DE102022131740A1

DE102022131740A1 - Verfahren zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial

Info

Publication number: DE102022131740A1
Application number: DE102022131740.4A
Authority: DE
Inventors: Marcel Niehaus; Andreas Haase
Original assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2024-06-06
Also published as: GB202316868D0; US20240177986A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial, das auf einem Probenträger abgelegt ist, aufweisend folgende Betriebsweise:- wiederholt lokales Beaufschlagen von Probenmaterial auf dem Probenträger unter Verwendung einer ersten energetischen Strahlung und Herbeiführen von lokaler Desorption von Probenmaterial in die Gasphase über dem Probenträger, dabei eine Relativposition der ersten Strahlung zum Probenträger verändernd und eine Vielzahl von Auftreffpunkten am Probenmaterial auf dem Probenträger ins Ziel nehmend;- gepulstes Beaufschlagen des lokal desorbierten Probenmaterials unter Verwendung einer zweiten energetischen Strahlung, die in das desorbierte Probenmaterial gerichtet wird, und Herbeiführen von Ionisierung und/oder Erhöhung eines Ionisierungsgrads des lokal desorbierten Probenmaterials, wobei eine Ausbreitungsrichtung der zweiten Strahlung in einer Ebene liegt, die substantiell senkrecht zu einer Flächennormalen des Probenträgers steht und über dem Probenträger angeordnet ist, dabei eine Fokus- und/oder Strahltaillenlage der zweiten Strahlung derart nachführend, dass sie einem aktuellen Auftreffpunkt am Probenmaterial auf dem Probenträger substantiell gegenüberliegt.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial, das auf einem Probenträger abgelegt ist. Prinzipien der Offenbarung können zum Beispiel in der bildgebenden Ionenspektrometrie Einsatz finden, insbesondere in der bildgebenden Ionenspektrometrie mit Ionenbildung unter Verwendung von Matrix-unterstützter Laserdesorption und -ionisierung (matrix-assisted laser desorption and ionisation; MALDI).
Hintergrund der Erfindung
Der Stand der Technik wird im Folgenden mit Bezug auf einen speziellen Aspekt erläutert. Dies soll jedoch nicht als Einschränkung verstanden werden. Nützliche Fortentwicklungen und Änderungen der Erfindung können auch über den vergleichsweise engen Rahmen dieser Einleitung hinaus anwendbar sein und werden sich geübten Praktikern auf diesem Gebiet nach Lektüre der dieser Einleitung nachfolgenden Offenbarung der Erfindung umstandslos erschließen.
Das MALDI-Verfahren wird seit langem für ionenspektrometrische Analysen verwendet. Im Fall der Ultraviolett-Vakuum-MALDI werden lösliche Analytmoleküle in eine lichtabsorbierende, auskristallisierende Matrixsubstanz eingebettet und anschließend mit kohärenten ultravioletten Lichtpulsen bestrahlt. Das UV-Licht wird von der auskristallisierten Matrixsubstanz aufgenommen, die daraufhin in eine Materialwolke desorbiert, wobei die eingebetteten Analytmoleküle mitdesorbiert werden. Durch die Eigenschaften des Desorptionsprozesses und der Materialwolke werden auch Ladungsträger gebildet und an die Analytmoleküle übertragen, so dass geladene Analytmoleküle oder Analytionen entstehen. Diese Analytionen können dann unter Verwendung elektromagnetischer Felder geführt und analysiert werden, z.B. im Rahmen einer Mobilitäts- und/oder Massenanalyse, die geladene Moleküle oder Ionen gemäß ihrem Wirkungsquerschnitt- bzw. Masse-zu-Ladungsverhältnis sortiert und nachweist.
Vorteile dieses etablierten MALDI-Verfahrens sind, dass die Analytmoleküle sehr sanft ionisiert werden, wobei Fragmentierung praktisch nicht vorkommt, und dass die entstehenden Analytionen einen weitgehend einheitlichen Ladungszustand haben, üblicherweise z = 1. Gerade in komplexen Proben hat sich jedoch gezeigt, dass verschiedene Molekülklassen unterschiedlich auf das MALDI-Verfahren ansprechen, insbesondere in Abhängigkeit der verwendeten Matrixsubstanz. Beispielsweise werden bestimmte Biomoleküle ausreichend nachweisbar ionisiert, wohingegen andere Biomoleküle in den Ionenströmen, die aus einem Gemisch gewonnen werden, im quantitativen Vergleich dazu unterpräsentiert sind. Diese unterschiedliche Empfänglichkeit zeigt sich beispielsweise bei der Untersuchung von Gewebeschnitten in der bildgebenden Massenspektrometrie und kann die Aussagekraft der daraus gewonnenen Messdaten beschränken. Es ist beispielsweise beobachtet worden, dass Lipide in Spektren von Gewebeschnitten im Vergleich zu Proteinen und Peptiden überrepräsentiert sein können.
Vor einiger Zeit wurde deswegen ein Postdesorptions-Ionisierungsverfahren vorgeschlagen, das die Umwandlungsrate von z.B. niederkonzentrierten Molekülen erhöhen kann. Das Prinzip besteht grundsätzlich darin, einen weiteren kohärenten ultravioletten Lichtpuls seitwärts in die Materialwolke der MALDI-Desorption zu strahlen. Diese Vorgehensweise wird MALDI-2 genannt. Die Wechselwirkung der Lichtpulse mit den Teilchen in der Materialwolke sorgt für eine Erweiterung des Ladungsträgerangebots, das insbesondere für niederkonzentrierte Analytmoleküle eine Verbesserung der Ionisierungsausbeute bewirkt. Doch auch höher konzentrierte Biomoleküle können von einer Nachionisierungsmodalität profitieren. Zum Beispiel werden Phosphatidylethanolamine (PEs) im Vergleich zu Phosphatidylcholinen (PCs) bei MALDI-Messungen kaum detektiert, obwohl beide in Gewebe vergleichbar abundant sind. Durch MALDI-2 werden PEs stark ionisiert und sind dann in den aufgenommenen Spektren verlässlich nachweisbar.
Eine wichtige Veröffentlichung zum MALDI-2-Verfahren ist die Studie von Jens Soltwisch et al. (Science, 10 April 2015 · Vol 348, Issue 6231, 211-215), in der dieser Name geprägt wurde. Ein auf die Wellenlänge abstimmbarer Post-Ionisierungslaser wird darin genutzt, um sekundäre MALDI-ähnliche Ionisierungsprozesse in der Gasphase anzuregen. Es wird eine Steigerung der Ionenausbeute für zahlreiche Lipidklassen, fettlösliche Vitamine und Saccharide, die in tierischem und pflanzlichem Gewebe mit einem 5 Mikrometer breiten Laserspot abgebildet wurden, um bis zu zwei Größenordnungen berichtet. Der Druck des Kühlgases in der Ionenquelle, die Laserwellenlänge, die Pulsenergie und die Verzögerung zwischen den beiden Laserpulsen werden als entscheidende Einflussgrößen für die Auslösung der sekundären Ionisierungsprozesse bezeichnet.
