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Die Erfindung bezieht sich auf Massenspektrometer mit Ionisierung der Proben durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), wobei sich die Proben auf einer beweglichen Trägerplatte befinden und dort von einem Pulslaser bestrahlt werden.
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Die Erfindung sieht die Verwendung einer schnellen Positionssteuerung von Laserspots über ein System drehbarer Spiegel zur Unterstützung des Trägerplatten-Bewegungsantriebs vor, der bei schneller Analysenfolge einer schnellen Bewegung von Probe zu Probe prinzipiell nicht mehr folgen kann. Wird die Spotposition durch das Spiegelsystem fein justiert und wenigstens phasenweise mit der Bewegung der Probenträgerplatte geführt, so kann die stoßweise Bewegung des Probenträgers durch eine kontinuierliche Bewegung, bevorzugt mit gleichmäßiger Geschwindigkeit, ersetzt werden. Des Weiteren erlaubt die schnelle Positionssteuerung eine gleichmäßigere Abtragung einer Probenfläche für eine bessere Ausnutzung der Analytmoleküle in dieser Fläche. Es werden bevorzugt Galvospiegel geringen Trägheitsmoments zwischen der Strahlerzeugung und einem Kepler-Teleskop im Gehäuse des Lasers eingesetzt. Die Positionssteuerung kann auch für eine vollautomatische Justierung von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern eingesetzt werden, jedenfalls, soweit die ionenoptischen Elemente wie Reflektor und Detektor mit Bewegungseinrichtungen versehen sind.
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Stand der Technik
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In Flugzeitmassenspektrometern mit einer Ionisierung der Proben durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) wird der Laserstrahl in der Regel durch fest justierte Linsen und Spiegel so auf eine Probe auf einem Probenträger fokussiert, dass ein Bestrahlungsspot mit gewünschtem Durchmesser und gewünschter Energiedichte an einem für eine hohe Empfindlichkeit optimal festgelegten Ort im Beschleunigungssystem der Ionenquelle erzeugt wird. Die Probe enthält eine dünne Schicht von Kriställchen der Matrixsubstanz, in die eine geringe Menge an Analytmolekülen eingebaut ist. Durch einen Lichtpuls des Lasers, üblicherweise eines UV-Lasers, wird eine Plasmawolke des Probenmaterials generiert, in der Ionen der Matrix- und Analytmoleküle erzeugt werden. In moderneren Ausführungen von MALDI-Lasern (siehe
DE 10 2004 044 196 A1 ; A. Haase et al., 2004, entsprechend
GB 2 421 352 B ;
US 7,235,781 B2 ) wird nicht nur ein einziger Bestrahlungsspot erzeugt, sondern gleichzeitig ein Muster aus mehreren Bestrahlungsspots, wodurch sich Spotdurchmesser und Energiedichte so optimieren lassen, dass eine hundertfach höhere Ausbeute an Analytionen erzielt wird. Das Muster kann beispielsweise 4, 9 oder 16 Bestrahlungsspots in quadratischer Anordnung, aber auch 7 oder 19 Spots in hexagonaler Anordnung enthalten. Durch den sparsameren Verbrauch des Probenmaterials lässt sich der Nutzungsgrad der Proben erhöhen.
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Eine Spannung, die an Blenden in der Ionenquelle angelegt wird, beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen in der Ionenquelle auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt. Leichtere Ionen erreichen den Ionendetektor früher als schwerere. Am Ionendetektor werden die Ionenströme mit zwei bis acht Messungen pro Nanosekunde vermessen und digitalisiert. Aus den Messwerten werden die Flugzeiten der Ionen ermittelt und aus den Flugzeiten die Massen der Ionen. Wie dem Fachmann bekannt, lassen sich für eine Erhöhung des Auflösungsvermögens geschwindigkeitsfokussierende Reflektoren einsetzen. Insbesondere kann zusätzlich eine verzögert einsetzende Beschleunigung der Ionen (DE = delayed extraction) Ionen einer Masse trotz ihrer anfänglich breiten Verteilung der Anfangsenergien durch die sich ausdehnende Plasmawolke wieder gut fokussieren. Es entspricht dem Stand der Technik, mindestens 50 bis 1000 Einzelflugzeitspektren einer Probe zu einem Summenflugzeitspektrum zu addieren und daraus das Massenspektrum der Probe zu gewinnen. Es werden heute mit guten Flugzeitmassenspektrometern Massenauflösungen von R = m/Δm > 50000 erreicht, in einem weiten Massenbereich von 1000 u < m/z < 4000 u. Die Massengenauigkeiten erreichen heute Werte in der Größenordnung von einem Millionstel der Masse (1 ppm).
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Im Dokument
DE 101 12 386 B4 (A. Holle und J. Franzen 2001; entsprechend
GB 2 376 794 B oder
US 6 734 421 B2 ) wird für die synchrone Aufnahme mehrerer Massenspektren von mehreren Probenstellen auf einem Probenträger nebst anderen Lösungen auch vorgeschlagen, eine schnelle Strahlablenkung für die Position eines Laserspots auf der Probenträgerplatte einzuführen, ohne jedoch eine realisierbare Ausführungsform darzustellen. Es wird lediglich vorgeschlagen, dass die Strahlablenkung mit beweglichen Spiegeln arbeiten könne; ausdrücklich werden piezo-gesteuerte Spiegel genannt. Der Probenträger sollte während des Abtasten mehrerer Proben unbewegt bleiben; die Ionen der verschiedenen Probenstellen sollten auf verschiedene Detektoren gelenkt werden. So sollten Massenspektren von mehreren Proben zeitlich überlappend gemessen werden können. Auch im Dokument
US 2004/0183009 A1 (J. P. Reilly et al.) werden Spiegel zur Positionssteuerung eingesetzt; hier werden sie zur Abtastung von inhomogen präparierten Proben verwendet, um Stellen höherer Ionenausbeute zu finden („sweet spots”). Kommerziell erhältliche Flugzeitmassenspektrometer mit Positionssteuerungen für Laserspots sind bisher nicht entwickelt worden.
