DE102004044196A1

DE102004044196A1 - Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse

Info

Publication number: DE102004044196A1
Application number: DE102004044196A
Authority: DE
Inventors: Andreas Haase; Markus Kayser; Jens Höhndorf; Armin Holle
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2004-09-14
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2024-09-15
Also published as: US7235781B2; DE102004044196B4; GB0518764D0; GB2421352A; US20060071160A1; GB2421352B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse. Die Erfindung besteht darin, dass ein Lasersystem bereitgestellt wird, das auf der Probe eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen erzeugt, die die Güte und die Robustheit der massenspektrometrischen Analyse im Vergleich zu einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung signifikant verbessert, und zwar insbesondere die Ionisationseffizienz und für ein Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss die Massenauflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis.

Description

Die Erfindung betrifft ein Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse.
Die Erfindung besteht darin, dass ein Lasersystem bereitgestellt wird, das auf der Probe eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen erzeugt, die die Güte und die Robustheit der massenspektrometrischen Analyse im Vergleich zu einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung signifikant verbessert, und zwar insbesondere die Ionisationseffizienz und für ein Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss die Massenauflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis.
Stand der Technik
In der massenspektrometrischen Analyse haben sich in den letzten 10 bis 15 Jahren zwei Verfahren zur weichen Ionisation von biologischen Makromolekülen durchgesetzt: die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI, Abkürzung für „Matrix Assisted Laser Desorption Ionization") und das Elektrosprühen (ESI, Abkürzung für „Electron Spray Ionization"). Die zu analysierenden biologischen Makromoleküle werden im Folgenden als Analytmoleküle bezeichnet. Beim MALDI-Verfahren sind die Analytmoleküle in der Regel auf der Oberfläche eines Probenträgers in einer festen Matrix präpariert, während sie beim ESI-Verfahren in einer Flüssigkeit gelöst sind. Beide Verfahren haben großen Einfluss auf die massenspektrometrische Analyse von biologischen Makromolekülen in der Genomik, Proteomik und Metabolomik; ihre Erfinder wurden im Jahr 2002 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
In einer präparierten MALDI-Probe sind die Matrixmoleküle gegenüber den Analytmolekülen mit einem 10³ bis 10⁵ fachen Überschuss vorhanden und bilden eine polykristalline Matrix, in der die Analytmoleküle vereinzelt im Inneren der Kristalle oder an deren Korngrenzen eingebaut sind. Die präparierte MALDI-Probe wird kurzzeitig mit einem Laserpuls bestrahlt, der von den Matrixmolekülen stark absorbiert wird. Durch die gepulste Bestrahlung wird die Matrix explosionsartig aus dem festen Aggregatzustand in die Gasphase einer Verdampfungswolke überführt (Desorption). Die Ionisation der Analytmoleküle erfolgt in der Regel durch deren Protonierung oder Deprotonierung in Reaktionen mit Matrixmolekülen oder Matrixionen, wobei die Analytionen nach dem Verlassen der Verdampfungswolke vorwiegend einfach geladen vorliegen. Der Ionisationsgrad der Analytmoleküle beträgt etwa nur etwa 10^–4. Man spricht von weicher Ionisation, wenn ein Analytmolekül isoliert in die Gasphase überführt und ionisiert wird, ohne einen Bindungsbruch zu erleiden.
Die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation ist trotz der linearen Absorption durch die Matrix ein nichtlinearer Prozess, der für gepulste Laserstrahlung mit einer Dauer von einigen Nanosekunden erst ab einer Intensitätsschwelle von etwa 10⁶ Watt pro Quadratzentimeter einsetzt. Für eine weiche Ionisation liegt die maximale Intensität bei einer Obergrenze von ungefähr 10⁷ Watt pro Quadratzentimeter. Bei einer typischen Dauer der Laserpulse von etwa zehn Nanosekunden ergibt sich aus den genannten Intensitätsgrenzen eine Fluenz zwischen 10 bis 100 Millijoule pro Quadratzentimeter.