Im Folgenden werden einige Druckschriften des Stands der Technik, die für die vorliegende Offenbarung relevant sein können, kurz gewürdigt:
Die Monografie von Klaus Dreisewerd (Chem. Rev. 2003, 103, 395-425) beschäftigt sich unter anderem mit Post-Ionisierungsexperimenten zur Charakterisierung des MALDI-Verfahrens, insbesondere im Abschnitt V. Plume Dynamics.
Die Patentveröffentlichung WO 2010/085720 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur effizienten Messung einer ionisierten MALDI-Desorptionswolke, wenn Post-Ionisierungsverfahren (POSTI) mit einem Feinvakuum-MALDI-Ionenmobilitäts-Orthogonal-Flugzeit-Massenspektrometer (MALDI-IM-oTOF-MS) kombiniert werden. Verwandt dazu ist die Arbeit von Amina S. Woods et al. (J Proteome Res. 2013 April 5; 12(4): 1668-1677).
Die Arbeit von M. Niehaus et al. (Nature Methods Vol. 16, 925-931 (2019)) beschäftigt sich mit MALDI-2-Massenspektrometrie im Transmissionsmodus zur Abbildung von Zellen und Geweben mit subzellulärer Auflösung.
MALDI-Messungen von sehr ausgedehntem Probenmaterial gewinnen immer weiter an Bedeutung; man denke an Gewebeschnitte in der bildgebenden Massenspektrometrie mit Flächen in der Größenordnung von wenigen Quadratzentimetern oder Felder sehr dicht gesetzter Einzelpräparationen in einer Hochdurchsatzanalyse, z.B. 1536 Einzelpräparationen auf einem MALDI-Probenträger. Die Messungen derart belegter Probenträger können sehr lange dauern; im Fall von ausgedehnten Gewebeschnitten mehrere Stunden oder sogar Tage. Um die Spektraldaten-Erfassungszeit zu verkürzen, wurde für den Messablauf ein dynamischer MALDI-Desorptionslaserstrahl-Betrieb vorgeschlagen, der viele rasch durchzuführende Ausrichtungsänderungen des Desorptionslaserstrahls zum Abtasten eines vorbestimmten endlichen Areals am Probenmaterial mit wenigen recht zeitaufwändigen Verstellungen des MALDI-Probenträgers zum Anfahren verschiedener Areale verbindet. Auf diese Weise kann die gesamte Fläche eines Probenträgers schneller abgetastet werden als mit reiner Verstellung des den Probenträger tragenden, massereichen und daher recht trägen Verschiebetischs. Ein Beispiel ist in der Patentveröffentlichung DE 10 2018 112 538 B3 angedeutet (entspricht US 2019/0362958 A1 und GB 2 574 709 A ), insbesondere mit Verweis auf .
Eine Abtastung der Probenträgerfläche ausschließlich unter Verwendung des Laserstrahls erfährt technische Grenzen dahingehend, dass einerseits der Desorptionslaserstrahl nicht zu schräg auf dem Probenmaterial einfallen darf und andererseits abgetragenes und ionisiertes Probenmaterial durch üblicherweise ortsfeste Schnittstellen in weitere Baugruppen eines angeschlossenen analytischen Systems zu überführen ist. Dies schränkt die Strahlauslenkung auf einige hundert Mikrometer Abstand zwischen den am weitesten auseinanderliegenden Auftreffpunkten auf einem vorbestimmten, endlichen Areal ein. Ein Standard-MALDI-Probenträger hingegen hat die Maße einer Mikrotitrationsplatte (127,76 Millimeter × 85,48 Millimeter × 14,35 Millimeter), so dass die verfügbare Fläche - selbst bei nicht vollständiger Probenbelegung - nicht allein durch den Desorptionslaserstrahl ohne räumliche Verstellung des Probenträgers vollständig überstrichen werden kann. Vielmehr lassen sich üblicherweise eine Vielzahl vorbestimmter, endlicher Areale auf dem Probenträger definieren.
Angesichts der vorherigen Ausführungen besteht ein Bedarf, Verfahren und Vorrichtungen zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial zu verbessern, insbesondere was Sensitivität gegenüber schwach ionisierenden Molekülsubstraten betrifft. Weitere von der Erfindung zu lösende Aufgaben ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres bei der Lektüre der nachfolgenden Offenbarung.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial, das auf einem Probenträger abgelegt ist, aufweisend: - wiederholt lokales Beaufschlagen von Probenmaterial auf dem Probenträger unter Verwendung einer ersten energetischen Strahlung und Herbeiführen von lokaler Desorption von Probenmaterial in die Gasphase über dem Probenträger, dabei eine Relativposition der ersten energetischen Strahlung zum Probenträger verändernd und eine Vielzahl von Auftreffpunkten am Probenmaterial auf dem Probenträger ins Ziel nehmend; - gepulstes Beaufschlagen des lokal desorbierten Probenmaterials unter Verwendung einer zweiten energetischen Strahlung, die in das desorbierte Probenmaterial gerichtet wird, und Herbeiführen von Ionisierung und/oder Erhöhung eines Ionisierungsgrads des lokal desorbierten Probenmaterials, wobei eine Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung in einer Ebene liegt, die substantiell senkrecht zu einer Flächennormalen des Probenträgers steht und über dem Probenträger angeordnet ist, dabei eine Fokus- und/oder Strahltaillenlage der zweiten energetischen Strahlung derart nachführend, dass sie einem aktuellen Auftreffpunkt am Probenmaterial auf dem Probenträger substantiell gegenüberliegt; und - Überführen von ionisiertem Probenmaterial, das aus dem lokal desorbierten und mit der zweiten energetischen Strahlung beaufschlagten Probenmaterial hervorgegangenen ist, in eine Ionenverarbeitungseinrichtung.
Die Höhe der Ebene über dem Probenträger kann im Bereich 300-1000 Mikrometer liegen, insbesondere 500 Mikrometer. Vorzugsweise ist die Lage der Ebene über dem Probenmaterial und Probenträger substantiell konstant, z.B. bei recht geringen Auslenkungen der Ausrichtung der ersten energetischen Strahlung um wenige Grad. In bestimmten Ausführungsformen kann es vorgesehen sein, die Höhe der Ebene über dem Probenmaterial und Probenträger kurzzeitig und vorübergehend zu verändern, z.B. zu erhöhen oder zu erniedrigen. Bei Desorption und Ionisierung im Unterdruck kann die Umgebung, in der der Probenträger mit dem Probenmaterial aufbewahrt wird, auf einem Druck im Bereich von 0,5-10 Hektopascal gehalten werden, z.B. durch geeignet angeschlossene Pumpen. Eine Zeitspanne oder Verzögerungszeit zwischen dem Auslösen der ersten energetischen Strahlung und der zweiten energetischen Strahlung liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5-1000 Mikrosekunden. Die Ausbreitungsrichtungen der ersten energetischen Strahlung und der zweiten energetischen Strahlung können substantiell senkrecht zueinanderstehen, insbesondere einen Winkel aus einem Bereich von beispielsweise 45-135 Grad zwischen sich aufweisen. Die erste energetische Strahlung kann im Auflicht, d.h. einfallend von einer Seite des Probenträgers, auf der das Probenmaterial abgelegt ist, oder im Durchlicht, d.h. einfallend von einer Seite des Probenträgers, die von der Seite, auf der das Probenmaterial abgelegt ist, abgewandt ist, eingestrahlt werden.
