WO2017013033A1

WO2017013033A1 - Hochauflösende, spektral selektive scanning-mikroskopie einer probe

Info

Publication number: WO2017013033A1
Application number: PCT/EP2016/066952
Authority: WO
Inventors: Ingo Kleppe; Ralf Wolleschensky; Ralf Netz; Yauheni Novikau
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2017-01-26
Also published as: DE102015111702A1; US10649188B2; US20180196245A1

Abstract

Eine hochauflösende spektral selektive Scanning-Mikroskopie einer Probe (2), wobei die Probe mit Beleuchtungsstrahlung (5) derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung zu einem Beleuchtungsfleck (14) in oder auf der Probe gebündelt wird, wobei der Beleuchtungsfleck in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzt ist und in dieser Raumrichtung eine minimale Ausdehnung hat, vom Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung beugungsbegrenzt in ein in einer Bildebene liegendes Beugungsbild (17) abgebildet und mit einer Ortsauflösung erfasst wird, die eine Struktur eines Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung auflöst, der Beleuchtungsfleck relativ zur Probein verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als die halbe minimale Ausdehnung des Beleuchtungsflecks, für jede Scanpositionen ein Einzelbild der Struktur des Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung erzeugt wird und aus den Einzelbildern ein Bild der Probe erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist, wobei die vom Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf einen Detektor (24) abgebildet wird, der in der Bildebene (19) eine Eintrittsfläche (18) mit mehreren nebeneinanderliegenden Ortskanälen (22) aufweist, die die Ortsauflösung festlegen, mit der die Struktur des Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung aufgelöst wird, und wobei die vom Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung spektral ausgewertet wird, ist vorgesehen, dass in genau einem ersten der nebeneinanderliegenden Ortskanäle (40; 40.1-40.4) die Fluoreszenzstrahlung auf ein Spektrometer (S) geleitet und damit spektral ausgewertet wird und in den übrigen zweiten der nebeneinanderliegenden Ortskanäle die Fluoreszenzstrahlung jeweils auf ein Detektorelement (25) geleitet wird, das die Fluoreszenzstrahlung nur hinsichtlich der Intensität erfasst.

Description

Hochauflösende, spektral selektive Scanninq-Mikroskopie einer Probe

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur hochauflösenden, spektral selektiven

Scanning-Mikroskopie einer Probe, wobei die Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung zu einem Beleuchtungsfleck in oder auf der Probe gebündelt wird, wobei der Beleuchtungsfleck in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzt ist und in dieser Raumrichtung eine minimale Ausdehnung hat und insbesondere punkt- oder linienförmig ist, vom

Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung beugungsbegrenzt in ein in einer Bildebene liegendes Beugungsbild abgebildet und mit einer Ortsauflösung erfasst wird, die eine Struktur eines Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung auflöst, der Beleuchtungsfleck relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als die halbe minimale Ausdehnung des

Beleuchtungsflecks, für jede Scanpositionen ein Einzelbild der Struktur des Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung erzeugt wird und aus den

Einzelbildern ein Bild der Probe erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist, wobei die vom Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf einen Detektor abgebildet wird, der in der Bildebene eine Eintrittsfläche mit mehreren nebeneinanderliegenden

Ortskanälen aufweist, die die Ortsauflösung festlegen, mit der die Struktur des Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung aufgelöst wird, und wobei die vom Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung spektral ausgewertet wird.

Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur hochauflösenden, spektral-selektiven Scanning-Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die ein im Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt, der in dieser Raumrichtung eine minimale Ausdehnung hat, einer Abbildungseinrichtung zum beugungsbegrenzten Abbilden vom Beleuchtungsfleck in der Fokalebene ausgehender Fluoreszenzstrahlung durch die Optik in ein Beugungsbild auf eine ortsauflösende Flächendetektoreinrichtung, die in einer zur Fokalebene konjugierten Bildebene liegt, wobei die Flächendetektoreinrichtung mehrere nebeneinanderliegende Ortskanäle aufweist, die eine Ortsauflösung festlegen, mit der die Struktur des Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung aufgelöst wird, wobei die Ortsauflösung eine Struktur des Beugungsbildes auflöst, einer Scaneinrichtung zur Verschiebung des Punktes in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als die halbe minimale Ausdehnung des Beleuchtungsflecks, einer Auswerteeinrichtung zum Auslesen der

Flächendetektoreinrichtung, zum Auswerten der Beugungsstruktur des Beugungsbildes aus Einzelbilddaten der Flächendetektoreinrichtung und aus den diesen Einzelbilddaten zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist. Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z.B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird mit Anregungsstrahlung darstellender Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und die dadurch angeregte Lumineszenzstrahlung mit geeigneten Detektoren erfasst. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Mikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren.

Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und

Fluoreszenz verstanden, erfasst also beide Prozesse. Soweit hier von Fluoreszenz gesprochen wird, ist das pars pro toto und nicht einschränken zu verstehen. Zur Probenuntersuchung ist es auch bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene abbilden, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es, ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Natürlich wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning- Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird.

Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskopes, auch die eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. Der Begriff„hochauflösend" wird hier für Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze verwendet.

Die US 5043570 beschreibt einen Versuch, die Auflösung durch "oversam pling" zu erhöhen. Dies führt nicht zu einer deutlich verbesserten Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze des Mikroskopes.

Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 gegenüber einem beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der US 586691 1 beschrieben. Für die Entvölkerungsprozesse sind verschiedene Ansätze bekannt, beispielsweise wie in der DE 4416558 C2, US 6633432 oder DE 10325460 A1 beschrieben.

Ein weiteres hochauflösendes Mikroskopieverfahren wird in US 5867604 angesprochen, in der ein Objekt mit einer periodischen Struktur abgetastet wird. Ein ähnliches Verfahren zur Auflösungssteigerung wird in der EP 1 157297 B1 angesprochen. Strukturierte Beleuchtung nutz nichtlineare Prozesse, z.B. eine Sättigung der Fluoreszenz. Der Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild. Ein Verfahren, das im Weitfeld eine Hochauflösung erreicht, ist aus der WO 2006127692 und der DE 102006021317 bekannt. Dieses mit PALM abgekürzte Verfahren (Photo Activated Light Microscopy) verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels eines optischen

Aktivierungssignals aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die

Markierungssubstanz mit Anregungsstrahlung zur Abgabe von bestimmter

Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Die Aktivierung wird so vorgenommen, dass zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten

Molekülen so beabstandet sind, dass sie gemessen an der optischen Auflösung der

Mikroskopie getrennt oder nachträglich trennbar sind. Nach Aufnahme der

Lumineszenzstrahlung wird für diese isolierten Moleküle dann das Zentrum deren

auflösungsbegrenzt bedingter Strahlungsverteilung ermittelt und daraus rechnerisch die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmt, als es die optische Abbildung eigentlich zulässt. Zur Abbildung der gesamten Probe wird die Isolierung der Markierungsmoleküle der Teilmenge durch Einbringen der Aktivierungsstrahlung, nachfolgende Anregung und

Fluoreszenzstrahlungsabbildung so lange wiederholt, bis möglichst alle Markierungsmoleküle einmal in einer Teilmenge enthalten und isoliert waren.

