WO2024041681A1 - Vorrichtung zur multimodalen analyse von probenmaterial - Google Patents

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WO2024041681A1
WO2024041681A1 PCT/DE2022/100627 DE2022100627W WO2024041681A1 WO 2024041681 A1 WO2024041681 A1 WO 2024041681A1 DE 2022100627 W DE2022100627 W DE 2022100627W WO 2024041681 A1 WO2024041681 A1 WO 2024041681A1
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WO
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sample material
sample
image information
spatially resolved
radiation
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Application number
PCT/DE2022/100627
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English (en)
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Alexander POTTHOFF
Jens Soltwisch
Marcel Niehaus
Klaus Dreisewerd
Original Assignee
Bruker Daltonics GmbH & Co. KG
Westfälische Wilhelms-Universität Münster
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Publication date
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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0004—Imaging particle spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/088—Condensers for both incident illumination and transillumination
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H01J49/161—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission using photoionisation, e.g. by laser
    • H01J49/164—Laser desorption/ionisation, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI]

Definitions

  • the invention relates to a device for the multimodal analysis of sample material, for example from a tissue, which acquires spatially resolved molecular image information from the sample material, for example using a time-of-flight mass analyzer, records spatially resolved light microscopic image information from the sample material and co-registers both with improved accuracy to spatially resolved Overall image information linked.
  • the MALDI-MSI requires information about the sample topography for each pixel, if possible. On this basis, the material removal and thus the data quality can then be optimized. This applies in particular to the high and highest resolution MALDI-MSI.
  • the so-called transmission geometry can be used here, tMALDI.
  • the shallow depth of field of the microscope lenses used e.g. 1.6 micrometers when using a 50X Mitutoyo Plan Apo NUV with an infinity-corrected lens, requires exact topography determination with submicrometer accuracy.
  • slide scanners are in use to record optical images, for example Olympus VS200, Hamamatsu, etc. Slide is used here to refer to the slide. These slide scanners are separate assemblies and primarily work with individual images rastered over the sample surface, which are then put together to form an overall image (stitching). This merging is based on image data that has already been processed, taking into account the finding of matching image features and not on raw data.
  • the co-registration of optical recordings in the MALDI-MSI serves two purposes.
  • the measuring range is defined before the measurement using co-registered optical scanning.
  • microscopic images taken before or after the MALDI measurement are used to combine optical and mass spectrometric information. Both tasks can only be solved very imprecisely and time-consuming using the known methods.
  • the user or an automated routine must first correlate optical features of an externally recorded image with the real-time image of the mass spectrometer's internal camera. A first error occurs in the positioning of the markers in both images.
  • the optical imaging quality within the mass spectrometer often does not allow precise assignment. After marking, the optical image is stretched, rotated and subjected to skew correction without a fixed aspect ratio. These image corrections also always involve artifacts that often lead to inaccurate co-registrations. Such systematic uncertainties in this initial co-registration have the direct consequence that the selected measuring range must always be selected with a certain safety margin. This prevents the measurement of directly adjacent areas, so that parts of the sample area are not taken into account, and lengthens the measurement times.
  • LAESI-MS laser ablation electrospray ionization mass spectrometry
  • the pixel-sharp topography determination can represent an important prerequisite for the highest-resolution MALDI-MSI, for example when examining highly profiled tissue such as retina.
  • Current methods for tissue samples or other mass spectrometric samples carry out this topography determination independently.
  • the accuracy of the topographic information available in the spectrometer is partly based on the error-prone co-registration.
  • commonly used methods are not precise enough for the shallow depths of field in the lower micrometer range that are used in tMALDI and are limited to relatively large areas and are therefore not pixel-sharp. For example, in Bruker's timsTOF fleX, a stripe pattern is projected onto the sample surface using an auxiliary laser.
  • the distance between the focal plane of the laser and the sample surface can be determined with an accuracy of approximately 5 micrometers. This accuracy is not high enough for the small tMALDI depths of field, such as the 1.6 micrometers calculated above for the 50X objective. Furthermore, this method is used to average over an area of approximately 1 millimeter x 1 millimeter. Structures that are smaller are therefore averaged out and cannot be evaluated.
  • SBADI scanning microprobe matrix-assisted laser desorption ionization
  • the sample can be imaged using a standard light microscope with a magnification of approximately 400x.
  • An area of approximately 500 microns x 400 microns is displayed on a video monitor.
  • the sample is not illuminated and observed from the side, but rather through the lens due to geometric constraints. Since the objective was not corrected for chromatic aberration, only monochromatic light, namely a He-Ne laser with an output light power of 15 mW, could be used to image the sample.
  • Patent publication US 2003/0222212 A1 discloses a method and system for generating a correlated optical image of an ion desorption region of a sample substrate using light with foci down to the micrometer or submicrometer range for matrix-assisted laser desorption/ionization is sampled ( Figure 3).
  • Patent publication US 2006/0289734 A1 presents a method for generating a sharp image of a region on a sample plate for a matrix-based ion source, comprising: positioning the region in a field of view of an imaging device; Generating a first image having an in-focus area and an out-of-focus area using the imaging device; generating a second image having an in-focus area and an out-of-focus area using the imaging device; and generating a final sharp image using the sharp areas of the first and second images.
  • the patent US 7,180,058 B1 protected an ion source for a mass spectrometer, comprising: a radiation source for generating a beam of rays; a beam focusing optics configured to focus the beam onto a sample disposed on a front surface of a sample carrier.
  • the beam focusing optics have a focal length of less than 25 millimeters and are positioned adjacent a rear surface of the sample carrier.
  • the sample carrier is transparent at the wavelength of the beam in order to allow the beam to pass through.
  • an ion optical device positioned adjacent the front surface of the sample carrier and configured to transport ions generated by irradiation of the sample.
  • the patent publication DE 10 2007 006 933 A1 sets out a method with which the distance between the sample surface and the first acceleration electrode is set in a MALDI axial time-of-flight analyzer the flight route can be adjusted relative to the digital camera with the help of knowledge of the position of the sample surface, which is determined by evaluating the images from a digital camera.
  • the patent publication US 2009/0146053 A1 describes for a mass spectrometer for carrying out a mass analysis while simultaneously microscopically observing a two-dimensional region of a sample, that the observation position for selecting a target region while simultaneously observing an image of the sample recorded with a CCD camera Analysis position for carrying out the mass analysis, in which laser light is emitted onto the sample, is separated.
  • the sample is placed on a table, which should be able to be moved precisely between the observation position and the analysis position using a table drive mechanism.
  • the patent publication US 2011/0266438 A1 discloses a mass spectrometer that is said to be able to obtain a microscopic observation image with high spatial resolution in real time during a mass analysis without affecting the analysis.
  • An opening is formed in a table on which a transparent sample plate is placed.
  • a microscopic observation unit which includes an optical observation system and a CCD camera, is provided below the table to observe the back of the sample through the opening of the table as well as the transparent sample plate. The observed image is displayed on the screen of a display unit.
  • Figure 1 of the present disclosure shows an adaptation of Figure 2 of this publication.
  • the reference numbers designate: 1 - chamber; 2 - UV laser; 3 - aperture; 4 - beam attenuator; 5 - white light source; 6 - CCD camera; 7 - xy translation table; 8 - rear observation window; 9 - microscope lens; 10 - time of flight analyzer flight tube.
  • the present disclosure relates to a device for the multimodal analysis of sample material, comprising: - a desorption optics system, which is arranged and designed in such a way that the sample material, which is arranged on one side of a sample carrier, is exposed to a first radiation and desorption of the sample material into the gas phase, whereby the desorbed sample material is ionized, - an analyzer which is arranged away from the sample carrier and is designed to receive the desorbed and ionized sample material and to process it into spatially resolved molecular image information, - a transmission reflected light optics system, which is arranged and designed to record spatially resolved light microscopic image information from the sample carrier and sample material using a second radiation in reflection through the translucent sample carrier, the second radiation being emitted by a light source which is arranged on a side of the sample carrier facing away from the sample material and is designed in such a way that the second radiation, when incident on the sample carrier, does not pass through an optical component which is passed through by
  • a microtomized tissue section can be used as sample material.
  • samples of this are brain tissue and retinal tissue.
  • the sample material can in particular be cut from a frozen piece of tissue or a formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue, which may require further preparation steps before analysis, e.g. “de-paraffinizing” and “de-wetting” (de-cros slinking), also known as antigen retrieval.
  • the thickness of a tissue section to be analyzed can be 2-20 micrometers, in particular 2-15 micrometers for tMALDI applications. For reflected light or reflection MALDI, the sections can also be thicker, e.g. 2-40 micrometers.
  • the multimodal analysis of tissue sections is becoming increasingly important, particularly in the area of clinical application to determine pathological conditions of a tissue and their differentiation from non-pathological conditions or the cell response to the administration of pharmaceutical substances.
  • the desorption optics system can comprise a laser desorption ion source (LDI), which can in particular be designed as a MALDI source.
  • a MALDI process in incident light (in reflection) or in transmitted light (in transmission) can be used for ionization.
  • the MALDI method requires a specific sample preparation with a light-absorbing matrix substance, e.g. sinapic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, a-cyano-4-hydroxycinnamic acid or 2,5-dihydroxyacetophenone, all of which absorb strongly in the ultraviolet spectral range, e.g. laser light from a nitrogen laser at about 337 nanometers wavelength or a frequency-tripled solid-state Nd:YAG laser at around 355 nanometers.
  • a light-absorbing matrix substance e.g. sinapic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, a-cyano-4-hydroxycinnamic acid or 2,5-dihydroxyacetophenone, all of which absorb strongly
  • the sample material can be exposed to the first radiation in a pulsed manner.
  • the clock rate of a pulse train can be in the range of a few Hertz, for example 1-20 pulses per second, up to 10 3 or 10 4 Hertz.
  • the analyzer can be a mobility analyzer, mass analyzer or combined mobility-mass analyzer.
  • ion spectrometric analyzers and measurement methods that can have mobility separation, mass separation or a combination of both.
  • An ion mobility analyzer separates charged molecules or molecular ions according to their collision cross-section to charge ratio, sometimes referred to as Q/z or o/z.
  • the basis for this is the interaction of the ion species with an electric field that couples to the charge of the ions, with the simultaneous action of a buffer gas that acts on the average cross-sectional area of the ion.
  • Drift tube mobility separators are particularly known static electric field gradient, which drive ions through an essentially stationary gas, whereby the drift speed of an ion species results from the driving force of the electric field and the braking force of the collisions with the gas particles.
  • Traveling wave mobility separators can also be mentioned.
  • a mass analyzer separates charged molecules or molecular ions according to their mass-to-charge ratio, usually referred to as m/z.
  • Time-of-flight analyzers can be used, for which both linear and reflector structures and/or those with axial or orthogonal acceleration in the flight path can be provided.
  • Other types of mass-dispersing separators can also be used, e.g. quadrupole mass filters (single quads), triple quadrupole analyzers (“triple quads”), ion cyclotron resonance cells (ion cyclotron resonance, ICR), Kingdon-type analyzers such as the Orbitrap ® (Thermo Fisher Scientific) and others.
  • separators of the aforementioned types can be coupled in order to be able to separate ion species multidimensionally, i.e. according to more than one physicochemical property such as m / z and Q / z or o / z.
  • Linking spatially resolved molecular image information and spatially resolved light microscopic image information can mean superimposing the two image pieces of information in a spatially accurate manner and displaying them pictorially or graphically, for example on a computer screen. In this way, a user can be enabled to visually recognize matching and/or deviating features or structures in the image information of the various modalities in a spatially resolved manner.
  • Linking in the sense of the present disclosure can also include further processing of the image information, for example the creation of an overview map of the sample material, on which a key figure is plotted in a gray or color scale, which results from the calculation of the spatially resolved intensities of one or more ion species of interest m / z as well as the spatially resolved intensities of one or more wavelengths ⁇ , from the electromagnetic spectrum.
  • An ion species of interest may be, for example, a biomolecule or biopolymer, such as a protein, peptide, lipid, polynucleotide or polysaccharide.
  • the spatially resolved, co-registered overall image information covers the entire sample material over an area, for example the total area of an analyzed tissue section.
  • the image information grids of the different modalities are usually dimensioned differently, with the optical modality allowing a finer grid, ie image elements with smaller dimensions, than the mass analysis modality.
  • the optical resolution is usually in the submicrometer range, for example 500-700 nanometers
  • the pixel size (or lateral resolution) for mass analytical ablation is usually in the low micrometer range, for example 1-10 micrometers.
  • the linking may include adapting the image information data of the spatially higher-resolution modality to the grid of the lower-resolution modality.
  • the desorption optics system can have a transmitted light optics system that is arranged and designed in such a way that the first radiation acts on the sample material after it has passed through the sample carrier.
  • the design as a transmitted light optical system allows the ion formation area to be kept free of beam-guiding elements that could interfere with the ion extraction.
  • a transmitted light optics system enables a stronger focus of the first radiation for the very localized removal of the sample material, so that significantly higher spatial resolutions can be achieved than with reflected light optics systems such as reflection MALDI.
  • ablation and thus image element or pixel surfaces can be created with diameters in the single-digit micrometer range and - with particularly careful fine-tuning - even in the submicrometer range.
  • image element and pixel have the same meaning in the present disclosure and are used interchangeably.
  • an observation axis of the transmission reflected light optics system and an optical axis of the first radiation upon incidence on the sample carrier can be superimposed using a dichroic and/or dielectric mirror. This enables dual use of some optical components such as lenses and/or mirrors in guiding the first radiation when incident on the sample carrier and the second radiation in reflection from the sample material through the sample carrier.
  • the device can be designed to use a conductively coated glass plate as a sample carrier.
  • Indium tin oxide-coated glass plates ITO are particularly suitable, as their conductivity allows an electrical reference potential to be generated on their surface carrying the sample material, which can be used during further processing based on electrical potentials and fields of the ionized sample material generated is helpful.
  • the light source can be arranged and designed in such a way that the spatially resolved light microscopic image information is recorded substantially without shadows.
  • the one facing away from the sample holder can be seen
  • Strongly directed illumination of such a distinctively structured surface can mislead automated image analysis algorithms by casting shadows, since the actual topography can only be clearly recognized on the side of the structures that faces the light, whereas the areas that are in shadow are due to The small differences in intensity and the resulting uniform appearance hardly provide any basis for image-based feature recognition.
  • the light source can be designed in several parts by having more than one light generator, the radiation of which is then combined for the observation of the spatially resolved light microscopic image information on the sample material, or it can also have a light generator, the light of which is then spatially spread out using a diffuser or several diffusers before it is blasted onto the sample material.