In verschiedenen Ausführungsformen kann eine Einfallsrichtung der ersten energetischen Strahlung relativ zu einer Flächennormalen des Probenträgers verändert und eine Vielzahl von Auftreffpunkten ins Ziel genommen werden. Diese Arbeitsweise beschleunigt das Abrastern eines flächig mit Probenmaterial belegten Probenträgers, da sich Änderungen der Strahlausrichtung, z.B. unter Verwendung von reflektierenden Optikelementen wie galvanometrischen Mikrospiegeln, sehr viel schneller und aufwandsärmer ausführen lassen als das Bewegen des sehr massereichen Verschiebetischs, auf dem der Probenträger mitsamt Probenmaterial abgelegt und/oder präpariert ist. Bewegungen des Verschiebetischs werden vorzugsweise dann ausgeführt, wenn die Bewegungsreichweite der ersten energetischen Strahlung über einem vorbestimmten, endlichen Areal auf dem Probenträger ausgeschöpft ist.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Probenmaterial mit einer lichtabsorptionsfähigen Matrixsubstanz präpariert worden sein. Für die Desorption können je nach Anforderung ein MALDI-Verfahren im Auflicht (in Reflektion) oder im Durchlicht (in Transmission) in Frage kommen. Das MALDI-Verfahren erfordert eine bestimmte Probenpräparation mit einer lichtabsorbierenden Matrixsubstanz, z.B. Sinapinsäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure oder 2,5-Dihydroxyacetophenon, die alle stark im ultravioletten Spektralbereich absorbieren. Geeignet für die erste energetische Strahlung ist z.B. Laserlicht eines Stickstofflasers bei etwa 337 Nanometern Wellenlänge oder eines frequenzverdreifachten Festkörper Nd:YAG-Lasers bei etwa 355 Nanometern. Die zweite energetische Strahlung kann Laserlichtpulse einer Wellenlänge von z.B. 266 Nanometern umfassen. Allgemein sind für die zweite energetische Strahlung alle Wellenlängen, die unter der Zwei-Photonen-Grenze für die Ionisierung der genutzten Matrixsubstanz liegen, verwendbar, zumeist also Wellenlängen kleiner oder gleich 290 Nanometern bei Matrixsubstanzen mit Ionisierungsenergien von um die acht Elektronenvolt. Die Energie der ersten energetischen Strahlung liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1-50 Mikroj oule, wobei die untere Grenze insbesondere bei kleinen Laserfoki auf dem Probenmaterial anwendbar ist, wie sie z.B. bei Transmissions-MALDI oder MALDI im Durchlicht einstellbar sind. Die Energie der zweiten energetischen Strahlung kann beispielsweise im Bereich von 100-600 Mikrojoule liegen, besonders bevorzugt sind 300-500 Mikrojoule.
In verschiedenen Ausführungsformen kann die erste energetische Strahlung unter Verwendung eines Durchlichtoptiksystems eingestrahlt werden, das derart angeordnet und ausgelegt ist, dass die erste energetische Strahlung aus rückwärtiger Richtung einfallend das Probenmaterial nach Durchlaufen des Probenträgers beaufschlagt. Die Ausgestaltung als Durchlichtoptiksystem erlaubt es, den vorderseitigen Desorptions- und Ionenbildungsbereich von strahlführenden Elementen, die mit der Ionenextraktion interferieren könnten, freizuhalten. Die Ionenextraktion aus dem Ionenbildungsbereich kann dabei linear parallel zu einer Flächennormalen des Probenträgers erfolgen oder auch Richtungsänderungen, z.B. Ablenkungen um 90°, welche durch geeignet angeordnete Umlenkelektroden bewirkt werden können, beinhalten. Überdies ermöglicht ein Durchlichtoptiksystem eine stärkere Fokussierung der ersten energetischen Strahlung für einen örtlich sehr begrenzten Abtrag des Probenmaterials, so dass sich deutlich höhere räumlich-laterale Auflösungen erzielen lassen als mit Auflichtoptiksystemen wie dem Reflektions-MALDI. Mit einem Laserstrahl lassen sich Abtrags- und damit Bildelement- oder Pixelflächen mit Durchmessern im einstelligen Mikrometerbereich und - bei besonders sorgfältiger Feinabstimmung - sogar im Submikrometerbereich realisieren, z.B. 0,5-5 Mikrometer Durchmesser.
In verschiedenen Ausführungsformen kann das Probenmaterial eine Vielzahl von Punktpräparationen oder einen flächigen Gewebeschnitt aufweisen. Als Probenmaterial kann insbesondere ein mikrotomierter Gewebeschnitt verwendet werden. Beispiele dafür sind Hirngewebe und Retinagewebe, z. B. von Nagetieren. Das Probenmaterial lässt sich insbesondere aus einem gefrorenen Gewebestück oder einem Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe schneiden, was ggfs. weitere Aufbereitungsschritte vor der Analyse erfordert, z.B. ein „Deparaffinieren“ und „Entnetzen“ (de-crosslinking), auch als Antigen-Retrieval bezeichnet. Die Dicke eines zu analysierenden Gewebeschnitts kann 2-20 Mikrometer betragen, für MALDI-Anwendungen im Durchlicht insbesondere 2-15 Mikrometer. Für Auflicht- oder Reflektions-MALDI können die Schnitte auch dicker sein, z.B. 2-40 Mikrometer. Die Analyse von Gewebeschnitten erfährt immer größere Bedeutung, insbesondere im Bereich klinischer Anwendung zur Ermittlung pathologischer Zustände eines Gewebes, und deren Unterscheidung von nicht-pathologischen Zuständen, oder der Zellantwort auf die Verabreichung pharmazeutischer Substanzen. Eine Vielzahl von Punktpräparationen kann beispielsweise ein dichtes Feld aus 1536 oder mehr vereinzelten Präparationen auf dem Probenträger umfassen, die unter Verwendung einer dried-droplet-Methode hergestellt worden sind. Als Anwendungsgebiet kann z.B. die Wirkstoffkandidatenerkennung für pharmakologische Untersuchungen erwähnt werden.