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Im Laufe der Jahre hat sich die Lasertechnik für MALDI-Flugzeitmassenspektrometer außerordentlich verbessert. Es wurde nicht nur die Aufteilung in mehrere Laserspots eingeführt und unter dem Namen „Smartbeam” weithin verbreitet, es wurde auch die Laserschussfrequenz von anfänglich 20 Schüssen pro Sekunde mit UV-Stickstofflasern auf heute 1000 bis 5000 Schüsse pro Sekunde mit UV-Festkörperlasern immer weiter erhöht. Gegenwärtig wird eine Schussfrequenz von 10 kHz angestrebt, wodurch aber für die Aufnahme eines Flugzeitspektrums, aber auch für Positionsänderungen des Laserspots nur noch 100 Mikrosekunden zur Verfügung stehen. Bei fünf Messungen des Ionenstroms am Detektor pro Nanosekunde besteht dann ein Einzelflugzeitspektrum aus 500000 Messwerten. Wie schon erwähnt, werden an einer Probe mindestens 50 bis 1000 Einzelflugzeitspektren akquiriert, die Messwert für Messwert zu einem Summenflugzeitspektrum addiert werden. Daraus wird dann das Massenspektrum der Probe gewonnen.
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Eine besondere Anwendung findet diese Technik mit hohen Laserschussraten in der „bildgebenden Massenspektrometrie” („imaging mass spectrometry”) von Gewebedünnschnitten, mit der von einem Dünnschnitt viele Zehn- bis Hunderttausende von Massenspektren aufgenommen werden. Wie ein originales Farbbild in jedem Bildpunkt ein volles Farbspektrum enthält, so enthält ein massenspektrometrisches Bild in jedem Bildpunkt ein volles Massenspektrum. Dabei werden heute Abstände der Bildpunkte zwischen 50 bis herunter zu 20 Mikrometern verwendet, in Zukunft werden Abstände von 10 oder sogar 5 Mikrometer angestrebt. Von einem Quadratzentimeter Gewebedünnschnitt werden bei 50 Mikrometer Auflösung 40000 Massenspektren gewonnen, bei 10 Mikrometer Auflösung bereits eine Million Massenspektren. Auch hier werden im Allgemeinen für das Massenspektrum eines Bildpunkts die Einzelflugzeitspektren von 50 bis 1000 Laserschüssen zu einem Summenflugzeitspektrum addiert, woraus dann das Massenspektrum des Bildpunkts gewonnen wird. Je höher die Anzahl der jeweils addierten Einzelflugzeitspektren ist, umso besser werden Nachweisgrenze und Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Es können jedoch nicht immer beliebig viele Einzelflugzeitspektren aufgenommen und addiert werden, da sich die Probe meist rasch erschöpft.
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In heutiger Technik werden diese Massenspektren mit feststehender Position des Laserspots oder Laserspotmusters in Bezug auf die Achse der Ionenquelle aufgenommen. Die räumliche Auflösung wird allein durch die Bewegung der Probenträgerplatte hergestellt. Wegen der erforderlichen Ebenheit der Oberfläche sind die Probenträger recht massiv und zusammen mit der Halterung recht schwer. Die pulsweise Bewegung der Probenträgerplatte von Probenstelle zu Probenstelle ergibt somit eine außerordentlich hohe Belastung für die Bewegungseinrichtung, die im Allgemeinen aus Schrittmotor und Gewindestange besteht. Es werden heute bereits bis zu 10 Probenstellen pro Sekunde angefahren, bei künftigen 10-kHz-Lasern werden es bis zu 200 Probenstellen pro Sekunde und mehr sein müssen, eine Bewegung, die mechanisch nicht mehr erreicht werden kann. Als Ausweg wird heute schon versucht, für die bildgebende Massenspektrometrie bei feststehender Laserspotposition mit kontinuierlicher Bewegung der Probenträgerplatte zu arbeiten. Dabei muss ein Kompromiss aus Vortriebsgeschwindigkeit und Laserschussfrequenz gebildet werden, um einigermaßen brauchbare Signalqualität zu erhalten, außerdem wird die Ausnutzung der Probe stark begrenzt. Diese Betriebsweise ist für die bildgebende Massenspektrometrie nicht befriedigend [siehe J. M. Spraggins und R. M. Caprioli, J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2011) 22: 1022–1031].
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Darüber hinaus ist heute auch die gleichmäßige Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Fläche einer Probenstelle und damit die Ausnutzung der verfügbaren Analytmoleküle für die Aufnahme der Einzelflugzeitspektren wenig zufriedenstellend. So wird beispielsweise bei heutigen Präparationen von Gewebedünnschnitten für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) eine Schicht winziger Kriställchen aus Matrixmaterial auf den Dünnschnitt aufgebracht, wobei die löslichen Peptide und Proteine aus dem Dünnschnitt in die oberste Schicht der Kriställchen transportiert werden. Wird das Spotmuster nicht bewegt, so sind nach drei bis fünf Laserschüssen die Analytmoleküle unter den Laserspots verbraucht. Das Spotmuster wird daher heute taumelnd rotiert, um immer wieder andere, noch unverbrauchte Stellen abzutragen. Es ist jedoch bis heute nur durch Bewegungen der Probenträgerplatte möglich, eine wirklich gleichmäßige Abtragung einer vorgegebenen Probenfläche zu erzielen. Die notwendig hohe Frequenz dieser Bewegungen ist aber heute mit der Bewegungseinrichtung für die Probenträgerplatte nicht zu erreichen.
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Die amerikanische Patentanmeldung US 2005/0236564 A1 offenbart ein optisches System, in dem ein optisches Element zur Aufweitung eines Laserstrahls vor einem Spiegelsystem angeordnet ist. Das optische System kann neben einer optischen Ablenkeinheit und einem Fokussierungselement weitere optische Elemente enthalten.
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Die deutsche Patentanmeldung
DE 10 2005 044 307 A1 offenbart ein Verfahren für die Erzeugung von Analyt-Ionen aus Analytmolekülen für eine Analyse in einem Spektrometer, wobei sich die Analytmoleküle in Proben auf einem festen Probenträger befinden und in einem Umgebungsgas bei einem Druck zwischen 10 und 1000 Pascal desorbiert werden, wobei in einer Reaktant-Ionenquelle Reaktant-Ionen erzeugt, diese durch ein Ionenleitsystem der Desorptionsstelle zugeführt, und die desorbierten Analytmoleküle durch die Reaktant-Ionen ionisiert werden.