Weitere hochauflösende Verfahren sind in Hell, "Far-Field Optical Nanoscopy", Science 316, 1153 - 1 158, 2007, beschrieben. Ein weiteres hochauflösendes Verfahren und Mikroskop ist aus der EP 2317362 A1 bekannt. Diese Druckschrift kombiniert in der dort in Fig. 5 dargestellten Ausführungsform eine beugungsbegrenzte Beleuchtung der Probe mit einem Flächendetektor, wobei eine

Scaneinrichtung so ausgebildet ist, dass das Beugungsbild des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten Punktes auf dem Flächendetektor ruht. Man bezeichnet diese Anordnung als sogenannte„de-scanned" Detektoranordnung. Sie wird üblicherweise dadurch erreicht, dass zwischen dem Vereinigungspunkt zwischen Beleuchtungseinrichtung und

Abbildungseinrichtung und der Probe ein Scanner angeordnet ist, der den Strahlengang ablenkt. Ein solcher Scanner wirkt dann sowohl auf den Beleuchtungsfleck als auch auf die beugungsbegrenzte Abbildung des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten Punktes, so dass in Abbildungsrichtung nach dem Scanner der Strahlengang ruht. Eine Alternative zu einem solchen Scanner ist die Verwendung eines bewegbaren Probentischs, der die Probe verschiebt. Auch dann ruht das Beugungsbild auf dem Flächendetektor. Im Konzept der EP 2317362 A1 ist der Flächendetektor mit einer Ortsauflösung versehen, die bezogen auf den

Abbildungsmaßstab eine Überabtastung des Beugungsbildes bewirkt und es somit erlaubt, die Beugungsstruktur des Beugungsbildes abzutasten. Das Verfahren wir als Airy-Scan- Mikroskopie bezeichnet. Die EP 2317362 A1 sieht eine Ausführungsform der Airy-Scan-Mikroskopie vor, bei der eine Farbanalyse möglich ist. Dazu werden mehrere Detektoren vorgesehen, die in entsprechenden Spektralkanälen liegen, welche durch einen dichroitischen Farbteiler gebildet werden. Dieser Ansatz ist für die Laser-Scanning-Mikroskopie schon seit langem bekannt. Er hat jedoch den Nachteil, dass für jeden Farbkanal ein entsprechender Farbteiler mit entsprechendem Detektor nötig ist. Bei der herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskopie, die einen nicht ortsauflösenden Detektor hinter einer konfokalen Lochblende (sogenanntes Pinhole) verwendet, ist diese Anforderung weitgehend unproblematisch; bei der Verwendung eines überabtastenden Flächendetektors gemäß EP 2317362 A1 entsteht jedoch ein erheblicher Aufwand, zumal solche Flächendetektoren teuer sind. Zudem müssten im Überabtastungsprinzip gemäß EP 2317362 A1 diese mehreren Flächendetektoren sub-pixelgenau zueinander justiert werden, da ansonsten ein Farbfehler zwischen den erzeugten Bildern der einzelnen Farbkanäle entstünde, der dadurch herrührt, dass für die hochauflösenden Bilder die Daten der Flächendetektoren auf die Scanposition, welche in Schritten verschoben wird, die klein gegen den Durchmesser des Beleuchtungsflecks sind, verschoben wird. Nur wenn die Flächendetektoren in allen

Farbkanälen zur optischen Achse sub-pixelgenau justiert sind, passen die Bilder der einzelnen Farbkanäle übereinander.

Die WO 2013/135487 A1 widmet sich der Problematik, einfachere Detektoren für die Flächendetektoreinrichtung der Airy-Scan-Mikroskopie verwenden zu können. Dazu wird ein Umverteilungselement, beispielsweise ein Faserbündel vorgesehen, dass das Beugungsbild in der Bildebene aufnimmt und auf einen Detektor umverteilt, dessen geometrische

Pixelanordnung eine völlig andere sein kann.

Die DE 102013019348 A1 verwendet zwei solcher Faserbündel, um eine Farbinformation zu erhalten. Die beiden Faserbündel führen auf einen gemeinsamen Detektor und die ihnen zugeführte Strahlung wird unterschiedlich spektral gefiltert. Hier stellt sich das Problem, dass entweder ein doppelt so großer Detektor nötig ist, was wiederum Bauaufwand und Kosten verursacht, oder auf Kosten der Farbauflösung nur die halbe Ortsauf lösung des

Flächendetektors zur Verfügung steht.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bzw. ein Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass beim Erzeugen der Farbinformation kein zusätzlicher Justieraufwand oder Aufwand für mehrere Detektoren entsteht und dennoch die Ortsauflösung nicht störend gemindert ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren zur hochauflösenden, spektral selektiven Scanning-Mikroskopie einer Probe, wobei die Probe mit

Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung zu einem Beleuchtungsfleck in oder auf der Probe gebündelt wird, wobei der Beleuchtungsfleck in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzt ist und in dieser Raumrichtung eine minimale Ausdehnung hat und insbesondere punkt- oder linienformig ist, vom Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung beugungsbegrenzt in ein in einer Bildebene liegendes Beugungsbild abgebildet und mit einer Ortsauflösung erfasst wird, die eine Struktur eines Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung auflöst, der Beleuchtungsfleck relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als die halbe minimale Ausdehnung des

Ortskanälen aufweist, die die Ortsauflösung festlegen, mit der die Struktur des Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung aufgelöst wird, und wobei die vom Beleuchtungsfleck ausgehende Fluoreszenzstrahlung spektral ausgewertet wird, wobei in genau einem ersten der nebeneinanderliegenden Ortskanäle die Fluoreszenzstrahlung auf ein Spektrometer geleitet und damit spektral ausgewertet wird und in den übrigen zweiten der nebeneinanderliegenden Ortskanäle die Fluoreszenzstrahlung jeweils auf ein nicht spektral auswertendes Detektorelement geleitet wird, das die Fluoreszenzstrahlung nur hinsichtlich der Intensität erfasst.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß weiter gelöst mit einem Mikroskop zur hochauflösenden, spektral-selektiven Scanning-Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die ein im Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die

Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt, der in dieser Raumrichtung eine minimale Ausdehnung hat und insbesondere punkt- oder linienförmig ist, einer