In verschiedenen Ausführungsformen kann der Probenträger als Glasplatte, Metallplatte oder Keramikplatte ausgebildet sein. Vorzugsweise ist die das Probenmaterial tragende Fläche des Probenträgers elektrisch leitfähig ausgebildet, um ein elektrisches Referenzpotential ausbilden zu können und die Handhabung des desorbierten und ionisierten Probenmaterials zu ermöglichen und/oder zu vereinfachen. Diese Ausgestaltung wirkt sich insbesondere bei axialer Extraktion des ionisierten Probenmaterials aus dem Ionenbildungsbereich, d.h. einer Extraktion, die substantiell parallel zu einer Flächennormalen des Probenträgers ausgeführt wird, positiv aus. Geeignet sind beispielsweise polierte Stahlplatten oder auch solche mit lyophilen Ankerflächen in lyophober Umgebung wie die AnchorChips™ von Bruker. Für den Einsatz von erster energetischer Strahlung im Durchlicht können insbesondere Indium-Zinnoxid-beschichtete Glas-Objektträger (indium tin oxide, ITO) verwendet werden.
In verschiedenen Ausführungsformen kann die erste energetische Strahlung und/oder die zweite energetische Strahlung von einem Pulslaser geliefert werden. Insbesondere kann das Probenmaterial von der ersten energetischen Strahlung gepulst beaufschlagt werden. Die Taktrate einer Pulsfolge kann im Bereich einiger Hertz, z.B. 1-20 Pulse pro Sekunde, bis zu 10³ oder 10⁴ Hertz betragen. Eine Taktrate der zweiten energetischen Strahlung kann entsprechend auf die Taktrate der ersten energetischen Strahlung abgestimmt sein, und jede einzelne Desorptionswolke kann mit einer geeigneten Zeitverzögerung von einigen Mikrosekunden, die ausgehend von der Beaufschlagung mit der ersten energetischen Strahlung das Ausbilden einer Desorptionswolke begünstigt, bestrahlt werden. Die Zeitverzögerung kann z.B. 0,5-100 Mikrosekunden betragen, in Abhängigkeit von der Höhe der Ausbreitungsrichtungsebene über dem Probenträger sowie dem Druckniveau, und bevorzugt bei 5-20 Mikrosekunden liegen, insbesondere unter Feinvakuum-Drücken von wenigen Hektopascal und einer Höhe der Ausbreitungsrichtungsebene über dem Probenträger von etwa 500 Mikrometer.
In verschiedenen Ausführungsformen kann die Relativposition des Probenträgers zur ersten energetischen Strahlung und/oder die Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung unter Verwendung eines oder mehrerer Spiegel und/oder einer oder mehrerer Linsen verändert bzw. nachgeführt werden. Für die erste energetische Strahlung kann beispielsweise ein optischer Aufbau mit Kepler-Teleskop verwendet werden, wie er in der Patentveröffentlichung DE 10 2011 112 649 A1 (entspricht GB 2 495 805 A und US 2013/0056628 A1 ) dargelegt ist. Für die zweite energetische Strahlung ist der Einsatz von galvanometrischen Mikrospiegel-Paaren bevorzugt, wobei jeder Mikrospiegel jeweils um eine Rotationsachse gedreht werden kann, um die Ausfallrichtung eines reflektierten Strahls verändern zu können. Der Einsatz wenigstens eines drehflexiblen Spiegelpaares erlaubt die Änderung der Strahlausrichtung dahingehend, dass ein nahezu paralleler Versatz im Vergleich zu einer voreingestellten Standardstrahlausrichtung möglich wird, bei gleichzeitiger Beibehaltung einer Höhenlage der Ausbreitungsrichtung über dem Probenmaterial und Probenträger. Auf diese Weise lässt sich die Ausrichtung der zweiten energetischen Strahlung den variierenden Auftreffpunkten am Probenmaterial auf dem Probenträger schnell und verlässlich nachführen, so dass eine sich ausbreitende Desorptionswolke immer optimal bestrahlt wird. Durch Bereitstellung eines zusätzlichen drehflexiblen galvanometrischen Mikrospiegelpaares, dessen Drehachsen senkrecht zu denen der anderen Mikrospiegel ausgerichtet sind, lässt sich auch die Höhenlage der Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung kurzzeitig und vorübergehend verändern, z.B. erhöhen oder erniedrigen.
In verschiedenen Ausführungsformen kann die Ionenverarbeitungseinrichtung als Analysator ausgebildet sein, insbesondere als Mobilitätsanalysator, Massenanalysator oder gekoppelter Mobilitäts-Massenanalysator. Vor dem eigentlichen Analysator oder den mehreren hintereinander geschalteten Analysatoren und auch in verschiedenen Abschnitten zwischen solchen hintereinander geschalteten Analysatoren können ionenführende Zwischenstufen angeordnet sein, beispielsweise Hochfrequenzspannungs-Ionenleiter wie Stab-Multipole oder auch HF-Trichteranordnungen. Ebenso können unterschiedliche Analysatoren und Zwischenstufen auf unterschiedlichen Unterdruckniveaus betrieben werden.
Ein Ionenmobilitätsanalysator trennt geladene Moleküle oder Molekülionen gemäß ihrem Stoßquerschnitt-zu-Ladungsverhältnis, gelegentlich als σ/z oder Ω/z bezeichnet. Grundlage hierfür ist die Wechselwirkung der Ionenspezies mit einem elektrischen Feld, das mit der Ladung der Ionen koppelt, bei gleichzeitiger Einwirkung eines Puffergases, das auf die mittlere Querschnittsfläche des Ions einwirkt. Bekannt sind insbesondere Driftröhren-Mobilitätsseparatoren mit statischem elektrischen Feldgradienten, die Ionen durch ein im Wesentlichen ruhendes Gas treiben, wobei sich die Driftgeschwindigkeit einer Ionenspezies aus der vorantreibenden Kraft des elektrischen Feldes und der bremsenden Kraft der Stöße mit den Gasteilchen ergibt. Ebenso geläufig sind Speicher-Ionenmobilitätsseparatoren (trapping ion mobility separators, TIMS) mit einem die Ionen vorantreibenden stetigen laminaren Gasstrom, dem ein schrittweise veränderter elektrischer Feldgradient mit entsprechend veränderlicher Bremskraft entgegenwirkt. Erwähnt werden können auch Wanderwellen-Mobilitätsseparatoren (travelling wave).
Ein Massenanalysator wiederum trennt geladene Moleküle oder Molekülionen gemäß ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis, üblicherweise als m/z bezeichnet. Verwendet werden können Flugzeitanalysatoren, für die sowohl Linear- als auch Reflektoraufbauten und/oder solche mit orthogonaler Beschleunigung in die Flugstrecke vorgesehen sein können. Auch andere Arten massendispergierender Separatoren lassen sich einsetzen, z.B. Quadrupol-Massenfilter (single quads), Tripel-Quadrupol-Analysatoren („Tripel-Quads“), Ionenzyklotronresonanz-Zellen (ion cyclotron resonance, ICR), Analysatoren des Kingdon-Typs wie die Orbitrap® (Thermo Fisher Scientific) und andere. Es versteht sich, dass Analysatoren und Separatoren der vorgenannten Typen gekoppelt werden können, um Ionenspezies mehrdimensional, also gemäß mehr als einer physikalisch-chemischen Eigenschaft wie m/z und σ/z oder Ω/z, trennen zu können.