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Die deutsche Patentanmeldung
DE 10 2004 061 820 A1 offenbart ein Lasersystem als Ersatz für einen Stickstofflaser in einem UV MALDI-Massenspektrometer, bei dem ein Festkörper oder ein Halbleiter als Lasermedium des Lasersystems eingesetzt wird und das Lasersystem gepulste Laserstrahlung im Wellenlängenbereich zwischen 332 und 342 Nanometern emittiert.
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Die amerikanische Patentanmeldung US 2005/0056776 A1 offenbart eine Laserdesorptions-Ionenquelle.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist die Aufgabenstellung für die Erfindung, sowohl für die Analyse von Proben in hoher räumlicher Dichte, wie beispielsweise in der bildgebenden Massenspektrometrie, wie auch für die gleichmäßige Abtragung der Proben auf vorgegebenen Flächen die Einrichtung zur Bewegung des Probenträgers von schnellen stoßweisen Bewegungen zu entlasten.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung sieht im Grundsatz zur Entlastung des Trägerplatten-Bewegungsantriebs die Verwendung eines Lasersystems mit einer schnellen Positionssteuerung des Laserspots auf der Probenträgerplatte vor. Für die Erzeugung sehr feiner Laserspots von wenigen Mikrometern Durchmesser ergibt sich allerdings ein Problem: Einerseits muss das Objektiv zur Erzeugung der Laserspots zur Vermeidung von Bedampfungen mit Probenmaterial recht weit von der Probenträgerplatte entfernt angebracht sein, daher muss nach den Gesetzen der Optik ein Objektiv großer Öffnung und längerer Brennweite in Verbindung mit einem aufgeweiteten Laserstrahl eingesetzt werden, um einen genügend kleinen Laserspot auf der Probenträgerplatte in der Ionenquelle des Massenspektrometers erzeugen zu können. Andererseits müssen für schnelle Positionsänderungen im Zeitrahmen von etwa 100 Mikrosekunden sehr kleine Spiegel mit geringem Trägheitsmoment eingesetzt werden; diese müssen daher vor der notwendigen Aufweitung des Laserstrahls eingesetzt werden. Dieses Problem lässt sich dadurch lösen, dass ein Spiegelsystem, beispielsweise mit kleinen Galvospiegeln, das gebrauchsfertig im Handel zu beziehen ist und eine Ablenkung in zwei Richtungen erlaubt, im Inneren des Lasersystems vor einem eigens berechneten Keplerschen Teleskop zur Aufweitung des Laserstrahls verwendet wird, und zwar so, dass sich die Winkelablenkung des dünnen Laserstrahls durch das Teleskop und das Objektiv hindurch in eine Änderung der Spotposition umsetzt. Das Lasersystem enthält also neben der eigentlichen Einrichtung zur Laserstrahlerzeugung aus dem Laserkristall und gegebenenfalls einer Einrichtung zur Vervielfachung der Frequenz des Laserlichts das erwähnte Spiegelsystem, ferner das Spezialteleskop zur Strahlaufweitung und das weit geöffnete Objektiv zur Fokussierung des aufgeweiteten Strahls zum Laserspot. Außerdem kann das Lasersystem einen Mustergenerator zur Erzeugung eines Spotmusters aus beispielsweise 4, 7, 9, 16 oder 19 einzelnen Laserspots enthalten. Wird UV-Licht für die Ionisierung verwendet, so müssen bevorzugt alle Linsen des Teleskops und des Objektivs und auch der Mustergenerator aus reinem Quarzglas gefertigt sein.
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Die schnelle Positionssteuerung erlaubt eine optimale Ausnutzung aller Analytmoleküle aus einer vorgegebenen Fläche einer Probe (der „Probenstelle”) durch gleichmäßiges Abtragen der Probe innerhalb dieser Fläche mit einem einzelnen Laserspot oder bevorzugt mit einem Laserspotmuster, ohne dass dabei das Bewegungsmuster für das Abtragen durch Bewegungen der Probenträgerplatte erzeugt werden müsste.
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Für die Aufnahme von Massenspektren vieler Probenstellen nacheinander erlaubt es die Positionssteuerung für den Laserspot, den Probenträger kontinuierlich, bevorzugt mit gleich bleibender Geschwindigkeit in einer Richtung, zu bewegen und die Spotposition durch Bewegung des Laserstrahls so mitzuführen, dass die Einzelflugzeitspektren für jedes Massenspektrum von jeweils derselben Probenstelle gewonnen werden. In dieser Phase haben also die Relativbewegungen zwischen Probenträgerplatte und Laserspot den Wert null. Dabei können dieser Mitführungsbewegung auch noch die feineren Laserspotbewegungen für ein gleichmäßiges Abtragen einer vorgegebenen Probenstellenfläche überlagert werden. Für die bildgebende Massenspektrometrie bleibt dann die räumliche Auflösung für die einzelnen Massenspektren erhalten und es wird gleichzeitig ein hoher Nutzgrad für die Analytmoleküle erreicht. Für die jeweils nächste Aufnahme eines Massenspektrums an einer anderen Probenstelle wird die Spotposition durch sprunghafte Bewegung des Spiegels innerhalb der Zeitdauer von nur 100 Mikrosekunden bis zum nächsten Laserschuss zu dieser anderen Probenstelle gesteuert. In dieser Phase sind die Relativbewegungen zwischen Probenträgerplatte und Laserspot stark verschieden. Für diese Betriebsweise ist es allerdings erforderlich, ionenoptische Korrekturen des sich ändernden Strahlenganges der Ionen durch das Massenspektrometer und Korrekturen der veränderten Flugzeit vorzunehmen. Die Probenstellen brauchen sich auf der Probenträgerplatte nicht in eindimensionaler Reihung zu befinden, es können auch durch laterale Bewegungen des Laserspots nebeneinander liegende Probenstellen analysiert werden. Es ist so ein mehrspuriges Analysieren von Proben während einer gleichmäßigen Bewegung der Probenträgerplatte in einer Richtung möglich.