  • the light source can be designed to be ring-shaped and to surround an observation axis of the transmission-incident light optics system.
  • a ring-shaped design around the observation axis enables in particular the incidence of light from the back on the sample carrier in such a way that an observation point, e.g. an image element or pixel with an area of 0.01-1 square micrometers, is illuminated on the possibly highly structured sample material with light from an extended solid angle range and can therefore be irradiated at a variety of different angles of incidence. Accordingly, such a design is suitable for avoiding shadows and the previously mentioned, associated disadvantageous poles.
  • the light source may comprise a plurality of light-emitting diodes.
  • the light from each individual light-emitting diode can contain a mixture of different wavelengths, which together create a white color impression.
  • Monochromatic light makes the optical setup for beam guidance easier because the optical components used do not have to process an extensive wavelength range but can be optimized in a narrow band.
  • Using light of different colors to record spatially resolved microscopic image information can have advantages for the perception and automated evaluation of specific sample features.
  • light-emitting diodes with the same construction, for example with white light characteristics.
  • light-emitting diodes of different colors can also be placed next to each other, which together - if all are activated and emit light - produce light of a first color, for example white and - if some are not activated - produce light of a different color, e.g. green.
  • a user can then use selective switching to choose the color characteristic that is best suited for his planned experiment and the sample material used, without having to carry out any complex modification work on the device.
  • the light source can be arranged and designed in such a way that the second radiation does not pass through any imaging and/or deflecting optical component when it impinges on the sample carrier.
  • Optical components include, in particular, refractive (refracting) and reflective (reflecting, “specular”) components such as lenses, mirrors, optical fibers, etc.
  • a microscope lens as a whole can also be viewed as an optical component.
  • a sample carrier holder that supports the sample carrier for example in a transmitted light desorption optical system in which the first beam falls onto the back of the sample carrier, is not to be viewed as an optical component within the meaning of the present disclosure.
  • the translucent sample carrier is also not to be viewed as an optical component in the sense of the disclosure.
  • the device can further have a movement mechanism for the sample carrier, which is arranged and designed to move the sample carrier along at least one spatial direction relative to an incidence direction of the first radiation and/or the second radiation.
  • the movement mechanism can in particular comprise an xy displacement table on which the sample carrier is placed and which spatially moves the sample carrier together with the sample material placed thereon along two spatial directions x and y, which extend substantially perpendicular to a surface normal of the sample carrier and substantially perpendicular to a microscopic observation direction adjusted.
  • the movement mechanism is also designed to spatially adjust the sample carrier in a third spatial direction z, which is perpendicular to the previously mentioned spatial directions x and y.
  • the movement mechanism can be designed and arranged to be operated under negative pressure.
  • a typical pressure applicable for example for vacuum MALDI, is substantially greater than a high vacuum (>10' 3 hectopascals) and less than about 10 2 hectopascals ( ⁇ atmospheric pressure), eg 0.1-10 hectopascals.
  • a high vacuum >10' 3 hectopascals
  • ⁇ atmospheric pressure eg 0.1-10 hectopascals.
  • local desorption and ionization of the sample material takes place in a gas-tight and continuously pumped vacuum chamber, which is in fluid communication with the analyzer to forward the locally desorbed and ionized sample material.
  • an operating mode of the computing unit, the desorption optics system and the transmission reflected light optics system can include recording the spatially resolved light microscopic image information before and/or after the sample material is exposed to the first radiation. Due to the special design of the device with a transmission reflected light optics system connected to the back of the ion source area for observing and recording spatially resolved light microscopic image information from the sample material, it is possible to produce light images and molecular images in the same holder of the sample carrier, so to speak in the same clamping, and in the same absolute position coordinate system capture. This means that not only are the position coordinates of the corresponding image elements or pixels known very precisely, but they also correspond for the different modalities: light microscopy and ion analysis.
  • the device may further comprise an imaging objective which is arranged such that the light source is positioned along an observation axis of the transmission reflected light optics system between the sample carrier and the objective.
  • the imaging lens can be designed in such a way as to image the first radiation upon incidence on the sample carrier and the second radiation after passing through the sample carrier and reflecting from the sample material.
  • the lens can in particular have dual imaging properties if a transmitted light desorption optical system is used, in that on the one hand it directs the light reflected from the sample material through the sample carrier, which is used to determine the spatially resolved light microscopic image information, to a camera used for recording and, if necessary, conditions it and on the other hand, the first radiation is conditioned for the rear incidence on the sample carrier and the sample material arranged on the other side, for example to focus sizes with diameters in the range of a few micrometers or even less.
  • the light source and the imaging lens can be designed as an integral assembly.
  • the light source is preferably integrated into a part of an objective body facing the back of the sample holder. Such a space-saving design reduces the distance between the light source and the sample carrier and allows the sample material to be irradiated with the light emitted by the light source without additional beam-guiding and beam-shaping optical components.
  • an operating mode of the computing unit and the transmission reflected light optics system can include recording the spatially resolved light microscopic image information by sequentially scanning a large number of xy individual image areas on the sample material and mathematically combining the isolated xy individual image information obtained in the process.
  • the individual image information can be combined into an overall image covering the entire sample material based on the captured raw data. Previous image data processing, which could impose further inaccuracies on the light microscopic data, which would then be looped through subsequent processing steps, is not necessary. In this way, the imaging quality of the overall optical image can be improved.
  • no overlapping areas of the individual images with subsequent feature comparison in the overlapping areas need to be provided for joining, since the position of the individual image areas is known very precisely due to the high positioning accuracy of the movement mechanics.
  • the present disclosure relates to a device for the multimodal analysis of sample material, comprising: - a desorption optics system, which is arranged and designed in such a way that the sample material, which is arranged on one side of a sample carrier, is exposed to a first radiation and desorption of the sample material into the gas phase, whereby the desorbed sample material is ionized, - an analyzer which is arranged away from the sample carrier and is designed to receive the desorbed and ionized sample material and to process it into spatially resolved molecular image information, - a transmission reflected light optics system, which is arranged and designed to record spatially resolved light microscopic image information from the sample carrier and sample material using a second radiation in reflection through the translucent sample carrier, the second radiation being emitted by a light source which is arranged on a side of the sample carrier facing away from the sample material and is designed in such a way that the spatially resolved light microscopic image information is recorded substantially without shadows, and - a computing
  • an operating mode of the computing unit and the transmission reflected light optics system may include scanning a plurality of xy individual image areas in a third spatial direction z to a maximum contrast and/or image sharpness level.
  • a preferred mode of operation of the computing unit and the transmission reflected light optics system can include using the contrast and/or image sharpness maximum in order to (i) determine spatially resolved height profile information of the sample material above the sample carrier and/or (ii) assemble an overall optical image that in each image element there is an image component from a z position of the respective maximum contrast and/or image sharpness (focus stacking).
  • An operating mode of the computing unit and the desorption optics system can therefore include the maximum contrast and/or image sharpness when acting on the sample material for an adjustment of a position of the (i) focus of the first radiation and/or (ii) sample carrier along the third Use spatial direction z.
  • the present disclosure relates to a method for multimodal analysis of sample material, comprising: - locally applying a first radiation to the sample material, which is arranged on one side of a sample carrier, and bringing about local desorption of the sample material into the gas phase , wherein the locally desorbed sample material is ionized, - receiving and processing the locally desorbed and ionized sample material into spatially resolved molecular image information using an analyzer which is arranged away from the sample carrier, - recording spatially resolved light microscopic image information from the sample carrier and sample material using a second radiation in reflection through the translucent sample carrier, the second radiation being emitted by a light source located on one of the sample material arranged on the opposite side of the sample carrier and designed in such a way that the second radiation, when incident on the sample carrier, does not pass through an optical component that is passed through by the first radiation when incident on the sample carrier, and - linking the spatially resolved molecular image information and the spatially resolved light microscopic image information to spatially resolved
  • the present disclosure relates to a method for multimodal analysis of sample material, comprising: - locally applying a first radiation to the sample material, which is arranged on one side of a sample carrier, and bringing about local desorption of the sample material into the gas phase , wherein the locally desorbed sample material is ionized, - receiving and processing the locally desorbed and ionized sample material into spatially resolved molecular image information using an analyzer which is arranged away from the sample carrier, - recording spatially resolved light microscopic image information from the sample carrier and sample material using a second radiation in reflection through the translucent sample carrier, the second radiation being emitted by a light source which is arranged on a side of the sample carrier facing away from the sample material and is designed such that the spatially resolved light microscopic image information is recorded substantially without shadows, and - linking the spatially resolved ones Molecular image information as well as the spatially resolved light microscopic image information to form spatially resolved co-registered overall image information, the spatially resolved light mic
  • the method according to the third and/or fourth aspect of the present disclosure may be carried out using an apparatus as explained above.
  • Figure 1 shows a structure of a tMALDI ion source including integrated light microscopic observation modality from the prior art.
  • Figure 2A schematically illustrates the desorption and ion generation region, including attached optical systems, of a device according to principles of the present disclosure in an isometric view.
  • Figure 2B shows a cross section of the desorption and ion generation region of Figure 2A in a first orientation.
  • Figure 2C shows the cross section of the desorption and ion generation region from Figure 2B in a second different orientation.
  • Figure 3 A shows a microscope objective in which a multi-part light source for recording light microscopic image information is integrated, in an isometric view.
  • Figure 3B shows a cross section of the microscope objective from Figure 3A.
  • Figure 4 shows the creation of an overall light microscopic image from a large number of light microscopic individual image area recordings on the sample material according to the principles of the present disclosure.
  • Figure 5 illustrates a method based on focus stacking and determination of a depth or profile map of profiled sample material over a sample carrier according to principles of the present disclosure.
  • Figure 6 illustrates the linking of spatially resolved light microscopic image information with spatially resolved molecular image information to form spatially resolved co-registered overall image information according to the principles of the present disclosure.
  • Figure 7 shows a MALDI time-of-flight mass analyzer of conventional design suitable for implementing principles of the present disclosure.
  • a single image is an optical image that is recorded using a camera with a single exposure through the observation optics of a single image area. Typical edge lengths of such an area are 30-200 micrometers.
  • the overall optical image is the mosaic-like composition of several individual images to provide an overview and can include the entire sample material with edge lengths of a few millimeters or even centimeters. A detailed description of the terms is included in the following sections.
  • the absolute position coordinates for the spatially resolved light microscopic image information and the spatially resolved molecular image information correspond to the laboratory position coordinate system and are therefore identical or congruent. Intrinsically, this enables almost perfect co-registration with the ion image recorded in the same source. Errors can be kept on the order of a few 100 nanometers, which corresponds to an accuracy smaller than the commonly used mass analysis pixel edge length (e.g. ⁇ 0.5-10 micrometers for tMALDI, ⁇ 5-100 micrometers for reflected light or reflection MALDI).
  • the sample topography can be determined pixel-sharp and with high resolution.
  • FIGS 2A-C schematically illustrate an embodiment of a device according to principles of the present disclosure in various views focusing on an ion source region. However, facilities for further processing ionized sample material are not shown in Figures 2A-C. For contextualization, reference is made to Figure 7, which will be explained below.
  • a vacuum chamber 20 is indicated, which is sealed airtight to the surrounding atmosphere and can be maintained at a pressure between 10' 3 and 10 2 hectopascals using suitable vacuum generators, for example pumps; a pressure range in which vacuum MALDI can be performed.
  • suitable vacuum generators for example pumps
  • An xyz displacement table 22 is arranged in the chamber 20, on which a sample carrier 24 can be placed.
  • the displacement table 22 is mounted on the lower wall 20-3 of the chamber 20 and is designed so that it has a large opening 22-1 through which radiation onto the sample carrier 24 is incident from the rear, i.e. away from the surface on which the sample material 26 is filed, is directed. In this arrangement, the sample carrier 24 rests on the edges around the opening 22-1.
  • a microscope objective 28 is mounted on the rear wall 20-1 and extends to just before the opening 22-1 in the displacement table 22. Details of the beam guidance and optical components in the objective 28 are not shown for clarity.
  • two beam paths 30, 32 are indicated, which are assigned, on the one hand, to a transmitted light desorption optical system and, on the other hand, to a transmission-incident light optical system.
  • the beam paths 30, 32 contain several beam-guiding and beam-shaping components such as lenses and deflecting mirrors, which ensure that the first radiation 30 required for the desorption of sample material 26 to the sample carrier 24 and that required for recording the spatially resolved light microscopic image information passes through from the sample material 26
  • the second radiation 32 reflected back from the sample carrier 24 can be guided to a camera 34.
  • Two windows 36', 36" are indicated in the upper and lower walls 20-2, 20-3 of the chamber 20, through which a third radiation, for example a laser beam for the post-ionization of neutrally desorbed sample material, enters the vacuum chamber 20 - or can be decoupled and focused into a desorption cloud above the section of the exposed sample material 26.
  • a third radiation for example a laser beam for the post-ionization of neutrally desorbed sample material
  • the structure can be divided into two parts, or two beam paths 30, 32.
  • the observation beam path 32 and the laser beam path 30 are aligned on their way from or to the sample carrier 26 using a dichroic and/or dielectric mirror 38, see the views in Figures 2B and 2C.
  • the radiation is coupled in and out of the vacuum chamber 20 or out of it via a corresponding window 40 in the rear wall 20-1 of the chamber 20.
  • the UV-compatible lens 28 in the vacuum chamber 20 which is both the observation beam path 32 and also the laser beam path 30
  • the laser beam 30 is focused on the front of the sample carrier 24 carrying the sample material 26 to a beam waist in the submicrometer range.
  • Both beam paths 30, 32 pass through the sample carrier 24, with the observation beam path 32 starting from the interface of the sample material 26 with the matrix that may have been applied thereto and being imaged onto the light-sensitive chip of the observation camera 34.
  • the image section shown can have an edge length of 50-250 micrometers, in which almost no contrast differences appear, and an optical resolution of 0.5-2 micrometers, depending on the choice of lens 28.
  • the laser beam path 30 hits the same interface on the back and is focused on a small section of the sample material 26. This section corresponds to an image element or pixel for the MS measurement, e.g. with a size of 0.5-10 micrometers in diameter or edge length.
  • the configuration is therefore a transmission MALDI (tMALDI) setup.
  • the embodiment shown is based on the dual use of a microscope objective 28 both for observing sample material and for removing sample material. This dualism enables the precise determination of the removal point on the generated optical image. With the help of tailor-made software, individual high-resolution microscope images can be combined into a large overview image. At the same time, analyzing the contrast of microscopic images at different object distances allows the topography to be determined with high spatial precision.