In verschiedenen Ausführungsformen kann die Fokus- und/oder Strahltaillenlage der zweiten energetischen Strahlung (i) senkrecht zur und/oder (ii) entlang der Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung nachgeführt werden. Vorzugsweise wird die Strahltaillen- oder Fokuslage entlang der Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung unter Verwendung eines Linsensystems im Strahlengang verwirklicht, das wenigstens eine bewegliche optische Linse enthält, mit der die Brennweiteneinstellung des Gesamtoptiksystems für die zweite energetische Strahlung angepasst werden kann. Bezüglich einer Nachführung senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung werden vorzugsweise Paare von galvanometrischen Mikrospiegeln eingesetzt, die jeweils um eine Spiegel-eigene Rotationsachse gedreht werden können und eine Ausfallsrichtung der reflektierten zweiten energetischen Strahlung verändern.
Eine Höhenänderung der Strahltaillen- oder Fokuslage über dem Probenmaterial und Probenträger kann dann sinnvoll sein, wenn eine sehr starke Auslenkung der ersten energetischen Strahlung von einem Standard-Auftreffpunkt eingestellt ist. Durch die Divergenz der zweiten energetischen Strahlung kann die Gefahr bestehen, bei sehr starker Auslenkung des Auftreffpunkts Bereiche auf dem Probenmaterial und Probenträger mit randständigen Bereichen der zweiten energetischen Strahlung zu berühren und dadurch störenden Untergrund in den Spektraldaten zu erzeugen. Durch das Einstellen einer vorübergehenden und kurzzeitigen größeren Höhe über dem Probenmaterial und Probenträger für solche Extremauslenkungen kann ein Kompromiss gefunden werden zwischen der Verringerung dieser Gefahr der Bildung von ionischem oder chemischem Untergrund in den Spektraldaten und einem immer noch günstigen Strahlengang der zweiten energetischen Strahlung. Es kann auch ratsam sein, kurzzeitig und vorübergehend eine geringere Höhe über dem Probenmaterial und Probenträger einzustellen, beispielsweise um die Wechselwirkung von zweiter energetischer Strahlung und desorbiertem Probenmaterial in einen Bereich der Desorptionswolke zu legen, in dem die Teilchendichte so hoch ist, dass Ladungsträgerbildung und Ladungsträgerübertragung auf ungeladene Moleküle in der Wolke deutlich begünstigt sind, wodurch die Ausbeute ionisierten desorbierten Probenmaterials steigen kann. Auch eine solche Ausführung ist der Erfindung zuzurechnen.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung eine Vorrichtung zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial, das auf einem Probenträger abgelegt ist, aufweisend: - eine Desorptionseinrichtung zur Erzeugung und Führung der ersten energetischen Strahlung; - eine Ionisierungseinrichtung zur Erzeugung und Führung der zweiten energetischen Strahlung; - eine erste Verstelleinrichtung zur Einstellung und Änderung der Relativposition der ersten energetischen Strahlung zum Probenträger; - eine zweite Verstelleinrichtung zur Einstellung und Nachführung der Fokus- und/oder Strahltaillenlage der zweiten energetischen Strahlung; und - ein Leitsystem, das mit der Desorptionseinrichtung, Ionisierungseinrichtung, ersten Verstelleinrichtung und zweiten Verstelleinrichtung kommuniziert und dazu ausgelegt und programmiert ist, ein wie zuvor beschriebenes Verfahren abzustimmen und auszuführen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Abbildungen verwiesen. Die Elemente in den Abbildungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu dargestellt, sondern sollen in erster Linie die Prinzipien der Erfindung (größtenteils schematisch) veranschaulichen. In den Abbildungen sind einander entsprechende Elemente in den verschiedenen Ansichten durch gleiche Bezugszeichen gekennzeichnet.

zeigt schematisch den Aufbau eines Ionenspektrometers, in dessen Quellbereich eine Laser-unterstützte Nachionisierung zum Einsatz kommt (adaptiert aus DE 10 2016 124 889 A1 , entsprechend GB 2 558 741 A und US 2018/0174815 A1 ).
veranschaulicht schematisch eine Betriebsart einer Ionenquelle, in der eine erste energetische Strahlung über ein Feld von Probenmaterial, das auf einem Probenträger abgelegt ist, zu unterschiedlichen Auftreff- und Abtragpunkten bewegt wird.
zeigt schematisch die Ionenquelle aus mit aktivierter Nachionisierungsmodalität und dem Auseinanderfallen von Auftreff-/Abtragpunkt und Fokus und/oder Strahltaille der zweiten energetischen Strahlung.
verdeutlicht schematisch die Anpassung der Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung bei einem Versatz der Auftreff- und Abtragpunkte der ersten energetischen Strahlung, der in eine Richtung senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung ausgeführt wird.

Detaillierte Beschreibung
Während die Erfindung anhand einer Anzahl von Ausführungsformen dargestellt und erläutert wurde, werden Fachleute auf dem Gebiet anerkennen, dass verschiedene Änderungen in Form und Detail daran vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der in den beigefügten Patentansprüchen definierten technischen Lehre abzuweichen.
zeigt ein Ionenspektrometer (10), das eine Nachionisierungsmodalität verwendet und in dem Prinzipien der vorliegenden Offenbarung umgesetzt werden können, und dient der Kontextualisierung.
Die Darstellung in zeigt ein vereinfachtes Schema. Der übliche Normalbetrieb mit Zwischenspeicherung und möglicher Stoßfragmentierung von Ionen im Ionenspeicher (19) sieht wie folgt aus: In einer Ionenquelle mit Lasersystem (11) wird durch den ersten Laserlichtpulsstrahl (12), der durch ein nicht gezeigtes Fenster in die Quelle gelangt, vom Probenmaterial auf dem Probenträger (15) ionisiertes Probenmaterial (16) erzeugt, das durch ein Potential an der Elektrode (14) in einen üblichen Hochfrequenz-(HF)-Ionentrichter (17) gedrückt wird. Der Auftreffpunkt des ersten Laserlichtpulsstrahls (12) am Probenmaterial kann in bestimmten Grenzen durch Änderung der Einstrahlungsrichtung des ersten Laserlichtpulsstrahls (12) variiert werden, wie zuvor erläutert. Die Ionenerzeugung kann durch einen zweiten Laserlichtpulsstrahl (12*), der zeitlich abgestimmt seitwärts in die sich über dem Probenträger (15) ausbreitende Desorptionswolke des abgetragenen Probenmaterials fokussiert wird, bevor ein Strahlfänger (30) ihn abseits des Probenträgers (15) aufnimmt, unterstützt werden. Die Fokus- und/oder Strahltaillenlage des zweiten Laserlichtpulsstrahls (12*) wird dabei derart angepasst, dass sie dem aktuellen Auftreffpunkt am Probenmaterial substantiell gegenüberliegt, um eine optimale Wechselwirkung der Energie im zweiten Laserlichtpulsstrahl und den Teilchen in der desorbierten Materialwolke zu gewährleisten.