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Diese Aufnahmeverfahren für Massenspektren können insbesondere bei der bildgebenden Massenspektrometrie von Gewebedünnschnitten, bei der Analyse dünnschichtchromatographischer Platten, aber auch bei anderen analytischen Aufgaben mit hoher Dichte an Proben eingesetzt werden.
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In verschiedenen Ausführungsformen kann der Laserspot ein Intensitätsmuster enthalten. Die Relativbewegung wird dann vorzugsweise zwischen einem Schwerpunkt des Intensitätsmusters auf dem Probenträger und dem Probenträger erzeugt. Bei diesem Schwerpunkt kann es sich zum Beispiel um einen geometrischen Schwerpunkt oder auch einen Intensitätsschwerpunkt handeln. Auch in diesen Ausführungsformen können klein-skalige Relativbewegungen des Intensitätsmusters zum Probenträger ausgeführt werden, um den Probenabtrag möglichst gleichmäßig über eine Laserspotgesamtfläche zu verteilen.
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Die schnelle Positionssteuerung für die Laserspots kann auch zur Lösung weitere Probleme eingesetzt werden. So ist es beispielsweise möglich, mit besonderen Proben, die über genügend lange Zeiten hinweg Spektren in gleich bleibender Intensität liefern, eine vollautomatische Justierung von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern vorzunehmen, gesteuert durch Programme im angeschlossenen Rechner. Dabei können nicht nur die beste Spotposition in Bezug auf die Ionenoptik des Spektrometers und alle notwendigen Korrekturspannungen für die Ionen aus Spots außerhalb dieser optimalen Stelle automatisch ermittelt werden, sondern es können auch die Elemente der Ionenoptik selbst optimal justiert werden, jedenfalls, soweit diese ionenoptischen Elemente wie beispielsweise Reflektor und Detektor zumindest für die Zeit einer Justierung mit Bewegungseinrichtungen versehen sind.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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zeigt schematisch ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit einem Flugzeitanalysator (1) und einem Lasersystem (2), das durch ein Spiegelsystem (7, 8) eine Steuerung der Laserspotposition des Lichtpulses auf der Probenträgerplatte (13) bewirkt. Der Laserpuls wird in der Strahlerzeugungseinheit (3) generiert, die einem Laserkristall (4) und erforderlichenfalls eine Vorrichtung (5) für eine Vervielfachung der Frequenz enthält, im Mustergenerator (6) in ein Spotmuster zerlegt, und im Spiegelsystem durch zwei Galvospiegel (7) und (8) in beiden Raumrichtungen abgelenkt. Der abgelenkte Laserstrahl wird dann in einem Keplerschen Teleskop (9) aufgeweitet und gemäß der Winkelablenkung parallel verschoben, der austretende Laserstrahl wird mit verkleinerter Winkelablenkung über den Spiegel (10) wieder genau zentral in das Objektiv (11) gerichtet. Das Objektiv (11) wird je nach Winkelablenkung zentral, aber unter leicht verschiedenen Winkeln durchstrahlt, wodurch sich die Positionsverschiebung des Spotmusters auf der Probenträgerplatte (13) ergibt. Die in den Plasmawolken des Laserspotmusters generierten Ionen werden durch Spannungen an den Blenden (14) und (15) zu einem Ionenstrahl (18) beschleunigt, der die beiden Ablenkkondensatoren zur Bahnkorrektur passiert und im Reflektor (19) auf den Detektor (20) fokussiert wird. Es sei hier angemerkt, dass die Strahlführung innerhalb eines Teleskops (9) nach Kepler komplizierter ist und aus Vereinfachungsgründen von der Abbildung nicht real wiedergegeben wird, die Abbildung gibt aber die Außenwirkung des Teleskops auf den Laserlichtstrahl richtig wieder.
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stellt verschiedene Laserspotmuster mit 1, 4, 7 und 9 einzelnen Laserspots dar. Die Abstände zwischen den Spots sind hier gerade so groß gewählt wie der Spotdurchmesser, es können jedoch auch Muster mit anderen Abständen und Spotdurchmessern hergestellt werden.
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In wird gezeigt, wie sich von einer quadratischen Probenfläche mit 50 Mikrometer Seitenlänge durch ein Laserspotmuster mit neun Laserspots eine erste Abtragungsschicht durch insgesamt 32 Laserschüsse gleichmäßig abtragen lässt, wenn die einzelnen Laserspots des Musters vier Mikrometer Durchmesser und Mittelpunktsabstände von acht Mikrometern haben. Je nach Art der Probenpräparation können Analytionen aus Tiefen von drei bis zehn solcher Abtragungsschichten geliefert werden. Bei dreimaligem Abrastern werden aus der Fläche 96 Einzelflugzeitspektren gewonnen, die addiert und zu einem Massenspektrum umgewandelt werden können. Aus einem Quadratzentimeter Probenfläche werden dann 40000 Massenspektren aufgenommen, die bei 10 kHz Laserschussrate aus etwa 4 Millionen Einzelflugzeitspektren in nur sieben Minuten gewonnen werden.
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zeigt das Schema, mit dem bei einer gleichmäßig bewegten Probenträgerplatte (13) eine Mitführung des Laserspots erfolgt. Zunächst werden von der Probenstelle (c) genügend Einzelflugzeitspektren für die Erzeugung eines Massenspektrums aufgenommen, wonach der Laserspot auf die Probenstelle (b) gelenkt und mit dieser Probenstelle mitgeführt wird, bis auch von dieser Probenstelle genügend Einzelflugzeitspektren erhalten wurden. Dieser Vorgang wird mit weiteren Probenstellen fortgesetzt.
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zeigt, dass bei gleichmäßig und langsam in Richtung (23) bewegter Probenträgerplatte (13) mit einer größeren Probenfläche (22) in einem Bewegungsdurchgang für die Probenträgerplatte auch Probenstellen in mehreren Spuren (25) nebeneinander analysiert werden können, wobei die Positionssteuerung für den Laserspot dem Bewegungsmuster (24) folgt, mit jeweils einem Halt auf jeder Probenstelle, hier durch Punkte symbolisiert.