  • the observation is realized by a camera 34, which is arranged along a surface normal of the sample carrier 26 and away from it in the rear area outside the vacuum chamber 20.
  • the lens 28 is corrected to infinity, which is why an imaging lens 42 is positioned at a distance from the camera 34 corresponding to its focal length.
  • the microscopic observation in transmission reflected light (reflective), i.e. reflected from the sample material 26 through the sample carrier, requires the most diffuse lighting possible in order to reduce shadowing effects. In the present case, this lighting is realized by a lighting ring made up of several light-emitting diodes (LED) 44.
  • LED light-emitting diodes
  • LEDs 44 are used.
  • the number of LEDs could also be smaller or larger.
  • Light sources or LEDs with white light or monochromatic color characteristics, e.g. green, can be used.
  • Light sources are also conceivable or LEDs with variable color characteristics, which can be tuned over a wavelength range, for example, or have mixed colors, in particular polychromatic but not white color characteristics.
  • the light-emitting diodes 44 are arranged in a cylindrical, axially projecting attachment 46, which is assembled with the lens body 28* to form an integral assembly, as shown in Figures 3A-B, and surround the optical observation axis 48 running through the lens 28 in a ring.
  • the light-emitting diodes 44 themselves are each housed in cylindrical housings which are embedded in the attachment 46 at an angle deviating from 0° and 180° to the optical observation axis 48 of the lens 28, so that the optical axes (dotted lines 50) of all diodes 44 are aligned focus or hit in a point 52 of maximum illumination that is distant from the attachment end of the lens body 28* and lies on the optical observation axis 48.
  • This point of maximum illumination 52 is located on the sample carrier 24 in order to be able to illuminate the sample material 26 placed on the front side with high intensity and shadow-free in transmission incident light, and corresponds to the optimal working distance for the objective 28 and/or its focal point.
  • the laser radiation 30 for the removal of the sample material 26 is adjusted to the targeted section of the sample material 26 coaxially to the observation beam path 32 through the objective 28 using the dichroic and/or dielectric mirror 38. This means that the removal position is firmly linked to a defined position on the observed image. The subsequent, error-prone co-registration of camera image and removal position is no longer necessary.
  • a defined set of points X n :Y m are first selected over the entire scanning area, for example the total area of a tissue section. These can be set instrumentally on a grid or set manually. An autofocus routine is performed at these points.
  • the technique used to determine the focal plane at each individual point is similar to that used by Michael J. Taylor et al. described method, see introduction.
  • the true sample material elevation above the sample carrier 24 can be calculated by interpolation and/or extrapolation, starting from the support points of the selected points X n :Y m , and introduced as a software-side z-correction.
  • This method is particularly suitable for correcting large-scale topographical variances, such as those that can arise when the sample carrier 24 is clamped into the holder provided for this purpose.
  • a method based on depth of field expansion is used. This allows the topography of the sample material 26 to be determined laterally with high resolution, for example to a few micrometers.
  • several overall optical images for defined z values are created using the movement space of the displacement table 22 in the z direction with the otherwise unchanged setting of the transmission reflected light optical system, indicated schematically in Figure 5 as zl, z2, z3.
  • these z values can, for example, cover a range of ⁇ 10 micrometers with an increment of 1 micrometer around a starting value, e.g. an average or expected tissue section thickness.
  • a Laplace filter is applied to each of these images.
  • the core size and the optional use of additional filters depend on the optical configuration and the observed sample material 26.
  • the results from this step serve as a local measure of the contrast or image sharpness and are written into a three-dimensional matrix.
  • the first and second dimensions correspond to the x and y positions on the sample material 26,
  • the third dimension corresponds to the z plane of the underlying image.
  • the maximum of the result matrix is determined along the third dimension.
  • the z-index of the maximum is written for each x and y position in a two-dimensional matrix, which can be called a depth or profile map, see the far right in Figure 5.
  • the depth or profile map thus contains, if necessary by inter- and /or extrapolation expands or supplements the z plane of highest image sharpness to any x and y position.
  • the depth or profile map obtained can, on the one hand, be used to keep the ablation laser in focus with pixel precision during a subsequent MALDI-MSI measurement, for example by changing the focus position or by moving the sample carrier along the z-axis.
  • a focus tacA image can be constructed, referred to as a “stack image” in Figure 5.
  • the real image pixel intensities of the recorded z-planes are combined pixel by pixel in such a way that only the image data of the sharpest z-plane at the respective xy position is contained in a resulting image.
  • This procedure significantly facilitates the visual evaluation of the overall light microscopic image information and its visual comparison with the molecular image information, particularly because of the consistently sharp representation.
  • Figure 6 illustrates the co-registration of the spatially resolved light microscopic image information, represented by an overall optical image 58* at the top left, the individual image grids of which are identified by black bars and the individual image center coordinates by crosses. The dimensions of each individual image and its location in the coordinate system are saved for a specific translation table position. Also shown is the spatially resolved molecular image information, represented by the ion image 60 at the bottom left, which, for example, represents the intensity distribution of a specific ion or molecular species of interest, e.g.
  • the information from the two modalities can then be linked to form overall image information, which - because of the acquisition in the identical coordinate system - is co-registered with high spatial resolution in the submicrometer range, represented by the composite representation 62 on the right.
  • the co-registered overall image information comprising a light microscopic image component and a molecular image component, can then be visually evaluated by a user or subjected to a computer-assisted automated evaluation routine, for example to find feature correlations in the data of the various modalities.
  • Figure 7 shows schematically a basically known MALDI time-of-flight mass analyzer in an axial reflector structure, in which principles of the present disclosure can be used.
  • the sample material is located on the sample carrier plate 71 opposite the acceleration electrodes 72 and 73 and can be ionized in a spatially resolved manner by the laser light pulse beam 74, 74* supplied by the laser 75, 75* in reflected or transmitted light.
  • the ions are accelerated by the acceleration electrodes 72 and 73 to form an ion beam 78, which creates a gas cell 79, which can be filled with collision gas if necessary.
  • the precursor ion selector 80 a fragment ion post-acceleration unit 81 and the precursor ion suppressor 82 and is then reflected by the reflector 83 onto the ion detector 84.
  • the housing of the mass analyzer is pumped by a powerful vacuum pump 85.
  • the ion detector 84 can have a multi-channel plate as an ion receiver.
  • a transmission reflected light optical system can be integrated into the rear part behind the sample carrier 71 in accordance with the principles of the present disclosure.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, z.B. aus einem Gewebe, die ortsaufgelöst Molekülbildinformation vom Probenmaterial erfasst, z.B. unter Verwendung eines MALDI-Flugzeit-Massenanalysators, ortsaufgelöst lichtmikroskopische Bildinformation vom Probenmaterial aufzeichnet und beide mit verbesserter Genauigkeit zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation verknüpft.

Description

Vorrichtung zur multimodalen Analyse von Probenmaterial
Gebiet der Erfindung
[0001] Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, z.B. aus einem Gewebe, die ortsaufgelöst Molekülbildinformation vom Probenmaterial erfasst, z.B. unter Verwendung eines Flugzeit-Massenanalysators, ortsaufgelöst lichtmikroskopische Bildinformation vom Probenmaterial aufzeichnet und beide mit verbesserter Genauigkeit zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation verknüpft.
Hintergrund der Erfindung
[0002] Der Stand der Technik wird im Folgenden mit Bezug auf einen speziellen Aspekt erläutert. Dies soll jedoch nicht als Einschränkung verstanden werden. Nützliche Fortentwicklungen und Änderungen der Erfindung können auch über den vergleichsweise engen Rahmen dieser Einleitung hinaus anwendbar sein und werden sich geübten Praktikern auf diesem Gebiet nach Lektüre der dieser Einleitung nachfolgenden Offenbarung der Erfindung umstandslos erschließen.
[0003] In der bildgebenden MALDI-Massenspektrometrie (mass spectrometry imaging = MSI; MALDI = matrix-assisted laser desorption ionization) ist die Co-Registrierung der lonenbilder mit hochaufgelösten optischen Mikroskopbildem eine wichtige Informationsquelle. Bisher dafür verwendete Methoden können zeitaufwändig und fehleranfällig sein.
[0004] Neben der genauen Korrelation der Ebenen-Koordinaten xy eines jeden Pixels für die Co-Registrierung benötigt die MALDI-MSI möglichst für jeden Pixel Information zur Probentopografie. Auf dieser Basis kann dann der Materialabtrag und damit die Datenqualität optimiert werden. Dies gilt insbesondere für die hoch- und höchstauflösende MALDI-MSI. Hier kann die sogenannte Transmissionsgeometrie verwendet werden, tMALDI. Die geringe Tiefenschärfe der dabei eingesetzten Mikroskop-Objektive, z.B. 1,6 Mikrometer im Falle der Verwendung eines 50X Mitutoyo Plan Apo NUV mit unendlich korrigiertem Objektiv, erfordert exakte Topografiebestimmung mit Submikrometer-Genauigkeit.
[0005] Zum jetzigen Stand der Technik werden diese beiden Aufgaben der räumlich präzisen Überlagerung und der Topografiebestimmung getrennt voneinander behandelt und sind unabhängig voneinander mit Ungenauigkeiten versehen, die einer aufschlussreichen Auswertung Grenzen setzen. [0006] Zur Aufnahme optischer Bilder sind diverse kommerziell erwerbliche sogenannte Slidescanner in Gebrauch, z.B. Olympus VS200, Hamamatsu, usw. Mit Englisch slide wird hier der Objektträger bezeichnet. Diese Slidescanner sind separate Baugruppen und arbeiten überwiegend mit über die Probenfläche gerasterten Einzelaufnahmen, die dann zu einem Gesamtbild zusammengefügt werden (stitching). Dieses Zusammenfügen basiert auf bereits prozessierten Bilddaten unter Berücksichtigung des Auffindens von übereinstimmenden Bildmerkmalen und nicht auf Rohdaten.
[0007] Auch ist die Co-Registrierung von extern aufgenommenen optischen Bildern mit lonen- bildem durch bei der Probenpräparation hinzugefügte Orientierungsmarken (teaching marks) bekannt. Verschiedene Massenspektrometer-Hersteller vertreiben Softwareprogramme für diese Art der multimodalen optischen/massenspektrometrischen Bildgebung. Beispiele dafür sind Bruker: fleximaging, oder Waters/Micromass: High Definition Imaging.
[0008] Die Co-Registrierung von optischen Aufnahmen in der MALDI-MSI dient zwei Aufgaben. Zum einen wird vor der Messung mit Hilfe einer co-registrierten optischen Abtastung der Messbereich definiert. Zum anderen werden in multimodalen Ansätzen vor oder nach der MALDI-Messung aufgenommene mikroskopische Aufnahmen verwendet, um optische und mas- senspektrometrische Informationen zusammenzuführen. Beide Aufgaben können mit den dafür bekannten Verfahren nur recht ungenau und zeitaufwändig gelöst werden. Für die initiale Co-Re- gistrierung von optischem Bild (Abtastung/Scan) und Abtragposition im Spektrometer müssen durch den Nutzer oder eine automatisierte Routine zunächst optische Merkmale eines extern aufgenommenen Bildes auf dem Echtzeitbild der internen Kamera des Massenspektrometers korreliert werden. Dabei tritt ein erster Fehler bei der Positionierung der Marker in beiden Bildern auf. Insbesondere bei Pixelgrößen von weniger als 10 Mikrometern erlaubt hier die optische Abbildungsqualität innerhalb des Massenspektrometers oft keine genaue Zuordnung. Nach der Markierung wird das optische Bild unter Anderem ohne festes Seitenverhältnis gestreckt, gedreht und einer Schräg-Korrektur unterzogen. Auch diese Bildkorrekturen bringen immer Artefakte mit sich, die häufig zu ungenauen Co-Registrierungen führen. Solche systematischen Unsicherheiten bei dieser initialen Co-Registrierung haben zur direkten Folge, dass der ausgewählte Messbereich immer mit einem gewissen Sicherheitsrand ausgewählt werden muss. Dies verhindert die Messung direkt angrenzender Bereiche, so dass Teile der Probenfläche unberücksichtigt bleiben, und verlängert die Messzeiten.
[0009] In der multimodalen Interpretation der gewonnenen Daten ist eine möglichst exakte Co- Registrierung essentiell. So erlauben nur präzise korrelierte Abbildungen einen direkten Vergleich von morphologischer und molekularer Information. Insbesondere bei hoch- und höchstauflösender MALDI-MSI (Pixelgröße < 10 Mikrometer) ist der systematische Fehler hier oft ein Vielfaches der Pixelgröße. Dies erfordert eine nachträgliche Korrektur der Co-Registrierung zwischen mikroskopischem Bild auf der einen und lonenverteilungsbildem auf der anderen Seite. Da beide Modalitäten ihren Kontrast auf sehr unterschiedliche Weise generieren, verbleiben hier üblicherweise systematische Fehler in der Größenordnung der Pixelgröße.
[0010] Eine exakte Co-Registrierung mit verfügbaren Methoden erfordert zudem zeit- und rechenintensive Verfahren, die auf mehreren mikroskopischen Aufnahmen vor und nach der MALDI-MSI beruhen, wie es in zwei Artikeln von Nathan Heath Patterson et al. erläutert wird. Beschrieben werden darin Arbeitsabläufe für die Registrierung und Analyse von MALDI MSI-zu- Mikroskopie-Daten unter Verwendung zerstörungsfreier MSI-kompatibler Weitfeld- Autofluoreszenz (AF)-Mikroskopie in Kombination mit computergestützter Bildregistrierung (Anal. Chem. 2018, 90, 12395-12403) bzw. eine weiterentwickelte histologiegeleitete Plattform, die MSI- kompatible AF-Mikroskopie vor einer histologischen Färbung oder MSI-Messung einsetzt (Anal. Chem. 2018, 90, 12404-12413).
[0011] Die Arbeit von Michael J. Taylor et al. (Metabolites 2021, 11, 200) beschäftigt sich mit der Laser- Ablations-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LAESI-MS) für die Einzel- zell-Metabolomik. Berichtet wird über die Integration eines Mikroskops in den optischen Pfad einer LAESI-Quelle, um eine visuell überwachte In-situ-Einzelzellanalyse zur Förderung des Verständnisses interzellulärer Unterschiede innerhalb großer Zellpopulationen unter Umgebungsbedingungen durchzuführen. Das Mikroskop erfasst optische Bilder über die Probenfläche hinweg in einzelnen „Kacheln“ (tiles), die dann durch Bildverarbeitungsprogramme zu einem Gesamtbild „zusammengenäht“ werden.