Die Ionen treten dann in das HF-Quadrupol-Stabsystem (18) ein, das sowohl als einfaches Ionenführungssystem oder Ionenleiter als auch als Massenfilter zur Auswahl einer zu fragmentierenden Sorte von Vorläufer-Ionen betrieben werden kann. Die unselektierten oder selektierten Ionen werden dann in den Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenspeicher (19) eingespeist und können dabei je nach ihrer Beschleunigung durch energetische Stöße fragmentiert werden. Der Ionenspeicher (19) ist gasdicht umschlossen und wird durch die Gaszuführung (20) mit Stoßgas wie Stickstoff oder Argon beschickt, um Ionen durch Stöße zu fokussieren und in der Achse zu versammeln.
Aus dem Ionenspeicher (19) werden zu vorgegebenen Zeiten Ionen durch eine Extraktionsschaltlinse (21) entnommen, zu einem feinen Primärionenstrahl (22) geformt und zum Ionenpulser (23) geschickt. Der Ionenpulser (23) pulst einen Abschnitt des Primärionenstrahls (22) orthogonal in die auf hohem elektrischen Potential befindliche Driftstrecke aus, wodurch der neue Ionenstrahl (24) entsteht. Der Ionenstrahl (24) wird im Reflektor (25) geschwindigkeitsfokussierend reflektiert und im Detektor (26) gemessen. Das Massenspektrometer wird durch angeschlossene Pumpen (27), (28) und (29) evakuiert.
In ist gezeigt, wie ionisiertes Probenmaterial, das sich von dem Probenträger (15), auf dem das Probenmaterial anfänglich gelagert ist, grundsätzlich entlang einer Flächennormalen des Probenträgers (15) wegbewegt, mittels einer Umlenkelektrode (14) abgelenkt und - unterstützt durch den Gasstrom von dem Ionenbildungsbereich im Feinvakuum in eine nachfolgende, bei geringerem Druck gehaltene Abteilung - in eine angeschlossene Ionenführung, hier als HF-Trichter (17) ausgeführt, geleitet wird. Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass diese Ausführung nicht als beschränkend anzusehen ist. Ebenso ist eine Extraktionsrichtung des ionisierten desorbierten Probenmaterials denkbar, die substantiell parallel zu einer Flächennormalen des Probenträgers (15) ist. Bezogen auf könnte das bedeuten, dass der Probenträger (15) dem weiten Ende des HF-Trichters (17) substantiell gegenüberliegend angeordnet wird (z.B. durch eine Verlagerung des Probenträgers im Uhrzeigersinn um 90°). Die Umlenkelektrode (14) könnte dann entfernt oder auch durch Ausnutzung der zentralen Öffnung zur Extraktionselektrode umfunktioniert beibehalten werden. Die Strahlengänge des ersten und zweiten Laserlichtpulsstrahls (12, 12*), ggfs. unter Entfernung und/oder Hinzufügung von geeigneten Umlenkspiegeln, sowie die Lage des Strahlfängers (30) für den zweiten Laserlichtpulsstrahl (12*) wären in einer solch geänderten Ausführung entsprechend anzupassen.
veranschaulichen schematisch und beispielhaft einen Abtrags- und Desorptionsvorgang in einer Ionenquelle. Ein Probenträger (115), der in diesem Beispiel eine Vielzahl von vereinzelten Aufbereitungen von Probenmaterial trägt, ist auf einem Verschiebetisch (132) angeordnet. Der Verschiebetisch (132) kann dazu ausgelegt sein, die Position des Probenträgers (115) entlang bis zu drei Raumachsen xyz zu verstellen, von denen zwei Achsen eine xy-Ebene senkrecht zur Darstellungsebene aufspannen und die dritte z in der Darstellungsebene von unten nach oben verlaufen kann. Gleichwohl ist die Zahl tatsächlicher Betätigungen des Verschiebetischs (132) recht gering, da er grundsätzlich sehr massereich ist, so dass eine Bewegung von der Ausführung bis zum Abklingen etwaiger bei der Bewegung erzeugter Schwingungen recht lange dauert. Vorteilhafter ist es, den Verschiebetisch (132) nur dann zu verfahren, wenn Probenmaterial, das außerhalb eines mit Strahlführungsmitteln überstreichbaren vorbestimmten, endlichen Areals auf dem Probenträger (115) angeordnet ist, einem Desorptionsstrahl (112) ausgesetzt werden soll. Diese Betriebsweise kann als sogenannter hybrider oder kombinierter „stage scan“-„laser scan“-Ansatz bezeichnet werden.
Ein erstes Lasersystem (111) ist in diesem Beispiel schräg über dem Verschiebetisch (132) angeordnet und dazu ausgelegt, ohne Bewegung des Verschiebetischs (132) einen Laserstrahl (112) in verschiedenen Ausrichtungen (durchgezogene, punktierte und gestrichelte Kontur) auf vorbestimmte Orte innerhalb eines vorbestimmten, endlichen Areals auf dem Probenträger (115) zu richten, z.B. eine Ausformung als Auflicht-MALDI oder Reflexions-MALDI; letztere Benennung kommt daher, dass das desorbierte und ionisierte Probenmaterial den Probenträger (115) im weitesten Sinne entgegen der Einfallsrichtung des ersten Laserstrahls (112) verlässt. Das endliche Areal kann z.B. einen Durchmesser oder eine Kantenlänge von 100-1000 Mikrometern haben. Ein über dem Probenträger (115) angeordnetes Führungselement wie der angedeutete HF-Ionentrichter (117) ist in der Lage, das desorbierte und mit elektrischer Ladung versehene Probenmaterial zu sammeln und einem angeschlossenen Analysator (nicht gezeigt) zuzuführen, ggfs. über Zwischenstufen und/oder unter Verwendung von axialer Extraktion oder einer Extraktion unter Richtungsänderungen. Der HF-Ionentrichter (117) kann dafür dauerhaft oder pulsweise abgestimmt auf die Desorptionspulse der ersten energetischen Strahlung (112) mit extrahierenden elektrischen Potentialen beschaltet werden.
Weiterhin gezeigt ist eine Nachionisierungsmodalität in der Form eines zweiten Lasersystems (111*), das so angeordnet und ausgelegt ist, dass ein zweiter Laserstrahl (112*) seitwärts in eine Desorptionswolke von Probenmaterial hineinfokussiert werden kann, z.B. nach dem sogenannten MALDI-2-Verfahren, siehe . Kontur und äußere Abmessungen des zweiten Laserstrahls (112*) sind hier nicht unbedingt maßstabsgetreu dargestellt, insbesondere bezüglich seiner Divergenz. In der Praxis tut der Nutzer gut daran, dafür zu sorgen, dass der zweite, seitwärts einfallende Laserstrahl (112*) hinreichend Abstand von der Probenträgeroberfläche hält, um unbeabsichtigtes Streifen des Probenträgers (115) oder des darauf abgelegten Probenmaterials zu vermeiden und die Entstehung von Untergrund in den Spektraldaten zu verhindern.