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Beste Ausführungsformen
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Wie oben bereits ausgeführt, hat die Erfindung zum Ziel, stoßweise Bewegungen oder auch schnelle Hin- und Herbewegungen der mechanisch trägen Probenträgerplatte einschließlich ihrer Halterung soweit möglich zu vermeiden und durch eine massearme Bewegungsvorrichtung für den Laserlichtstrahl zu ersetzen. Die Bewegungsvorrichtung soll in der Lage sein, den Laserspot in der Zeit von nur 100 Mikrosekunden, also zwischen zwei Laserschüssen, auf eine andere Stelle zu versetzen. Für die schnelle Positionssteuerung des Laserspots oder Laserspotmusters können im Prinzip verschiedenartige Ablenksysteme eingesetzt werden, wie beispielsweise piezoelektrisch bewegte Spiegel oder Kristalle mit elektrisch veränderbarer Refraktion. Technisch am weitesten ausgereift und preislich besonders günstig sind allerdings elektrisch bewegte Galvospiegel, wie sie für Laserscanner oder für Laserbeschriftungsapparate entwickelt wurden. Im technischen Grenzfall können kleine Galvospiegel mit etwa 4 Millimeter Durchmesser innerhalb von 100 Mikrosekunden von einer Winkelposition in eine andere bewegt werden, sofern die Winkeländerungen nur klein sind: es ist damit in idealer Weise möglich, den Laserspot zwischen zwei Schüssen eines 10-kHz-Lasers geeignet zu verschieben. Es gibt kommerzielle Einheiten mit jeweils zwei dieser Galvospiegel für Ablenkungen in beiden Raumrichtungen quer zum Strahl. Diese Galvospiegel haben darüber hinaus den Vorteil, in der angefahrenen Winkelposition stromlos zu verharren, wobei sie aber durch einen Winkelpositionsgeber rückgekoppelt gesteuert dort festgehalten werden.
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Das Einbringen dieser Galvospiegel in den Strahlengang zwischen Laser und Probenträgerplatte bietet allerdings ein Problem und erfordert eine technische Lösung mit einigem Aufwand. Es ist nicht möglich, die zur Erzielung eines geringen Trägheitsmoments notwendigerweise kleinen Spiegel in räumlicher Nähe zur Probenträgerplatte anzuordnen, da hier ein Laserstrahl nach den Gesetzen der Optik einen großen Durchmesser haben muss, um mit einem relativ weit entfernten Objektiv einen kleinen Laserspot erzeugen zu können. Eine Position im verjüngten Laserstrahl dicht vor der Probenträgerplatte ist ungünstig, weil die Spiegel rasch mit verdampfendem oder verspritzendem Probenmaterial bedeckt werden würden. Das Problem wird dadurch gelöst, dass die Galvospiegel (7, 8) stattdessen, wie in schematisch dargestellt, in der Lasereinheit (2) selbst vor jeder Aufweitung des Laserstrahls und weit weg von der Probenträgerplatte (13) angeordnet werden, aber so, dass sie trotzdem eine Veränderung der Position des Laserspots auf der Probenträgerplatte (13) bewirken. Das geschieht dadurch, dass zunächst mit der Strahlerzeugungseinheit (3), beispielsweise mit einem Nd-YAG-Laserkristall (4) und einem Frequenzverdreifacher (5) auf 355 Nanometer (in diesem Beispiel also im ultravioletten Spektralbereich), ein gepulster Laserlichtstrahl von nur 2 Millimeter Durchmesser erzeugt wird. Eine von den Galvospiegeln (7) und (8) bewirkte Winkelablenkung dieses dünnen Laserlichtstrahls wird dann in einem eigens berechneten und hergestellten Keplerschen Teleskop (9) in einen Parallelversatz des Laserlichtstrahls innerhalb des Teleskops (9) umgesetzt, wobei der Parallelversatz beim Verlassen des Teleskops (9) wieder in einen (schwächeren) Winkelversatz transformiert wird. Das Teleskop (9) weitet gleichzeitig den Laserstrahl von 2 auf etwa 16 Millimeter auf. Für die Erzeugung eines kleinen Laserspots von nur 4 bis 5 Mikrometer Durchmesser auf der Probenträgerplatte (13) ist es notwendig, den aufgeweiteten Laserstrahl mit einem gut gegen sphärische Aberration und andere Bildfehler wie Astigmatismus und Koma korrigiertes Objektiv (11) mit hohem Öffnungsdurchmesser auf die Probenträgerplatte zu fokussieren. Die Winkelablenkung des Laserlichtstrahls beim Verlassen des Teleskops (9) in Verbindung mit dem Versatz des Strahls richtet den Laserlichtstrahl bei richtiger Justierung wieder genau zentral auf die Mitte des Objektivs (11), wobei aber nun das Objektiv (11) unter einem kleinen Winkel durchstrahlt wird, der sich in eine Verschiebung des Laserspots auf der Probenträgerplatte (13) umsetzt. Die mittige Durchstrahlung des Objektivs (11) ist wichtig für eine Erzeugung eines sauberen Laserspots kleinen Durchmessers, da nur so die Fehlerkorrekturen des Objektivs (11) voll zur Wirkung kommen. Es sei hier angemerkt, dass die Strahlführung innerhalb des Keplerschen Teleskops (9) kompliziert ist und von der nicht konkret wiedergegeben wird, die gibt aber die Außenwirkung des Teleskops (9) auf den Laserlichtstrahl richtig wieder.
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Wenn es sich um UV-Strahlung handelt, sind alle Linsen des Teleskops (9) und des Objektivs (11) wegen der hohen Energiedichte vorzugsweise aus sehr sauberem, UV-durchlässigem Material wie beispielsweise Quarzglas zu fertigen. Bewährt haben sich für einen Laserstrahl von primär 2 mm Durchmesser Galvospiegel (7) und (8) mit 4,5 mm Durchmesser, die für kleinere Winkelablenkungen bis zu etwa 5 Millirad die Bedingung einer Winkeländerung in nur 100 Mikrosekunden erfüllen. Das Objektiv (11) hat einen Öffnungsdurchmesser von etwa 20 mm. Es können damit Laserspots mit Durchmessern von etwa vier bis fünf Mikrometern in einer Entfernung von etwa 100 Millimeter vom Objektiv (11) erzeugt werden. Dieser Abstand des Objektivs von der Probenträgerplatte ist günstig, um Verschmutzungen durch verdampfendes oder verspritzendes Probenmaterial zu vermeiden.
