DE102007035827B4

DE102007035827B4 - Präparative Ionenmobilitätsspektrometrie

Info

Publication number: DE102007035827B4
Application number: DE102007035827A
Authority: DE
Inventors: Gökhan Baykut; Jonas Bergquist
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2006-08-17
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2027-08-01
Also published as: US20080042055A1; GB2441200B; US8188424B2; GB2441200A; GB0715639D0; DE102007035827A1

Abstract

Eine Methode zum Trennen von Substanzen, bestehend aus den Schritten: (a) Erzeugen von Ionen aus Substanzen, (b) Trennen der Ionen nach ihrer Ionenmobilität, (c) Ablagern der nach Mobilität getrennten Ionen auf räumlich getrennten Stellen auf einem Auffänger, und (d) Wiederholung der Schritte (a) bis (c), wobei die im Schritt (b) nach Mobilität getrennten Ionen gleicher Mobilität bei jedem Wiederholungszyklus an den gleichen Stellen auf dem Auffänger abgelagert werden, so dass eine kumulative Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen auf dem Auffänger erreicht wird.

Description

Hintergrund der Erfindung
Mit Einführung der Verfahren zur Elektrospray-Ionisierung (ESI) und matrixunterstützten Laserdesorption (MALDI) hat die Massenspektrometrie in der analytischen Chemie großer Moleküle und Biopolymere in den letzten zwei Jahrzehnten enorme Fortschritte gemacht. Durch Massenspektrometer mit Massennachweisfunktionen höherer Genauigkeit (z. B. Fourier-Transform-Ionen-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometer, FT-ICR MS oder orthogonale Elektrospray-Flugzeit-Massenspektrometer ESI-TOF MS) wurden bereits einige Anforderungen hinsichtlich der Messung genauer Massen erfüllt. Zusätzlich konnten durch Messungen der Fragment-Ionen wichtige Strukturinformationen über ausgewählte Ionen ermittelt werden, insbesondere durch Kollisionen mit neutralen Teilchen (Stoßfragmentierung, CID), durch sequentielle Absorption mehrerer Infrarot-Photonen von einem CO₂-Laser (IRMPD), durch Einfangen von Elektronen geringer Energie (ECD) oder durch Elektronenübertragung von einem negativen Ion (Elektronen-Transfer-Dissoziation, ETD).
In der Biochemie, insbesondere zur Kennzeichnung von Proteinen, ist die Sequenz der Aminosäuren eine wichtige analytische Information. Doch die physiologische Aktivität eines Proteins hängt nicht nur von der Sequenz ihrer Aminosäuren ab. Proteinketten bilden durch Faltung sekundäre Strukturen (Alpha-Helices, Beta-Faltblätter), die wiederum durch Faltung tertiäre Strukturen erzeugen, die stabilere Konformationen darstellen. Zusätzlich bilden einige gefaltete Proteineinheiten in manchen Fällen nicht kovalente Agglomerate (quaternäre Strukturen): Hämoglobin z. B. bildet eine tetramere Struktur mit zwei Alpha- und zwei Betaketten.
Neueste Versuche mit Proteinen lehren uns, dass neurodegenerative Störungen wie Alzheimer, Parkinson, Huntington, amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) oder die entsprechend auf den Menschen übertragbare Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD) in engem Zusammenhang mit einer gestörten Faltung von Proteinen stehen. Damit hat die Ermittlung von Informationen über tertiäre Proteinstrukturen in der Forschung stark an Bedeutung gewonnen. Bei der Erforschung physiologischer Aktivitäten von Proteinen stellen die Informationen über ihre Faltungsgeometrie eine Ergänzung zu den Informationen über ihre grundlegende Aminosäurensequenz dar.
Die gesamten geometrischen Änderungen von Proteinen werden auch durch andere Effekte festgestellt: Viele Proteine werden posttranslational geändert. Etwa 70% der aktiven Proteine im menschlichen Organismus sind glycosyliert. Posttranslationale Modifikationen (PTM) führen auch zu Unterschieden in der Proteingeometrie. Modifizierte Proteine, die eine Anzahl polarer Gruppen wie Phosphate oder Zuckergruppen enthalten, erhöhen ihre potenzielle Energie sowohl durch sterische wie auch durch elektronische Interaktionen innerhalb des Moleküls. Die Konformation des Moleküls ändert sich, so dass die neuen Gruppen aufgenommen werden, ohne dass das Molekül nennenswert an Stabilität verliert. Daher können phosphorylierte und glycosylierte Proteine eine andere Gesamtgeometrie haben als ihre nicht modifizierten Äquivalente. Posttranslationale Modifikationen ändern offenbar die Masse des Proteins, wodurch sich die Gesamtmasse eines modifizierten Proteins ändert. Proteine mit nur geringen Unterschieden, wie z. B. posttranslationalen Modifikationen, sind Isoformen. Isoformen können auch sehr unterschiedliche geometrische Querschnitte haben. Die strukturelle Kennzeichnung verschiedener Isoformen großer Proteine durch Bestimmung von Positionen, Anzahl und Art bestimmter Modifikationen kann schwierig sein, wenn die gängigsten Fragmentierungsmethoden CID oder IRMPD verwendet werden, da die Gruppen posttranslationaler Modifikationen bei diesen Prozessen nicht geschützt sind und in der Regel verloren gehen. Nur die Methoden ECD und ETD können die posttranslationalen Modifikationen erhalten, doch beide sind auf bestimmte Typen von Massenspektrometern beschränkt.
Strukturelle oder konformative Isomere haben ein unterschiedliches Erscheinungsbild, doch genau die gleiche Masse. Damit können sie in der regulären Massenspektrometrie nicht als unterschiedliche Arten erkannt werden. Eine der effizientesten Methoden zum Erkennen und Trennen struktureller oder konformativer Isomere ist die Ionenmobilitätstrennung. Ionen werden in einer Ionenmobilitätszelle beschleunigt. Eine Ionenmobilitätszelle enthält ein inertes Kollisionsgas (z. B. Helium). Ionen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt. Aufgrund der Kollisionen mit Gasmolekülen sind die Ionen auch einer Widerstandskraft ausgesetzt und bewegen sich daher mit konstanter Geschwindigkeit proportional zum elektrischen Feld durch die Zelle. Die Proportionalitätskonstante wird als „Ionenmobilität” bezeichnet und ist eine Funktion der Temperatur, des Drucks, der Ionenladung, des Ionenkollisionsquerschnitts und der reduzierten Masse. Ionen mit identischer Masse, doch unterschiedlichen Kollisionsquerschnitten sind unterschiedlich mobil. Wenn unterschiedliche konformative Isomere derselben Verbindung in einer Ionenmobilitätszelle beschleunigt werden, hat das Isomer mit dem kleinsten geometrischen Querschnitt die höchste Ionenmobilität. Protonierte Moleküle eines eng gefalteten Proteinkonformers haben einen kleineren geometrischen Querschnitt und sind daher bei ihrem Flug durch die Mobilitätszelle einer kleineren Anzahl von Kollisionen ausgesetzt. Ionen mit offener (nicht gefalteter) Konformation kollidieren häufiger und fliegen daher langsamer als das eng gefaltete Isomer mit gleichem Masse-zu-Ladungsverhältnis. Nicht gefaltete Isomere verlassen die Mobilitätszelle zu einer späteren „Ankunftszeit” ( ).
Die Informationen auf Basis von Messungen der Ionenmobilität werden auf unterschiedlichen Ebenen gewonnen. Ionen mit genau identischem Masse-zu-Ladungsverhältnis, doch unterschiedlicher Konformation, werden getrennt gemessen. Aus den Absolutwerten der Ionenmobilitätsquerschnitte in einem bestimmten Kollisionsgas (z. B. Helium) lassen sich verschiedene Ionenkonformationsmöglichkeiten errechnen, indem die verfügbaren Kraftfeldprogramme verwendet werden, wie z. B. AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement) oder CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics). Bei der Massenspektrometrie mit Ionenmobilitätstrennung werden auch häufig die relativen geometrischen Querschnitte gemessen, um Änderungen zu untersuchen und die Existenz unterschiedlicher isomerer Strukturen zu erfassen.
In der Vergangenheit wurden Ionenmobilitätsspektrometer hauptsächlich zum Nachweis chemischer Kampfstoffe, Arzneimittel und Sprengstoffe eingesetzt. Bei Ionenmobilitätsspektrometern, die speziell zum lokalen Nachweis dieser Verbindungsklassen gebaut sind, handelt es sich meist um handgeführte Detektoren. Die Ionenmobilitätstrennung in diesen Geräten erfolgt in einem Kollisionsgas bei Atmosphärendruck. Im Gegensatz zu Massenspektrometern ist in diesen Ionenmobilitätsspektrometern kein Vakuum erforderlich. Damit werden in diesen Geräten keine teuren Pumpensysteme benötigt, und ihre Produktion ist relativ kostengünstig.
In den letzten Jahren wurden mit zunehmender Bedeutung der Ionenmobilitätstrennung für die chemische und biologische Forschung Ionenmobilitätstrennzellen in Massenspektrometersysteme integriert, um die Ionenquerschnittsinformation isomerer Verbindungen mit ihrer Masseninformation zu kombinieren. Ein wesentlicher Nachteil dieser hybriden Instrumente ist der hohe Druckbereich der Ionenmobilitätstrennung, der mit dem Rest der Massenspektrometrie-Ausrüstung nicht unbedingt kompatibel ist. Für Ionenmobilitätstrennungen sind Drücke von mindestens 1 mbar erforderlich, wobei als Kollisionsgas meist Helium (manchmal auch Argon) verwendet wird. Hochdruckzellen bilden in Massenspektrometer-Vakuumsystemen stets eine Herausforderung für das Pumpensystem. Große Pumpen sind zum Herauspumpen des Kollisionsgases in den Hochdruckkammern unerlässlich. Außerdem müssen Hochdruckkammern durch sorgfältig konstruierte Pumpenstufen vom übrigen Massenspektrometer isoliert werden. Diese Maßnahmen erhöhen den Raumbedarf für die Ionenmobilitätsseparatoren, die bauliche Komplexität dieser hybriden Systeme und die Endkosten der Ausrüstung. Lösungen erfordern stets Kompromisse auf beiden Seiten. Weitere Probleme entstehen durch Koppeln der Ionenmobilitätszelle mit einem nachgeschalteten Analysator (z. B. Massenanalysatoren) hinsichtlich der Zeit, zu der die nach Mobilität getrennten Ionen die Ionenmobilitätstrennzelle verlassen und in den Analysator (z. B. Massenanalysator) gelangen. Der nachgeschaltete Analysator muss in der Regel deutlich schneller arbeiten als die Ionenmobilitätstrennung, was nicht einmal bei Massenanalysatoren mit schneller Spektrenaufnahme wie Flugzeit-Massenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS) leicht zu erreichen ist. Bei einer Mobilitätszelle mit üblichen Maßen erfolgt die Trennung der konformativen Isomere von Proteinen z. B. im Hundert-Mikrosekunden-Bereich. Wie bereits erwähnt, wird eine masenspektrometrische Messung dieser Trennung selbst bei Flugzeit-Massenspektrometern zu einer Herausforderung. Andere Massenspektrometer sind deutlich langsamer. Bei der Fourier-Transform-Ionen-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometrie (FT-ICR MS) kann die Zeit vom Ionisierungsprozess bis zum Nachweis mehrere hundert Millisekunden bis zu mehrere Sekunden betragen. Es gibt praktisch keinen Weg, alle Ionen für ein Ionenmobilitätstrennspektrum vollständig zu nutzen. Der einzige Weg, ein hybrides FT-ICR MS-Ionenmobilitätsinstrument zu verwenden, ist die Zeitscheibenmethode. Ionen eines vordefinierten Ionenmobilitätsfensters können in einer linearen HF-Multipol-Ionenfalle eingefangen, gesammelt und dann zur Analyse in die Ionen-Cyclotron-Resonanzzelle übertragen werden. Eine Online-Analyse eines vollständigen Ionenmobilitätsspektrums ist hier aus Zeitgründen nicht möglich.