Die Ausrichtung und Fokussierung des zweiten Laserstrahls (112*) ist üblicherweise starr, lässt sich also ohne aufwändigen menschlichen Eingriff nicht ändern oder anpassen, was bedeutet, dass es eine einzige optimale Lage für eine Desorptionswolke gibt, um von dem zweiten Strahl (112*) bestmöglich getroffen zu werden. Ziel ist dabei immer die Ionisierung oder zumindest die Erhöhung des Ionisierungsgrads, sollte der Desorptionsprozess selbst schon mit Ionisierung einhergehen wie bei einer MALDI-Präparation. Aus diesem Grund müsste der Abtrags- oder Desorptionsort immer in die feste Fokus- oder Strahltaillenlage des zweiten Lasers gefahren werden, was allerdings nur mit einer Bewegung des Verschiebetischs (132) erreicht werden kann, die wie oben angedeutet schwerfällig und zeitaufwändig ist. Wenn die Ausrichtung des ersten Laserstrahls (112) zum Probenträger (115) oder vielmehr zu einer Flächennormalen (134) des Probenträgers (115), siehe , verändert wird, können Auftreff- und Desorptionsort und Fokus- oder Strahltaillenlage des zweiten Strahls (112*) nicht mehr optimal übereinstimmen, und es können sich Wirksamkeitseinbußen ergeben, z.B. wegen einer nur randständigen Überlappung von zweitem Strahl (112*) und Desorptionswolke oder weil durch Strahldivergenz eine kritische Strahlfluenz für die Wechselwirkung mit dem desorbierten Probenmaterial nicht mehr erreicht wird. In einem extremen Fall, bei sehr starker Auslenkung des ersten Strahls (112) von einem Standard-Auftreffpunkt, könnte der zweite Strahl (112*) die Desorptionswolke, die sich bei Auflicht- oder Reflexions-MALDI mit schrägem Strahleinfall erfahrungsgemäß nicht genau entlang einer Flächennormalen (134) des Probenträgers (115) ausbreitet, sondern leicht entgegen der Einfallsrichtung des ersten Strahls (112) verzerrt ist, sogar vollständig verfehlen. Die vorteilhafte, nachionisierende Wirkung des zweiten Strahls (112*) würde dann natürlich ausbleiben.
zeigen schematisch und beispielhaft die Problematik bei Auslenkung des ersten Strahls (112) auf Auftreffpunkte, die sich entlang der Ausbreitungsrichtung des zweiten Strahls (112*) aufreihen. Bei feststehendem Verschiebetisch (132) wird der erste Strahl (112) in drei unterschiedlichen Einfallswinkeln relativ zum Probenträger (115) auf unterschiedliche Auftreffpunkte eingestrahlt, siehe . Die Fokuslage des zweiten Strahls (112*) liegt nur dem in der Mitte befindlichen Ausschnitt des Probenmaterials substantiell gegenüber und ist daher optimal; bei Auslenkung (Δ) jeweils nach rechts und nach links in der , trifft der zweite Strahl (112*) die Desorptionswolke nicht mit seiner Strahltaille oder seinem Bereich geringsten Umfangs, was in den allermeisten Fällen mit der Fokuslage übereinstimmt. Dies kann dazu führen, dass Teile des desorbierten Probenmaterials nicht mit dem zweiten Strahl (112*) wechselwirken oder dass die Fluenz am Ort der Wechselwirkung unter einer kritischen Schwelle bleibt, so dass sich die Wirkung des vorteilhaften Ladungsträgererhöhung nur unvollständig einstellen kann. Eine Anpassung der Fokus- oder Strahltaillenlage entlang der Ausbreitungsrichtung des zweiten Strahls (112*) ist vonnöten, um diesem Problem abzuhelfen, z.B. unter Verwendung von im Strahlengang angeordneten beweglichen optischen Linsen (140). Die Linse (140) in ist als schematischer Platzhalter zu verstehen. An ihrer Stelle kann ein umfangreicheres Linsensystem mit mehreren Optikelementen angeordnet sein, um die Strahltaillen- und/oder Fokuslage entlang der Ausbreitungsrichtung zu verändern.
Gravierender ist die Sachlage, wenn eine Ausrichtungsänderung des ersten energetischen Strahls (112) den Auftreffpunkt auf dem Probenträger (115) entlang einer Richtung auslenkt, die substantiell senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des zweiten Strahls (112*) steht. In einer solchen Situation stellt sich das Problem des vollständigen räumlichen Auseinanderfallens von zweitem Strahl (112*) und Desorptionswolke viel schneller ein als ein Aus-dem-Fokus-geraten bei Auslenkung entlang der Ausbreitungsrichtung des zweiten Strahls (112*). Dieser Fall ist in schematisch und beispielhaft illustriert.
zeigt in einer schematischen Aufsicht das zweite Lasersystem (211 *), das den zweiten energetischen Strahl (212*) hervorbringt, auf der linken Seite. Demgegenüber am anderen Ende der Abbildung auf der rechten Seite befindet sich ein Strahlfänger (230), der überschüssige photonische Energie aufnehmen und aus der Anordnung entfernen soll, um etwaig störendes Streulicht zu verhindern, das z.B. andere Komponenten oder Baugruppen beeinträchtigen könnte. Zu sehen ist ebenfalls der Probenträger (215) mit skizzenartig hervorgehobenen Auftreffpunkten, die Abtrags- und Desorptionsorte von Probenmaterial kennzeichnen, sowie ein optisches Führungssystem, das Spiegelpaare (238, 238') und abbildende Linsen (240) aufweist. Das Probenmaterial auf dem Probenträger (215) ist hier als Gewebeschnitt skizziert. Der Strahlengang des zweiten Strahls (212*) in unterschiedlichen Einstellungen ist mit durchgezogener sowie punktierter und strich-punktierter Linie veranschaulicht. Die Spiegel (238, 238') sind so ausgelegt, dass sie jeweils um eine Spiegel-eigene Rotationsachse gedreht werden können, wobei die Rotationsachse der Spiegel (238) eine andere ist als die der Spiegel (238`), und wobei diese Rotationsachsen vorzugsweise senkrecht zueinanderstehen. Die Rotationsachsen der Spiegel (238) können beispielsweise senkrecht zur Zeichenebene stehen, wohingegen die Rotationsachsen der Spiegel (238') in der Zeichenebene liegen. Die drehflexible Ausformung der Spiegel (238) sorgt dafür, dass sich die Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung (212*) in einer festen Ebene parallel zur Fläche des Probenträgers (215) verstellen lässt, ohne die Höhe über dem Probenträger (215) zu ändern. Die drehflexible Ausformung der Spiegel (238') wiederum erlaubt auch, die Höhe der Strahlebene über dem Probenträger (215) anzupassen. Die Fläche der Spiegel (238, 238') ist derart bemessen, dass verschiedene Winkelablenkungen des zweiten Strahls (212*) in einen räumlichen Versatz (Δ) der Strahlachse entlang zweier Raumrichtungen, die senkrecht zur allgemeinen Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung (212*) ausgerichtet sind, übersetzt werden können. Das Linsensystem (240) kann überdies eine Vielzahl abbildender Linsen (240) aufweisen, von denen wenigstens eine in Ausbreitungsrichtung des zweiten Strahls (212*) bewegt werden kann. Auf diese Weise lässt sich die Fokus- oder Strahltaillenlage des zweiten Strahls (212*) über dem Probenträger (215) in Ausbreitungsrichtung des zweiten Strahls (212*) entlang der drei Raumrichtungen anpassen, wie zuvor in Bezug auf die erläutert.