Abbildungseinrichtung zum beugungsbegrenzten Abbilden vom Beleuchtungsfleck in der

Fokalebene ausgehender Fluoreszenzstrahlung durch die Optik in ein Beugungsbild auf eine ortsauflösende Flächendetektoreinrichtung, die in einer zur Fokalebene konjugierten Bildebene liegt, wobei die Flächendetektoreinrichtung mehrere nebeneinanderliegende Ortskanäle aufweist, die eine Ortsauflösung festlegen, mit der die Struktur des Beugungsbildes der vom Beleuchtungsfleck ausgehenden Fluoreszenzstrahlung aufgelöst wird, wobei die Ortsauflösung eine Struktur des Beugungsbildes auflöst, einer Scaneinrichtung zur Verschiebung des Punktes in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als die halbe minimale Ausdehnung des Beleuchtungsflecks, einer Auswerteeinrichtung zum Auslesen der

Flächendetektoreinrichtung, zum Auswerten der Beugungsstruktur des Beugungsbildes aus Einzelbilddaten der Flächendetektoreinrichtung und aus den diesen Einzelbilddaten zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist, wobei genau ein erster der

nebeneinanderliegenden Ortskanäle die Fluoreszenzstrahlung auf ein Spektrometer leitet, das die Fluoreszenzstrahlung spektral auswertet und die übrigen, zweiten der

nebeneinanderliegenden Ortskanäle die Fluoreszenzstrahlung jeweils auf ein nicht spektral auswertendes Detektorelement leiten, das die Fluoreszenzstrahlung nur hinsichtlich der Intensität erfasst.

Die Erfindung erreicht eine im Wesentlichen gleich bleibende Auflösung für die Airy-Scan- Mikroskopie und zugleich eine spektrale Bildinformation, indem einer der Ortskanäle auf ein Spektrometer geleitet wird, d.h. die in ihm geführte Strahlung spektral analysiert wird. Aus dieser spektralen Analyse wird eine Farbangabe bzw. Farbinformation gewonnen, welche die Ortsinformation, die aus den übrigen Ortskanälen aus Airy-Scan-Mikroskopie bekannte Weise gewonnen wird, ergänzt.

Die spektrale Information stammt somit aus einem Ortskanal, dessen Lichtmenge der eines Pinholes entspricht, das so zugezogen ist, dass es nur einen Teil des Airy- Beugungsscheibchens aufnimmt. Das Spektrometer kann damit ein Spektrometer sein, wie es aus der Laserscanningmikroskopie bekannt ist (beispielsweise ein Spektrometer mit frei kombinierbaren digitalen Kanälen).

Der erste Ortskanal, in dem die Fluoreszenzstrahlung spektral analysiert wird, hat die Funktion eines Farbkanals. Die aus diesem Farbkanal gewonnene Farbinformation kann auf

verschiedene Art und Weise mit der Ortsinformation, die aus den übrigen, zweiten Ortskanälen gewonnen wird, kombiniert werden. In einem besonders rechensparenden Vorgehen wird aus den zweiten Ortskanälen ein hochauflösendes Bild der Probe gewonnen. Das ist zu diesem Zeitpunkt ein reines Graustufenbild, da die zweiten Ortskanäle keine Farbinformation liefern. Dieses Graustufenbild kann dann mit Hilfe der Farbinformation aus dem ersten Ortskanal zu einem farbigen Bild ergänzt werden. Dabei wird jedem Punkt des hochauflösenden Bildes die Farbinformation zugewiesen, die für die entsprechende Scanposition aus dem ersten Ortskanal, d.h. dem Farbkanal gewonnen wurde. Auf diese Weise kann unter Beibehaltung bestehender Algorithmen der Erzeugung des Bildes aus den Einzelbildern auf schnelle Art und Weise ein farbiges, hochauflösendes Bild der Probe erhalten werden. Nachteilig ist, dass bei der

Erzeugung des hochauflösenden Bildes aus den Einzelbildern im Algorithmus keine spektrale Information zur Verfügung steht. Der Algorithmus arbeitet damit beispielsweise mit einer Punktbildverwaschungsfunktion, die einer mittleren (quasi einer„grauen")

Punktbildverwaschungsfunktion über den zu erwartenden Spektralbereich der

Fluoreszenzstrahlung entspricht.

Möchte man diesen Nachteil beheben und eine nochmals gesteigerte Ortsauflösung im Bild erzeugen, ist es in einer Alternative zu bevorzugen, der Intensitätsangabe aus den zweiten Ortskanälen für jedes Einzelbild die Farbinformation zuzuweisen, die für das entsprechende Einzelbild aus dem ersten Ortskanal gewonnen wurde. Dann kann der Algorithmus zur

Bildrekonstruktion aus den Einzelbildern diese Farbinformation verwerten, beispielsweise mit der spektral entsprechenden (quasi„farbigen") Punktbildverwaschungsfunktion rechnen. Um den Preis eines höheren Rechenaufwandes erhält man eine genauere, noch hochauflosendere Bildrekonstruktion.

Die Abteilung des ersten Ortskanals von den zweiten Ortskanälen kann in einer besonders einfachen Bauweise dadurch erfolgen, dass ein oder mehrere Lichtleitfasern eines

Faserbündels, das als Umverteilungselement fungiert, auf ein Spektrometer geleitet werden. Die Zahl der Faserbündel, die den ersten Ortskanal bilden, stellt die Lichtmenge ein, die auf das Spektrometer gelangt.

Eine größere Anzahl von Lichtleitfasern erhöht den Flächenanteil des ersten Ortskanals an der Eintrittsfläche, an der das Beugungsbild aufgenommen wird. Damit steigt die im Spektrometer vorhandene Lichtmenge und letztlich die spektrale Auflösung. Die Ortsauflösung kann dadurch jedoch sinken, da weniger Bildpunkte zum Erfassen der Beugungsstruktur zur Verfügung stehen. Diese Beugungsstruktur wird ja mit den zweiten Ortskanälen ermittelt. Weniger Lichtleitfasern reduzieren möglicherweise aufgrund eines herabgesetzten Signal-Rausch- Verhältnisses die spektrale Auflösung oder Trennschärfe und liefern eine höhere Ortsauf lösung des Beugungsbildes. Hierbei ist es auch möglich, mehrere Fasern einzeln spektral (und damit in vergleichsweise weniger Kanäle) aufzutrennen , was den Vorteil bietet, Spektrale gegen Ortsauflösung einzutauschen und besser verrechnen zu können. In einer Kombination kann die Strahlungsintensität aus dem ersten Ortskanal nach Gewinnen der Farbinformation über die Farbkanäle aufaddiert werden, so dass der erste Ortskanal nicht nur als Farbkanal fungiert, sondern auch ein Signal bereitstellt, das dem eines nicht spektral auswertenden, zweiten Ortskanals entspricht. Durch dieses Vorgehen ist die Ortsauflösung bei der Erzeugung des hochauflösenden Bildes nicht oder weniger reduziert.