In regulären Ionenmobilitätsspektrometern befindet sich am Ausgang der Ionenmobilitätstrennzelle ein Gerät für den Ionennachweis. In den letzten Jahren wurden Ionenmobilitätstrennung und Massenspektrometrie kombiniert, um die nach Mobilität getrennten Isomere durch Massenspektrometrie analysieren zu können. Die US 5 905 258 A (David E. Clemmer und James P. Reilly) und US 6 960 761 B2 (David E. Clemmer) beschreiben massenspektrometrische Systeme, die mit Geräten zur Ionenmobilitätstrennung ausgestattet sind.
Die Patentanmeldung US 2005/0189485 A1 (McLean et al.) offenbart Verfahren und Vorrichtungen für die Gasphasen-Separation ionischer Biomoleküle, einschließlich Peptide und Protein- oder inorganische Clusterionen oder Nanopartikel, mittels Ionenmobilität und zum intakten, ortsaufgelösten Ablagern dieser auf einer Oberfläche. Die Oberfläche, die als Substrat der abzulagernden Proteine dient, kann mit dem Ziel modifiziert werden, Mikroarrays biologisch relevanter Substanzen zu schaffen oder das Wachstum von Proteinkristallen hoher Ordnung zu fördern.
Die Patentanmeldung US 2003/0226963 A1 (Cooks et al.) wiederum beschreibt ein Trennverfahren, das auf eine Mischung von Molekülen, Partikeln oder Atomen anwendbar ist, mit darauf folgender Lokalisierung der getrennten Spezies. Gemäß dem Verfahren werden die Spezies in einem Ionisierungsschritt in Gasphasen-Ionen umgewandelt, diese Ionen werden sodann nach ihrer Mobilität und/oder ladungsbezogenen Masse separiert, und die getrennten Ionenspezies werden schließlich auf einer Oberfläche abgelagert.
Zusammenfassung der Erfindung
Vorliegende Erfindung besteht aus einer Einrichtung und einer Methode zum Erzeugen von Ionen, Trennen dieser Ionen nach ihrer Mobilität und Ablagern der nach Mobilität getrennten Ionen auf einem Zielobjekt, das nachfolgend als „Auffänger” bezeichnet wird. Die nach Mobilität getrennten Ionen können vor ihrer Ablagerung auf dem Auffänger räumlich fokussiert werden. Das Ablagern kann durch weiches Landen ohne Fragmentierung oder durch Bruchlandung mit Fragmentierung erfolgen. Nach Mobilität getrennte Ionen mit unterschiedlicher Ionenmobilität werden an räumlich getrennten Stellen auf dem Auffänger abgelagert. Dies erfolgt durch Verschieben des Auffängers oder durch Verwenden ionenablenkender Optiken, um nach Mobilität getrennte Ionen unterschiedlicher Mobilität an räumlich unterschiedliche Stellen auf dem Auffänger zu übertragen. Die Schritte des Erzeugens, Trennens und Ablagerns werden wiederholt, wobei die nach Mobilität getrennten Ionen gleicher Mobilität bei jedem Wiederholungszyklus an den gleichen Stellen auf dem Auffänger abgelagert werden, so dass eine kumulative Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen auf dem Auffänger erreicht wird. Ein grundlegender Vorteil dieser Erfindung ist die neue Option zur Analyse der nach Mobilität getrennten Ionen durch Aufteilung der Ionenmobilitätstrennungs- und Analyseprozesse in zwei grundsätzlich unterschiedlichen Geräten. Um die abgelagerten Ionen zu analysieren, wird der Auffänger entfernt und in ein Analyseinstrument eingeführt. Es können verschiedene physikalische, chemische oder biologische Analyseverfahren und -instrumente verwendet werden, wie z. B. Massenspektrometrie- oder Oberflächenanalyseverfahren, indem ein spezieller für das gewünschte Analyseverfahren geeigneter Auffänger gewählt wird. Die auf dem Auffänger abgelagerten getrennten Verbindungen können unter vordefinierten Bedingungen aufrecht erhalten und später in einem geeigneten Analyseinstrument verwendet werden, das im Prinzip viel langsamer als das Ionenmobilitätsspektrometer arbeiten kann: Die Analyse kann weitaus länger dauern als der Prozess der Ionenmobilitätstrennung.
Je nach den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Ablagerungsfläche und der chemischen Zusammensetzung der Ionen können diese bekanntlich als Ionen abgelagert oder während bzw. nach dem Ablagerungsprozess neutralisiert werden und als neutrale Spezies auf der Oberfläche bleiben. Der Ausdruck „Ionenablagerung” wird nachfolgend unabhängig davon verwendet, ob der Ionencharakter der abgelagerten Spezies in der abgelagerten Phase erhalten bleibt. Entsprechend werden die abgelagerten Spezies, die in der Gasphase vor der Ablagerung Ionen waren, nachfolgend als „abgelagerte Ionen” bezeichnet. Nach dem Ablagern kann es sich dabei weiterhin um Ionenspezies handeln oder es kann der Ionencharakter verloren gegangen sein.
Um intakte Ionen abzulagern, ist deren kinetische Energie bei Annäherung an den Auffänger auf einem sehr geringen Wert zu halten und sorgfältig zu kontrollieren. Andererseits ist eine kontrollierte Ionenfragmentierung, wie von Massenspektrometrieverfahren bekannt, eine wertvolle Quelle für Strukturinformationen. Somit ist es zusätzlich zum Ablagern intakter Ionen eines bestimmen Ionenmobilitätsfensters durch weiches Landen ebenfalls wichtig, Ionen durch „Bruchlandung” an räumlich unterschiedlichen, doch zugewiesenen Stellen abzulagern. In diesem Fall ist die kinetische Energie der Ionen höher einzustellen (bei Bedarf schrittweise) und es werden Ionen durch härteres Landen abgelagert. Dies wird nachfolgend als „Bruchlandung” bezeichnet. Bei diesem Prozess werden fragmentierte Ionen abgelagert, die bereits die Strukturinformationen enthalten. In anderen Worten, dies ist ein Weg zum Ablagern der Fragmentierungsinformationen. Wenn der Auffänger später von einem massenspektrometrischen Analysesystem untersucht wird, kann die bereits abgelagerte Fragmentierungsinformation zufriedenstellend sein. Eine zusätzliche Fragmentierung im Massenspektrometer ist für Strukturuntersuchungen möglicherweise nicht erforderlich.
Mit dem Ionenmobilitätsspektrometer gemäß dieser Erfindung können Ionen wiederholt in die Ionenmobilitätstrennzelle gepulst und die nach Mobilität getrennten Ionen wiederholt an räumlich getrennten Stellen auf dem Auffänger abgelagert werden. Der Zyklus der Pulse, Trennungen und Ablagerungen kann mit der Bewegung (z. B. Drehung) des Auffängers oder mit der Bewegung des Ionenstrahls synchronisiert werden, so dass Ionen aus demselben Ionenmobilitätszeitfenster stets an der gleichen Stelle abgelagert werden. Dies ermöglicht eine kumulative Ablagerung.
Die Ionen können auch in Bezug auf ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis vor der Trennung in der Ionenmobilitätstrennzelle gewählt oder getrennt werden, indem ein Massenanalysator wie z. B. ein Quadrupol-Massenfilter oder eine 2D- oder 3D-Quadrupol-Ionenfalle verwendet wird.
Zur weichen Landung getrennter Ionen müssen Ionen auf sehr geringe Energien abgebremst und die kinetische Energie bei diesem Landeprozess sorgfältig kontrolliert werden. Andererseits müssen die getrennten Ionen zum Landen auf räumlich getrennte Stellen fokussiert werden. Daher wird eine Ionenoptik verwendet, die eine Einzellinse oder einen speziellen Linsenstapel enthält, um die kinetische Energie getrennter Ionen zu steuern und diese auf einzelne Stellen des Auffängers zu fokussieren. Wie oben erwähnt, kann die Ionenoptik zum Ablagern auch Ionenablenkungsoptiken enthalten.
Die Temperatur des Auffängers ist ein wichtiger Parameter für einige der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Auffängers oder für die Beschichtung der Auffängeroberfläche, insbesondere die Viskosität und den Dampfdruck einer strömungstechnischen Schicht. Er muss bei Bedarf abgekühlt oder beheizt werden. Daher ist es günstig, wenn der Auffänger temperaturgesteuert ist.
Die in dieser Erfindung zu verwendende Ionenmobilitätstrennzelle kann eine lineare Ionenmobilitätstrennzelle oder auch ein Gerät zur Trennung nach Mobilität auf Basis anderer Technologien sein, um eine getrennte Ablenkung der Ionen zu erreichen. Die Ionen kommen nicht nur zeitlich getrennt an, sondern landen direkt auf räumlich getrennten Detektoren. Zum Trennen können auch Varianten von FAIMS-Zellen (Field Asymmetric Waveform Ion Mobility) verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
(Stand der Technik) zeigt schematisch das Prinzip der Ionenmobilitätstrennung am Beispiel von Proteinen. Proteinionen mit identischem Masse-zu-Ladungsverhältnis, doch unterschiedlichen Faltungszuständen gelangen in die Ionenmobilitätstrennzelle. Diagramm 1a zeigt, dass die Proteine gleichzeitig und pulsförmig in die Ionenmobilitätszelle gelangen. Diagramm 1b zeigt ein Schema einer Ionenmobilitätstrennzelle. Proteinionen mit offenem Faltungszustand sind einer größeren Anzahl von Kollisionen ausgesetzt und verbringen mehr Zeit in der Mobilitätszelle als die Isomere mit kompaktem Faltungszustand. Die kompakten Ionen verlassen die Zelle somit früher, und die größeren folgen später. Diagramm 1c zeigt die Reihenfolge, in der die Ionen die Zelle verlassen. Obwohl gefaltete sowie nicht gefaltete Proteinionen auf ihrem Weg durch die Mobilitätszelle zum Rotieren neigen, ist der durchschnittliche geometrische Querschnitt nicht gefalteter Ionen aufgrund der Verzögerung und einer längeren Retentionszeit größer.