Der MALDI-Prozess ist komplex und wird durch viele und zum Teil voneinander abhängige Faktoren beeinflusst. Seit der Erstveröffentlichung des MALDI-Verfahrens im Jahr 1988 wurden viele Parameter untersucht und variiert. Trotzdem sind die Prozesse in der Matrix und in der Verdampfungswolke, die zur Ionisation der Analytmoleküle führen, noch nicht vollständig verstanden und werden weiterhin intensiv erforscht (K. Dreisewerd, Chem Rev. 103 (2003), 395-425: „The Desorption Process in MALDI").
Die chemischen Parameter des MALDI-Prozesses, wie zum Beispiel die Matrixsubstanzen selber, das Konzentrationsverhältnis zwischen Matrix- und Analytmolekülen und die Präparationsbedingungen, sind eingehend untersucht worden. Für Analytmoleküle unterschiedlicher chemischer Substanzklassen, wie etwa Proteine oder Nukleinsäuren, sind über einhundert verschiedene chemische Matrixsubstanzen bekannt, wie zum Beispiel Sinapinsäure, DHB (Abkürzung für „2,5-dihydroxy-bencoic acid"), CHCA (Abkürzung. für „α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid", Zimtsäure) oder HPA (Abkürzung für „ 3-hydroxypicolinic acid"). Die Matrixsubstanzen weisen im Wellenlängenbereich zwischen 330 und 360 Nanometer eine starke Absorption auf. Eine MALDI-Probe kann auf verschiedene Arten präpariert werden, zum Beispiel mit der „Dried Droplet" Präparation oder der Dünnschichtpräparation (im Englischen „Thin Layer"). In der „Dried Droplet" Präparation wird die Matrixsubstanz zusammen mit den Analytmolekülen in einem Lösungsmittel gelöst, auf einen Probenträger aufgetragen und anschließend getrocknet. In der Dünnschichtpräparation hingegen wird die Matrixsubstanz ohne Analytmoleküle auf den Probenträger aufgetragen und getrocknet. Danach wird eine Lösung mit Analytmolekülen auf die dünne polykristalline Matrix gegeben, wodurch diese teilweise erneut gelöst wird und die Analytmoleküle bei der anschließenden Trocknung in die Matrix eingebaut werden. Bei den physikalischen Parametern des MALDI-Prozesses sind bisher vornehmlich die zeitliche Dauer der Laserpulse, die Intensität im Laserfokus und die Wellenlänge der gepulsten Laserstrahlung betrachtet worden.
Für kommerziell verfügbare Massenspektrometer mit MALDI werden heutzutage überwiegend gepulste Lasersysteme im ultravioletten Spektralbereich (UV) verwendet. Dafür stehen verschiedene Lasertypen und Wellenlängen zur Auswahl: Stickstofflaser (λ = 337nm), Excimerlaser (λ = 193nm, 248nm, 308nm) und Nd:YAG Laser (λ = 266nm, 355nm), wobei für das MALDI-Verfahren kommerziell nur der Stickstofflaser und der Nd:YAG Laser bei der Wellenlänge 355 Nanometer von Bedeutung sind und der Stickstofflaser mit großem Abstand am häufigsten eingesetzt wird. Das Lasermedium des Stickstofflasers und der Excimerlaser ist ein Gas oder ein Gasgemisch, während es beim Nd:YAG Laser ein mit Neodym Ionen dotierter YAG-Kristall (Yttrium-Aluminium-Granat: Y₃Al₅O₁₂) ist. Beim Nd:YAG Laser wird die stärkste Laserlinie, die bei einer Wellenlänge von 1064 Nanometern liegt, in nichtlinearen optischen Kristallen in die angegebenen Wellenlängen umgewandelt. Die Dauer der im MALDI-Verfahren verwendeten Laserpulse beträgt im UV typischerweise zwischen 1 und 20 Nanosekunden, es sind aber im akademischen Bereich auch Pulsdauern im Bereich von Pikosekunden eingesetzt worden.
Für das MALDI-Verfahren werden zu Forschungszwecken gelegentlich auch Lasersysteme eingesetzt, die im infraroten Spektralbereich (IR) emittieren: Er:YAG (λ = 2.94μm) und CO2 (λ = 10.6μm). Während beim UV-MALDI-Verfahren den Matrixmolekülen über angeregte elektronische Zustände Energie zugeführt wird, werden im IR-MALDI-Verfahren Molekülschwingungen der Matrixmoleküle angeregt. Die Pulsdauer der IR-Lasersysteme im IR-MALDI-Verfahren beträgt zwischen 6 und 200 Nanosekunden. Im Gegensatz zum UV-MALDI-Verfahren werden im IR-MALDI-Verfahren neben festen Matrizes auch flüssige Matrizes verwendet, wie zum Beispiel Glycerin.
