständen
der Probenträgerplatte
aufgenommen werden. Die Analyse der Massenspektren auf beste Massenauflösung und
Empfindlichkeit kann verwendet werden, die optimale Lage der Linie bester
Schärfe oder
die optimale Lage des Musters im Videobild festzulegen und zukünftig für die Regelung
des Abstandes zu verwenden.
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Diese
Verfahren erlauben es, bei Dünnschichtpräparationen
mit flächig
angeordneten Matrixkristallen in der Größenordnung weniger Mikrometer
zu einer Abstandsregelung zu gelangen, die auf etwa ein bis zwei
Mikrometer genau ist. Dünnschichtpräparationen
dieser Art werden häufig
benutzt und finden insbesondere in der Peptidanalyse ihre Anwendung;
es sind hierfür
Probenträger
aus Metall oder Kunststoff mit vorpräparierten Matrixkristalldünnschichten
im Handel. Für
diese ebenen Dünnschichtpräparationen
ist lediglich eine Verstelleinrichtung für den Abstand, gegebenenfalls
die Einrichtung zur schrägen
Projektion eines leicht erkennbaren Musters und eine Softwareausstattung
zur Analyse der Bilder der Videokamera notwendig. Elektronische
Einrichtungen zur Überführung der
digital aufgenommenen Kamerabilder in den Rechner des Massenspektrometers
sind in der Regel bereits vorhanden.
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Für Matrixmaterialien,
die sich nicht als Dünnschicht
präparieren
lassen, muss dieses Verfahren der Bildanalyse etwas abgewandelt
und zusätzlich
mit einer Spannungsregelung kombiniert werden. Es ist dann notwendig,
durch eine Vermessung des schräg
eingestrahlten Musters an zwei Stellen, einmal auf der Probenträgerplatte
möglichst dicht
neben der Probe und einmal auf der Probe selbst, die Dicke der Kristallschicht
zu bestimmen. Es wird dann die Oberfläche der Probe auf den richtigen Abstand
zur ersten Beschleunigungselektrode eingeregelt, und es wird des
Weiteren die Spannung an der Probenträgerplatte so erhöht, dass
genau auf der Oberfläche
der Probe das richtige, einkalibrierte Potential für die Beschleunigung
der Ionen herrscht.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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zeigt
ein Schema einer Anordnung mit einer schräg einstrahlenden Projektionsoptik
(5, 6) und einer Videokamera (9, 10),
die ein Bild der Probe (2) auf einer Probenträgerplatte
(1) aufnimmt. Der Abstand der Oberfläche der Probe (2)
zur ersten Beschleunigungselektrode (3) kann durch eine
Bewegungseinrichtung (15) in Verbindung mit einem Gelenk
(14) geregelt werden. Die Strahlengänge (8) für die Projektionseinrichtung
(5, 6) und (12) für die Videokamera (9, 10)
werden jeweils durch Spiegel (7) bzw. (11) abgelenkt,
um einen ungestörten
Strahlengang (13) für
die beschleunigten Ionen zu schaffen. Die feldfreie Flugstrecke
der Ionen beginnt ab der zweiten Beschleunigungselektrode (4),
die sich auf Massepotential befindet.
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Die , und zeigen
schematisch Videobilder (20) einer runden Probe (21)
mit etwa zwei Millimeter Durchmesser, die durch eine Dünnschichtpräparation
erhalten wurde, und auf deren Oberfläche jeweils ein Gitter (22)
projiziert wird. Die Proben erscheinen durch laterale Bewegung der Probenträgerplatte
jeweils in die Mitte des Bildes gerückt, aber die Lage des Gitters
im Bild gibt an, ob der Abstand zur ersten Beschleunigungselektrode
eingehalten ist: nur in ist der Abstand korrekt, in ist
der Abstand zu klein, in zu groß. Für den korrekten Abstand wurde
die Projektion so justiert, dass sich das Gitter in der Mitte des
Bildes befindet.
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Beste Ausführungsformen
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Eine
einfache Ausführungsform
der Erfindung besteht darin, durch eine Analyse der Schärfenverteilung
quer über
das Kamerabild der in schräger Aufsicht
aufgenommenen Probe zu einer Regelung des Abstandes der Probenoberfläche zur
ersten Beschleunigungselektrode zu kommen (statt der Schärfe kann
auch der Kontrast analysiert werden). Dieses Verfahren erfordert,
dass die Probe an ihrer Oberfläche
eben und sichtbar strukturiert ist. Das ist bei Dünnschichtpräparationen
regelmäßig der
Fall, da die einzelnen Kriställchen
dieser Präparation
in der Videokamera räumlich
aufgelöst
erscheinen. Durch die schräg
auf die Probe blickende Kamera ergibt sich eine Linie bester Schärfe quer über das
Bild, und die Lage dieser Linie in der Bildfläche der feststehenden Kamera
gibt ein Maß für den Abstand
der Probenoberfläche.
Dieses Maß kann
für die
Regelung des Abstandes genutzt werden. Die Software zur Auswertung
der Kamerabilder muss in der Lage sein, diese Linie bester Schärfe zu erkennen.