Um eine besonders unverfälschte Farbinformation zu erhalten, ist es zu bevorzugen, in der Eintrittsfläche der Flächendetektoreinrichtung für den ersten Ortskanal ein Loch vorzusehen, durch das die Fluoreszenzstrahlung fällt und als Freistrahl zum Spektrometer geleitet wird. Spektrale Einflüsse einer Lichtleitfaser entfallen dann. Die übrigen Ortskanäle können entweder durch ein entsprechendes Spiegelsystem oder durch Lichtleitfasern zu den spektral nicht auflösenden Detektorelementen geleitet werden. Darüber hinaus kann die Verrechnung in einem gemeinsamen Gleichungssystem erfolgen, bei dem die Ortskanäle als Summe über verschiedene Farben beitragen und die Farbkanäle nur einen Eintrag in der Farbe haben. Eine andere Ausführungsform ist es, die Ortskanäle zur Verrechnung über die PSF zu entmischen und die Entmischung mit einer variablen PSF so lange zu optimieren, bis die Ergebnisse von der Farbtrennung her mit den Messungen aus den Farbkanälen verträglich sind. In einer weiteren Option liegt in der Eintrittsfläche der Flächendetektoreinrichtung ein DMD- Element, das die Strahlung für den ersten Ortskanal zum Spektrometer spiegelt und die Strahlung für die zweiten Ortskanäle zur Eintrittsseite eines Lichtleitfaserbündels oder zu einem 2D-Detektorarray. Der Begriff „beugungsbegrenzt" soll hier nicht auf die Beugungsgrenze gemäß der Abbe'schen Theorie beschränkt sein, sondern auch Fälle erfassen, in denen auf Grund realer

Unzulänglichkeiten oder Einschränkungen das theoretische Maximum um 20 % verfehlt wird. Auch dann hat das Einzelbild eine Struktur, die hier als Beugungsstruktur bezeichnet wird. Sie wird überabgetastet.

Die Abbildung eines gewünschten Bereichs der Probe erfolgt wie in einem üblichen LSM scannend. Da Beleuchtung und die Abbildung bzw. die entsprechenden Einrichtungen eine gemeinsame optische Scaneinrichtung haben, welche den Beleuchtungsfleck über die Probe führt und zugleich den mit dem Beleuchtungsfleck zusammenfallenden Punkt, an dem die Probe abgebildet wird, in Bezug auf die Detektion wieder descannt, kann man eine Zoomoptik in den gemeinsamen Teil von Beleuchtungs- und Abbildungseinrichtung setzen. Sie erlaubt es, eine Anpassung des Beugungsbildes an die Größe der Eintrittsfläche der

Flächendetektoreinrichtung vorzunehmen und zusätzlich die verfügbare Beleuchtungsstrahlung ohne Randverluste vollständig in die Objektivpupille, welche sich mit Wahl des Objektives ändern kann, einzukoppeln .

Der Beleuchtungsfleck ist in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzt. Anstelle der bereits erwähnten punkt- oder linienförmigen Gestalt kann auch eine Form des Doughnuts oder einer Helix für die Punktbildverwaschungsfunktion (sog. PSF) verwendet werden.

Soweit hier ein Verfahren beschrieben wird, realisiert ein Steuergerät diese Verfahrensschritte im Betrieb des Mikroskops.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen , sondern auch in anderen

Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen :

Fig. 1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanner-Mikroskops zur hochauflösenden Airy- Scan-Mikroskopie,

Fig. 2 eine vergrößerte Darstellung einer Flächendetektoreinrichtung, die im Mikroskop der Fig. 1 zum Einsatz kommt, Fig. 3 und 4 Draufsichten auf ein Lichtleitfaserbündel, das in der Flächendetektoreinrichtung der Fig. 2 verwendet werden kann, Fig. 5 eine Abwandlung des Mikroskops der Fig. 1 , wobei die Abwandlung die

Flächendetektoreinrichtung betrifft, und

Fig. 6 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops ähnlich dem der Fig. 1 , wobei eine abgewandelte Detektoreinrichtung zum Einsatz kommt.

Fig. 1 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1 , das zum Mikroskopieren einer Probe 2 ausgebildet ist. Das Laserscanningmikroskop (nachfolgend als LSM abgekürzt) 1 wird von einem Steuergerät C gesteuert und umfasst einen Beleuchtungsstrahlengang 3 sowie einen Abbildungsstrahlengang 4. Der Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet einen Spot in der Probe 2, und der Abbildungsstrahlengang 4 bildet diesen Spot beugungsbegrenzt zur Detektion ab. Beleuchtungsstrahlengang 3 und Abbildungsstrahlengang 4 teilen sich eine Optik.

Die Beleuchtung der Probe 2 erfolgt im LSM 1 mittels eines bereitgestellten Laserstrahls 5, der über einen nicht weiter funktionell erforderlichen Umlenkspiegel 6 und eine Linse 7 auf einen Spiegel 8 eingekoppelt wird. Der Spiegel 8 sorgt dafür, dass der Laserstrahl 5 unter einem

Reflexionswinkel auf ein Einkoppelelement fällt. Das Einkoppelelement kann zugleich auch als Emissionsfilter ausgebildet sein. Zur übersichtlicheren Darstellung ist für den Laserstrahl 5 lediglich dessen Hauptachse eingezeichnet. Nach Reflexion am Einkoppelelement 9 wird der Laserstrahl 5 von einem Scanner 10 zweiachsig abgelenkt und mittels Linsen 1 1 und 12 durch ein Objektiv 13 als

beugungsbegrenzter Beleuchtungsfleck 14 in eine Fokalebene 29 in der Probe 2 fokussiert. Der Beleuchtungsfleck 14 ist dabei in der Darstellung der Fig. 1 punktförmig; es ist jedoch auch ein linienförmiger Beleuchtungsfleck möglich. Fluoreszenzstrahlung, die am Ort (z. B. Punkt) des Beleuchtungsfleck 14 angeregt wurde, wird aus der Fokalebene 29 über das Objektiv 13, die Linsen 1 1 und 12 wieder zum Scanner 10 geleitet, nach dem in Abbildungsrichtung dann wieder ein ruhender Lichtstrahl vorliegt. Dieser fällt durch das Einkoppelelement 9, welches hier zusätzlich die Funktion hat, die Fluoreszenzstrahlung im Beleuchtungsfleck 14 hinsichtlich ihrer Wellenlänge zu selektieren und der Beleuchtungsstrahlung des Laserstrahls 5, die

beispielsweise als Anregungsstrahlung dienen kann, abzublocken. Eine Linse 16 sorgt dafür, dass insgesamt der Ort des Beleuchtungsflecks 14 in ein beugungsbegrenztes Beugungsbild 17 abgebildet wird, welches in einer Detektionsebene oder Bildebene 18 liegt. Die Bildebene 18 ist eine konjugierte Ebene zur Fokalebene 29, in welcher der Beleuchtungsfleck 14 in der Probe 2 liegt.