[0012] In dem von Michael J. Taylor et al. vorgestellten Verfahren wird in einem LAESI Experiment eine Beleuchtung und Beobachtung koaxial mit dem Ablations-Laser-Strahlengang beschrieben. Hier wird auch eine Autofokus-Routine auf Basis von Bildschärfe eingesetzt. Diese Beobachtung von vome im Auflicht ist für MALDI-Proben aufgrund der weitgehend undurchsichtigen Matrixbeschichtung nicht geeignet. Des Weiteren wäre die Beobachtung entlang der Probennormalen nicht möglich oder nur sehr schwer umzusetzen, da bei MALDI dieser Raum für die lonenextraktion benötigt wird. Eine Beobachtung unter einem Winkel größer 0° zur Probennormalen führt zu Bildverzerrungen, die korrigiert werden müssten. Durch die benötigte Verschiebung der Einzelbilder zueinander ist mit dieser Methode keine ausreichend präzise Co-Re- gistrierung möglich. [0013] Neben der Co-Registrierung kann die pixelscharfe Topografiebestimmung eine wichtige Voraussetzung für die höchstauflösende MALDI-MSI darstellen, z.B. bei der Untersuchung von stark profiliertem Gewebe wie Retina. Aktuelle Verfahren für Gewebeproben oder andere mas- senspektrometrische Proben führen diese Topografiebestimmung unabhängig durch. Die Genauigkeit der im Spektrometer zur Verfügung stehenden topografischen Information beruht also zum Teil auf der fehleranfälligen Co-Registrierung. Zudem sind üblicherweise verwendete Verfahren nicht exakt genug für die geringen Tiefenschärfen im unteren Mikrometerbereich, die in der tMALDI Verwendung finden, und sind beschränkt auf relativ große Areale und somit nicht pixelscharf. Beispielsweise wird im timsTOF fleX von Bruker mittels eines Hilfslasers ein Streifenmuster auf die Probenoberfläche projiziert. Anhand dieses Musters kann die Entfernung zwischen der Fokusebene des Lasers und der Probenoberfläche auf ca. 5 Mikrometer genau bestimmt werden. Diese Genauigkeit ist für die geringen tMALDI-Tiefenschärfen, wie die oben für das 50X Objektiv beispielhaft berechneten 1,6 Mikrometer, nicht hoch genug. Weiterhin wird mit Hilfe dieses Verfahrens über eine Fläche von ca. 1 Millimeter x 1 Millimeter gemittelt. Strukturen, die kleiner sind, werden somit herausgemittelt und entziehen sich der Auswertung.
[0014] In der Studie von Mario Kompauer et al. (Nat. Methods 2017, 14, 1156-1158) wird vorgeschlagen, bei der Höhenprofilbestimmung mit einer Punktlichtquelle für jeden Pixel eine zeitaufwändige Autofokus-Routine durchzuführen, um kleine Strukturen aufzulösen. Dabei ist die Pixelgröße zurzeit auf ca. 20 Mikrometer begrenzt. Verwandt dazu ist die Patentveröffentlichung EP 3 306 639 Al (entsprechend US 10,964,519 B2), die zum Ziel hat, eine Vorrichtung bereitzustellen, die eine gleichzeitige Analyse der zweidimensionalen, räumlichen chemischen Zusammensetzung und der Topografie einer Probe ermöglicht.
[0015] Im Folgenden werden ferner einige Dokumente des Stands der Technik, die für den Gegenstand der vorliegenden Offenbarung relevant sein können, kurz gewürdigt:
[0016] Die Arbeit von F. Hillenkamp et al. (Appl. Phys. 8, 341-348 (1975)) präsentiert einen Hochempfmdlichkeits-/zz.ser Microprobe Mass Analyzer (LAMMA), der insbesondere für die Untersuchung biologischen Probenmaterials entworfen wurde. Aufbauend auf dieser Pionierarbeit beschreibt der Artikel von H. Vogt et al. (Fresenius Z. Anal. Chem. 308, 195-200 (1981)) Prinzipien und technische Merkmale des Laser Microprobe Mass Analyzer (LAMMA) 500, der mit einem Lichtmikroskop zur visuellen Beobachtung der Probe in Reflektion durch ein beschichtetes elektronenmikroskopisches Gitter als Objektträger hindurch ausgestattet war. [0017] Die Arbeit von Bernhard Spengler et al. (J Am Soc Mass Spectrom 2002, 13, 735-748) betrifft ein Scanning Microprobe Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (SMALDI) Massenspektrometer für die aufgelöste LDI- und MALDI-Oberflächenanalyse im Submikrometerbereich. Zur Übersichtsbeobachtung kann die Probe mit einem Standard-Lichtmikroskop mit einer Vergrößerung von etwa 400x abgebildet werden. Ein Bereich von etwa 500 Mikrometer x 400 Mikrometer wird auf einem Videomonitor angezeigt. Die Probe wird nicht von der Seite beleuchtet und beobachtet, sondern aufgrund geometrischer Zwänge durch das Objektiv. Da das Objektiv nicht für chromatische Abberation korrigiert war, konnte nur monochromatisches Licht, nämlich ein He-Ne-Laser mit einer Ausgangslichtleistung von 15 mW, für die Abbildung der Probe verwendet werden.
[0018] Die Patentveröffentli chung US 2003/0222212 Al offenbart ein Verfahren und System zur Erzeugung eines korrelierten optischen Bildes eines lonendesorptionsbereichs eines Probensubstrats, das unter Verwendung von Licht mit Foki bis hinunter in den Mikrometer- oder Submikrometerbereich für die Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation beprobt wird (Figur 3).
[0019] Die Patentveröffentlichung US 2006/0289734 Al präsentiert ein Verfahren zum Erzeugen eines scharfen Bildes eines Bereichs auf einer Probenplatte für eine lonenquelle auf Matrixbasis, umfassend: Positionieren des Bereichs in einem Sichtfeld einer Abbildungsvorrichtung; Erzeugen eines ersten Bildes mit einem scharfen Bereich (in-focus) und einem unscharfen Bereich (out-of-focus) unter Verwendung der Abbildungsvorrichtung; Erzeugen eines zweiten Bildes mit einem scharfen Bereich und einem unscharfen Bereich unter Verwendung der Abbildungsvorrichtung; und Erzeugen eines endgültigen scharfen Bildes unter Verwendung der scharfen Bereiche des ersten und zweiten Bildes.
[0020] Das Patent US 7,180,058 Bl schützte eine lonenquelle für ein Massenspektrometer, umfassend: eine Strahlungsquelle zum Erzeugen eines Strahlenbündels; eine Strahlenfokussierungsoptik, die so konfiguriert ist, dass sie das Strahlenbündel auf eine Probe fokussiert, die auf einer vorderen Oberfläche eines Probenträgers angeordnet ist. Die Strahlenfokussierungsoptik weist eine Brennweite von weniger als 25 Millimetern auf und ist angrenzend an eine hintere Oberfläche des Probenträgers positioniert. Der Probenträger ist bei der Wellenlänge des Strahlenbündels transparent, um das Strahlenbündel durchzulassen. Weiterhin enthalten ist eine ionenopti- sche Vorrichtung, die angrenzend an die vordere Oberfläche des Probenträgers positioniert und so konfiguriert ist, dass sie Ionen transportiert, die durch Bestrahlung der Probe erzeugt werden. Ferner umfasst ist eine Betrachtungsoptik zur Erfassung eines Bildes der Probe, die angrenzend an die hintere Oberfläche des Probenträgers angeordnet ist. [0021] Die Patentveröffentlichung DE 10 2007 006 933 Al (entsprechend US 2008/0191131 Al und GB 2 446 699 A) legt ein Verfahren dar, mit dem in einem MALDI Axial-Flugzeitanaly- sator der Abstand zwischen der Probenoberfläche und der ersten Beschleunigungselektrode an der Flugstrecke mit Hilfe der Kenntnis der Position der Probenoberfläche, die durch die Auswertung der Bilder einer Digitalkamera ermittelt wird, relativ zur Digitalkamera eingestellt werden kann.
[0022] Die Patentveröffentlichung US 2009/0146053 Al beschreibt für ein Massenspektrometer zur Durchführung einer Massenanalyse bei gleichzeitiger mikroskopischer Beobachtung eines zweidimensionalen Bereichs einer Probe, dass die Beobachtungsposition zur Auswahl eines Zielbereichs bei gleichzeitiger Beobachtung eines mit einer CCD-Kamera aufgenommenen Bildes der Probe von der Analyseposition zur Durchführung der Massenanalyse, in der Laserlicht auf die Probe abgegeben wird, getrennt wird. Die Probe wird auf einem Tisch platziert, der durch einen Tischantriebsmechanismus präzise zwischen der Beobachtungsposition und der Analyseposition verfahrbar sein soll.
[0023] Die Patentveröffentli chung US 2011/0315874 Al offenbart ein Massenspektrometer, das in der Lage sein soll, bildgebende Massenspektrometrie effizient über einen räumlichen Bereich durchzuführen, der über das Beobachtungsfeld einer mikroskopischen Beobachtungseinheit hinausgeht.
[0024] Die Patentveröffentli chung US 2011/0266438 Al offenbart ein Massenspektrometer, das in der Lage sein soll, ein mikroskopisches Beobachtungsbild mit hoher räumlicher Auflösung in Echtzeit während einer Massenanalyse zu erhalten, ohne die Analyse zu beeinträchtigen. In einem Tisch ist eine Öffnung ausgebildet, auf der eine transparente Probenplatte platziert wird. Eine mikroskopische Beobachtungseinheit, die ein optisches Beobachtungssystem und eine CCD- Kamera umfasst, ist unterhalb des Tisches vorgesehen, um die Rückseite der Probe durch die Öffnung des Tisches sowie die transparente Probenplatte zu beobachten. Das beobachtete Bild wird auf dem Bildschirm einer Anzeigeeinheit angezeigt.
[0025] In der Studie von Andre Zavalin et al. (J Mass Spectrom. 2012 November; 47 (11), 1473-1481) schlussfolgern die Autoren, dass mit einer Transmissionsgeometrie-Konfiguration ein Laserstrahl in der lonenquelle eines MALDI-Massenspektrometers auf Abmessungen von weniger als 1 Mikrometer fokussiert werden kann, wodurch die direkte Abbildung heterogener Gewebeschnitte und einzelner Zellen mit subzellulärer Auflösung möglich sein soll. Die subzellulären MS-Bilder wurden durch Co-Registrierung von Einzelbildern validiert, die mit mikroskopischen Methoden, z. B. optischem Phasenkontrast, DIC (Differential Interference Contrast) und Hellfeld- Aufnahmen, gewonnen wurden. Optische Mikroskop-Einzelbilder wurden dabei sowohl vor als auch nach dem MS-Bildgebungs-Experiment aufgenommen. Abbildung 1 der vorliegenden Offenbarung zeigt eine Adaption von Figur 2 dieser Druckschrift. Darin bezeichnen die Bezugszeichen: 1 - Kammer; 2 - UV-Laser; 3 - Blende; 4 - Strahlabschwächer; 5 - Weißlichtquelle; 6 - CCD-Kamera; 7 - xy-Verschiebetisch; 8 - rückseitiges Beobachtungsfenster; 9 - Mikroskopobjektiv; 10 - Flugzeitanalysator-Flugröhre.
[0026] Die Studie von Marcel Niehaus et al. (Nat. Methods 2019, 16, 925-931) beschäftigt sich mit MALDI-2-Massenspektrometrie im Transmissionsmodus zur Abbildung von Zellen und Geweben mit subzellulärer Auflösung. Die mikroskopische Beobachtung der Probe im Durchlicht ist über denselben Strahlengang des MALDI-Lasers unter Verwendung einer einzelnen LED als Lichtquelle, eines Strahlteilers und einer CCD-Kamera (charge-coupled device) möglich.
[0027] Angesichts der vorherigen Ausführungen besteht ein Bedarf, die Co-Registrierung von ortsaufgelöster Molekülbildinformation und ortsaufgelöster mikroskopischer Bildinformation zu verbessern, insbesondere bezüglich ihrer Genauigkeit und des Aufwands für die Ausgestaltung der Optikbaugruppen. Weitere von der Erfindung zu lösende Aufgaben ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres bei der Lektüre der nachfolgenden Offenbarung.
Zusammenfassung der Erfindung
[0028] Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung eine Vorrichtung zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend: - ein Desorptionsoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, das Probenmaterial, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung zu beaufschlagen und Desorption des Probenmaterials in die Gasphase herbeizuführen, wobei das desorbierte Probenmaterial ionisiert wird, - einen Analysator, der abseits des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, das desorbierte und ionisierte Probenmaterial zu empfangen und zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation zu verarbeiten, - ein Transmissions-Auflichtoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, ortsaufgelöst lichtmikroskopische Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch aufzuzeichnen, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die zweite Strahlung beim Einfall auf den Probenträger keine Optikkomponente durchläuft, die von der ersten Strahlung beim Einfall auf den Probenträger durchlaufen wird, und - eine Recheneinheit, die derart angeordnet und ausgelegt ist, mit dem Desorptionsoptiksystem, dem Analysator und dem Transmissions-Auflichtoptiksystem zu kommunizieren und die ortsaufgelöste Molekülbildinformation sowie die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation zu verknüpfen.
[0029] Als Probenmaterial kann insbesondere ein mikrotomierter Gewebeschnitt verwendet werden. Beispiele dafür sind Himgewebe und Retinagewebe. Das Probenmaterial lässt sich insbesondere aus einem gefrorenen Gewebestück oder einem Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe schneiden, was ggfs. weitere Aufbereitungsschritte vor der Analyse erfordert, z.B. ein „Deparaffinieren“ und „Entnetzen“ (de-cros slinking), auch als Antigen-Retrieval bezeichnet. Die Dicke eines zu analysierenden Gewebeschnitts kann 2-20 Mikrometer betragen, für tMALDI- Anwendungen insbesondere 2-15 Mikrometer. Für Auflicht- oder Reflektions-MALDI können die Schnitte auch dicker sein, z.B. 2-40 Mikrometer. Die multimodale Analyse von Gewebeschnitten erfährt insbesondere im Bereich klinischer Anwendung zur Ermittlung pathologischer Zustände eines Gewebes, und deren Unterscheidung von nicht-pathologischen Zuständen, oder der Zellantwort auf die Verabreichung pharmazeutischer Substanzen immer größere Bedeutung.