zeigt die Funktionskomponenten einer Vorrichtung zur Trennung und Ablagerung von Ionen nach Mobilität, bestehend aus einer Ionentrichter-Elektrosprühquelle, einer linearen HF-Hexapolfalle zur Ionenspeicherung, einem Massenselektionsquadrupol, einem außeraxialen Ionendetektor, einer Ionenmobilitätstrennzelle, einer energiesteuernden, fokussierenden und ablenkenden Ionenoptik zum Ablagern und einem rotierenden Auffänger zur Unterstützung der räumlich getrennten Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen. Die Vakuumstufen sind in dieser Abbildung nicht dargestellt.
zeigt die Funktionskomponenten einer Vorrichtung zur Trennung und Ablagerung von Ionen nach Mobilität, bestehend aus einer Ionentrichter-Elektrosprühquelle, einer linearen HF-Hexapolfalle zur Ionenspeicherung, einem Massenselektionsquadrupol, einem außeraxialen Ionendetektor, einer Ionenmobilitätstrennzelle, einem Ionenselektor, einer weiteren linearen HF-Hexapolfalle zum Ioneneinfang, einer Ionenoptik zur Ablagerung und einem rotierenden Auffänger zur Unterstützung der räumlich getrennten Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen. Die Vakuumstufen sind in dieser Abbildung nicht dargestellt.
zeigt die Funktionskomponenten einer Vorrichtung zur Trennung und Ablagerung nach Ionenmobilität, bestehend aus einer Ionentrichter-MALDI-Quelle für die MALDI-Abbildung einer dünnen Gewebeschicht, einem linearen HF-Hexapol zum Ionenfang, einem Massenselektionsquadrupol, einem außeraxialen Ionendetektor, einer Ionenmobilitätstrennzelle, einer Ionenoptik zur Ablagerung und einem rotierenden Auffänger zur Unterstützung der räumlich getrennten Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen. Die Vakuumstufen sind in dieser Abbildung nicht dargestellt.
zeigt die Funktionskomponenten einer Vorrichtung zur Trennung und Ablagerung von Ionen nach Mobilität, bestehend aus einer Ionentrichter-Elektrosprühquelle, einer linearen HF-Hexapolfalle zur Ionenspeicherung, einem Quadrupol-Massenfilter, einem außeraxialen Ionendetektor, einer Ionenmobilitätstrennzelle, einer Ionenoptik zum Ablagern und einem Auffänger. In diesem Fall ist der Auffänger eine rotierende zylindrische Trommel. Die Vakuumstufen sind in dieser Abbildung nicht dargestellt.
zeigt die Funktionskomponenten einer Vorrichtung zur Trennung und Ablagerung von Ionen nach Mobilität, bestehend aus einer Ionentrichter-Elektrosprühquelle, einer linearen HF-Hexapolfalle zur Ionenspeicherung, einem Massenselektionsquadrupol, einem außeraxialen Ionendetektor, einem zweiten HF-Hexapol, einer Ionenmobilitätstrennzelle, einem Ionenselektor, einer dritten linearen HF-Hexapol-Ionenfalle, einer energiesteuernden, fokussierenden und ablenkenden Ionenoptik zur Ablagerung und einem Auffänger. Die Vakuumstufen sind in dieser Abbildung nicht dargestellt.
zeigt ein Beispiel einer energiesteuernden, fokussierenden und ablenkenden Ionenoptik zur Ablagerung. Sie enthält eine Ionenlinse und ein zweidimensionales Ionenablenksystem. Die abzulagernden Ionen kommen von der Trennung, passieren die Ablagerungsionenlinse und werden zu den getrennten Stellen auf dem Auffänger abgelenkt und dort abgelagert. Die Rotations- und Translationsbewegung des Auffängers kann die Bewegung des abgelenkten Strahls auch begleiten, um beim Ablagern der nach Mobilität getrennten Ionen die relative Umschaltgeschwindigkeit zwischen den Stellen zu erhöhen.
zeigt die Kombination eines Systems zur Trennung und Ablagerung von Ionen nach Mobilität mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. Das Ionenmobilitätssystem in dieser Abbildung ist mit dem in grundsätzlich identisch. Doch in diesem speziellen Fall ist der Auffänger eine Laserzielplatte für die MALDI-Massenspektrometrie. Das hier dargestellte System hat eine Transferkammer mit einer Vakuumverriegelung zwischen dem Teil zur Ionenablagerung nach Mobilität und dem Massenspektrometer.
zeigt ein System zur Trennung und Ablagerung von Ionen nach Mobilität, das dem in grundsätzlich entspricht. In diesem Fall ist der Auffänger jedoch ein Mehrdüsen-Nanoelektrospray-Chip. Die Ablagerung erfolgt auf der Rückseite eines Mehrdüsen-Nanospray-Chips. Nach der Ablagerung werden die Ablagerungen auf dem Spray-Chip in einer besonderen Elektrospray-Quelle eines orthogonalen Flugzeit-Massenspektrometers analysiert.
Bevorzugte Ausführungsformen
Bei vorliegender Erfindung sind Ionenmobilitätstrennung und massenspektrometrischer Nachweis getrennt. Diese beiden Prozesse, die in zwei getrennten Instrumenten ausgeführt werden, lösen die vakuumsystembezogenen Probleme der Massenspektrometrie. Durch Unterteilung von Ionenmobilitätstrennung und Analyse entfallen auch alle mit einer Nachweiszeitbegrenzung verbundenen Probleme. Außerdem werden bei dieser Erfindung Ionen unter idealen Bedingungen der Ionenmobilitätsspektrometrie generiert und in einer Zelle nach Mobilität getrennt. Anschließend werden die getrennten Ionen durch weiches Landen auf einem Auffänger abgelagert, der als Träger für Proben zur Analyse der abgelagerten Ionen dient. Da das Ionenmobilitätsspektrometer vom Analysesystem getrennt ist, können das Ionenmobilitätsspektrometer und das Analysesystem unter ihren jeweiligen Idealbedingungen arbeiten. Wenn die Ablagerung abgeschlossen ist, wird der Auffänger als Probenträger zum Analysegerät überführt.
Sobald die nach Mobilität getrennten Ionen abgelagert sind, können sie einer physikalischen, chemischen oder biologischen Analysemethode unterzogen werden, wobei ganz andere Bedingungen eingestellt werden können als zur Ionenmobilitätstrennung erforderlich. Das Analysegerät zur Untersuchung der abgelagerten Ionen kann ein Massenspektrometer mit einer Laserdesorptions-Ionisierungsquelle (mit oder ohne Verwendung einer Matrixsubstanz) oder mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle sein. Es kann sich auch um ein Oberflächen-Plasmon-Resonanzgerät, ein Photoelektron-Spektrometer, ein Rasterkraftmikroskop, ein Raster-Tunnel-Mikroskop, ein Feldionenmikroskop oder ein Feinstrukturanalysegerät mit Röntgenstrahlenabsorption handeln. Vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit zum Ablagern der nach Mobilität getrennten Ionen auf einem Auffänger als geeignetem Probenträger speziell für die anschließend zu verwendende gewählte Analysemethode. Der Auffänger kann somit ein Probenträger für Oberflächenanalyseverfahren sein, die in Photoelektronenspektroskopie, Rasterkraftmikroskopie, Oberflächenplasmonresonanz, SIMS, Auger-Elektronenspektroskopie, ballistischer Elektronenmikroskopie, Raster-Tunnelmikroskopie, erweiterter Feinstrukfuranalyse mit Röntgenstrahlenabsorption, Feldionenmikroskopie, Feldemissionsmikroskopie oder Fourier-Transform-IR-Reflexionsspektroskopie bestehen.
Der Auffänger zur Ionenablagerung kann somit aus verschiedenen Materialien (z. B. Metall, Keramik, Glas, Polymer) in verschiedenen Formen (z. B. einfache rechteckige Plattform, Scheibe oder zylindrische Trommel) bestehen, und die Oberfläche kann verschiedene Strukturen (z. B. belegt, gequollen, blank oder porös) haben und physikalisch, chemisch, biochemisch oder biologisch vorbereitet sein (z. B. beschichtet, um eine geeignete Dielektrizitätskonstante, Hydrophobie, Azidität, Basizität zu erreichen, oder eine Oberfläche mit einer strömungstechnischen Schicht oder eine Oberfläche, die mit ausgewählten Bakterien, Zellen, Enzymen, immobilisierten Proteinen oder Antikörpern bedeckt ist), um die weich landenden Ionen anzunehmen und intakt zu halten. Wenn die Oberfläche des Auffängers mit einer strömungstechnischen Schicht bedeckt ist, sollten die Eigenschaften dieser Schicht, wie z. B. ihre chemische Zusammensetzung, Azidität, Basizität, Hydrophobie, Dielektrizitätskonstante, Viskosität und ihr Dampfdruck, für die Ablagerung der gewünschten Ionen optimiert werden. Für die Ablagerung mancher Proteine können strömungstechnische Oberflächen auf Basis von Mischungen aus Glyzerin und verschiedenen Zuckerlösungen vorbereitet werden. Eine angemessene physikalische, chemische oder biochemische Behandlung der Auffängeroberfläche ist erforderlich, um eine geeignete Oberfläche für chemische oder biochemische Analysemethoden zu erhalten, wie z. B. immunhistochemische Analyse, affinitätsbasierte Nachweisverfahren, Verwendung von Aptameren, Affibodies oder Antikörpern.
Die abgelagerten Ionen können durch physikalische Anlagerung oder durch chemische Bindung auf dem Oberflächenmaterial gehalten werden. Letztere kann eine schwache nicht kovalente Wechselwirkung zwischen der Oberfläche und den abgelagerten Ionen oder eine ionische oder kovalente chemische Bindung sein. Während der Ablagerung von Ionen auf einer porösen Oberfläche des Auffängers können die auf der Oberfläche abgelagerten Ionen in die Poren gelangen und deren Oberfläche bedecken, so dass praktisch ein Volumenprozess stattfindet. Wenn abgelagerte Ionen eine chemische Reaktion mit der Oberfläche eingehen, die sich in der festen Phase fortsetzt, kann die Ablagerung in diesem Fall ein echter Volumenprozess werden.
Um während der Ablagerung jede Stelle auf der Oberfläche des Auffängers zu erreichen, kann entweder der Ionenstrahl mit geeigneten Ionenoptiken umgelenkt oder der Auffänger verschoben werden. Wenn der Ablagerungsionenstrahl ortsfest ist, kann durch Kombination von Linear- und Rotationsbewegungen des Auffängers jeder Punkt der Auffängeroberfläche erreicht werden. Wenn der Ablagerungsstrahl bewegt wird, können komplexere Bewegungen programmiert werden, um jede Stelle auf dem Auffänger zu erreichen. Um die Verteilungsgeschwindigkeit zu erhöhen, können sowohl der Ablagerungsstrahl als auch der Auffänger mit geeigneten Softwaretools bewegt werden.