Das Beugungsbild 17 des Beleuchtungsflecks 14 wird in der Detektionsebene von einer Flachendetektoreinrichtung 19 aufgenommen, dessen exemplarische Ausführung nachfolgend anhand der Fig. 2 näher erläutert wird. Wesentlich ist hier, dass die Flächendetektoreinrichtung 19 das beugungsbegrenzte Bild 17 des Spots 14 in der Bildebene 18 räumlich auflöst, also eine Überabtastung bewirkt.

Das Steuergerät C steuert alle Komponenten des LSM 1 , insbesondere Scanner 10 und Flächendetektoreinrichtung 19. Das Steuergerät C nimmt für verschiedene Scanstellungen die Daten jedes einzelnen Bildes 17 auf, analysiert dessen Beugungsstruktur und erzeugt ein hochaufgelöstes Gesamtbild der Probe 2.

Das LSM 1 der Fig. 1 ist exemplarisch für einen einzigen und punktförmigen Beleuchtungsfleck 14, der auf der Probe abgetastet wird, dargestellt. Es kann jedoch zugleich auch zur Abtastung gemäß einem Linien-Beleuchtungsfleck verwendet werden, der sich beispielsweise senkrecht zur Zeichnungsebene der Fig. 1 erstreckt. Auch ist es möglich, das LSM 1 der Fig. 1 so auszuführen, dass mehrere nebeneinanderliegende Punkt-Beleuchtungsflecke in der Probe abgetastet werden. Ihre entsprechenden Beugungsbilder 17 liegen dann in der Bildebene 18 ebenfalls nebeneinander. Die Flächendetektoreinrichtung 19 ist dann entsprechend ausgestaltet, um die nebeneinanderliegenden Beugungsbilder 17 in der Detektionsebene zu erfassen.

Die Flächendetektoreinrichtung 19 nimmt in der Bildebene, die somit eine Detektionsebene 18 ist, die Strahlung an mehreren Ortskanälen auf. Einer oder mehrere dieser Ortskanäle führt/führen die Strahlung, wie nachfolgend noch erläutert werden wird, auf ein Spektrometer S.

Ein Ausführungsbeispiel für die Flächendetektoreinrichtung 19 ist vergrößert in Fig. 2 dargestellt. Sie umfasst ein Lichtleitfaserbündel 20, welches ein z.B. lineares Detektorarray 24 speist. Das Lichtleitfaserbündel 20 ist aus Einzellichtfasern 21 aufgebaut. Die Enden der Lichtleitfasern 21 bilden den Lichtleitfaserbündeleingang 22, der in der Detektionsebene 18 liegt. Die einzelnen Lichtleitfasern 21 stellen somit Ortskanäle dar, mit denen das Beugungsbild 17 des Beleuchtungsflecks 14 aufgenommen wird. Sie entsprechen funktionell Pixeln eines in die Detektionsebene 18 gestellten Matrixdetektors.

Da der Beleuchtungsflecks 14 in der Ausführungsform der Fig. 1 exemplarisch ein Punkt-Spot ist, ist das Beugungsbild 17 ein Airy-Scheibchen, dessen Ausdehnung innerhalb des Kreises liegt, welcher in den Fig. 1 und 2 die Bildebene veranschaulicht. Es sei darauf hingewiesen, dass Fig. 1 in dieser Hinsicht eine Vereinfachung enthält. Die Ausdehnung des

Lichtleitfaserbündeleingangs 22 ist realiter so groß, dass damit die Ausdehnung der

Beugungsbild abgedeckt wird.

Einer der Ortskanäle führt die Strahlung jedoch nicht zu dem Detektorarray 24, sondern auf ein Spektrometer S, das die ihm zugeführte Strahlung spektral analysiert, beispielsweise in mehrere digital kombinierbare Spektralkanäle. Dieser Ortskanal hat die Funktion eines

Farbkanals und wurde im allgemeinen Teil der Beschreibung als„erster Ortskanal" bezeichnet. Die restlichen Lichtleitfasern 21 im Lichtleitfaserbündel 20 sind hingegen auf das spektral nicht weiter auflösende Detektorarray 24 geleitet. Sie sind damit reine Ortskanäle und wurden im allgemeinen Teil der Beschreibung als„zweite Ortskanäle" bezeichnet.

In einer Weiterbildung, die in den Figuren gezeigt ist, aber optional ist, sind die Lichtleitfasern der zweiten Ortskanäle im Leichtleitfaserbündel 20 an ihren Ausgängen in eine andere geometrische Anordnung gebracht, als am Lichtleitfaserbündeleingang 22, z.B. in Form eines längserstreckten Steckers 23, in dem die ausgangsseitigen Enden der Lichtleitfasern der zweiten Ortskanäle nebeneinander liegen. Der Stecker 23 ist passend zur geometrischen Anordnung der Detektorzeile, die das Detektorarray 24 bildet, ausgebildet, d. h. jedes ausgangsseitige Ende einer Lichtleitfaser 21 liegt genau vor einem Pixel 25 der Detektorzeile 24.

Es sei darauf hingewiesen, dass die Ausführung der Flächendetektoreinrichtung 19 hinsichtlich der zweiten Ortskanäle gemäß Fig. 2 rein exemplarisch ist.

Die Fig. 3 und 4 zeigen mögliche Ausführungsformen des Lichtleitfaserbündeleingangs 22. Die Lichtleitfasern 21 können am Lichtleitfaserbündeleingang 22 miteinander verschmolzen werden. Hierdurch wird ein höherer Füllfaktor erreicht, d. h. Lücken zwischen den einzelnen

Lichtleitfasern 21 am Lichtleitfaserbündeleingang 22 werden minimiert. Das Verschmelzen führ andererseits zu einem gewissen Übersprechen zwischen benachbarten Lichtleitfasern. Möchte man dieses vermeiden, können die Lichtleitfasern verklebt werden. Auch ist eine quadratische Anordnung der Enden der Lichtleitfasern 21 möglich, wie Fig. 4 zeigt.