[0030] Das Desorptionsoptiksystem kann eine Laserdesorptions-Ionenquelle (LDI) umfassen, welche insbesondere als MALDI-Quelle ausgeführt sein kann. Für die Ionisierung kommen je nach Anforderung ein MALDI- Verfahren im Auflicht (in Reflektion) oder im Durchlicht (in Transmission) in Frage. Das MALDI -Verfahren erfordert eine bestimmte Probenpräparation mit einer lichtabsorbierenden Matrixsubstanz, z.B. Sinapinsäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure, a- Cyano-4-hydroxyzimtsäure oder 2,5-Dihydroxyacetophenon, die alle stark im ultravioletten Spektralbereich absorbieren, z.B. Laserlicht eines Stickstofflasers bei etwa 337 Nanometern Wellenlänge oder eines frequenzverdreifachten Festkörper Nd:YAG-Lasers bei etwa 355 Nanometern.
[0031] Das Probenmaterial kann von der ersten Strahlung gepulst beaufschlagt werden. Die Taktrate einer Pulsfolge kann im Bereich einiger Hertz, z.B. 1-20 Pulse pro Sekunde, bis zu 103 oder 104 Hertz betragen.
[0032] Der Analysator kann ein Mobilitätsanalysator, Massenanalysator oder kombinierter Mo- bilitäts-Massenanalysator sein. Verallgemeinert lässt sich von lonen-spektrometrischen Analysatoren und Messverfahren sprechen, die Mobilitätsseparation, Massenseparation oder eine Kombination aus beidem aufweisen können.
[0033] Ein lonenmobilitätsanalysator trennt geladene Moleküle oder Molekülionen gemäß ihrem Stoßquerschnitt-zu-Ladungsverhältnis, gelegentlich als Q/z oder o/z bezeichnet. Grundlage hierfür ist die Wechselwirkung der lonenspezies mit einem elektrischen Feld, das mit der Ladung der Ionen koppelt, bei gleichzeitiger Einwirkung eines Puffergases, das auf die mittlere Querschnittsfläche des Ions einwirkt. Bekannt sind insbesondere Driftröhren-Mobilitätsseparatoren mit statischem elektrischen Feldgradienten, die Ionen durch ein im Wesentlichen ruhendes Gas treiben, wobei sich die Driftgeschwindigkeit einer lonenspezies aus der vorantreibenden Kraft des elektrischen Feldes und der bremsenden Kraft der Stöße mit den Gasteilchen ergibt. Ebenso geläufig sind Speicher-Ionenmobilitätsseparatoren (trapping ion mobility separators, TIMS) mit einem die Ionen vorantreibenden stetigen laminaren Gasstrom, dem ein schrittweise veränderter elektrischer Feldgradient mit entsprechend veränderlicher Bremskraft entgegenwirkt. Erwähnt werden können auch Wanderwellen-Mobilitätsseparatoren (travelling wave).
[0034] Ein Massenanalysator wiederum trennt geladene Moleküle oder Molekülionen gemäß ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis, üblicherweise als m/z bezeichnet. Verwendet werden können Flugzeitanalysatoren, für die sowohl Linear- als auch Reflektoraufbauten und/oder solche mit axialer oder orthogonaler Beschleunigung in die Flugstrecke vorgesehen sein können. Auch andere Arten massendispergierender Separatoren lassen sich einsetzen, z.B. Quadrupol-Massenfilter (single quads), Tripel-Quadrupol- Analysatoren („Tripel-Quads“), lonenzyklotronresonanz-Zellen (ion cyclotron resonance, ICR), Analysatoren des Kingdon-Typs wie die Orbitrap® (Thermo Fisher Scientific) und andere. Es versteht sich, dass Separatoren der vorgenannten Typen gekoppelt werden können, um lonenspezies mehrdimensional, also gemäß mehr als einer physikalisch-chemischen Eigenschaft wie m/z und Q/z oder o/z, trennen zu können.
[0035] Verknüpfung von ortsaufgelöster Molekülbildinformation und ortsaufgelöster lichtmikroskopischer Bildinformation kann bedeuten, die beiden Bildinformationen ortsgetreu zu überlagern und bildlich oder grafisch darzustellen, z.B. auf einem Computerbildschirm. Auf diese Weise kann ein Nutzer befähigt werden, ortsaufgelöst visuell übereinstimmende und/oder abweichende Merkmalsausprägungen oder Strukturen in den Bildinformationen der verschiedenen Modalitäten zu erkennen. Verknüpfen im Sinne der vorliegenden Offenbarung kann aber auch weitergehende Prozessierungen der Bildinformationen einschließen, beispielsweise das Erstellen einer Übersichtskarte über das Probenmaterial, auf der eine Kennzahl in einer Grau- oder Farbskala aufgetragen ist, die sich aus der Verrechnung der ortsaufgelösten Intensitäten einer oder mehrerer interessierender lonenspezies m/z sowie der ortsaufgelösten Intensitäten einer oder mehrerer Wellenlängen Ä, aus dem elektromagnetischen Spektrum ergibt. Eine interessierende lonenspezies kann beispielsweise ein Biomolekül oder Biopolymer sein, wie ein Protein, Peptid, Lipid, Poly-Nukleotid oder Polysaccharid. Vorzugsweise deckt die ortsaufgelöste, co-registrierte Gesamtbildinformation das gesamte Probenmaterial flächig ab, z.B. die Gesamtfläche eines analysierten Gewebeschnitts. Die Bildinformationsraster der verschiedenen Modalitäten sind normalerweise unterschiedlich dimensioniert, wobei die optische Modalität ein feineres Raster, d.h. Bildelemente mit kleineren Abmessungen, erlaubt als die massenanalytische Modalität. Je nach Ausgestaltung der lichtmikro- skopischen Beobachtungsoptik liegt die optische Auflösung regelmäßig im Submikrometerbereich, z.B. bei 500-700 Nanometern, wohingegen die Pixelgröße (oder Lateralauflösung) für massenanalytischen Abtrag üblicherweise im niedrigen Mikrometerbereich hegt, z.B. 1-10 Mikrometer. In besonderen Ausführungsformen kann das Verknüpfen eine Anpassung der Bildinformationsdaten der räumlich höher aufgelösten Modalität auf das Raster der niedriger aufgelösten Modalität beinhalten.
[0036] In verschiedenen Ausführungsformen kann das Desorptionsoptiksystem ein Durchlichtoptiksystem aufweisen, das derart angeordnet und ausgelegt ist, dass die erste Strahlung das Probenmaterial nach Durchlaufen des Probenträgers beaufschlagt. Die Ausgestaltung als Durchlichtoptiksystem erlaubt es, den lonenbildungsbereich von strahlführenden Elementen, die mit der lo- nenextraktion interferieren könnten, freizuhalten. Überdies ermöglicht ein Durchlichtoptiksystem eine stärkere Fokussierung der ersten Strahlung für den örtlich sehr begrenzten Abtrag des Probenmaterials, so dass sich deutlich höhere räumliche Auflösungen erzielen lassen als mit Auflich- toptiksystemen wie dem Reflektions-MALDI. Mit einem Laserstrahl lassen sich Abtrags- und damit Bildelement- oder Pixelflächen mit Durchmessern im einstelligen Mikrometerbereich und - bei besonders sorgfältiger Feinabstimmung - sogar im Submikrometerbereich realisieren. Die Begriffe „Bildelement“ und „Pixel“ haben in der vorliegenden Offenbarung die gleiche Bedeutung und werden synonym verwendet.
[0037] In verschiedenen Ausführungsformen können eine Beobachtungsachse des Transmissi- ons-Auflichtoptiksystems und eine optische Achse der ersten Strahlung beim Einfall auf den Probenträger unter Verwendung eines dichroitischen und/oder dielektrischen Spiegels übereinander gebracht werden. Dies ermöglicht eine duale Nutzung einiger Optikkomponenten wie Linsen und/oder Spiegel bei der Führung der ersten Strahlung beim Einfall auf den Probenträger und der zweiten Strahlung in Reflektion vom Probenmaterial durch den Probenträger.
[0038] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Vorrichtung für die Verwendung eines leitfähig beschichteten Glasplättchens als Probenträger ausgebildet sein. Besonders geeignet sind Indium-Zinnoxid-beschichtete Glasplättchen (indium tin oxide, ITO), da sie es durch ihre Leitfähigkeit erlauben, an ihrer das Probenmaterial tragenden Oberfläche ein elektrisches Referenzpotential zu erzeugen, das bei der weiteren auf elektrischen Potentialen und Feldern beruhenden Pro- zessierung des erzeugten ionisierten Probenmaterials hilfreich ist.
[0039] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Lichtquelle derart angeordnet und ausgelegt sein, dass die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation substanziell schattenfrei aufgezeichnet wird. In einer stark vergrößerten Aufnahme kann die vom Probenträger abgewandte Oberfläche des Probenmaterials, ggfs. von Matrixsubstanz überdeckt, stark zerklüftet erscheinen. Stark gerichtete Beleuchtung einer solch ausgeprägt strukturierten Oberfläche kann automatisierte Bildauswertealgorithmen durch Schattenwurf in die Irre führen, da die tatsächliche Topografie nur auf der Seite der Strukturen, die dem Lichteinfall zugewandt ist, deutlich erkannt werden kann, wohingegen die Bereiche, die im Schatten hegen, wegen der geringen Intensitätsunterschiede und daraus resultierenden gleichförmigen Erscheinung kaum Stützpunkte für eine abbildungsbasierte Merkmalserkennung liefern. Die Lichtquelle kann mehrteilig ausgebildet sein, indem sie mehr als einen Lichterzeuger aufweist, deren Strahlung dann für die Beobachtung der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation am Probenmaterial zusammengeführt wird, oder sie kann auch einen Lichterzeuger aufweisen, dessen Licht dann unter Verwendung eines Diffusors oder mehrerer Diffusoren räumlich aufgefächert wird, bevor es auf das Probenmaterial gestrahlt wird.
[0040] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Lichtquelle ringförmig und eine Beobachtungsachse des Transmissions-Auflichtoptiksystems umgebend ausgebildet sein. Eine ringförmige Ausbildung um die Beobachtungsachse herum ermöglicht insbesondere den rückseitigen Lichteinfall auf den Probenträger derart, dass ein Beobachtungspunkt, z.B. ein Bildelement oder Pixel mit einer Lläche von 0,01-1 Quadratmikrometem, auf dem ggfs. stark strukturierten Probenmaterial mit Licht aus einem ausgedehnten Raumwinkelbereich und demnach unter einer Vielzahl unterschiedlicher Einfallswinkel bestrahlt werden kann. Lolglich ist eine solche Ausgestaltung dazu geeignet, S chatten wurf und die zuvor erwähnten, damit einhergehenden nachteiligen Polgen zu vermeiden.
[0041] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Lichtquelle eine Vielzahl von Leuchtdioden umfassen. Das Licht jeder einzelnen Leuchtdiode kann eine Mischung unterschiedlicher Wellenlängen enthalten, die zusammen einen weißen Farbeindruck erzeugen. Es ist aber auch möglich, eine oder mehrere Leuchtdioden so auszugestalten, dass sie Licht mit von weiß abweichender unterschiedlicher Farbcharakteristik abgeben, z.B. eine oder mehrere der Komplementärfarben rot-cyan, grün-magenta und blau-gelb. Monochromatisches Licht erleichtert den optischen Aufbau zur Strahlführung, da die verwendeten Optikkomponenten keinen ausgedehnten Wellenlängenbereich verarbeiten müssen sondern sich schmalbandig optimieren lassen. Licht unterschiedlicher Farben für die Aufzeichnung der ortsaufgelösten mikroskopischen Bildinformation zu verwenden, kann für die Wahrnehmung und automatisierte Auswertung spezifischer Probenmerkmale Vorteile haben. Zum Beispiel kann es mit monochromatischem Licht einfacher sein, Kontrast- oder Bildschärfenmaxima in den optischen Bildern zu verorten. Es ist möglich, alle Leuchtdioden baugleich auszuführen, z.B. mit Weißlichtcharakteristik. In Varianten können auch Leuchtdioden unterschiedlicher Farben nebeneinandergesetzt werden, die zusammen - sofern alle aktiviert sind und Licht abgeben - Licht einer ersten Farbe, z.B. weiß erzeugen und - falls einige nicht aktiviert sind - Licht einer anderen Farbe erzeugen, z.B. grün. Ein Nutzer kann dann durch selektives Schalten die Farbcharakteristik wählen, die für sein geplantes Experiment und das verwendete Probenmaterial am besten geeignet ist, ohne aufwändige Umbauarbeiten an der Vorrichtung vornehmen zu müssen.
[0042] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Lichtquelle derart angeordnet und ausgelegt sein, dass die zweite Strahlung beim Einfall auf den Probenträger keine abbildende und/oder umlenkende Optikkomponente durchläuft. Dies vereinfacht den Aufbau der Transmissions-Auf- lichtoptik und ermöglicht die Anordnung der Lichtquelle in unmittelbarer Nähe zum Probenträger oder dessen Halterung. Als Optikkomponente sind dabei insbesondere refraktive (brechende) und reflektierende (zurückwerfende, „spiegelnde“) Komponenten wie Linsen, Spiegel, Lichtwellenleiter usw. gemeint. Auch ein Mikroskopobjektiv ist in seiner Gesamtheit als Optikkomponente anzusehen. Nicht als Optikkomponente im Sinne der vorliegenden Offenbarung sind rein lichtdurchlässige Platten, z.B. aus Glas, anzusehen, die von Licht oder elektromagnetischen Wellen unter weitgehend paraxialen Bedingungen durchlaufen werden, also unter Winkeln, die nur wenig von einer Flächennormalen der Platte abweichen. Insbesondere ist eine Probenträgerhalterung, die den Probenträger stützt, beispielsweise in einem Durchlichtdesorptionsoptiksystem, in dem der erste Strahl rückseitig auf den Probenträger fällt, nicht als Optikkomponente im Sinne der vorliegenden Offenbarung anzusehen. Auch der lichtdurchlässige Probenträger ist nicht als Optikkomponente im Sinne der Offenbarung anzusehen.