Die Verwendung einer rotierenden Platte oder einer rotierenden zylindrischen Trommel als Auffänger hat viele Vorteile, insbesondere bei der Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen mit kurzen Zeitunterschieden untereinander. Ein rotierender Auffänger kann mit dem Ablagerungspuls eines getrennten Ionentyps synchronisiert werden, so dass an genau der gleichen Stelle dieselben Isomere abgelagert werden können. Die Trennung in regulären Ionenmobilitätstrennzellen kann in der Größenordnung einiger hundert Mikrosekunden liegen. Die Ansteuerung der x-y-Bewegungen ist bei einer ebenen Platte normalerweise zu langsam, um zwischen verschiedenen Stellen auf dem Auffänger umzuschalten und die abgelagerten Ionen dadurch räumlich zu trennen. Die Drehgeschwindigkeit ist ein zusätzlicher Faktor, um die Auflösung der Ablagerung zu bestimmen.
Zur Anwendung der anderen schnellen Methode zur Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen, bei der der Ionenstrahl bewegt wird, kann ein Ionendeflektor verwendet werden. Das einfachste Beispiel für einen Ionendeflektor ist ein Plattenpaar mit einer Potenzialdifferenz. Um die Richtung eines Ionenstrahls in zwei Dimensionen (x und y) zu steuern, sind zwei Plattenpaare erforderlich, eins für die x- und eins für die y-Richtung. Es können auch komplexere Mehrelektroden-Strahldeflektoren verwendet werden. Eine computergesteuerte Bewegung des Ionenstrahls sowie des Auffängers erhöht die Geschwindigkeit der räumlich getrennten Ablagerung.
Bei größeren Ionendriftabständen in einer Mobilitätszelle neigen die Ionen dazu, sich durch radiale Diffusion von der Achse zu entfernen und ihre Fokussierung zu verlieren. Um diesen Effekt zu verhindern, kann die Ionenmobilitätstrennung in einem hochfrequenten elektrischen Multipolfeld stattfinden, um die Ionen bei ihrem axialen Flug durch die Zelle zu lenken und eine radiale Diffusion zu verhindern. Das US-Patent 6,630,662 B1 von Alexandre V. Loboda beschreibt eine HF-Quadrupol-Ionenführung mit aufgeteilten Elektroden zum Anlegen eines axialen elektrischen Felds, das als Ionenmobilitätstrennzelle verwendet wird. Dadurch können bei Bedarf extrem lange Ionenmobilitätszellen gebaut werden, und längere Ionenmobilitätszellen bewirken eine bessere Auflösung bei der Ionentrennung. In diesem Fall muss die Positionsumschaltung des Auffängers oder Ionenstrahls während der Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen somit nicht all zu schnell sein.
Die kinetischen Energien der Ionen für eine weiche Landung oder Bruchlandung können vom chemischen Aufbau der abzulagernden Ionen abhängen. Dies lässt sich im Zusammenhang mit Bindungsenergien erörtern. Organische Ionen biologischen Ursprungs haben eine große Anzahl von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (Einfach- und Doppelbindungen), Kohlenstoff-Stickstoff-, Kohlenstoff-Sauerstoff- und Phosphor-Sauerstoff-Bindungen. Die kinetischen Energien von Ionen beim Landen bestimmen im Grunde das Ziel der Ionenlandung. Die Energie einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindung beträgt 348 kJ/mol, (3,61 eV), die von Doppel- und Dreifachbindungen liegt deutlich darüber. Die Energie einer Kohlenstoff-Stickstoff-Einfachbindung beträgt 292 kJ/mol, (3,04 eV), und die einer Kohlenstoff-Sauerstoff-Einfachbindung liegt etwa bei 351 kJ/mol (3,66 eV). Bei diesen Werten kann ein Ion, das mit kinetischen Energien über 3 eV landet, für organische Moleküle bereits kritisch sein und eine Bruchlandung verursachen. Daher gewährleisten kinetische, Energien unter 3 eV eine weiche Landung. Obwohl Energien über 3 eV bei großen Ionen wie z. B. protoniertem Insulin (m/z ≅ 5800) ebenfalls zu Bruchlandungen auf dem Auffänger führen können, bewirken Energien etwas über 3 eV möglicherweise keine Fragmentierung. Ein so komplexes Ion hat zahlreiche Freiheitsgrade, und die gewonnene interne Energie verbreitet sich im Molekül in Form von Vibrationen. Das angeregte Ion kann einer unimolekularen Fragmentierung unterliegen, deren Geschwindigkeit von Anzahl und Frequenz ihrer Vibrationsmodi abhängt. Für einfache Fälle in der Gasphase, bei denen Ionen durch Kollisionen mit Molekülen angeregt werden, sind zur Vorhersage unimolekularer Fragmentierungsraten Simulationsverfahren erforderlich, bei denen die Vibrations- und Rotationszustände berücksichtigt werden, so z. B. das bekannte Rice-Ramsperger-Kassel-Markus (RRKM) Verfahren.
Bei der Ablagerung von Proteinionen ist es wünschenswert, auch den Faltungszustand des Proteins beizubehalten. Angesichts der Effekte der kinetischen Energie sollten daher nicht nur die Spaltungen der Bindung berücksichtigt werden, sondern auch mögliche Änderungen bei der Faltung. Bei der Elektrospray-Erzeugung von Peptid- oder einfachen Proteinionen kann es vorkommen, dass diese ihre in der Lösungsphase bestehende Faltung in der Gasphase nicht aufrechterhalten können. Sie ändern ihre Faltung selbst unter diesen milden energetischen Bedingungen und stellen ihre Gasphasenfaltung wieder her. Proteinionen mit größerer Masse und komplizierter Struktur müssen jedoch hohe Energiebarrieren überwinden, um ihren gesamten Faltungszustand zu ändern. Nach Berichten der Bowers Gruppe desolvatisieren komplexe Proteine beim Elektrosprühen und schrumpfen, behalten jedoch ihre grundlegende Struktur aus der Lösungsphase bei (Bernstein, S. L.; Wyttenbach, T. Baumketner, A. Shea, J.-E., Bitan, G.; Teplow, D. B.; Bowers, M. T. Amyloid β-Protein: Monomer Structure and Early Aggregation States of Aβ42 and Its Pro 19 Alloform J. Am. Chem. Soc.; 2005; 127, 2075–2084). Ebenso sind die tertiären Strukturen komplexer Proteine während der Ablagerung von Proteinen bei den weichen Landebedingungen nicht unbedingt leicht zu beeinflussen. Die abgelagerten Ionen können deformiert werden, doch der grundlegende Faltungszustand kann in der abgelagerten Form erhalten bleiben.
Berichte in der Literatur zur Ablagerung von Ionen (die nicht nach Ionenmobilität getrennt sind) zeigen, dass eine sorgfältige Einstellung der kinetischen Energie der abzulagernden Ionen und eine spezielle Vorbereitung der Auffängeroberfläche eine Ablagerung „intakter” Ionen ermöglichen, die die gleiche Konformation wie in der Gasphase haben (Ouyang, Z.; Takats, Z.; Blake T. A.; Gologan, B.; Guymon A. J.; Wiseman J. M., Oliver J. C.; Davisson V. J.; Cooks R. G. Preparing protein microarrays by soft landing of mass-selected ions. Science 2003, 301, 1351–1354). Die Verfasser haben Massenselektions- und Ablagerungsversuche mit Proteinen wie Lysozym, Insulin, Cytochrom C und Apomyoglobin in einem linearen Ionenfalleninstrument mit Elektrosprüh-Ionisierung ausgeführt. Dies geschah durch Sprühen von insgesamt 480 μL einer Lösung (10^–7 bis 10^–6 molar in jedem Protein), um mehrfach geladene Ionen zu bilden. Dabei entstand ein Ionenfluss von 10⁹ bis 10¹⁰ Ionen pro Sekunde. Die beschriebene Rückgewinnung von Proteinmengen im Bereich von 10 ng lässt darauf schließen, dass bei diesen Versuchen eine mehrschichtige Ablagerung erfolgt. In vorliegender Erfindung gewährleisten eine Feinsteuerung der kinetischen Energie der nach Mobilität getrennten Ionen während der Ablagerung und die spezielle Vorbereitung der Auffängeroberfläche für den Typ der abzulagernden Ionen eine Ablagerung mit unveränderter Konformation. Die abgelagerten Ionen können eine mehrmolekulare Schicht bilden, insbesondere bei wiederholten Ablagerungszyklen.
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Auffängers können eine Nutzung der Oberfläche in ihrem bestehenden Zustand zur weiteren analytischen Bestimmung, wie oben beschrieben, ermöglichen. Zur massenspektrometrischen Analyse kann dies durch in-situ-Laserdesorptions-Ionisierung (mit oder ohne Matrixsubstanz) oder durch Extraktion und anschließende Elektrospray-Ionisierung erfolgen. Nach einer weichen Landung von Proteinen wie Lysozym auf selbst-ordnenden einschichtigen Oberflächen als Träger für funktionale Carboxyl- und Pyridin-N-Oxid-Gruppen wird von einem erfolgreichen in-situ-Nachweis durch MALDI-Massenspektrometrie berichtet. Es wurden glyzerinbasierte Flüssigkeitsflächen entdeckt, die ein geeignetes Medium zum weichen Landen für Proteinionen darstellen, da sie beim Landen die Möglichkeit zum Resolvieren bieten, wie in der oben erwähnten Arbeit von Z. Ouyang et al. beschrieben ist. Ablagerungsflächen, die mit einem glyzerinbasierten Ablagerungsmedium beschichtet sind, bieten einen weiteren Nutzen für die analytische Bestimmung der abgelagerten Ionen: Glyzerin ist eine beliebte Matrix für Infrarot-MALDI, wenn ein Erbium-YAG-Laser zur Desorption verwendet wird.
Nach der Ablagerung wird der Auffänger zur weiteren analytischen Bestimmung der nach ihren Ionenmobilitäten getrennten Spezies verwendet. Transfer des Auffängers in ein Massenspektrometer zur Analyse z. B. bei matrixunterstützter Ionisierung durch Laserdesorption (MALDI) ist eine der bevorzugten Methoden. Auch zur oberflächenverbesserten Ionisierung durch Laserdesorption (SELDI) können vorbereitete Oberflächen verwendet werden. Elektrospray-Massenspektrometrie der abgelagerten Ionen ist bei Verwendung des richtigen Auffängers ebenfalls eine Option. Beim Elektrosprühen ist zum Extrahieren und Sprühen der abgelagerten Spezies ein Lösungsmittel erforderlich. Abgelagerte Ionen können auch von der Oberfläche des Auffängers desorbiert werden, indem bei Umgebungsdruck eine Desorptions-Elektrosprühmethode (DESI) bzw. bei Umgebungsatmosphäre andere Ionisierungsmethoden verwendet werden. Obwohl die Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-MS, eine sehr beliebte Methode ist, um auf geeigneten Auffängern abgelagerte Verbindungen zu analysieren, kommt diese Ablagerung auch anderen Analysemethoden zugute. Die abgelagerten Spezies können für viele Oberflächenanalyseverfahren eingesetzt werden, einschließlich Photoelektronenspektroskopie (PES), Rasterkraftmikroskopie (AFM), Raster-Tunnelmikroskopie (STM), konfokale Mikroskopie und Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Auch biochemische Analyseverfahren könnten eingesetzt werden, einschließlich verschiedener Formen von Immuntests, sowie Biosensoren wie z. B. Quarzkristallmikrowaage (QCM). Auf Wunsch können auch getrennte und abgelagerte Analyte durch Flüssigextraktion aus der Auffängeroberfläche extrahiert und zum zweiten Analyseschritt überführt werden. Dies kann manuell oder automatisch mit einem Robotersystem zur Handhabung von Flüssigkeiten erfolgen.