Bevorzugt sind die einzelnen Lichtleitfasern 21 so den einzelnen Pixeln 25 des Detektorarrays 24 zugeordnet, dass am Lichtleitfaserbündeleingang 22 nebeneinander liegende Lichtleitfasern 21 auch am Detektorarray 24 nebeneinander liegen. Durch dieses Vorgehen minimiert man Übersprechen zwischen benachbarten Pixeln 25, das beispielsweise durch Streustrahlung oder in der Signalverarbeitung der einzelnen Pixel 25 auftreten kann. Ist das Detektorarray 24 eine Zeile, kann man die entsprechende Anordnung dadurch erreichen, indem die Reihenfolge der Einzellichtleitfasern auf der Detektorzeile durch eine Spirale festgelegt wird, welche in

Draufsicht auf die Detektionsebene 18 die Einzellichtleitfasern nacheinander verbindet.

Fig. 3 zeigt weiter noch optional Blindfasern 26, die in den Ecken der Anordnung der

Lichtleitfasern 21 am Lichtleitfaserbündeleingang 22 liegen. Diese Blindfasern sind nicht auf Pixel 25 des Detektorarrays 24 geführt. An den Orten der Blindfasern wäre keine für die Auswertung der Signale erforderliche Signalintensität mehr vorhanden. Man kann dadurch die Anzahl der Lichtleitfasern 21 und damit die Anzahl der Pixel 25 im Detektorarray 24 so reduzieren, dass beispielsweise mit 32 Pixeln gearbeitet werden kann. Solche Detektorzeilen sind bereits anderweitig in Laser-Scanning-Mikroskopen im Einsatz, was den Vorteil hat, dass die Signalauswerteelektronik in solchen Laser-Scanning-Mikroskopen nur einmal vorgehalten werden muss und zwischen einer bereits bestehenden Detektorzeile 24 und der durch die Flächendetektoreinrichtung 19 hinzugekommenen, weiteren Detektorzeile 24 umgeschaltet wird.

In der Ausführungsform gemäß Fig. 4 werden Lichtleitfasern mit quadratischer Grundform für das Bündel verwendet. Sie haben ebenfalls einen hohen Abdeckungsgrad in der

Detektionsebene 19, sammeln die Strahlung also effizient auf.

Die Fig. 2, 3 und 4 zeigen, dass am Lichtleitfaserbündeleingang 22 auch eine Lichtleitfaser 40 beginnt, die auf das Spektrometer S gelegt ist. Diese in den Figuren schraffiert gezeigte Eintrittsfläche der Lichtleitfaser 40 bildet den Beginn des ersten Ortskanals.

Exemplarisch sind in Fig. 4 vier Lichtleitfasern für den ersten Ortskanal gezeigt, nämlich Lichtleitfasern 40.1 , 40.2, 40.3 und 40.4. Dies soll exemplarisch verdeutlichen, dass zum Spektrometer S auch mehr Lichtleitfasern oder eine Lichtleitfaser größeren Querschnitts führen können, als zu einem einzigen Pixel 25 des Detektorarrays 24.

Fig. 5 zeigt eine Abwandlung des LSM 1 der Fig. 1 hinsichtlich der Flächendetektoreinrichtung 19. Diese Flächendetektoreinrichtung 19 weist einen Facettenspiegel 30 auf, der einzelne Facetten 31 trägt. Die Facetten 31 entsprechen hinsichtlich der Auflösung des Bildes 17 den Enden der Lichtleitfasern 21 am Lichtleitfaserbündeleingang 22. Die einzelnen Facetten 31 unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Neigung zur optischen Achse des Strahlungseinfalls. Zusammen mit einer Linse 32 und einem Minilinsenarray 33 sowie einem nur der Strahlfaltung dienenden Umlenkspiegel 34 bildet jede Facette 31 einen Flächenabschnitt des Einzelbildes 17 auf ein Pixel 25 eines Detektorarrays 24 ab. Je nach Orientierung der Facetten 31 kann das Detektorarray 24 dabei bevorzugt ein 2D-Array sein, aber auch eine Detektorzeile ist möglich.

Der Facettenspiegel 30 ist dabei so gestaltet, dass eine einzelne (oder auch mehrere)

Facette(n) 42 die Strahlung für den ersten Ortskanal in eine andere Richtung leitet, als für die restlichen zweiten Ortskanäle. Die Strahlung des ersten Ortskanals wird dann über eine Linse 41 auf das Spektrometer S, beispielsweise dessen Eingangsspalt geführt. Die übrigen

Ortskanäle werden nicht spektral auswertend erfasst.

Der Facettenspiegel 30 kann in einer Weiterbildung auch als DMD ausgestaltet werden. Dies erlaubt ein Umschalten zwischen Farbauswertung und nicht spektral auswertendem Betrieb, je nachdem ob der Spiegel 42 die Strahlung des ersten Ortskanals zum Spektrometer S oder zum Detektorarray 24 leitet.

In einer abgewandelten Ausgestaltung, die in Fig. 6 gezeigt ist, weist das Lichtleitfaserbündel 20 an seiner Eintrittsseite, d. h. in der Detektionsebene 19 anstelle der Lichtleitfaser 40 ein Loch 41 auf. Die durch dieses Loch 41 fallende Strahlung wird dann in einem Freistrahlengang zum Spektrometer S geleitet. Das Spektrometer S weist in der Ausführungsform der Fig. 6 exemplarisch einen bündelnden Spiegel 42, ein Gitter 43 sowie eine Detektorzeile 44 auf. Der Spiegel 42 leitet die durch das Loch 41 gefallene Strahlung auf das Gitter 43, welches eine spektrale Aufgliederung bewirkt. Die spektral aufgefächerte Strahlung wird dann von der Detektorzeile 44 aufgenommen. Diese Bauweise hat den Vorteil, dass der Flächenanteil zwischen erstem Ortskanal und zweiten Ortskanälen mit geringem Aufwand konstruktiv eingestellt werden kann, indem nämlich die Größe des Lochs 41 , das von den Enden der Lichtleitfasern 21 , welche die zweiten Ortskanäle bilden, umgeben wird, entsprechend gewählt wird. Eine Einstellung während des Betriebs erlaubt eine in Fig. 6 exemplarisch dargestellte, einstellbare Fokussieroptik, mit der die Lage der Detektionsebene 18 passend zum

Lichtleitfaserbündeleingang 22 eingestellt werden kann.