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Besonders
günstig
ist ein abgewandeltes Verfahren, das in dargestellt
ist und worin eine schräg
einstrahlende Projektionsoptik (5) mit Linse (6)
ein leicht erkennbares Muster auf die Probe (2) projiziert.
Die Projektion kann bevorzugt unter etwa 45° erfolgen, wie in ,
es ist aber ein großer
Winkelbereich von etwa 15 bis zu 75° nutzbar. Eine Veränderung
des Abstandes der Probenoberfläche
(2) bewirkt einen seitlichen Versatz des Musters, wie in
den , und gezeigt.
Dieser Versatz kann leicht analysiert und zur Regelung herangezogen
werden. Als Muster können
beispielsweise ein runder Fleck oder ein Rechteck verwendet werden,
deren Schwerpunktslagen im Bild der Videokamera leicht bestimmt
werden können.
Als Muster eignet sich aber auch besonders gut ein Hell-Dunkel-Muster
(22) einer Anordnung aus einigen parallelen Strichen, wie
in den , und gewählt. Die
Striche sollen so angeordnet sein, dass sie parallel zu den Bildrändern liegen.
Die Projektionsoptik kann mit Leuchtdioden, besonders gut aber auch
mit Laserdioden arbeiten. Für
den Gebrauch der Laserdioden liegt eine günstige Breite der Striche und
der Zwischenräume
zwischen den Strichen bei etwa 100 Mikrometern, da dann die Speckelbildung gut
ausgemittelt werden kann; damit lässt sich die Lage der bestrahlten
Probenoberfläche
gut und schnell auf etwa ein bis zwei Mikrometer genau bestimmen.
Für die
Auswertung hat sich eine Fourier-Analyse der Pixelwerte mit einer
schnellen, zweidimensionalen Fourier-Transformation (FFT) bewährt. Die
Auswertung dauert nur wenige Hundertstel Sekunden und trägt daher
kaum zu einer Verlängerung
der Zeitdauer des Analysenverfahrens bei. Das Hell-Dunkel-Muster
der Projektionseinrichtung kann auch mit einer normalen Beleuchtung
aus einer Beleuchtungseinrichtung gemischt werden, so dass eine
andauernde Beobachtung der Proben möglich bleibt.
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Anordnungen
zur Steuerung des Abstandes der Probenoberfläche (2) zur ersten
Beschleunigungselektronik (3) sind bereits im oben zitierten
Patent beschrieben; sie können
insbesondere drei gleiche Bewegungseinrichtungen zur parallelen
Bewegung der Probenträgerplatte
(1) umfassen. Die Bewegungseinrichtungen können aus
motorisch bewegten Feinschrauben bestehen, aber auch aus Piezo-Elementen
verschiedener Ausführungsformen. Sogar
temperatur-gesteuerte Bimetallelemente können verwendet werden, letztere
sind allerdings meist etwas träge
in ihrer Bewegung. Die drei Bewegungselemente können auch durch zwei Elemente
oder sogar durch ein einziges Element ersetzt werden, wenn es gelingt,
eine gut parallele Führung
der Probenträgerplatte
in einer Richtung senkrecht zur Oberfläche zu erzeugen.
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Es
hat sich jedoch erwiesen, dass auch ein einzelnes Bewegungselement
(15) für
die Probenträgerplatte
verwendet werden kann, wenn diese mit einem möglichst weit außerhalb
der Probenbelegungsfläche
liegenden Gelenk (14) verbunden ist. das Gelenk (14)
kann an der Probenträgerplatte
selbst, aber auch an ihrer Grundplatte befestigt sein. Die Probenträgerplatte
(1) ist für
gewöhnlich
mit Isolatoren auf einer motorisch bewegten Grundplatte befestigt,
wobei sich die Grundplatte auf Massepotential befindet, während die
Probenträgerplatte
(1) auf ein Potential von etwa 30 Kilovolt gelegt werden
kann. Die leichte Änderung
des Winkels der Probenoberfläche
(2) zu der Ebene der ersten Beschleunigungsblende (3) wirkt
sich nach Erfahrung nicht messbar auf die Qualität der Massenspektren aus. Die
Grundplatte befindet sich auf einer x-y-Bewegungseinrichtung, die
die einzelnen Proben in der Ebene der Probenträgeroberfläche in den Fokus des Lasers
fährt.
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Für die Abstandsregelung
der Probenträgerplatte
(1) durch ein einziges Bewegungselement (15) in
Verbindung mit einem Gelenk (14) muss dabei berücksichtigt
werden, dass je nach Lage der Probe (2) auf dem Probenträger (1)
der Hub an der Stelle der Probe (2) nicht mit dem Hub der
Bewegungseinrichtung (15) übereinstimmt. Es herrscht aber
eine Proportionalität,
die sich geometrisch aus der Lage der Probe (2) auf der
Probenträgerplatte
(1) ergibt und leicht rechnerisch zu beherrschen ist.