zeigt die Funktionskomponenten eines präparativen Ionenmobilitätsspektrometers mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle. Die Probe wird durch die Sprühvorrichtung (6) eingeführt, und durch die Elektrosprühprozesse werden Ionen erzeugt. Sie passieren eine Glaskapillare (7) mit metallisierten Enden. Anschließend werden die Ionen durch ein zweistufiges Ionentrichtersystem (8, 9) eingefangen (J. Franzen: US-Patent 5,572,035 A , auch Richard D. Smith und Scott A. Schaffer: US-Patent 6,107,628 A ) und durch eine Lochelektrode (10) in eine lineare HF-Hexapol-Ionenfalle (11) weitergeleitet. Wenn genügend Analytionen gefangen sind, wird das Reflexionspotenzial der Lochelektrode (12) umgeschaltet, und die eingefangenen Ionen werden aus der Falle in einen Quadrupolmassenfilter (13) gepulst. Am Ende des Quadrupol-Massenfilters (13) werden ein Ionendeflektor (14) und ein außeraxialer Ionendetektor (15) platziert. Mit dem Quadrupol-Massenfilter (13) und dem Detektor (15) lässt sich ein Massenspektrum erzeugen. Der Massenfilter wird zum Selektieren von Ionen mit der gewünschten Masse (Masse-zu-Ladungsverhältnis) verwendet. Die selektierten Ionen passieren die Lochelektrode (16) und können dann die Ionenmobilitätstrennzelle (17) durchfliegen, so dass die konformativen Isomere mit dem selektierten Masse-zu-Ladungsverhältnis getrennt werden. In der Ionenmobilitätstrennzelle (17) befinden sich die Ionen in einem Druckbereich über einem Millibar und driften unter dem Einfluss eines axialen elektrischen Beschleunigungsfelds, das aufgrund der gestapelten Ringelektroden um die Ionenmobilitätstrennzelle (17) anliegt. Ionen mit größerem geometrischem Querschnitt sind einer größeren Anzahl von Kollisionen ausgesetzt und driften langsamer, während kompakte Ionen schneller fliegen und früher am Ausgang der Ionenmobilitätstrennzelle ankommen (17). Nach ihrer temporären Trennung fliegen die getrennten Ionen durch ein Ionenoptik-System (18). Dies ist hilfreich zum Fokussieren und Senken ihrer kinetischen Energie für eine weiche Landung auf der Oberfläche des Auffängers (19). Der Auffänger (19) in ist eine runde Plattform, die sich auf einem Drehtisch (20) mit Motorantrieb (21) befindet. Der Tisch kann nicht nur gedreht, sondern samt Motor auch translatorisch bewegt werden, so dass verschiedene Tischradien für die Ablagerung mobilitätsselektierter Ionen zur Verfügung stehen.
Die isomeren Ionen werden in den Quadrupol-Massenfilter (13) gepulst, dort selektiert und in die Ionenmobilitätstrennzelle (17) überführt. Nach ihrer Trennung nach Mobilität werden die Ionen dann an räumlich getrennten Stellen auf der Auffängerplatte (19) abgelagert. Die räumliche Trennung auf dem Auffänger (19) wird durch die schnelle Drehung des Auffängers (19) erreicht. Wiederholte Ablagerungen sind möglich: Die Ionen werden in den Quadrupol-Massenfilter (13) gepulst, die Massenselektion und Ionenmobilitätstrennung der isomeren Ionen kann mehrmals wiederholt werden. Die Rotationsfrequenz des Auffängers (19) lässt sich mit dem Versuchszyklus synchronisieren, so dass bei der Ablagerung immer wieder genau die gleiche Position auf dem Auffänger verwendet werden kann, um getrennte Isomere durch wiederholte Ablagerungen an derselben Stelle anzureichern. Dadurch lässt sich eine kumulative Ablagerung nach Mobilität getrennter isomerer Ionen auf dem Auffänger (19) erreichen. Je größer die kumulative Menge eines mobilitätsselektierten isomeren Ions, desto effizienter sind die analytischen Bestimmungen nachdem Ablagerungsprozess.
Mit dem außeraxialen Detektor (15) auf der Flugstrecke zwischen dem Quadrupol-Massenfilter (13) und der Ionenmobilitätstrennzelle (17), der in (und anderen Abbildungen) dargestellt ist, lassen sich massenspektrometrische Daten ermitteln, um bestimmte Ionen für die Ionenmobilitätstrennung zu selektieren. Es ist praktisch, den Detektor als außeraxiales Gerät vor der Ionenmobilitätstrennzelle (17) zu platzieren. Ein Detektor kann sich jedoch auch an anderen Stellen befinden. So kann er z. B. auch hinter der Ionenmobilitätstrennzelle (17) am Ende der Flugstrecke implementiert werden. Der Auffänger kann entfernt werden, so dass der Detektor die Ionen nachweisen kann. Anschließend kann der Detektor entfernt und der Auffänger wieder integriert und verwendet werden.
Eine komfortablere Variante des Detektors am Ende der Flugstrecke besteht darin, ihn nicht zu deplatzieren und wieder einzubauen, sondern den Ionendeflektor in der Ablagerungsionenoptik zu verwenden. Der Deflektor kann den Ionenstrahl sehr schnell auf einen Detektor bewegen, der seitlich montiert ist (ebenfalls außeraxial, doch am Ende der Flugstrecke). Auf diese Weise können Ionennachweise sehr schnell ausgeführt werden.
zeigt die Funktionskomponenten eines präparativen Ionenmobilitätsspektrometers, das dem in dargestellten grundsätzlich sehr ähnelt. Die getrennten Ionen, die die Mobilitätstrennzelle (17) verlassen, gelangen hierbei jedoch durch eine Lochelektrode (22) in einen Ionenselektor (23) und später durch eine andere Öffnung (24) in eine lineare HF-Hexapol-Ionenfalle (25), bevor sie abgelagert werden. Der Ionenselektor (23) ist in schematisch als einfacher elektrischer Deflektor aus zwei Elektrodenplatten dargestellt. Er kann jedoch auch als Mehrelektrodendeflektor ausgeführt sein. Der Ionenselektor (23) ermöglicht die Selektion von Ionen, deren Mobilität in einem vordefinierten Ionenmobilitätsfenster liegt, und hilft, alle unerwünschten Ionen mit Ausnahme der Ionen zu eliminieren, die im gewünschten Mobilitätsfenster ankommen. Das System in ermöglicht eine wiederholte Ionenmobilitätstrennung isomerer Ionen und das Einfangen nur eines der nach Mobilität getrennten und selektierten Isomere in einer linearen HF-Hexapol-Ionenfalle (25). Nach dem Einfangen werden die Ionen aus der Hexapol-Ionenfalle (25) extrahiert und über die spezielle Ionenoptik (18) auf dem Auffänger (19) abgelagert. Der Auffänger (19) ist auch hier eine runde Plattform (20). Da die nach Mobilität getrennten und selektierten Ionen in der Hexapol-Ionenfalle eingefangen werden können, bevor sie abgelagert werden, ist hier kein schnell beweglicher Auffänger erforderlich. Bei Montage des Auffängers (19) auf dem Tisch (20), der mit Hilfe eines Motors (21) gedreht werden kann, bietet dieses System jedoch Optionen einerseits zum Einfangen von Ionen eines vordefinierten Mobilitätsbereichs in der HF-Hexapolfalle und deren Ablagerung und andererseits zum kumulativen Ablagern unterschiedlicher mobilitätsgetrennter Ionen breiter Mobilitätsbereiche ohne vorheriges Einfangen in der HF-Hexapolfalle.
zeigt die Funktionskomponenten eines präparativen Ionenmobilitätsspektrometers zur Ionenmobilitätstrennung MALDI-generierter Ionen. Im letzten Jahrzehnt hat die MALDI-Massenspektrometrie eine neue Anwendung für biologische Entdeckungen dazugewonnen: Die MALDI-Abbildung. Am Laserziel kann ein Gewebedünnschnitt platziert werden, und biologische Ionen können direkt aus dem Gewebe desorbiert werden. Mit dieser Methode lassen sich komplexe Gewebedünnschnitte (z. B. von Tiergehirnen) rastern, für jedes Rasterelement entsprechende Massenspektren erzeugen und die Spektren den entsprechenden Punkten auf dem Gewebe zuordnen. Ein Bild des Gewebes auf Basis des Massenspektrums gibt eine Verteilung der gewünschten Biomoleküle wieder und bietet Aufschluss über die Funktionen und Funktionsstörungen von Organismen (Richard M. Caprioli, US-Pat. 5808300 ).
In diesem Beispiel werden Ionen aus einer Gewebeprobe auf einer MALDI-Zielplatte (26) generiert. Die Gewebeprobe (27), z. B. eine Rattengehirndünnschnitt, kann mit einer geeigneten Matrix (z. B. 2,5-Dihydroxy-Benzoesäure) zur Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption vorbereitet sein. Der vom Laser (29) generierte Laserstrahl (28) wird von der Linse (30) fokussiert, und der konvergente Strahl (31) wird an einem Spiegel reflektiert, bevor er auf die Stelle (33) der Gewebeprobe (27) trifft. Die generierten Ionen fliegen durch die Ionentrichter (8) und (9) und werden im ersten HF-Hexapol (11) gefangen. In diesem Hexapol (11) können Ionen aus mehreren Laserschüssen gesammelt werden. Anschließend werden sie aus der HF-Hexapolfalle (11) extrahiert, indem das Potenzial der Falle an der Lochelektrode (12) umgepolt wird, und treffen auf einen Quadrupol-Massenfilter (13). Der massenselektierte Ionentyp fliegt durch die Mobilitätstrennzelle (17), und die getrennten Isomere werden durch weiches Landen auf der Auffängeroberfläche (19) an räumlich getrennten Stellen abgelagert. Der Auffänger (19) in ist ebenfalls eine runde Plattform, die sich auf einem Drehtisch (20) mit Motorantrieb (21) befindet. Der Tisch kann nicht nur gedreht, sondern samt Motor auch translatorisch bewegt werden, so dass verschiedene Tischradien für die Ablagerung mobilitätsselektierter Ionen zur Verfügung stehen.
Bei den Versuchen einer massenspektrometrischen MALDI-Abbildung nach Stand der Technik werden die massenspektrometrischen Daten der Verbindung, die von der Stelle desorbiert wird, auf diese spezielle Stelle bezogen. Die Zuordnung der Massenspektren zu jeder desorbierten Stelle der Gewebeprobe ergibt eine Abbildung der Beziehung zwischen Geometrie und Chemie. Bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden laserdesorbierte Verbindungen von der Stelle nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) selektiert und einer Ionenmobilitätstrennung unterzogen. Nach Mobilität getrennte isomere Ionen werden an getrennten Stellen des Auffängers abgelagert. Dadurch werden die Positionen des Laserflecks zu den Ablagerungsstellen auf dem Auffänger in Beziehung gesetzt. Dies führt zu einer neuen dreifachen Wechselbeziehung: Wenn z. B. Proteine in einem komplexen Gewebe durch Ionenmobilitätstrennung/Ablagerung mit MALDI-Abbildung untersucht werden, liefert die Anordnung der letztendlich auf dem Auffänger abgelagerten Ionen vollständige Informationen über