Ein Lasersystem besteht in der Regel aus einem Lasermedium, einer Energiezufuhr zur Anregung der Lasertätigkeit, einem optischen Resonator sowie optischen und elektrooptischen Komponenten zur Formung der Laserstrahlung. Unter einem Lasersystem wird im Folgenden der gesamte Aufbau aus optischen, elektrischen und elektrooptischen Komponenten verstanden, die für die Erzeugung und Formung der Laserstrahlung vom Lasermedium bis zum Ort der MALDI-Probe notwendig sind. Die Komponenten zur Strahlformung können sich dabei sowohl innerhalb des optischen Resonators nahe am Lasermedium als auch außerhalb des optischen Resonators befinden. Beispiele für derartige Komponenten sind Linsen, Spiegel, aktive und passive Güteschalter zur Pulserzeugung, die Ein- und Auskoppelung in bzw. aus einer Faser und nichtlineare optische Kristalle. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass nicht alle genannten Komponenten in den unterschiedlichen Lasersystemen verwendet werden müssen und durch weitere Komponenten ergänzt werden können.
Im MALDI-Verfahren eingesetzte Lasersysteme unterscheiden sich nicht nur in der Wellenlänge, sondern auch in ihrem räumlichen Strahlprofil. Bei Festkörperlasern, wie zum Beispiel dem Nd:YAG LAser oder dem Er:YAG Laser, ist das Lasermedium ein mit Ionen dotierter Kristall. Das Lasermedium befindet sich in einem optischen Resonator, der dafür sorgt, dass das räumliche Strahlprofil aus einer transversalen Grundmode oder wenigen transversalen Strahlmoden besteht. Die radiale Intensitätsverteilung der transversalen Grundmode entspricht einer Gaußfunktion und ist zur Ausbreitungsrichtung der Laserstrahlung rotationssymmetrisch. Ein solcher Laserstrahl kann auf einen nur durch die Beugung begrenzten minimalen Durchmesser fokussiert werden.
Der Stickstofflaser bei einer Wellenlänge von 337 Nanometer ist der mit Abstand am häufigsten im MALDI-Verfahren verwendete Lasertyp, wobei diese Wellenlänge die intensivste Laserlinie des Stickstofflasers ist. Als Lasermedium wird gasförmiger Stickstoff verwendet, der durch eine elektrische Entladung zwischen zwei Elektroden angeregt wird. Da die intensivste Laserlinie eine hohe Verstärkung aufweist, kann ein Laserpuls die Besetzungsinversion der Energiezustände bereits dann abbauen, wenn er die Elektroden nur einmal durchläuft. Selbst bei Verwendung von Resonatorspiegeln überlagern sich im Strahlprofil des Stickstofflasers viele transversale Strahlmoden, wodurch der minimale Durchmesser eines Laserfokus von kommerziellen Stickstofflasern bei einer Wellenlänge von 337 Nanometern nur etwa drei Mikrometer beträgt. Der typische Durchmesser der in MALDI-Anwendungen bestrahlten Fläche beträgt etwa 20 bis 200 Mikrometer. Das Strahlprofil des Stickstofflasers hat an den Elektroden ein nahezu rechteckförmiges Plateau (im Englischen „flat top", wobei die Breite und die Höhe des Strahlprofils durch den Abstand bzw. die Höhe der Entladungselektroden bestimmt werden. Die Wiederholfrequenz der Laserpulse im Stickstofflaser ist auf etwa 100 Hertz begrenzt, wenn nicht für einen schnellen Gasaustausch gesorgt wird. Für MALDI-Anwendungen werden Stickstofflaser mit einer typischen Wiederholfrequenz von 50 Hertz eingesetzt.