[0043] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Vorrichtung weiter eine Bewegungsmechanik für den Probenträger aufweisen, die derart angeordnet und ausgelegt ist, den Probenträger entlang wenigstens einer Raumrichtung gegenüber einer Einfallsrichtung der ersten Strahlung und/oder der zweiten Strahlung zu bewegen. Die Bewegungsmechanik kann insbesondere einen xy-Verschiebetisch umfassen, auf dem der Probenträger abgelegt ist und der den Probenträger mitsamt darauf abgelegtem Probenmaterial entlang zweier Raumrichtungen x und y, die sich substantiell senkrecht zu einer Flächennormale des Probenträgers und substantiell senkrecht zu einer mikroskopischen Beobachtungsrichtung erstrecken, räumlich verstellt. Vorzugsweise ist die Bewegungsmechanik auch dazu ausgelegt, den Probenträger in einer dritten Raumrichtung z räumlich zu verstellen, die senkrecht zu den zuvor erwähnten Raumrichtungen x und y steht. Insbesondere kann die Bewegungsmechanik dazu ausgelegt und angeordnet sein, im Unterdrück betrieben zu werden. Ein typischer Druck, anwendbar beispielsweise für Vakuum-MALDI, ist substantiell größer als ein Hochvakuum (> 10'3 Hektopascal) und geringer als etwa 102 Hektopascal (< Atmosphärendruck), z.B. 0,1-10 Hektopascal. Im Fall von Ausführungsformen unter Verwendung von Vakuum-MALDI finden lokale Desorption und Ionisierung des Probenmaterials in einer gasdichten und kontinuierlich bepumpten Unterdruckkammer statt, die zur Weiterleitung des lokal desor- bierten und ionisierten Probenmaterials in Fluidverbindung mit dem Analysator steht.
[0044] In verschiedenen Ausführungsformen kann eine Betriebsweise der Recheneinheit, des Desorptionsoptiksystems und des Transmissions-Auflichtoptiksy stems beinhalten, die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation zeitlich vor und/oder nach der Beaufschlagung des Probenmaterials mit der ersten Strahlung aufzuzeichnen. Durch die spezielle Ausgestaltung der Vorrichtung mit einem rückseitig an den lonenquellbereich angeschlossenen Transmissions-Auflichtoptiksystem zur Beobachtung und Aufzeichnung ortsaufgelöster lichtmikroskopischer Bildinformation vom Probenmaterial ist es möglich, Lichtbilder und Molekülbilder in der gleichen Halterung des Probenträgers, sozusagen in der gleichen Einspannung, und im gleichen absoluten Lagekoordinatensystem zu erfassen. Dadurch sind nicht nur die Lagekoordinaten der entsprechenden Bildelemente oder Pixel sehr genau bekannt, sondern sie entsprechen sich auch für die unterschiedlichen Modalitäten: Lichtmikroskopie und lonenanalyse. Die einzige Varianz, die dabei auftreten könnte, sind etwaige Fehlschritte der Bewegungsmechanik bei wiederholtem Anfahren einer bestimmten Position. Allerdings sind Verschiebetische erhältlich, die laut Herstellerspezifikation eine Positioniergenauigkeit im zweistelligen Nanometerbereich aufweisen, z.B. piezoelektrisch betriebene Verschiebetische des Herstellers SmarAct (Oldenburg, Deutschland), insbesondere der CLL-, CLS- und SLC-Serie mit einer Positioniergenauigkeit von 40 Nanometern. Darüber hinaus lassen sich etwaig auftretende Ungenauigkeiten bei der Positionierung durch bekannte Überwachungsmethoden und ggfs. Stellungskorrektur der Bewegungsmechanik zuverlässig berichtigen.
[0045] In verschiedenen Ausführungsformen kann die Vorrichtung weiter ein abbildendes Objektiv aufweisen, das derart angeordnet ist, dass die Lichtquelle entlang einer Beobachtungsachse des Transmissions-Auflichtoptiksystems zwischen dem Probenträger und dem Objektiv hegt. Das abbildende Objektiv kann derart ausgelegt sein, die erste Strahlung beim Einfall auf den Probenträger und die zweite Strahlung nach Durchlaufen des Probenträgers und Reflektion vom Probenmaterial abzubilden. Das Objektiv kann insbesondere duale Abbildungseigenschaften haben, wenn ein Durchlichtdesorptionsoptiksystem eingesetzt wird, indem es einerseits das vom Probenmaterial durch den Probenträger zurückgeworfene Licht, das für die Ermittlung der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation verwendet wird, zu einer für die Aufzeichnung verwendeten Kamera leitet und ggfs. konditioniert und andererseits die erste Strahlung für den rückseitigen Einfall auf den Probenträger und das auf der anderen Seite angeordnete Probenmaterial konditioniert, z.B. auf Fokusgrößen mit Durchmessern im Bereich weniger Mikrometer oder sogar darunter. [0046] In verschiedenen Ausführungsformen können die Lichtquelle und das abbildende Objektiv als integrale Baugruppe ausgebildet sein. Vorzugsweise ist die Lichtquelle in einen der Rückseite des Probenträgers zugewandten Teil eines Objektivkörpers integriert. Eine solche raumsparende Ausgestaltung verringert den Abstand zwischen der Lichtquelle und dem Probenträger und erlaubt die Bestrahlung des Probenmaterials mit dem von der Lichtquelle ausgesandten Licht ohne weitere strahlführende und strahlformende Optikkomponenten.
[0047] In verschiedenen Ausführungsformen kann eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions-Auflichtoptiksystems beinhalten, die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation durch sequentielle Abtastung einer Vielzahl von xy-Einzelbildarealen auf dem Probenmaterial und rechnerisches Zusammenfügen der dabei gewonnenen vereinzelten xy-Einzelbil- dinformation aufzuzeichnen. Die Einzelbildinformation kann auf Grundlage der erfassten Rohdaten zu einem das gesamte Probenmaterial abdeckenden Gesamtbild zusammengefügt werden. Eine vorherige Bilddatenprozessierung, die den lichtmikroskopischen Daten weitere Ungenauigkeiten aufprägen könnte, welche dann durch nachfolgende Prozessierschritte durchgeschleift würden, ist nicht erforderlich. Auf diese Weise lässt sich die Abbildungsgüte des optischen Gesamtbildes verbessern. Darüber hinaus müssen zum Zusammenfügen keine Überlappungsbereiche der Einzelbilder mit anschließendem Merkmalsabgleich in den Überlappungsbereichen vorgesehen werden, da die Position der Einzelbildareale durch die hohe Positioniergenauigkeit der Bewegungsmechanik sehr präzise bekannt ist.
[0048] Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung eine Vorrichtung zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend: - ein Desorptionsoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, das Probenmaterial, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung zu beaufschlagen und Desorption des Probenmaterials in die Gasphase herbeizuführen, wobei das desorbierte Probenmaterial ionisiert wird, - einen Analysator, der abseits des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, das desorbierte und ionisierte Probenmaterial zu empfangen und zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation zu verarbeiten, - ein Transmissions-Auflichtoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, ortsaufgelöst lichtmikroskopische Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch aufzuzeichnen, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation substanziell schattenfrei aufgezeichnet wird, und - eine Recheneinheit, die derart angeordnet und ausgelegt ist, mit dem Desorptionsoptiksystem, dem Analysator und dem Transmissions-Auflichtoptiksystem zu kommunizieren und die ortsaufgelöste Molekülbildinformation sowie die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation zu verknüpfen, wobei eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions- Auflichtoptiksystems beinhaltet, die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation durch sequentielle Abtastung einer Vielzahl von xy-Einzelbildarealen auf dem Probenmaterial und rechnerisches Zusammenfügen der dabei gewonnenen vereinzelten xy -Einzelbildinformation aufzuzeichnen.
[0049] In verschiedenen Ausführungsformen kann eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions-Auflichtoptiksystems beinhalten, eine Vielzahl von xy-Einzelbildarealen in einer dritten Raumrichtung z auf eine Kontrast- und/oder Bildschärfen-Maximumlage abzutasten. Eine bevorzugte Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions-Auflichtoptiksystems kann beinhalten, die Kontrast- und/oder Bildschärfen-Maximumlage zu verwenden, um (i) ortsaufgelöste Höhenprofilinformation des Probenmaterials über dem Probenträger zu ermitteln und/oder (ii) ein optisches Gesamtbild zusammenzusetzen, das in jedem Bildelement einen Bildanteil aus einer z-Position der jeweiligen Kontrast- und/oder Bildschärfen-Maximumlage aufweist (focus stacking).
[0050] Bei Probenmaterial, das ausgeprägte Höhenunterschiede über dem Probenträger aufweist, kann es nützlich sein, die Abtragposition bei Beaufschlagung des Probenmaterials mit der ersten Strahlung anzupassen, um über eine ausgedehnte Fläche, z.B. in der Größenordnung von Quadratmillimetern bis Quadratzentimetem für mikrotomierte Gewebeschnitte, einheitliche Desorptionsbedingungen aufrechtzuerhalten. Eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Desorptionsoptiksystems kann folglich beinhalten, die Kontrast- und/oder Bildschärfen-Maxi- mumlage bei der Beaufschlagung des Probenmaterials für eine Anpassung einer Lage des (i) Fokus der ersten Strahlung und/oder (ii) Probenträgers entlang der dritten Raumrichtung z zu verwenden.
[0051] Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend: - lokales Beaufschlagen des Probenmaterials, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung und Herbeiführen von lokaler Desorption des Probenmaterials in die Gasphase, wobei das lokal desor- bierte Probenmaterial ionisiert wird, - Empfangen und Verarbeiten des lokal desorbierten und ionisierten Probenmaterials zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation unter Verwendung eines Analysators, der abseits des Probenträgers angeordnet ist, - Aufzeichnen von ortsaufgelöster lichtmikroskopischer Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die zweite Strahlung beim Einfall auf den Probenträger keine Optikkomponente durchläuft, die von der ersten Strahlung beim Einfall auf den Probenträger durchlaufen wird, und - Verknüpfen der ortsaufgelösten Molekülbildinformation sowie der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation.
[0052] Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend: - lokales Beaufschlagen des Probenmaterials, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung und Herbeiführen von lokaler Desorption des Probenmaterials in die Gasphase, wobei das lokal desor- bierte Probenmaterial ionisiert wird, - Empfangen und Verarbeiten des lokal desorbierten und ionisierten Probenmaterials zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation unter Verwendung eines Analysators, der abseits des Probenträgers angeordnet ist, - Aufzeichnen von ortsaufgelöster lichtmikroskopischer Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation substanziell schattenfrei aufgezeichnet wird, und - Verknüpfen der ortsaufgelösten Molekülbildinformation sowie der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation, wobei die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation durch sequentielle Abtastung einer Vielzahl von xy- Einzelbildarealen auf dem Probenmaterial und rechnerisches Zusammenfügen der dabei gewonnenen vereinzelten xy-Einzelbildinformation aufgezeichnet wird.
[0053] In verschiedenen Ausführungsformen kann das Verfahren gemäß dem dritten und/oder dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung unter Verwendung einer wie zuvor erläuterten Vorrichtung ausgeführt werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
[0054] Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Abbildungen verwiesen. Die Elemente in den Abbildungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu dargestellt, sondern sollen in erster Linie die Prinzipien der Erfindung (größtenteils schematisch) veranschaulichen. In den Abbildungen sind einander entsprechende Elemente in den verschiedenen Ansichten durch gleiche Bezugszeichen gekennzeichnet.
[0055] Abbildung 1 zeigt einen Aufbau einer tMALDI-Ionenquelle mitsamt integrierter lichtmikroskopischer Beobachtungsmodalität aus dem Stand der Technik. [0056] Abbildung 2A veranschaulicht schematisch den Desorptions- und lonenerzeugungsbe- reich einschließlich angeschlossener Optiksysteme einer Vorrichtung gemäß Prinzipien der vorliegenden Offenbarung in einer isometrischen Ansicht.
[0057] Abbildung 2B zeigt einen Querschnitt des Desorptions- und lonenerzeugungsbereichs aus Abbildung 2A in einer ersten Ausrichtung.
[0058] Abbildung 2C zeigt den Querschnitt des Desorptions- und lonenerzeugungsbereichs aus Abbildung 2B in einer zweiten unterschiedlichen Ausrichtung.
[0059] Abbildung 3 A stellt ein Mikroskopobjektiv dar, in das eine mehrteilige Lichtquelle für die Aufzeichnung lichtmikroskopischer Bildinformation integriert ist, in einer isometrischen Ansicht.
[0060] Abbildung 3B zeigt einen Querschnitt des Mikroskopobjektivs aus Abbildung 3A.
[0061] Abbildung 4 zeigt die Erstellung eines lichtmikroskopischen Gesamtbilds aus einer Vielzahl von lichtmikroskopischen Einzelbildareal-Aufnahmen auf dem Probenmaterial gemäß Prinzipien der vorliegenden Offenbarung.
[0062] Abbildung 5 veranschaulicht ein auf Schärfentiefe-Erweiterung (focus stacking) beruhendes Verfahren sowie eine Bestimmung einer Tiefen- oder Profilkarte von profiliertem Probenmaterial über einem Probenträger gemäß Prinzipien der vorliegenden Offenbarung.
[0063] Abbildung 6 illustriert die Verknüpfung von ortsaufgelöster lichtmikroskopischer Bildinformation mit ortsaufgelöster Molekülbildinformation zu einer ortsaufgelösten co-registrierten Gesamtbildinformation nach Prinzipien der vorliegenden Offenbarung.
[0064] Abbildung 7 zeigt einen MALDI-Flugzeit-Massenanalysator mit konventionellem Aufbau, der für die Umsetzung von Prinzipien der vorliegenden Offenbarung geeignet ist.
Detaillierte Beschreibung
[0065] Während die Erfindung anhand einer Anzahl von Ausführungsformen dargestellt und erläutert wurde, werden Fachleute auf dem Gebiet anerkennen, dass verschiedene Änderungen in Form und Detail daran vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der in den beigefügten Patentansprüchen definierten technischen Lehre abzuweichen. [0066] Im Rahmen dieser Beschreibung werden verschiedene zentrale Begriffe verwendet, die im Folgenden insbesondere für die optische oder mikroskopische Betrachtung kurz erläutert werden. Als Pixel / Bildelement wird die kleinste Einheit eines Bildes bezeichnet. Pixelgrößen in der optischen/mikroskopischen Modalität sind in der Regel deutlich kleiner als in den entsprechenden Molekülbildem. Die Größe des Probenmaterialareals, das auf einem optischen Pixel abgebildet wird, ist abhängig von der Sensorgröße der eingesetzten Kamera sowie den optischen Abbildungseigenschaften und kann beispielsweise bei 100 x 100 Quadratnanometem hegen. Ein Einzelbild ist ein optisches Bild, welches unter Verwendung einer Kamera mit einer einzelnen Aufnahme durch die Beobachtungsoptik von einem Einzelbildareal aufgenommen wird. Typische Kantenlängen eines solchen Areals sind 30-200 Mikrometer. Das optische Gesamtbild ist die mosaikartige Zusammensetzung mehrerer Einzelbilder, um eine Übersicht zu erhalten, und kann das gesamte Probenmaterial mit Kantenlängen von einigen Millimetern oder sogar Zentimetern umfassen. Eine detaillierte Beschreibung der Begriffe ist in den folgenden Abschnitten enthalten.