1. Masse-zu-Ladungsverhältnis,
2. geometrischen Querschnitt auf Basis des konformativen Zustands,
3. Positionskoordinaten auf der ursprünglichen Gewebeprobe.

Diese Informationen werden bei der Analyse der abgelagerten Ionen und der molekularbiologischen Untersuchung der Gewebeprobe verwendet. Außerdem können vergrößerte reale Bilder, die aus Pixeln auf Basis mobilitätsgetrennter und abgelagerter Ionen bestehen, ebenfalls auf dem Auffänger generiert werden.
Wie in dem Gerät in verwendet, können ein Ionendeflektor (23), eine Lochelektrode (24) und eine lineare HF-Hexapolfalle (25) zwischen Ionenmobilitätstrennzelle (17) und Ablagerungsionenoptik (18) zum Sammeln mobilitätsgetrennter Ionen platziert werden.
zeigt die Funktionskomponenten eines präparativen Ionenmobilitätsspektrometers, das die Proben in einer Elektrosprühquelle ionisiert. Wie bei der Ausführungsform in werden Ionen nach Masse selektiert, nach Mobilität getrennt und auf einem Auffänger (34) abgelagert. In diesem Fall ist der Auffänger (34) zylindrisch und befindet sich auf dem Mantel eines trommelförmigen Trägers (35), der sich um eine Achse senkrecht zur Achse des Ionenmobilitätsspektrometers dreht. Nach Abschluss des Ionenmobilitätstrennungs- und Ablagerungsprozesses wird der Auffänger entfernt und auf einem Analyseinstrument platziert.
Durch Implementierung von Ionenspeichersystemen wie linearen HF-Multipol-Ionenspeichergeräten können die generierten Ionen wie folgt gesammelt werden:

a. vor der Quadrupol-Massenselektion, um die Anzahl der Ionen zu erhöhen, oder
b. nach der Quadrupol-Massenselektion, um die Anzahl der massenselektierten Ionen zu erhöhen, die in die Ionenmobilitätstrennzelle gelangen, oder
c. nach der Ionenmobilitätstrennung und Ionenselektion, um die Anzahl der mobilitätsselektierten Ionen vor der Ablagerung von Ionen zu erhöhen.

zeigt ein präparatives Ionenmobilitätsmassenspektrometer ähnlich dem in dargestellten Gerät. Dieses Gerät bietet jedoch zusätzlich die Möglichkeit, Ionen nach erfolgter Masse-zu-Ladungsselektion im Quadrupol (13) zu speichern, bevor sie in der Ionenmobilitätstrennzelle (17) nach Mobilität getrennt und auf dem Auffänger (36) abgelagert werden. Sobald die Ionen generiert wurden und den Quadrupol-Massenselektor (13) passiert haben, fokussiert die Linse (33) direkt hinter dem Quadrupol-Massenselektor (13) die selektierten Ionen in die zusätzliche lineare HF-Hexapol-Ionenfalle (34). Die durch wiederholtes Generieren und Selektieren gewonnenen Ionen können hier gesammelt werden, bevor sie nach Mobilität selektiert werden. Auf diese Weise wird die Anzahl der Ionen mit dem gewählten Masse-zu-Ladungsverhältnis vor der Ionenmobilitätstrennung erhöht. Hinter der Ionenmobilitätszelle wird ein Ionenselektor (23) zwischen zwei Lochelektroden (22) und (24) und dahinter eine lineare HF-Multipol-Falle (25) (in diesem Fall Hexapol) platziert. Das Ionenselektionsgerät (23), das hier schematisch als einfacher Zwei-Platten-Ionenselektor dargestellt ist, hilft beim Selektieren der Ionen eines vordefinierten Ionenmobilitätsbereichs, um diese Ionen in der linearen HF-Hexapolfalle (25) zu sammeln, bevor sie auf dem Auffänger (36) abgelagert werden. Mit drei verschiedenen linearen HF-Hexapol-Ionenfallen bietet dieses Gerät die Möglichkeit,

1. in der ersten linearen HF-Hexapolfalle (11) alle generierten Ionen und/oder
2. in der zweiten linearen HF-Hexapolfalle (34) massenselektierte Ionen und/oder
3. in der dritten linearen HF-Hexapolfalle (25) nach Mobilität getrennte und selektierte isomere Ionen