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Wie
oben bereits ausgeführt,
erlauben es diese Verfahren, bei Dünnschichtpräparationen mit flächig angeordneten
Matrixkristallen in der Größenordnung
weniger Mikrometer zu einer Abstandsregelung zu gelangen, die auf
etwa ein bis zwei Mikrometer genau ist. Dünnschichtpräparationen dieser Art werden
häufig
benutzt und finden insbesondere in der Peptidanalyse ihre Anwendung;
es sind hierfür sogar
Einweg-Probenträger
aus Kunststoff mit vorpräparierten
Matrixkristalldünnschichten
im Handel. Um diese Probenträger
kostengünstig
herstellen zu können,
muss auf die Einhaltung äußerster
Präzision für die Ebenheit
der Probenoberfläche
verzichtet werden können.
Immerhin sind die Flächen
zur Aufnahme der Proben etwa 100 Quadratzentimeter groß. Dieser
Verzicht auf eine Präzision
von nur wenigen Mikrometern ist aber nur möglich, wenn der jeweilige Abstand
der Probenoberfläche
zur ersten Beschleunigungselektrode geregelt werden kann.
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Für diese
ebenen Dünnschichtpräparationen ist
neben der geschilderten Verstellmotorik für den Abstand lediglich eine
Softwareausstattung zur Analyse der Bilder der Videokamera (9, 10)
und gegebenenfalls die Einrichtung (5, 6) zur
schrägen
Projektion eines Musters notwendig. Die Projektion des Musters kann
mit der generellen Beleuchtung der Probe für die Aufnahme der Videobilder
kombiniert werden. Elektronische Einrichtungen zur Überführung der
digital aufgenommenen Kamerabilder in den Rechner des Massenspektrometers
sind in der Regel bereits vorhanden.
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Schwieriger
ist eine gute Regelung für
solche Matrixmaterialien, die sich nicht als Dünnschicht präparieren
lassen. Hier ist nicht nur der Abstand der Probenoberfläche zur
ersten Beschleunigungselektrode zu regeln, sondern auch die Spannung
am weiter zurück
liegenden Probenträger,
wenn der erwünschte
Effekt einer hochauflösenden
Messung der Ionenmassen mit hoher Präzision und Genauigkeit erreicht
werden soll. Hier muss das Verfahren der Bildanalyse etwas abgewandelt
und zusätzlich
mit einer Spannungsregelung kombiniert werden. Es ist hier notwendig,
durch eine Vermessung des schräg
eingestrahlten Musters an zwei Stellen, einmal auf der Probenträgerplatte
neben der Probe und einmal auf der Probe selbst, die Dicke der elektrisch
nicht leitenden Kristallschicht zu bestimmen. Es wird sodann die Oberfläche der
Probe auf den richtigen Abstand zur ersten Beschleunigungselektrode
eingeregelt, und es wird des Weiteren die Spannung an der Probenplatte
so erhöht,
dass genau auf der Oberfläche
der Probe das richtige, einkalibrierte Potential für die Beschleunigung
der Ionen herrscht.
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Ein
Zahlenbeispiel möge
das erläutern:
Beträgt
der Abstand der Probenoberfläche
zur ersten Beschleunigungselektrode drei Millimeter, beträgt ferner
die verzögert
einzuschaltende Beschleunigungsspannung zwischen diesen beiden Flächen 1800
Volt (600 Volt pro Millimeter), und ist die Kristallschicht 50 Mikrometer
dick (1/20 Millimeter), so muss die Probenträgerplatte auf ein Potential
geschaltet werden, das um 30 Volt höher liegt als für eine Dünnschichtpräparation.
Es herrscht dann genau das richtige Potential an der Oberfläche der
kristallinen Probe, und alle Fokussierungsbedingungen sind wieder identisch
hergestellt.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
haben außerordentliche
Vorteile. Selbst wenn es nicht gelingt, die Kalibrierkurve so zu
treffen, dass ohne eine Nachkalibrierung eine Massengenauigkeit
von wenigen Millionsteln der Masse (wenigen ppm) erreicht wird,
so kommt man dennoch so nahe an die Verhältnisse für die Gültigkeit der Kalibrierkurve
heran, dass die Nachkorrektur durch einen einfachen Proportionalitätsfaktor
vorgenommen werden kann. Des Weiteren bleiben die Verhältnisse
für beste
Massenauflösung
von Probe zu Probe erhalten.
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Außerdem erreicht
man eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Höhe der Ionenstromsignale, also
eine sehr gute Voraussetzung für
quantitative Analysen, die bisher für die MALDI-Massenspektrometrie
nicht ohne Vergleichsmessungen von markierten und unmarkierten Substanzen
in der gleichen Probe durchzuführen
waren. Es bleibt durch die Erhaltung der günstigsten Abbildungseigenschaften
für die
Ionen auch stets die höchste
Empfindlichkeit erhalten, die ohne eine solche Regelung nicht erhalten werden
konnte. Es sei daran erinnert, dass die Empfindlichkeit bei einer
Veränderung
des Abstandes zwischen Probenoberfläche und erster Beschleunigungselektrode
um nur etwa 10 bis 20 Mikrometer bereits auf weniger als 50 Prozent
absinkt. Diese Erfindung macht daher ein quantitatives Arbeiten
ohne Markierungen überhaupt
erst möglich.