Die elektrische Gasentladung im Stickstofflaser ist in der Praxis nicht an jedem Punkt zwischen den Elektroden gleich und erzeugt ein räumlich inhomogenes Verstärkungsprofil, das sich bei der kurzen Dauer der Lasertätigkeit nicht ausgleicht, sondern auf das Strahlprofil des Stickstofflasers überträgt. Der Stickstofflaser hat somit ein räumlich moduliertes plateauförmiges Strahlprofil mit Intensitätsmaxima und -minima, das auf die Probe abgebildet oder auf diese fokussiert wird. Des Weiteren ist eine gepulste Gasentladung meist schlecht reproduzierbar, so dass die Intensitätsverteilung im Strahlprofil und die Energie von Laserpuls zu Laserpuls schwanken. Nach dem Stand der Technik wird im MALDI-Verfahren eine Intensitätsverteilung angestrebt, die auf der Probe räumlich möglichst homogen ist. Wird diese großflächig erzeugt, werden die Inhomogenitäten der präparierten MALDI-Probe, wie zum Beispiel bei einer ungleichmäßigen Einlagerung der Analytmoleküle in die Matrix, herausgemittelt. Die immanent vorhandenen Inhomogenitäten im Strahlprofil des Stickstofflasers führen allerdings dazu, dass die Intensitätsverteilung auf der Probe räumlich moduliert ist und unerwünschte Intensitätsmaxima aufweist.
Die bisher im MALDI-Verfahren eingesetzten gepulsten Festkörperlaser weisen typischerweise ein Strahlprofil auf, das einer einzigen gaußförmigen Strahlmode sehr nahe kommt. Wird ein gepulster Laserstrahl auf die Probe fokussiert oder abgebildet, so ergibt sich am Ort der Probe eine gaußförmige Intensitätsverteilung mit einem einzigen Maximum. Die Halbwertsbreite, bei der die Intensität des Maximums auf den halben Wert abgefallen ist, kann bei den Festkörperlasern im UV theoretisch weniger als einen Mikrometer betragen, liegt aber in MALDI-Anwendungen bei etwa 20 bis 200 Mikrometer. Auch wenn bei Festkörperlasern prinzipiell Wiederholfrequenzen der Laserpulse von einigen hundert Kilohertz möglich sind, wird derzeit in den meisten MALDI-Anwendungen mit einer Wiederholfrequenz bis zu 200 Hertz gearbeitet. Die Energieschwankungen von Laserpuls zu Laserpuls sind bei Festkörperlasern typischerweise kleiner als beim Stickstofflaser.
Nach dem Stand der Technik wird auf der Probe eine räumlich homogene Intensitätsverteilung angestrebt. Um mit dem gaußförmigen Strahlprofil eines Festkörperlasers eine homogene Intensitätsverteilung auf der Probe zu erhalten, kann das Strahlprofil durch die Ausbreitung in einer Faser räumlich homogenisiert und danach auf die Probe abgebildet werden. Der Laserstrahl wird dazu in eine Faser eingekoppelt, in der eine Vielzahl von transversalen Fasermoden mit unterschiedlichen radialen Intensitätsverteilungen ausbreitungsfähig ist (Multimodefaser). Durch die Ausbreitung des eingekoppelten Laserstrahls in der Multimodefaser wird Energie aus der gaußförmigen Strahlmode in viele transversale Fasermoden übertragen, die sich am Ausgang der Faser überlagern. Falls die zeitliche Kohärenz der verwendeten Laserstrahlung hinreichend klein bzw. die Multimodefaser hinreichend lang ist, ergibt sich die Intensitätsverteilung am Faserausgang aus der Summe der Intensitätsverteilungen der einzelnen transversalen Fasermoden. Durch die Vielzahl von transversalen Fasermoden mit unterschiedlichen radialen Intensitätsprofilen ergibt sich somit am Faserausgang eine homogene Intensitätsverteilung. Wird nun der Ausgang der Multimodefaser abgebildet, erhält man auch auf der Probe eine plateauförmige Intensitätsverteilung. Dieses Verfahren zur Homogenisierung des Strahlprofils kann auch beim Stickstofflaser verwendet werden, um die immanenten Inhomogenitäten im Strahlprofil zu minimieren.