Ebenfalls exemplarisch ist in Fig. 6 gezeigt, dass ein zusätzliches Emissionsfilter 46 im

Detektionsstrahlengang 4 dem Einkoppelelement 9 in Abbildungsrichtung nachgeordnet werden kann. Dieses Emissionsfilter 46 ergänzt oder ersetzt eine emissionsfilternde Wirkung des Einkoppelelementes 9. Das zusätzliche oder alternative Emissionsfilter sowie die einstellbare Fokussierungsoptik sind natürlich auch in den Bauweisen der Fig. 1 und 5 möglich . Die Auswertung der Farbinformation kann in verschiedenen Ausführungsformen des Verfahrens so erfolgen, wie im allgemeinen Teil der Beschreibung erläutert wurde. Hinsichtlich der Erzeugung des hochauflösenden Bildes aus den Einzelbildern wird exemplarisch auf die EP 2317362 A2 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt diesbezüglich vollumfänglich hier einbezogen ist. Folgt man diesem Prinzip und verwendet die im allgemeinen Teil der Beschreibung zweitgenannte Variante, bei der jedem Pixel des Ortskanals eine Farbinformation in jedem Einzelbild zugewiesen wird, für den in der eingangs genannten EP 2317362 A1 beschriebenen Gleichungsansatz folgendes:

Zur genaueren Erläuterung der mathematischen Analyse der Aufstellung des

Gleichungssystems sei zur Einführung zuerst der Fall betrachtet, dass nur eine Farbe auftritt, d.h. das spektralselektive Element 15 fehlt. Bezeichnet man mit 0{x) das Objekt, mit E{x) die Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) der Anregung und mit /7(r) die PSF der Detektion, erhält man als Signal £>(r,p) für jeden Bildpunkt folgende Gleichung, wobei r den Abstand vom Ort p des Beleuchtungsflecks bezeichnet:

Eine Fourier-Transformation von £>(r,p) bezüglich des Ortes p liefert:

D{T, <Q) = <9(_ra) 7\ {E(r')H(r' + r)}

Das Produkt im Realraum wird im Fourier-Raum die folgende Faltung:

(3)

Führt man eine Trägerfunktion am Ort r ein:

£H(r,co) = 7\ {E(r')H(r' + r)}

(4) ergibt sich als Gleichung (2)

(5) Unterschiedliche Orte r am Flächendetektor werden mittels eines Wiener-Filter kombiniert

(6) wobei ^|o(c )|²^ und ^|η(ω)|²^ die entsprechenden spektralen Leistungsdichten des Signals ("O") und des Rauschens (n) sind.

Dies vorausgeschickt erhält man für mehrere Farbkanäle, die jedem Pixel zweiten Ortskanal zugewiesen werden, die durch die PSF vorgegebenen Gewichte wie folgt:

D(r, ro) = £ 0 )EH_c (r, ö>)

(7)

In dieser Gleichung ist c der Farbkanalindex. Schreibt man die Gleichung (7) als Matrix erhält man:

[D(r,_ra)]_r = [O_c(_ra)]_c [EH_c (r, _ra)]_{c r}

(8)

Berücksichtigt man zusätzliches Rauschen nimmt Gleichung (8) folgende Form [ß(r, = [O_c ( o)]_c[EH_c (r, o)]_c + [N(r, o)]_r

(9)

Das Objekt [O_c (to)]_c kann man mittels eines Operators [G_c(r, o)]_{r c} gewinnen, der eine Frequenzfilterung und eine Farbkanalentmischung kombiniert:

(10)

Wie bei der Ableitung des Wiener-Filters muss nun der quadratische Abstand zwischen dem rekonstruierten und dem wirklichen Objekt für jede Frequenz und jeden Farbkanal minimiert werden:

[O )]_c - [/3(r,«)]_r [G , <o)L_c =mm

(1 1 )

Unter Verwendung der Gleichung (9) erhält man damit:

(O_c

(r, o)]_{r c} - [O_c (o)]_c =min

(12)

Unter Anwendung derselben Grundsätze wie bei der Ableitung des Wiener-Filters, die dem Fachmann beispielsweise aus http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution bekannt sind, erhält man:

= [D{r, <a)llEH_c{r, <a)l _r [ll [EH_c{r, <a)l _r +

(13)

Hierin sind [/]_c und [σ² . die spektralen Leistungsdichten des Signals für jeden Farbkanal und das Rauschen:

(14)

Wenn Emissionsspektren von Fluorophoren überlappen, kann es sein, dass in einem Farbkanal Schatten eines Objekts aus dem anderen Farbkanal auftreten. Solche Schattenbilder werden mit derselben Detektions-PSF verzerrt, wie das Hauptbild im eigentlichen Farbkanal. Dadurch ist ein im Kanal c, O_c (<o) detektiertes Bild eine Überlagerung der Bilder o_c ^TRUE (ω)

entsprechend den den unterschiedlichen Farbkanälen zugeordneten Objekten:

(15)

Hier ist [M]_C eine Entmischungsmatrix. Bei beispielsweise zwei Farben erhält man dann: 0₁ (ω) = m_nO™^UE {<o)+ m_l20₂ ^{TR UE} {ω)

0₂ (ω) = >^η ₂₁0Γ^Ε (ω) + m₂₂0₂ ^TRUE (ω)

(16)

Die wahren Bilder 0™^UE (oa) zu gewinnen ist einfach, wenn deren Mischungsmatrix [M ]_C bekannt ist. Ist dies nicht der Fall, kann sie durch Minimierung einer Kreuzkorrelation zwischen den erzeugten Bildern gewonnen werden, d.h. die Matrix ist so zu bestimmen, dass ihre Werte die niedrigste Kreuzkorrelation für die am besten entmischten Objekte sicherstellt.

Falls die im allgemeinen Teil der Beschreibung erstgenannte Variante verwendet wird, bei der zuerst das hochauflösende Bild erzeugt wird und dann den Orten im Bild die entsprechende Farbinformation zugewiesen wird, kann die Aufstellung des Gleichungssystems und die Ermittlung des hochauflösenden Bildes exakt so erfolgen, wie dies in der EP 2317362 A1 beschrieben ist.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur hochauflösenden, spektral selektiven Scanning-Mikroskopie einer Probe (2), wobei

die Probe (2) mit Beleuchtungsstrahlung (5) derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung zu einem Beleuchtungsfleck (14) in oder auf der Probe (2) gebündelt wird, wobei der Beleuchtungsfleck (14) in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzt ist und in dieser Raumrichtung eine minimale Ausdehnung hat und insbesondere punkt- oder linienförmig ist,

vom Beleuchtungsfleck (14) ausgehende Fluoreszenzstrahlung beugungsbegrenzt in ein in einer Bildebene liegendes Beugungsbild (17) abgebildet und mit einer Ortsauflösung erfasst wird, die eine Struktur eines Beugungsbildes (17) der vom Beleuchtungsfleck (14) ausgehenden Fluoreszenzstrahlung auflöst,

der Beleuchtungsfleck (14) relativ zur Probe (2) in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als die halbe minimale Ausdehnung des

Beleuchtungsflecks (14),

für jede Scanpositionen ein Einzelbild der Struktur des Beugungsbildes (17) der vom Beleuchtungsfleck (14) ausgehenden Fluoreszenzstrahlung erzeugt wird und aus den