[0067] Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, hochaufgelöste optische Bilder direkt in der lo- nenquelle eines Massenanalysators aufzunehmen. Dies bedeutet, dass die absoluten Lagekoordinaten für die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation und die ortsaufgelöste Molekülbildinformation dem Labor-Lagekoordinatensystem entsprechen und somit identisch oder deckungsgleich sind. Intrinsisch ermöglicht dies eine nahezu perfekte Co-Registrierung mit dem in derselben Quelle aufgenommenen lonenbild. Fehler können in der Größenordnung weniger 100 Nanometer gehalten werden, was einer Genauigkeit kleiner der üblicherweise verwendeten Mas- senanalyse-Pixelkantenlänge (z.B. ~ 0,5-10 Mikrometer für tMALDI, ~ 5-100 Mikrometer für Auflicht- oder Reflektions-MALDI) entspricht. Zusätzlich kann mit Hilfe der neu eingeführten optischen Beobachtung die Probentopografie pixelscharf und mit hoher Auflösung bestimmt werden.
[0068] Die Abbildungen 2A-C illustrieren schematisch ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung nach Prinzipien der vorliegenden Offenbarung in verschiedenen Ansichten und konzentrieren sich auf einen lonenquellbereich. Einrichtungen zur weiteren Verarbeitung ionisierten Probenmaterials sind in den Abbildungen 2A-C hingegen nicht gezeigt. Zur Kontextualisierung wird auf die weiter unten zu erläuternde Abbildung 7 verwiesen.
[0069] In Abbildung 2A ist eine Unterdruckkammer 20 angedeutet, die zur umgebenden Atmosphäre luftdicht verschlossen ist und unter Verwendung geeigneter Unterdruckerzeuger, z.B. Pumpen, auf einem Druck zwischen 10'3 und 102 Hektopascal gehalten werden kann; ein Druckbereich, in dem sich Vakuum-MALDI durchführen lässt. Der Übersichtlichkeit halber sind einige Seitenwände der Kammer 20 in der Darstellung weggelassen, nur die Rückwand 20-1 sowie obere und untere Wände 20-2, 20-3 sind zu sehen. In der Kammer 20 ist ein xyz- Verschiebetisch 22 angeordnet, auf dem ein Probenträger 24 abgesetzt werden kann. Der Verschiebetisch 22 ist an der unteren Wand 20-3 der Kammer 20 montiert und so ausgelegt, dass er eine große Öffnung 22-1 aufweist, durch die Strahlung auf den Probenträger 24 von der Rückseite einfallend, also abseits der Oberfläche, auf der das Probenmaterial 26 abgelegt wird, gerichtet wird. Der Probenträger 24 hegt in dieser Anordnung auf den Rändern um die Öffnung 22-1 auf.
[0070] Zwischen Rückwand 20-1 der Kammer 20 und dem Verschiebetisch 22 ist ein Mikroskopobjektiv 28 an der Rückwand 20-1 montiert und erstreckt sich bis kurz vor die Öffnung 22-1 im Verschiebetisch 22. Einzelheiten der Strahlführungs- und Optikkomponenten im Objektiv 28 sind der Übersichtlichkeit halber nicht gezeigt.
[0071] Jenseits der Rückwand 20-1 der Kammer 20 sind zwei Strahlengänge 30, 32 angedeutet, die einerseits einem Durchlichtdesorptionsoptiksystem und andererseits einem Transmissions- Auflichtoptiksystem zugeordnet sind. Die Strahlengänge 30, 32 enthalten mehrere strahlführende und strahlformende Komponenten wie Linsen und Umlenkspiegel, die dafür sorgen, dass die für die Desorption von Probenmaterial 26 benötigte erste Strahlung 30 zum Probenträger 24 und die für die Aufzeichnung der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation benötigte, vom Probenmaterial 26 durch den Probenträger 24 zurückgeworfene zweite Strahlung 32 zu einer Kamera 34 geführt werden.
[0072] In der oberen und unteren Wand 20-2, 20-3 der Kammer 20 sind zwei Fenster 36‘, 36“ angedeutet, durch die eine dritte Strahlung, z.B. ein Laserstrahl für die Nachionisierung neutral desorbierten Probenmaterials, in die Unterdruckkammer 20 ein- bzw. ausgekoppelt und in eine Desorptionswolke über dem Ausschnitt des beaufschlagten Probenmaterials 26 fokussiert werden kann. Einzelheiten zu diesem MALDI-2 genannten Verfahren finden sich beispielsweise in dem Artikel von Jens Soltwisch et al. (Science, 10 April 2015 • Vol 348 Issue 6231, 211 ff.) oder auch der in der Einleitung erwähnten Studie von M. Niehaus et al. für einen tMALDI- Aufbau
[0073] Der Aufbau lässt sich in zwei Teile, oder zwei Strahlengänge 30, 32, unterteilen. Der Beobachtungsstrahlengang 32 und der Laserstrahlengang 30 werden mit Hilfe eines dichroitischen und/oder dielektrischen Spiegels 38, siehe die Ansichten in den Abbildungen 2B und 2C, auf ihrem Weg vom bzw. zum Probenträger 26 übereingebracht. Die Ein- und Auskopplung der Strahlung in die Unterdruckkammer 20 bzw. aus ihr heraus erfolgt über ein entsprechendes Fenster 40 in Rückwand 20-1 der Kammer 20. Mit Hilfe des UV-gängigen Objektivs 28 in der Unterdruckkammer 20, das sowohl der Beobachtungsstrahlengang 32 als auch der Laserstrahlengang 30 durchlaufen, wird einerseits eine mikroskopische Betrachtung des Probenmaterials 26 im Trans- missions-Auflicht ermöglicht und andererseits die Fokussierung des Laserstrahls 30 an der das Probenmaterial 26 tragenden Vorderseite des Probenträgers 24 auf eine Strahltaille im Submikrometer-Bereich realisiert.
[0074] Beide Strahlengänge 30, 32 durchlaufen den Probenträger 24, wobei der Beobachtungsstrahlengang 32 von der Grenzfläche des Probenmaterials 26 mit der ggfs. darauf aufgetragenen Matrix ausgeht und auf den lichtempfindlichen Chip der Beobachtungskamera 34 abgebildet wird. Der dabei abgebildete Bildausschnitt kann eine Kantenlänge von 50-250 Mikrometern, in dem nahezu keine Kontrastunterschiede aufscheinen, und eine optische Auflösung von 0,5-2 Mikrometer aufweisen, abhängig von der Wahl des Objektivs 28. Der Laserstrahlengang 30 trifft rückseitig auf die gleiche Grenzfläche und ist auf einen kleinen Ausschnitt des Probenmaterials 26 fokussiert. Dieser Ausschnitt entspricht einem Bildelement oder Pixel für die MS-Messung, z.B. mit einer Größe von 0,5-10 Mikrometer Durchmesser oder Kantenlänge. Es handelt sich daher bei der Konfiguration um einen Transmissions-MALDI (tMALDI) Aufbau.
[0075] Die gezeigte Ausführungsform beruht auf der dualen Nutzung eines Mikroskopobjektives 28 sowohl zur Probenmaterialbeobachtung als auch zum Probenmaterialabtrag. Dieser Dualismus ermöglicht die genaue Bestimmung des Abtragpunktes auf dem generierten optischen Bild. Mit Hilfe von maßgeschneiderter Software können dabei einzelne hochaufgelöste Mikroskopbilder zu einem großen Übersichtsbild zusammenfasst werden. Gleichzeitig erlaubt die Analyse des Kontrastes mikroskopischer Aufnahmen bei unterschiedlicher Objektweite die Ermittlung der Topografie mit hoher räumlicher Präzision.
[0076] Die Beobachtung wird durch eine Kamera 34 realisiert, die entlang einer Flächennormalen des Probenträgers 26 und abseits von diesem im rückwärtigen Bereich außerhalb der Unterdruckkammer 20 angeordnet ist. Das Objektiv 28 ist unendlich korrigiert, weshalb eine abbildende Linse 42 in einem Abstand entsprechend ihrer Brennweite zur Kamera 34 positioniert wird. Die mikroskopische Betrachtung im Transmissions- Auflicht (reflektiv), d.h. vom Probenmaterial 26 zurückgeworfen durch den Probenträger hindurch, benötigt eine möglichst diffuse Beleuchtung, um Abschattungseffekte zu verringern. Diese Beleuchtung wird vorliegend durch einen Beleuchtungsring aus mehreren Leuchtdioden (LED) 44 realisiert.
[0077] In dem gezeigten Beispiel werden 15 LEDs 44 verwendet. Die Zahl der LEDs könnte auch kleiner oder größer sein. Es können Lichtquellen oder LEDs mit Weißlicht- oder auch monochromatischer Farbcharakteristik verwendet werden, z.B. grün. Denkbar sind auch Lichtquellen oder LEDs mit variabler Farbcharakteristik, die z.B. über einen Wellenlängenbereich durchstimmbar sind oder Mischfarben, insbesondere poly chromatische aber nicht weiße Farbcharakteristik, aufweisen. Die Leuchtdioden 44 sind in einem zylinderförmigen, axial auskragenden Aufsatz 46 angeordnet, der mit dem Objektivkörper 28* zu einer integralen Baugruppe zusammengefügt ist, wie in den Abbildungen 3A-B gezeigt, und umgeben die durch das Objektiv 28 verlaufende optische Beobachtungsachse 48 ringförmig. Die Leuchtdioden 44 selbst sind jeweils in zylinderförmigen Gehäusen untergebracht, die unter einem von 0° und 180° abweichenden Winkel zur optischen Beobachtungsachse 48 des Objektivs 28 in den Aufsatz 46 eingebettet sind, so dass die optischen Achsen (punktierte Linien 50) aller Dioden 44 sich in einem von dem Aufsatzende des Objektivkörpers 28* entfernten, auf der optischen Beobachtungsachse 48 liegenden Punkt 52 maximaler Ausleuchtung bündeln oder treffen. Dieser Punkt maximaler Ausleuchtung 52 hegt am Probenträger 24, um das darauf vorderseitig abgelegte Probenmaterial 26 mit hoher Intensität und schattenfrei im Transmissions- Auflicht ausleuchten zu können, und stimmt mit dem optimalen Arbeitsabstand für das Objektiv 28 und/oder dessen Brennpunkt überein.
[0078] Die Laserstrahlung 30 für den Abtrag des Probenmaterials 26 wird mit Hilfe des dichroitischen und/oder dielektrischen Spiegels 38 koaxial zum Beobachtungsstrahlengang 32 durch das Objektiv 28 auf den anvisierten Ausschnitt des Probenmaterials 26 einjustiert. Damit ist die Abtragposition fest mit einer definierten Position auf dem beobachteten Bild gekoppelt. Die nachträgliche fehlerbehaftete Co-Registrierung von Kamerabild und Abtragposition entfällt.
[0079] Für die Erzeugung eines optischen Übersichtsbildes (Abtastung/Scan) mit hoher Auflösung werden Einzelbilder 54 von definierten Arealen 56 auf dem Probenträger 26 mit hoher Vergrößerung aufgenommen und mosaikartig zu einem Gesamtbild 58 aneinandergefügt. Das entsprechende Prinzip ist in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Dafür sind Kamera 34 und Verfahrmechanik des Verschiebetischs 22 Software-seitig koordiniert und synchronisiert. Anschließend werden mit Hilfe der für jedes Einzelbild 54 gespeicherten Koordinaten X:Y Mosaikbilder konstruiert. Durch die exakte Positionierung und die minimale Bearbeitung der Einzelbilder 54 werden keine Verzerrungseffekte wie beispielsweise Streckung, Drehung u.Ä. eingeführt. Die Positionierungsgenauigkeit ist begrenzt durch die Genauigkeit der Verfahrmechanik des Verschiebetisches 22 und der Größe eines optischen Pixels, also je nach Skalierungsfaktor in der Größenordnung 100 Nanometer oder sogar darunter. Da die Koordinaten der Verfahrmechanik beim Abtasten des Probenmaterials 26 für die Aufzeichnung des optischen Bilds und bei einer vorausgehenden oder folgenden Massenanalyse im Labor-Lagekoordinatensystem konstant bleiben, wird ohne zusätzlichen Eingriff oder nachgelagerte Korrektur eine nahezu perfekte Co-Registrierung des optischen und molekularen Gesamtbilds erreicht. [0080] Um in einer bevorzugten Ausführungsform die Topografie des flächig ausgedehnten Probenmaterials 26 zu bestimmen, werden zunächst auf dem gesamten Abtastbereich, z.B. der Gesamtfläche eines Gewebeschnitts, eine definierte Menge von Punkten Xn:Ym ausgewählt. Diese können an einem Raster instrumentell fest angelegt sein oder manuell gesetzt werden. An diesen Punkten wird eine Autofokus-Routine durchgeführt. Die dabei verwendete Technik zur Bestimmung der Fokusebene an jedem einzelnen Punkt ist ähnlich zu der von Michael J. Taylor et al. beschrieben Methode, siehe Einleitung. Für jeden beliebigen Ort auf dem Probenmaterial 26 kann durch Inter- und/oder Extrapolation, ausgehend von den Stützstellen der ausgewählten Punkte Xn:Ym, die wahre Probenmaterialerhebung über dem Probenträger 24 berechnet und als softwareseitige z-Korrektur eingeführt werden. Diese Methode eignet sich insbesondere zur Korrektur von großflächigen topografischen Varianzen, wie sie beim Einspannen des Probenträgers 24 in die dafür vorgesehene Halterung entstehen können.
[0081] In einer besonderen Ausführungsform wird ein auf Schärfentiefe-Erweiterung (focus stacking) basierendes Verfahren angewandt. Hiermit kann die Topografie des Probenmaterials 26 lateral hochaufgelöst, z.B. auf wenige Mikrometer, bestimmt werden. Analog zum oben genannten Verfahren zur Erzeugung eines optischen Gesamtbildes werden unter Verwendung des Bewegungsraums des Verschiebetischs 22 in z-Richtung bei ansonsten unveränderter Einstellung des Transmissions-Auflichtoptiksystems mehrere optische Gesamtbilder für definierte z-Werte erstellt, in Abbildung 5 schematisch angedeutet als zl, z2, z3. Je nach erwarteter Probentopografie können diese z-Werte beispielsweise einen Bereich von ±10 Mikrometern mit einer Schrittweite von 1 Mikrometer um einen Startwert, z.B. eine mittlere oder erwartete Gewebeschnittdicke, abdecken.