36

37

21

36

zeigt schematisch ein Beispiel der Ionenoptik zur Ablenkung und Energiesteuerung (18) für das Ablagern von Ionen. Ein Strahl abzulagernder Ionen (38) kommt aus einer Mobilitätstrennzelle und wird durch das Ablagerungsionen-Linsensystem (39) zu einem konvergenten Ionenstrahl (40) fokussiert. Die Ionen werden dann vom Deflektor (41) von ihrer ursprünglichen Flugachse zu einer der getrennten Stellen (42) auf dem Auffänger (19) abgelenkt und abgelagert. Der Auffänger selbst kann ebenfalls durch eine Rotations- oder Translationsbewegung (43) bewegt werden, um das schnelle Umschalten der Stelle zu unterstützen, an der die nach Mobilität getrennten Ionen abgelagert werden sollen. Elektroden in Form metallbeschichteter Ablagerungsstellen auf einer elektrisch isolierten Hintergrundoberfläche speziell gebauter Auffänger können den Ablagerungsprozess sowie den Ablenkungsprozess für die räumliche Trennung unterstützen. Der Ablagerungsstrahl kann auf die gewählten Stellen umgelenkt werden, indem das elektrische Potenzial der Stelle geändert wird. Auch ein Auffänger, der ein Elektrodenmuster enthält (Ablagerungsstellen – jede mit einem elektrischen Potenzial verbunden), können so ausgelegt sein, dass sie die abzulagernden Ionen fokussieren, umleiten und abbremsen. Wenn die chemischen Strukturen der abgelagerten Ionen erhalten bleiben sollen, ist eine weiche Landung erforderlich, so dass die Energie reduziert und sorgfältig kontrolliert werden muss, wenn sich die Ionen dem Auffänger annähern.
Da die Ionenoptik in die Möglichkeit bietet, den Ionenstrahl während der Ablagerung zu fokussieren, kann zur Ionenablagerung ein fokussierter Strahl (38) verwendet werden. Ionen können jedoch auch mit einem nicht fokussierten Strahl abgelagert werden, so dass sie auf der Auffängeroberfläche einen größeren Fleck bilden. Ein wichtiger Faktor bei der Entscheidung, ob die Ionen bei der Ablagerung fokussiert werden sollen, ist z. B. die analytische Methode, die für die nachfolgende Analyse der abgelagerten Ionen zu verwenden ist.
In das Ionenmobilitätsspektrometer integrierte Ionenspeichergeräte, wie z. B. HF-Hexapol-Ionenführungen, können bei erhöhten Drücken eines Kollisionsgases als Fragmentierungskammern verwendet werden. Eine Fragmentierung der Ionen durch Kollision kann in jeder der HF-Hexapol-Ionenfallen stattfinden. Durch Ionenfragmentierung in einer solchen Fragmentierungskammer kann eine Ionenmobilitätstrennung des generierten Fragments durchgeführt werden, um weitere Strukturinformationen zu erhalten. Durch Fragmentierung eines nach Mobilität getrennten isomeren Ions vor dessen Ablagerung lassen sich zusätzliche Strukturdaten gewinnen.
Die Stoßfragmentierung (Collision Induced Dissociation, CID) ist nur eine der zahlreichen Methoden zur Ionenfragmentierung, um Strukturinformationen zu erhalten. Eine Fragmentierung im Ionenmobilitätsspektrometer der vorliegenden Erfindung kann auch erreicht werden, wenn Ionen durch sequenzielle Absorption von Infrarot-Photonen angeregt werden. Die Infrarot-Multiphoton-Fragmentierung (Infrared Multiphoton Dissociation, IRMPD) ist eine weitere Alternative, die zu ähnlichen Fragmentionenmustern führt wie die Stoßfragmentierung (CID). Eine in der Proteom-Forschung viel verwendete Methode ist die Fragmentierung durch Ionenfang (Electron Capture Dissociation, ECD), bei der die Absorption eines niederenergetischen Elektrons durch das mehrfach protonierte Molekül zu einer Fragmentierung führt, oder die Elektronen-Transfer-Dissoziation (Electron Transfer Dissociation, ETD), bei der ein Elektronentransfer von einem negativen Ion zu einem mehrfach protonierten Molekül zur Fragmentierung des letzteren führt. Für mehrfach geladene negative Ionen kann die Dissoziation durch Elektronenablösung (Electron Detachment Dissociation, EDD) verwendet werden. Auch die Fragmentierung durch metastabile Atome (Metastable Atom Induced Decomposition, MAID) ist eine Fragmentierungsmethode zur Ermittlung von Strukturinformationen.
Der Auffänger des präparativen Ionenmobilitätsspektrometers kann eine Laserzielplatte sein, die in einem MALDI-Flugzeit-Massenspektrometer eingesetzt wird. Die Zielplatte kann bereits eine Laserdesorptionsmatrix enthalten, bevor nach Mobilität getrennte Ionen abgelagert werden. Nach Ablagerung der nach Mobilität selektierten Ionen kann diese Platte in das massenspektrometrische Vakuumsystem für die MALDI-Flugzeit-Spektrometrie überführt werden. zeigt schematisch ein vollständiges Massenanalysesystem, in dem das präparative Ionenmobilitätsspektrometer nur einen Teil darstellt. Das präparative Ionenmobilitätsspektrometer entspricht im Grunde dem in dargestellten Gerät. Die Ionenquelle des Ionenmobilitätstrennsystems ist eine Elektrosprühquelle mit einer abgewinkelten Sprühvorrichtung (6), einer Endkappe (44) und einer an beiden Seiten metallisierten Glaskapillare (45), die jedoch orthogonal zu den Ionentrichtern (8) und (9) angeordnet ist. Die aus der Elektrosprühkapillare austretenden Ionen ändern ihre Richtung aufgrund des Anziehungspotenzials des Trichters (8) und des Reflexionspotenzials der Druckblende (46) um 90° und fliegen in die Ionentrichter (8) und (9). Neutrale Tröpfchen setzen ihren Weg senkrecht zur Achse der Trichter fort und treten nicht in das Ionenmobilitätsspektrometer ein. Hinter den Trichtern gelangen die Ionen in die lineare HF-Hexapolfalle (13) und die Ionenmobilitätstrennzelle (17). Sie können im HF-Hexapol (25) gespeichert oder auf dem Auffänger (14) abgelagert werden, der auf dem Drehtisch (48) montiert ist und durch einen Motor (49) angetrieben wird. Der Motor kann hier auch linear verschoben werden, um die nach Mobilität getrennten Ionen an Stellen mit unterschiedlichen Radien abzulagern.
Der Auffänger (47) wird über eine Transferkammer (50) mit einer Vakuumverriegelung durch ein Transfergerät (51) aus dem Ionenmobilitätsspektrometer in das massenspektrometrische Vakuumsystem bewegt. Das Ionenmobilitätssystem hat einen höheren Innendruck als das MALDI-Flugzeit-Massenspektrometer. Der Transfer des Auffängers zur MALDI-Quelle des Massenspektrometers, wie in schematisch dargestellt, kann ein einfacher Prozess sein, wenn der Auffänger bereits die Matrix für die Laserdesorption enthält. Ablagerungen auf mit Glyzerinflüssigkeiten beschichteten Oberflächen können anschließend für Infrarot-MALDI verwendet werden. Bei Ablagerungen, die ohne Matrix ausgeführt werden müssen, ist die Matrix nach der Ablagerung aufzubringen. In diesem Fall muss die Transferkammer (50) ein Gerät zum Aufbringen der Matrix enthalten, um den Auffänger (47) für den MALDI-Prozess vorzubereiten. Die Auffängerplatte (47) wird transferiert und in der Ionenquelle eines TOF/TOF-Massenspektrometers platziert, das eine MS/MS-Fragmentierung selektierter Ionen ermöglicht. Der Träger (52) ist hier ebenfalls drehbar und von einem Motor angetrieben, dessen Position durch eine Translationsbewegung geändert werden kann. Der Laserstrahl (53) gelangt durch das Laserfenster (54) in das massenspektrometrische Vakuumsystem, wird vom Spiegel (55) reflektiert und trifft an einer der Ablagerungsstellen nach der Ionenmobilitätstrennung auf das Laserziel. Die an dieser Stelle gebildeten Ionen gelangen von der Auffängerplatte durch Ionenlinsen (56) in eine Stoßzelle (57) und durch den zeitgesteuerten Ionenselektor (58) durch die zweite Quelle (59) zum metastabilen Ionenunterdrücker (60). Der Ionenstrahl (61) wird dann von dem gitterlosen Reflektor (62) reflektiert und am Detektor (63) nachgewiesen oder nicht reflektiert und in dem Detektor (64) hinter dem Reflektor nachgewiesen.
zeigt die Funktionskomponenten eines präparativen Ionenmobiliätsspektrometers und eines massenspektrometrischen Analysesystems. Dieses Ionenmobilitätsspektrometer entspricht grundsätzlich dem in dargestellten Gerät, mit Ausnahme des Auffängers (65) und der Auffängerhalterung (66). Bei dieser Ausführungsform werden die nach Mobilität getrennten Ionen auf der Rückseite einer Mehrdüsen-Nanospray-Feldplatte (65) abgelagert. Im Gegensatz zu den in der MALDI-Massenspektrometrie verwendeten Auffängern findet die Ablagerung bei diesem MehrdüsenfeldAuffänger (65) auf der Rückseite des Auffängers statt. Die Platte ist in einer Halterung (66) platziert, und ihre Drehung wird durch den Motor (67) betrieben, der auch in Translationsrichtung bewegt werden kann. Wenn die Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen auf dem Auffänger (65) abgeschlossen ist, kann dieser entfernt (68) und in einer Nanospray-Vorrichtung (69) platziert werden. Die Elektrospraylösung gelangt von der Rückseite in die Mehrdüsenplatte, löst die abgelagerten Spezies auf und sprüht/ionisiert sie. Die gesprühten Ionen treten durch die Endplatte (70) in die Elektrosprühkapillare (71) ein, werden durch das Potenzial der Druckblende (72) und das Potenzial des Ionentrichters (73) um 90° reflektiert, passieren durch den zweistufigen Trichter (73) und (74) den HF-Hexapol (75), den Quadrupol-Massenselektor (76), die Linsenplatte (77) und die HF-Hexapolfalle (78), die hier als Stoßzelle dient. Wenn eine Stoßfragmentierung erforderlich ist, findet diese hier statt. Nach Anregung der Stoßzelle (78) gelangen die Ionen durch ein Linsensystem (79) in das orthogonale Extraktionssystem (80), um ihren Flug in das Flugzeit-Massenspektrometer zu starten. Der extrahierte Ionenstrahl wird auf seine ursprüngliche Achse beschleunigt und folgt dem Strahlengang (81) bis zum Reflektor (82) mit Gitter, von dem er auf den Detektor (83) reflektiert wird, wo eine Analyse erfolgt.

Claims

Eine Methode zum Trennen von Substanzen, bestehend aus den Schritten: (a) Erzeugen von Ionen aus Substanzen, (b) Trennen der Ionen nach ihrer Ionenmobilität, (c) Ablagern der nach Mobilität getrennten Ionen auf räumlich getrennten Stellen auf einem Auffänger, und (d) Wiederholung der Schritte (a) bis (c), wobei die im Schritt (b) nach Mobilität getrennten Ionen gleicher Mobilität bei jedem Wiederholungszyklus an den gleichen Stellen auf dem Auffänger abgelagert werden, so dass eine kumulative Ablagerung nach Mobilität getrennter Ionen auf dem Auffänger erreicht wird.
Methode gemäß Anspruch 1, die im Schritt (c) die Bewegung des Auffängers oder die Bewegung der nach Mobilität getrennten Ionen relativ zum Auffänger umfasst.
Methode gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der die nach Mobilität getrennten Ionen auf dem Auffänger durch weiches Landen abgelagert werden, um chemische Strukturen zu erhalten.
Methode gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der die nach Mobilität getrennten Ionen auf dem Auffänger durch Bruchlandung abgelagert werden, um Ionenfragmente abzulagern.
Methode gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der nach Mobilität getrennte Ionen eines vordefinierten Mobilitätsbereichs selektiert und auf dem Auffänger abgelagert werden.
Methode gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der die Ionen nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis selektiert werden.
Methode gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der die Ionen nacheinander von unterschiedlichen Stellen einer vorbereiteten Gewebescheibe generiert werden.