Ein Leitsystem (242) kommuniziert mit der Verstelleinrichtung (nicht gezeigt) des Probenträgers (215), dem zweiten Lasersystem (211*), der Verstelleinrichtung des ersten Strahls (nicht gezeigt), den Spiegelpaaren (238, 238') sowie dem Linsensystem (240) und stimmt deren Betrieb aufeinander ab, so dass Auftreff- und Abtragpunkt auf dem Probenträger (215) sowie Strahltaillen- oder Fokuslage des zweiten Strahls (212*) einander immer substantiell gegenüberliegen. Angedeutet ist die Kommunikation über die strich-doppelpunktierten Linien (244).
Prinzipien der Erfindung ermöglichen es insbesondere die Areale am Probenmaterial, die zwecks Materialabtrag durch reine Verstellung der ersten energetischen Strahlung beaufschlagt werden können, ohne den massereichen und trägen Verschiebetisch, auf dem der Probenträger gelagert ist, verfahren zu müssen, zu vergrößern. Auf diese Weise lassen sich größere Auslenkungen in der Strahlführung der ersten energetischen Strahlung einstellen. Dies kann dazu beitragen, die ortsaufgelöste Abarbeitung eines mit Probenmaterial belegten Probenträgers im Vergleich zu aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zu beschleunigen, da sich Gesamtzahl und Häufigkeit der für das Abrastern erforderlichen Probenträgerbewegungen noch weiter verringern lassen.
Die Erfindung ist vorstehend mit Bezug auf verschiedene besondere Ausführungsbeispiele beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass diverse Gesichtspunkte oder Einzelheiten der beschriebenen Ausführungen geändert werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Weiterhin können die im Zusammenhang mit unterschiedlichen Ausführungsformen offenbarten Merkmale und Maßnahmen beliebig kombiniert werden, sofern dies einem Fachmann praktikabel erscheint. Überdies dient die vorstehende Beschreibung nur zur Veranschaulichung der Erfindung und nicht zur Einschränkung des Schutzbereichs, der ausschließlich durch die beigefügten Patentansprüche unter Berücksichtigung etwaig vorhandener Äquivalente definiert wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2010085720 A1 [0009]
DE 102018112538 B3 [0011]
US 20190362958 A1 [0011]
GB 2574709 A [0011]
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US 20130056628 A1 [0022]
DE 102016124889 A1 [0029]
GB 2558741 A [0029]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Jens Soltwisch et al. (Science, 10 April 2015 · Vol 348, Issue 6231, 211-215 [0006]
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Claims

Verfahren zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial, das auf einem Probenträger abgelegt ist, aufweisend: - wiederholt lokales Beaufschlagen von Probenmaterial auf dem Probenträger unter Verwendung einer ersten energetischen Strahlung und Herbeiführen von lokaler Desorption von Probenmaterial in die Gasphase über dem Probenträger, dabei eine Relativposition der ersten energetischen Strahlung zum Probenträger verändernd und eine Vielzahl von Auftreffpunkten am Probenmaterial auf dem Probenträger ins Ziel nehmend; - gepulstes Beaufschlagen des lokal desorbierten Probenmaterials unter Verwendung einer zweiten energetischen Strahlung, die in das desorbierte Probenmaterial gerichtet wird, und Herbeiführen von Ionisierung und/oder Erhöhung eines Ionisierungsgrads des lokal desorbierten Probenmaterials, wobei eine Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung in einer Ebene liegt, die substantiell senkrecht zu einer Flächennormalen des Probenträgers steht und über dem Probenträger angeordnet ist, dabei eine Fokus- und/oder Strahltaillenlage der zweiten energetischen Strahlung derart nachführend, dass sie einem aktuellen Auftreffpunkt am Probenmaterial auf dem Probenträger substantiell gegenüberliegt; und - Überführen von ionisiertem Probenmaterial, das aus dem lokal desorbierten und mit der zweiten energetischen Strahlung beaufschlagten Probenmaterial hervorgegangenen ist, in eine Ionenverarbeitungseinrichtung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eine Einfallsrichtung der ersten energetischen Strahlung relativ zu einer Flächennormalen des Probenträgers verändert und eine Vielzahl von Auftreffpunkten ins Ziel genommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem das Probenmaterial mit einer lichtabsorptionsfähigen Matrixsubstanz präpariert worden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Probenmaterial eine Vielzahl von Punktpräparationen oder einen flächigen Gewebeschnitt aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Probenträger als Glasplatte, Metallplatte oder Keramikplatte ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die erste energetische Strahlung und/oder die zweite energetische Strahlung von einem Pulslaser geliefert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Relativposition des Probenträgers zur ersten energetischen Strahlung und/oder die Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung unter Verwendung eines oder mehrerer Spiegel und/oder einer oder mehrerer Linsen verändert bzw. nachgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Ionenverarbeitungseinrichtung als Analysator ausgebildet ist, insbesondere als Mobilitätsanalysator, Massenanalysator oder gekoppelter Mobilitäts-Massenanalysator.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Fokus- und/oder Strahltaillenlage der zweiten energetischen Strahlung (i) senkrecht zur und/oder (ii) entlang der Ausbreitungsrichtung der zweiten energetischen Strahlung nachgeführt wird.
Vorrichtung zum Desorbieren und Ionisieren von Probenmaterial, das auf einem Probenträger abgelegt ist, aufweisend: - eine Desorptionseinrichtung zur Erzeugung und Führung der ersten energetischen Strahlung; - eine Ionisierungseinrichtung zur Erzeugung und Führung der zweiten energetischen Strahlung; - eine erste Verstelleinrichtung zur Einstellung und Änderung der Relativposition der ersten energetischen Strahlung zum Probenträger; - eine zweite Verstelleinrichtung zur Einstellung und Nachführung der Fokus- und/oder Strahltaillenlage der zweiten energetischen Strahlung; und - ein Leitsystem, das mit der Desorptionseinrichtung, Ionisierungseinrichtung, ersten Verstelleinrichtung und zweiten Verstelleinrichtung kommuniziert und dazu ausgelegt und programmiert ist, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 abzustimmen und auszuführen.