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Die Laserspots oder Laserspotmuster lassen sich mit den Galvospiegeln (7) und (8) auf der Probenträgerplatte (13) um etwa plus oder minus 150 Mikrometer verschieben. In diesem quadratischen Bewegungsbereich der Laserspots mit 300 Mikrometer Seitenlänge können die dort erzeugten Ionen noch von der beschleunigenden Ionenoptik (14, 15) der Ionenquelle erfasst und beschleunigt werden. Durch Verwendung eines geeigneten Mustergenerators (6) lassen sich mit dieser Anordnung auch Muster mit beispielsweise vier, sieben, neun oder 16 Laserspots generieren, wie sie beispielsweise in gezeigt werden.
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Werden die Ionen allerdings etwas außerhalb der Achse der Ionenoptik (14, 15) für die Ionenquelle erzeugt, so werden sie nicht mehr auf den Ionendetektor (20) am Ende der Flugstrecke abgebildet. Es ist somit notwendig, die Ionen durch Ablenkeinheiten (16) und (17) wieder auf den Ionendetektor auszurichten. Solche Ablenkeinheiten bestehen hier aus zwei gekreuzten Ablenkkondensatoren (16) und (17); die zur Korrektur notwendigen Spannungen betragen einige 100 Volt und müssen von einem gut steuerbaren Spannungsgenerator geliefert werden.
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Außerdem haben Ionen, die außerhalb der Achse der Ionenquelle (13, 14, 15) generiert werden, einen etwas längeren Flugweg bis zum Ionendetektor (20) und erleiden dadurch eine Verlängerung ihrer Flugzeit. Die Verlängerung des Flugweges kann mehrere Mikrometer ausmachen. Da eine Verlängerung des Flugweges von nur einem Mikrometer bei einer Gesamtfluglänge von zwei Metern bereits eine Flugzeitverlängerung von einem halben Millionstel der Flugzeit, gleichbedeutend mit einem Millionstel der Masse, ergibt, ist auch hierfür eine Korrektur notwendig, wenn eine hohe Massengenauigkeit erhalten bleiben soll. Das kann beispielsweise durch eine Korrektur der Verzögerungszeit der Beschleunigung, durch eine Korrektur der Spannung in der ersten Beschleunigungsstrecke zwischen Probenträgerplatte (13) und erster Beschleunigungsblende (14), durch eine Korrektur der Gesamtbeschleunigung oder durch eine andere Vorrichtung zur Korrektur der Flugzeit geschehen. Korrekturspannungen für zusätzliche Beschleunigungen betragen einige Volt. Die Korrektur der Flugzeit ist dann ebenso mit der Position des Laserspots mitzuführen wie auch schon die Ablenkspannung für die Bahnkorrektur an den Ablenkeinheiten (16) und (17).
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Im Prinzip kann die verlängerte Flugstrecke auch rechnerisch bei der Umrechnung von Flugzeiten in Massen berücksichtigt werden. Diese Umrechnung wird im Allgemeinen durch parametrisierte Kalibrierfunktionen durchgeführt. Die Korrektur besteht dann in einer Änderung der Parameterwerte. Für den Einsatz dieses Verfahrens auf einer gleichmäßig bewegten Probenträgerplatte, wie sie unten geschildert werden wird, ist diese rechnerische Korrektur aber nicht möglich, da die Einzelflugzeitspektren verschiedener Genesepunkte zunächst zu einem Summenflugzeitspektrum addiert werden sollen. Die Einzelflugzeitspektren sind somit vor ihrer Addition zu einem Summenflugzeitspektrum zu korrigieren, daher ist eine elektrische Korrektur der Flugzeiten, die die sofortige Addition ermöglicht, zu bevorzugen.
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In einem ersten Ausführungsbeispiel wird eine schnelle Positionssteuerung des Laserspots zur Entlastung des Trägerplatten-Bewegungsantriebs bei schnellen Folgen von Analysen dicht benachbarter Probenstellen eingesetzt. Das Prinzip dazu ist in wiedergegeben. Der Bewegungsantrieb für die Probenträgerplatte (13), der in der Regel aus Schrittmotor und Gewindespindel besteht, ist nach heutiger Technik für eine schnelle Analysenfolge von bis zu 200 Probenstellen pro Sekunde ungeeignet. Durch den pulsweisen Weitertransport der relativ schweren Probenträgerplatte von Probe zu Probe wird der Bewegungsantrieb außerordentlich stark belastet und hohem Verschleiß unterworfen. Durch die Trägheit des Systems wird für das Bewegen von Probenstelle zu Probenstelle wesentlich mehr Zeit benötigt, als zwischen zwei Laserschüssen zur Verengung steht. Daher können in dieser Zeit keine Massenspektren aufgenommen werden und die gewünschte Aufnahmerate von 10 kHz kann nicht erreicht werden. Versuche, die Probenträgerplatte kontinuierlich zu bewegen und mit unbewegter Laserspotposition abzurastern, haben selbst für die bildgebende Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten keine befriedigenden Ergebnisse gezeigt; für einzeln präparierte Proben auf Probenträgern ist dieses Verfahren aus ersichtlichen Gründen überhaupt nicht anzuwenden.