Bei einigen Massenspektrometern mit MALDI wird der Laserstrahl durch ein Metallgitter hindurch auf die Probe abgebildet oder fokussiert, wobei das Metallgitter als Ionenoptik dient, mit dem die Ionen aus der Verdampfungswolke herausgezogen werden. Da diese Ionenoptik eine hohe Transmission für die im MALDI-Prozess erzeugten Ionen aufweisen muss, sind die offenen Flächen des Metallgitters im Verhältnis zur Stegfläche so groß, dass dadurch die homogene Intensitätsverteilung auf der Probe nur wenig beeinflusst wird.
Die Güte einer massenspektrometrischen Analyse wird allgemein durch die folgenden Kenngrößen festgelegt: die Massengenauigkeit, die Massenauflösung, das Nachweisvermögen, die quantitative Reproduzierbarkeit und das Signal-Rausch-Verhältnis. Dabei erhöht sich die Güte einer massenspektrometrischen Analyse, wenn mindestens eine Kenngröße verbessert wird und die anderen Kenngrößen dadurch nicht verschlechtert werden. Die Massengenauigkeit umfasst sowohl eine systematische Abweichung der gemessenen mittleren Ionenmasse zur wahren Ionenmasse (Massenrichtigkeit oder besser Massenunrichtigkeit) als auch die statistische Streuung der einzelnen Messwerte um den Mittelwert der Ionenmasse (Massenpräzision). Aus der Massenauflösung ergibt sich, welche Ionenmassen in der massenspektrometrischen Analyse noch unterschieden werden können. In der Praxis ist allerdings nicht nur die Güte, sondern auch die Robustheit der massenspektrometrischen Analyse wichtig. Eine massenspektrometrische Analyse ist dann robust, wenn sich deren Güte bei einer Variation der Messparameter, wie zum Beispiel der Energie der Laserpulse oder der Präparationsbedingungen der MALDI-Probe, wenig ändert.
Das Ionensignal eines Massenspektrometers mit MALDI ist proportional zur Ionisationseffizienz, zum desorbierten Probenvolumen und zur Konzentration der Analytmoleküle in der Probe. Die Ionisationseffizienz ergibt sich aus der Anzahl der auswertbaren Analytionen dividiert durch die Anzahl der Analytmoleküle im desorbierten Probenvolumen, d.h., wie viel Prozent der Analytmoleküle aus dem durch die Laserbestrahlung abgetragenen Probenvolumen einer massenspektrometrischen Analyse als Ionen zur Verfügung stehen. Für den Fall, dass Analytmoleküle schon vor dem Desorptionsvorgang in der Matrix ionisiert vorliegen, erhöht sich die Anzahl der Analytmoleküle um die Anzahl der schon ionisiert vorliegenden Analytionen. Da das desorbierte Probenvolumen durch die bestrahlte Probenfläche und durch die Fluenz relativ leicht erhöht werden kann, stellt die Ionisationseffizienz einen wichtigen Parameter zur Optimierung des MALDI-Prozesses dar. Eine hohe Ionisationseffizienz ermöglicht ein hohes Nachweisvermögen, da ein maximales Ionensignal bei geringer Konzentration (oder bei geringem Probenverbrauch) erzielt wird. Bei einem typischen Ionisationsgrad von nur 10^–4 besteht die Möglichkeit, den MALDI-Prozess erheblich zu verbessern. Die Definition der Ionisationseffizienz des MALDI-Prozesses berücksichtigt auch die Verluste, die durch eine Fragmentierung von Analytmolekülen bei der Überführung in die Gasphase entstehen und somit die Anzahl der auswertbaren Analytionen reduzieren.
Für die massenspetrometrische Analyse der im MALDI-Prozess erzeugten Analytionen kommen im Prinzip sowohl klassische Sektorfeld-Massenspektrometer und Quadrupol-Massenspektrometer wie auch Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer und Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer in Frage. Besonders geeignet sind aber Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss, die für die Messung der Flugzeit (TOF, Abkürzung für „Time Of Flight") einen gepulsten Ionenstrom benötigen. Der Zeitpunkt für den Start der Flugzeitmessung wird dabei durch den ionisierenden Laserpuls vorgegeben. Der MALDI-Prozess ist ursprünglich für den Einsatz im Vakuum entwickelt worden. In neueren Entwicklungen wird die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation ebenfalls bei Atmosphärendruck verwendet (AP MALDI, Abkürzung für „Atmospheric Pressure Matrix Assisted Laser Desorption Ionization"). Hier werden die Ionen mit einer Wiederholfrequenz von bis zu 2 Kilohertz erzeugt und mit Hilfe eines Ionenleitsystems einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss (OTOF, Abkürzung für „Orthogonal Time Of Flight"), einem Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer oder einem Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer zugeführt. In einem OTOF Massenspektrometer können die im MALDI-Prozess erzeugten Ionen fragmentiert und gespeichert werden, bevor die Messung der Flugzeit mit einer elektronischen Auspulsung gestartet wird.