[0082] Auf jedes dieser Bilder wird ein Laplace-Filter angewendet. Die Kemelgröße und der optionale Einsatz weiterer Filter ist abhängig von der optischen Konfiguration und vom beobachteten Probenmaterial 26. Die Ergebnisse aus diesem Schritt dienen als lokales Maß für den Kontrast oder die Bildschärfe und werden in eine dreidimensionale Matrix geschrieben. Hierbei entspricht die erste und zweite Dimension der x- und y-Position auf dem Probenmaterial 26, die dritte Dimension entspricht der z-Ebene des zugrundeliegenden Bildes. Für jede x- und y-Position wird entlang der dritten Dimension das Maximum der Ergebnismatrix bestimmt. Der z-Index des Maximums wird für jede x- und y-Position in eine zweidimensionale Matrix geschrieben, die als Tiefen- oder Profilkarte bezeichnet werden kann, siehe ganz rechts in Abbildung 5. Die Tiefenoder Profilkarte enthält somit, ggfs. durch Inter- und/oder Extrapolation erweitert oder ergänzt, zu jeder beliebigen x- und y-Position die z-Ebene der höchsten Bildschärfe. [0083] Die erhaltene Tiefen- oder Profilkarte kann einerseits dafür verwendet werden, den Abtrag-Laser während einer folgenden MALDI-MSI-Messung pixelgenau im Fokus zu halten, beispielsweise durch Änderung der Fokuslage oder durch Verschiebung des Probenträgers entlang der z- Achse. Andererseits kann ein Focus tacA Bild konstruiert werden, in Abbildung 5 als „Stapelbild“ bezeichnet. Hierbei werden die Echtbild-Pixelintensitäten der aufgenommenen z-Ebenen pixelweise so zusammengefügt, dass in einem Ergebnisbild nur die Bilddaten der jeweils schärfsten z-Ebene an der jeweiligen xy -Position enthalten sind. Diese Vorgehens weise erleichtert insbesondere wegen der durchgehend scharfen Darstellung die visuelle Auswertung der lichtmikroskopischen Gesamtbildinformation und deren visuellen Abgleich mit der Molekülbildinformation signifikant.
[0084] Durch die oben beschriebenen Techniken wird der Arbeitsablauf und/oder die Genauigkeit für eine tMALDI-MSI-Messung mit kleinen Pixelgrößen deutlich erleichtert und verbessert. Abbildung 6 veranschaulicht die Co-Registrierung der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation, repräsentiert durch ein optisches Gesamtbild 58* oben links, dessen Einzelbildraster durch schwarze Balken sowie Einzelbildmitte-Koordinaten durch Kreuze kenntlich gemacht sind. Die Abmessungen jedes Einzelbildes sowie dessen Verortung im Koordinatensystem sind für eine bestimmte Verschiebetischposition gespeichert. Ebenfalls gezeigt ist die ortsaufgelöste Molekülbildinformation, repräsentiert durch das lonenbild 60 unten links, das beispielsweise die Intensitätsverteilung einer bestimmten interessierenden Ionen- oder Molekülspezies wiedergibt, z.B. ein Protein, Peptid, Lipid, Poly-Nukleotid oder Polysaccharid. Die Informationen der beiden Modalitäten können dann zu einer Gesamtbildinformation verknüpft werden, die - wegen der Erfassung im identischen Koordinatensystem - mit hoher räumlicher Auflösung im Submikrometerbereich co-registriert ist, repräsentiert durch die Kompositdarstellung 62 rechts. Die co-registrierte Gesamtbildinformation, aufweisend einen lichtmikroskopischen Bildanteil und einen molekularen Bildanteil, kann dann von einem Nutzer visuell ausgewertet oder einer Rechner-gestützten automatisierten Auswerteroutine unterworfen werden, z.B. zum Auffinden von Merkmalskorrelationen in den Daten der verschiedenen Modalitäten.
[0085] Abbildung 7 zeigt schematisch einen grundsätzlich bekannten MALDI- Flugzeitmassenanalysator in einem Axial-Reflektor- Aufbau, in denen Prinzipien der vorliegenden Offenbarung zum Einsatz kommen können. Die Probenmaterial befindet sich auf der Probenträgerplatte 71 gegenüber den Beschleunigungselektroden 72 und 73 und kann durch den vom Laser 75, 75* im Auflicht oder Durchlicht gelieferten Laserlichtpulsstrahl 74, 74* ortsaufgelöst ionisiert werden. Die Ionen werden durch die Beschleunigungselektroden 72 und 73 zu einem lonenstrahl 78 beschleunigt, der eine Gaszelle 79, die bei Bedarf mit Stoßgas gefüllt werden kann, einen Vor- läuferionenselektor 80, eine Fragmentionen-Nachbeschleunigungseinheit 81 und den Vorläuferio- nen-Unterdrücker 82 passiert und dann vom Reflektor 83 auf den lonendetektor 84 reflektiert wird. Das Gehäuse des Massenanalysators wird durch eine leistungsstarke Vakuumpumpe 85 be- pumpt. Der lonendetektor 84 kann eine Vielkanalplatte als lonenempfänger aufweisen. In den rückwärtigen Teil hinter den Probenträger 71 lässt sich ein Transmissions-Auflichtoptiksystem gemäß Prinzipien der vorliegenden Offenbarung integrieren.
[0086] Die Erfindung ist vorstehend mit Bezug auf verschiedene besondere Ausführungsbeispiele beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass diverse Gesichtspunkte oder Einzelheiten der beschriebenen Ausführungen geändert werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Weiterhin können die im Zusammenhang mit unterschiedlichen Ausführungsformen offenbarten Merkmale und Maßnahmen beliebig kombiniert werden, sofern dies einem Fachmann praktikabel erscheint. Überdies dient die vorstehende Beschreibung nur zur Veranschaulichung der Erfindung und nicht zur Einschränkung des Schutzbereichs, der ausschließlich durch die beigefügten Patentansprüche unter Berücksichtigung etwaig vorhandener Äquivalente definiert wird.

Claims

Ansprüche
1. Vorrichtung zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend:
- ein Desorptionsoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, das Probenmaterial, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung zu beaufschlagen und Desorption des Probenmaterials in die Gasphase herbeizuführen, wobei das desorbierte Probenmaterial ionisiert wird,
- einen Analysator, der abseits des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, das desorbierte und ionisierte Probenmaterial zu empfangen und zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation zu verarbeiten,
- ein Transmissions-Auflichtoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, ortsaufgelöst lichtmikroskopische Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch aufzuzeichnen, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die zweite Strahlung beim Einfall auf den Probenträger keine Optikkomponente durchläuft, die von der ersten Strahlung beim Einfall auf den Probenträger durchlaufen wird, und
- eine Recheneinheit, die derart angeordnet und ausgelegt ist, mit dem Desorptionsoptiksystem, dem Analysator und dem Transmissions-Auflichtoptiksystem zu kommunizieren und die ortsaufgelöste Molekülbildinformation sowie die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation zu verknüpfen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der das Desorptionsoptiksystem ein Durchlichtoptiksystem aufweist, das derart angeordnet und ausgelegt ist, dass die erste Strahlung das Probenmaterial nach Durchlaufen des Probenträgers beaufschlagt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der eine Beobachtungsachse des Transmissions-Auflichtoptiksystems und eine optische Achse der ersten Strahlung beim Einfall auf den Probenträger unter Verwendung eines dichroitischen und/oder dielektrischen Spiegels übereinander gebracht werden.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die für die Verwendung eines leitfähig beschichteten Glasplättchens als Probenträger ausgebildet ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die Lichtquelle derart angeordnet und ausgelegt ist, dass die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation substanziell schattenfrei aufgezeichnet wird. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der die Lichtquelle ringförmig und eine Beobachtungsachse des Transmissions- Auflichtoptiksystems umgebend ausgebildet ist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der die Lichtquelle eine Vielzahl von Leuchtdioden umfasst. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der die Lichtquelle derart angeordnet und ausgelegt ist, dass die zweite Strahlung beim Einfall auf den Probenträger keine abbildende und/oder umlenkende Optikkomponente durchläuft. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter aufweisend eine Bewegungsmechanik für den Probenträger, die derart angeordnet und ausgelegt ist, den Probenträger entlang wenigstens einer Raumrichtung gegenüber einer Einfallsrichtung der ersten Strahlung und/oder der zweiten Strahlung zu bewegen. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der eine Betriebsweise der Recheneinheit, des Desorptionsoptiksystems und des Transmissions-Auflichtoptiksy stems beinhaltet, die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation zeitlich vor und/oder nach der Beaufschlagung des Probenmaterials mit der ersten Strahlung aufzuzeichnen. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, weiter aufweisend ein abbildendes Objektiv, das derart angeordnet ist, dass die Lichtquelle entlang einer Beobachtungsachse des Transmissions-Auflichtoptiksystems zwischen dem Probenträger und dem Objektiv liegt. Vorrichtung nach Anspruch 11, bei der das abbildende Objektiv derart ausgelegt ist, die erste Strahlung beim Einfall auf den Probenträger und die zweite Strahlung nach Durchlaufen des Probenträgers und Reflektion vom Probenmaterial abzubilden. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, bei der die Lichtquelle und das abbildende Objektiv als integrale Baugruppe ausgebildet sind. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei der eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions-Auflichtoptiksystems beinhaltet, die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation durch sequentielle Abtastung einer Vielzahl von xy-Einzelbildare- alen auf dem Probenmaterial und rechnerisches Zusammenfügen der dabei gewonnenen vereinzelten xy-Einzelbildinformation aufzuzeichnen. Vorrichtung zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend:
- ein Desorptionsoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, das Probenmaterial, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung zu beaufschlagen und Desorption des Probenmaterials in die Gasphase herbeizuführen, wobei das desorbierte Probenmaterial ionisiert wird,
- einen Analysator, der abseits des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, das desorbierte und ionisierte Probenmaterial zu empfangen und zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation zu verarbeiten,
- ein Transmissions-Auflichtoptiksystem, das derart angeordnet und ausgelegt ist, ortsaufgelöst lichtmikroskopische Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch aufzuzeichnen, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation substanziell schattenfrei aufgezeichnet wird, und
- eine Recheneinheit, die derart angeordnet und ausgelegt ist, mit dem Desorptionsoptiksystem, dem Analysator und dem Transmissions- Auflichtoptiksystem zu kommunizieren und die ortsaufgelöste Molekülbildinformation sowie die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation zu verknüpfen, wobei eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions- Auflichtoptiksy stems beinhaltet, die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation durch sequentielle Abtastung einer Vielzahl von xy-Einzelbildarealen auf dem Probenmaterial und rechnerisches Zusammenfügen der dabei gewonnenen vereinzelten xy -Einzelbildinformation aufzuzeichnen. Vorrichtung nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, bei der eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions-Auflichtoptiksystems beinhaltet, eine Vielzahl von xy-Einzelbildarealen in einer dritten Raumrichtung z auf eine Kontrast- und/oder Bildschärfen-Maxi- mumlage abzutasten. Vorrichtung nach Anspruch 16, bei der eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Transmissions-Auflichtoptiksystems beinhaltet, die Kontrast- und/oder Bildschärfen-Maximum- lage zu verwenden, um (i) ortsaufgelöste Höhenprofilinformation des Probenmaterials über dem Probenträger zu ermitteln und/oder (ii) ein optisches Gesamtbild zusammenzusetzen, das in jedem Bildelement einen Bildanteil aus einer z-Position der jeweiligen Kontrast- und/oder Maximumlage aufweist (focus stacking). Vorrichtung nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, bei der eine Betriebsweise der Recheneinheit und des Desorptionsoptiksystems beinhaltet, die Kontrast- und/oder Bildschärfen-Maxi- mumlage bei der Beaufschlagung des Probenmaterials für eine Anpassung einer Lage des (i) Fokus der ersten Strahlung und/oder (ii) Probenträgers entlang der dritten Raumrichtung z zu verwenden. Verfahren zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend:
- lokales Beaufschlagen des Probenmaterials, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung und Herbeiführen von lokaler Desorption des Probenmaterials in die Gasphase, wobei das lokal desorbierte Probenmaterial ionisiert wird,
- Empfangen und Verarbeiten des lokal desorbierten und ionisierten Probenmaterials zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation unter Verwendung eines Analysators, der abseits des Probenträgers angeordnet ist,
- Aufzeichnen von ortsaufgelöster lichtmikroskopischer Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die zweite Strahlung beim Einfall auf den Probenträger keine Optikkomponente durchläuft, die von der ersten Strahlung beim Einfall auf den Probenträger durchlaufen wird, und
- Verknüpfen der ortsaufgelösten Molekülbildinformation sowie der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation.
Verfahren zur multimodalen Analyse von Probenmaterial, umfassend:
- lokales Beaufschlagen des Probenmaterials, welches auf einer Seite eines Probenträgers angeordnet ist, mit einer ersten Strahlung und Herbeiführen von lokaler Desorption des Probenmaterials in die Gasphase, wobei das lokal desorbierte Probenmaterial ionisiert wird,
- Empfangen und Verarbeiten des lokal desorbierten und ionisierten Probenmaterials zu ortsaufgelöster Molekülbildinformation unter Verwendung eines Analysators, der abseits des Probenträgers angeordnet ist,
- Aufzeichnen von ortsaufgelöster lichtmikroskopischer Bildinformation von dem Probenträger und Probenmaterial unter Verwendung einer zweiten Strahlung in Reflektion durch den lichtdurchlässigen Probenträger hindurch, wobei die zweite Strahlung von einer Lichtquelle ausgesendet wird, die auf einer dem Probenmaterial abgewandten Seite des Probenträgers angeordnet und derart ausgelegt ist, dass die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation substanziell schattenfrei aufgezeichnet wird, und
- Verknüpfen der ortsaufgelösten Molekülbildinformation sowie der ortsaufgelösten lichtmikroskopischen Bildinformation zu ortsaufgelöster co-registrierter Gesamtbildinformation, wobei die ortsaufgelöste lichtmikroskopische Bildinformation durch sequentielle Abtastung einer Vielzahl von xy-Einzelbildarealen auf dem Probenmaterial und rechnerisches Zusammenfügen der dabei gewonnenen vereinzelten xy-Einzelbildinformation aufgezeichnet wird. Verfahren nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, das unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18 ausgeführt wird.
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