Einzelbildern ein Bild der Probe (2) erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist,

wobei die vom Beleuchtungsfleck (14) ausgehende Fluoreszenzstrahlung

beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild (17) auf einen Detektor (19) abgebildet wird, der in der Bildebene (19) eine Eintrittsfläche (18) mit mehreren nebeneinanderliegenden Ortskanälen (22) aufweist, die die Ortsauflösung festlegen, mit der die Struktur des Beugungsbildes (17) der vom Beleuchtungsfleck (14) ausgehenden Fluoreszenzstrahlung aufgelöst wird, und

wobei die vom Beleuchtungsfleck (14) ausgehende Fluoreszenzstrahlung spektral ausgewertet wird,

dadurch gekennzeichnet, dass

in genau einem ersten der nebeneinanderliegenden Ortskanäle (40; 40.1 -40.4) die Fluoreszenzstrahlung auf ein Spektrometer (S) geleitet und damit spektral ausgewertet wird und in den übrigen zweiten der nebeneinanderliegenden Ortskanäle die Fluoreszenzstrahlung jeweils auf ein nicht spektral auswertendes Detektorelement (25) geleitet wird, das die

Fluoreszenzstrahlung nur hinsichtlich der Intensität erfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Ortskanäle den ersten Ortskanal (40; 40.1 -40.4) in der Eintrittsfläche (18) umgeben, insbesondere, dass der erste Ortskanal (40; 40.1 -40.4) in der Eintrittsfläche (1 7) zentral liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass aus der spektralen Auswertung Farbangaben ermittelt werden uns gemäß der Lage der Scanpositionen dem Bild der Probe zugewiesen werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass für jedes Einzelbild aus der spektralen Auswertung eine Farbangabe ermittelt wird, den Einzelbildern diese Farbangabe zugeordnet wird und dann aus den derart mit einer Farbangabe versehenen Einzelbildern das Bild der Probe erzeugt wird, wobei beim Erzeugen des Bildes die Farbe der Einzelbilder berücksichtigt wird, insbesondere bei der Wahl einer

Punktbildverwaschungsfunktion.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Ortskanal einen größeren Anteil an der Eintrittsfläche hat als jeder der zweiten Kanäle, und insbesondere von mehreren Lichtleitfasern (21 ) gebildet ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Ortskanal dadurch gebildet ist, dass der Detektor in der Eintrittsfläche ein Loch hat, durch welches die Fluoreszenzstrahlung auf das Spektrometer geleitet wird, wohingegen die zweiten Ortskanäle das Loch umgeben und eine optische Einrichtung aufweisen, welche die

Fluoreszenzstrahlung von der durch das Loch gefallenen Fluoreszenzstrahlung trennt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das der Detektor ein Faserbündel aufweist, dessen Einzelfasern in der Eintrittsfläche beginnen, wobei eine oder mehrere der Einzelfasern den ersten Ortskanal bilden und die Fluoreszenzstrahlung auf das Spektrometer leiten und die übrigen Fasern jeweils auf eines der nicht spektral auswertenden Detektorelemente geführt sind.

8. Mikroskop zur hochauflösenden, spektral-selektiven Scanning-Mikroskopie mit

einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe (2), die zur Abgabe von

Fluoreszenzstrahlung anregbar ist,

- einer Optik (1 1 -13), die ein im Probenraum liegende Fokalebene (29) und eine

Auflösungsgrenze hat,

einer Beleuchtungseinrichtung (3), die einen Eingang (6) zum Zuführen von

Beleuchtungsstrahlung (5) aufweist und die über die Optik (1 1 -13) den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung (5) derart beleuchtet, dass die Optik (1 1 -13) die Beleuchtungsstrahlung (5) an einem Punkt in der Fokalebene (29) zu einem in mindestens einer Raumrichtung beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck (14) bündelt, der in dieser Raumrichtung eine minimale Ausdehnung hat,

- einer Abbildungseinrichtung ( ,4) zum beugungsbegrenzten Abbilden vom

Beleuchtungsfleck in der Fokalebene (29) ausgehender Fluoreszenzstrahlung durch die Optik (1 1 -13) in ein Beugungsbild (30-33) auf einem ortsauflösenden Flächendetektor (19), der in einer zur Fokalebene (29) konjugierten Bildebene (18) liegt, wobei der Flächendetektor (19) mehreren nebeneinanderliegenden Ortskanälen (22) aufweist, die eine Ortsauflösung festlegen, mit der die Struktur des Beugungsbildes (17) der vom Beleuchtungsfleck (14) ausgehenden Fluoreszenzstrahlung aufgelöst wird, wobei die Ortsauflösung eine Struktur des

Beugungsbildes (30-33) auflöst,

einer Scaneinrichtung (10) zur Verschiebung des Punktes in verschiedene

Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als die halbe minimale Ausdehnung des Beleuchtungsflecks (14),

einer Auswerteeinrichtung (C) zum Auslesen des Flächendetektors (19), zum Auswerten der Beugungsstruktur des Beugungsbildes (30-33) aus Einzelbilddaten des Flächendetektors (19) und aus den diesen Einzelbilddaten zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe (2), das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist,

dadurch gekennzeichnet, dass

genau ein erster der nebeneinanderliegenden Ortskanäle (40; 40.1 -40.4) die

Fluoreszenzstrahlung auf ein Spektrometer (S) leitet, das die Fluoreszenzstrahlung spektral auswertet und

- die übrigen, zweiten der nebeneinanderliegenden Ortskanäle die Fluoreszenzstrahlung jeweils auf ein nicht spektral auswertendes Detektorelement (25) leiten, das die

Fluoreszenzstrahlung nur hinsichtlich der Intensität erfasst.

9. Mikroskop nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Ortskanäle den ersten Ortskanal (40; 40.1 -40.4) in der Eintrittsfläche (18) umgeben, insbesondere, dass der erste Ortskanal (40; 40.1 -40.4) in der Eintrittsfläche (17) zentral liegt.

10. Mikroskop nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Ortskanal dadurch gebildet ist, dass der Detektor in der Eintrittsfläche ein Loch hat, durch welches die Fluoreszenzstrahlung auf das Spektrometer geleitet wird, wohingegen die zweiten Ortskanäle das Loch umgeben und eine optische Einrichtung aufweisen, welche die Fluoreszenzstrahlung von der durch das Loch gefallenen Fluoreszenzstrahlung trennt.

11 . Mikroskop nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das der Detektor ein Faserbündel aufweist, dessen Einzelfasern in der Eintrittsfläche beginnen, wobei eine oder mehrere der Einzelfasern den ersten Ortskanal bilden und die Fluoreszenzstrahlung auf das Spektrometer leiten und die übrigen Fasern jeweils auf eines der nicht spektral auswertenden Detektorelemente geführt sind.