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Es wird nun vorgeschlagen, die Probenträgerplatte kontinuierlich weiter zu bewegen, beispielsweise mit gleich bleibender Geschwindigkeit in einer Richtung, aber für die notwendige Anzahl an Einzelflugzeitspektren aus einer Spotposition auf der Probe, beispielsweise der Spotposition (c) in , die Spotposition durch die schnelle Positionssteuerung mitzuführen. Durch diese phasenweise Mitführung der Spotposition auf dem kontinuierlich bewegten Probenträger (13) wird erreicht, dass die Einzelflugzeitspektren von derselben Probenstelle (c) gewonnen werden und somit keine Vermischung von Einzelflugzeitspektren von verschiedenen Probenstellen stattfindet. Für die bildgebende Massenspektrometrie bleibt so die räumliche Auflösung des massenspektrometrischen Bildes erhalten. Es verschiebt sich allerdings der Entstehungsort der Ionen in Bezug auf die Achse des Massenspektrometers, insbesondere in Bezug auf die Achse der ionenoptischen Anordnung (14, 15) in der Ionenquelle, so dass auch eine synchrone ionenoptische Korrektur des sich ändernden Strahlenganges der Ionen, beispielsweise durch die x-y-Ablenkungskondensatoren (16) und (17) im Strahlengang der Ionen im Flugzeitmassenspektrometer und eine Korrektur der Flugzeit durch zusätzliche Beschleunigungsspannungen vorzunehmen ist. Die Korrekturspannungen für diese Ablenkung und für die Zusatzbeschleunigung sind dann mit den Veränderungen der Spotposition gegenüber der optischen Achse mitzuführen. Für die nachfolgende Aufnahme des Massenspektrums einer anderen Probenstelle, beispielsweise der Probenstelle (b), das wieder aus vielen Einzelflugzeitspektren gewonnen werden muss, wird die Spotposition sprunghaft zur dieser anderen Probestelle (b) gesteuert und dann wieder mitgeführt. Es wechseln sich also Phasen, in denen die Relativgeschwindigkeit zwischen Probenträgerplatte und Laserspot den Wert null hat, mit solchen Phasen ab, in den die Relativgeschwindigkeiten ungleich null sind. Dabei werden jeweils auch alle Korrekturspannungen geändert. Bei richtiger Abstimmung der Bewegungsgeschwindigkeit der Probenträgerplatte (13), des Abstandes der Probenstellen (a, b, c, d) voneinander und der Aufnahmerate von Massenspektren kann die Probenträgerplatte (13) von einem Ende der Probenauftragung bis zum anderen Ende ohne Halt mit gleicher Geschwindigkeit durchfahren werden. Diese Technik kann insbesondere bei der bildgebenden Massenspektrometrie, aber auch bei anderen analytischen Aufgaben mit hoher Dichte an Proben eingesetzt werden.
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Dabei können nicht nur Probenstellen in linearer Reihung nacheinander gemessen werden, sondern es können Probenstellen auch zweidimensional abgerastert werden, wie schematisch in gezeigt. Dazu ist der Laserspot nicht nur mit der Bewegung (23) der Probenträgerplatte (13) einfach linear mitzuführen und linear zurückzuschalten, sondern auch in einem Muster (24) seitwärts zu bewegen, mit einem Halt auf jeder Probenstelle (in durch Punkte symbolisch dargestellt). So können beispielsweise für die bildgebende Massenspektrometrie mehrere Spuren (25) von Bildpunkten nebeneinander in einem Bewegungsdurchgang der Probenträgerplatte abgerastert werden, soweit diese Spuren von der Positionssteuerung erreicht werden können. Das nächste Bündel an Spuren kann dann auf der Rückfahrt der Probenträgerplatte (13) aufgenommen werden; es kann aber in Hinsicht auf die Positionspräzision der Bildpunkte günstiger sein, die Probenträgerplatte (13) schnell zurückzufahren und die Massenspektren aller Spuren in der gleichen Bewegungsrichtung aufzunehmen. An jeder Probenstelle kann dem Bewegungsmuster (24) ein feineres, in nicht gezeigtes Bewegungsmuster des Laserspots für das schichtweise Abtragen der Probenstelle überlagert sein.
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Die optimale Position des Laserspots oder des Laserspotmusters in Bezug auf die Achse der Ionenoptik muss allerdings zunächst ermittelt werden. Auch hier kann die schnelle Positionssteuerung für die automatische, programmgesteuerte Ermittlung der optimalen Position der Laserspots eingesetzt werden, wobei die optimale Position durch die dadurch erzielte höchste Empfindlichkeit des Massenspektrometers definiert ist. Dafür werden zweckmäßig besondere Proben eingesetzt, die über viele Stunden und Millionen von Laserschüssen hinweg Flugzeitspektren völlig gleich bleibender Intensität liefern. Solche Proben sind bekannt, beispielsweise können hier flüssige Auftragungen aus Peptiden gelöst in Glyzerin verwendet werden. Bei diesen Glyzerinproben ist es für den Erhalt eines gleichmäßigen Ionensignals besonders vorteilhaft, den Laserspot immer auf exakt dieselbe Stelle des Tropfens abzubilden. Als Nachschub diffundieren ständig neue Analytmoleküle durch die Flüssigkeit zu dieser Stelle. Für die Verwendung dieser Proben sollte also beim Verschieben der Probenträgerplatte (13) der Laserstrahl exakt mitgeführt werden. Insbesondere kann mit diesem Verfahren auch die Abhängigkeit aller Korrekturspannungen für Ablenkungen und Zusatzbeschleunigungen von der Spotposition vollautomatisch bestimmt werden.
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Es wurde hier des Öfteren der Begriff „Probenstelle” verwendet, von der ein Massenspektrum genommen wurde. Dieser Begriff bedarf einer etwas eingehenderen Betrachtung und Erläuterung. Für die Aufnahme der Einzelflugzeitspektren einer Probe ist es nicht günstig, mit einem Laserspot oder einem Laserspotmuster immer genau an exakt der gleichen Stelle zu arbeiten, da sich hier die Probe sehr schnell erschöpft, bei Dünnschichtpräparationen nach etwa drei bis zehn Laserschüssen. Es ist daher zweckmäßig, die zur Verfügung stehende Fläche der Probe so abzurastern, dass eine gleichmäßige Abtragung der Probe erfolgt. Es sollten nach Möglichkeit sogar die einzelnen Laserspots in aufeinander folgenden Laserschüssen nicht dicht an dicht nebeneinander gesetzt werden, da sich dadurch das Probenmaterial zu stark lokal erhitzen könnte. Es ist also ein Rasterungsmuster zu wählen, das nach Möglichkeit sowohl die lokale Überhitzung des Probenmaterials vermeidet wie auch eine gleichmäßige Abtragung der Probe über die verfügbare Fläche hinweg bewirkt. In ist das Rastermuster für eine solche gleichmäßige Abtragung anhand eines Laserspotmusters mit 9 Laserspots dargestellt, wobei in einem Probenflächenquadrat von genau 50 Mikrometer Seitenlänge eine Schicht der Probe recht gleichmäßig mit insgesamt 32 Laserschüssen abgetragen wird. Auch diese Abrasterung wird durch die schnelle Positionssteuerung für den Laserspot oder das Laserspotmuster ermöglicht. Es kann damit die Ausnutzung einer Probe durch ein besseres Abtragungsraster mit dem Laserspot oder Laserspotmuster gegenüber bisher verwendeten Techniken verbessert werden. Das gilt sowohl für die bildgebende Massenspektrometrie wie auch für die Analyse einzeln präparierter Proben. Das oben beschriebene „Mitführen” des Laserspots auf der Probenstelle bei gleichmäßig bewegter Probenträgerplatte ist also bevorzugt noch mit dieser Rasterbewegung zu überlagern.
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Es können auch feinere Quadrate abgerastert werden, dann ist es jedoch unumgänglich, die Laserspots dicht an dicht zu setzen. So kann mit dem Muster aus neun Laserspots in acht Laserschüssen ein Quadrat von 26 Mikrometer Seitenlänge abgerastert werden. Erlaubt die Ergiebigkeit der Probe die Abtragung von fünf Abtragungsschichten, so können jeweils 40 Einzelflugzeitspektren zu einem Summenflugzeitspektrum dieser feineren Probenfläche addiert werden. Mit Spotmustern von nur vier Spots lassen sich Quadrate mit 18 Mikrometer Seitenlänge abrastern. Die Abtragung feinerer Quadrate erhöht die räumliche Auflösung des Gewebebildes, allerdings auf Kosten der Nachweisgrenze und des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses; in vielen Fällen können aber später feinere Bildpunkte wieder zu größeren Flächen zusammengesetzt werden, wenn sich in den feineren Flächen nicht überraschend verschiedene Massenspektren aus sehr feinen Gewebestrukturen zeigen.
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Im Extremfall kann man mit diesem Verfahren mit Einzelspots von beispielsweise fünf Mikrometer Durchmesser und zehn Laserschüssen pro Stelle eine Oberfläche mit höchster Auflösung vermessen, damit die Massenspektren auch feinste Strukturen wiedergeben können. Zeigen sich dabei keine Feinstrukturen, so kann die Datenverarbeitung später wieder Gruppen dieser Massenspektren zu geringer räumlich aufgelösten Bildpunkten zusammenfassen, um ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erzielen. So können schwache Signale mit geringer Auflösung und starke Signale mit hoher Auflösung aus den Daten im Nachhinein entnommen werden.
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Das Abtragungsraster braucht aber nicht aus quadratisch geformten Probenflächen zu bestehen. So ist es beispielsweise für die Aufnahme von Massenspektren von besonderen Platten für die Dünnschichtchromatographie zweckmäßig, die Massenspektren einer chromatographischen Spur mit einem breiten, rechteckigen Abtastmuster aufzunehmen; die Probenfläche zur Gewinnung der Einzelflugzeitspektren kann dabei beispielsweise 50 mal 300 Mikrometer betragen. Zur massenspektrometrischen Vermessung von Platten der Dünnschichtchromatographie siehe Dokument
DE 199 37 438 C2 (F. Mayer-Posner und J. Franzen 1999; entsprechend
GB 2 355 581 B oder
US 6,414,306 B1 ).
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Verfahren für die optimale Präparation der Proben, der optimalen Aufnahme und Verarbeitung von Massenspektren für verschiedene analytische Aufgaben sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht detailliert wiedergegeben zu werden. Beispielsweise sind für die bildgebende Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten die Probenpräparationen auf besonderen Objektträgern mit Auftragung der Schichten von feinen Kriställchen des Matrixmaterials in den Dokumenten
DE 10 2006 019 530 B4 (M. Schürenberg et al.) und
DE 10 2006 059 695 B3 (M. Schürenberg) einzeln dargelegt. Im Dokument
DE 10 2010 051 810 A1 (D. Suckau et al.) ist geschildert, wie ein lokaler Verdau von Proteinen zu Verdaupeptiden vorgenommen und für die Identifizierung der Proteine des Gewebedünnschnitts verwendet werden kann. Das Dokument
DE 10 2008 023 438 A1 gibt wieder, wie dem massenspektrometrischen Bild ein hoch auflösendes optisches Bild unterlegt wird. Dokument
DE 10 2010 009 853 A1 stellt dar, wie durch mathematische Bearbeitung ein weitgehend rauschfreies Bild der Proteine auf dem Gewebedünnschnitt erzeugt werden kann.
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Die schnelle Positionssteuerung für die Laserspots kann des Weiteren für eine vollautomatische Justierung von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern genutzt werden. Dabei können alle Komponenten der Ionenoptik selbständig optimal justiert werden, jedenfalls, soweit diese ionenoptischen Komponenten wie Reflektor und Detektor zumindest für die Zeitdauer der Justierung mit Bewegungseinrichtungen oder elektrisch betriebenen Justierelementen versehen sind. Die automatische Justierung der Komponenten des Massenspektrometers spart Prüfzeiten im Prüffeld ein; sie ist aber auch besonders wertvoll für den späteren Service an den Massenspektrometern, bei dem nach Reinigungs- oder Reparaturarbeiten in aller Regel eine Justierung vorzunehmen ist.
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Die hier angegebene Anordnung ist nicht die einzig mögliche lichtoptische Anordnung für die Erzeugung der Laserspots oder der Laserspotmuster; es soll daher die Erfindung nicht auf diese Anordnung beschränkt sein. Weiterhin wurden zuvor Ausführungsformen beschrieben, die zur Desorption ultraviolettes Licht verwenden. Die Erfindung soll aber nicht darauf beschränkt sein. In Frage kommen auch anderen Arten kohärenten Lichts, beispielweise im infraroten Spektralbereich.