Bei speziellen MALDI-Anwendungen wird die Intensität auf der Probe so weit erhöht, dass die erzeugten Ionen hinreichend viel innere Energie aufweisen, um zu dissoziieren. Je nach der zeitlichen Dauer zwischen der Erzeugung der Ionen und ihrer Dissoziation spricht man von einem Zerfall innerhalb der Ionenquelle (ISD, Abkürzung für „In Source Decay") oder außerhalb der Ionenquelle (PSD, Abkürzung für „Post Source Decay").
Es gibt des Weiteren auch bildgebende massenspektrometrische Analyseverfahren (IMS, Abkürzung für „Imaging Mass Spectrometry"), in denen der MALDI-Prozess zur Erzeugung der Ionen verwendet wird. Bei der IMS wird ein dünner Gewebeschnitt, der beispielsweise mit einem Mikrotom aus dem Organ eines Menschen gewonnen wird, mit einer Matrixsubstanz präpariert und räumlich aufgelöst massenspektrometrisch untersucht. Die räumliche Auflösung der massenspektrometrischen Untersuchung kann entweder durch das Abrastern einzel ner Punkte des Gewebeschnittes oder durch eine stigmatische Abbildung der erzeugten Ionen erfolgen. Beim Rasterverfahren wird der gepulste Laserstrahl auf einen kleinen Durchmesser auf der Probe fokussiert, wobei ein Massenspektrum für jeden einzelnen Rasterpunkt gemessen wird. Aus der Vielzahl der einzelnen räumlich aufgelösten Massenspektren wird eine ein- oder zweidimensionale Häufigkeitsverteilung für einzelne Proteine erstellt. Bei der stigmatischen Abbildung wird eine Fläche von bis zu 200 mal 200 Mikrometern homogen mit einem Laserpuls bestrahlt. Die dabei erzeugten Ionen werden Punkt für Punkt ionenoptisch auf einen ortsauflösenden Detektor abgebildet. Bisher kann mit einem einzelnen Laserpuls nur die Häufigkeitsverteilung einer Ionenmasse aufgenommen werden, da es keine hinreichend schnellen ortsauflösenden Ionendetektoren gibt. Allerdings kann die gemessene Ionenmasse von Laserpuls zu Laserpuls variiert werden.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse bereitzustellen, das die Güte und Robustheit der massenspektrometrischen Analyse signifikant verbessert, und zwar insbesondere die Ionisationseffizienz und bei Flugzeitmassenspektrometern mit axialem Einschuss die Massenauflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis.

Lösung der Aufgabe

Der vorliegenden Erfindung liegt die völlig überraschende Erkenntnis zugrunde, dass die Güte und die Robustheit einer massenspektrometrischen Analyse signifikant verbessert werden kann, wenn die räumliche Intensitätsverteilung der Laserstrahlung auf der Probe nicht homogen ist, sondern durch Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden oder beides räumlich moduliert wird. Wenn die erzeugten Analytionen in einem Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss analysiert werden, können insbesondere sowohl die Ionisationseffizienz als auch die Massenauflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis gegenüber einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung deutlich gesteigert werden, wobei die anderen Kenngrößen mindestens konstant bleiben und somit insgesamt die Güte signifikant verbessert wird. Durch eine Vielzahl von Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden erfolgt zugleich eine Mittelung des Ionensignales über die bestrahlte Fläche, wodurch auch präparative Inhomogenitäten der MALDI-Probe ausgeglichen werden können.

Eine Intensitätsschneide ist als eine linienförmige Intensitätsverteilung definiert, bei der die Intensität auf der Linie in mindestens einer Richtung ein Maximum aufweist, wie zum Beispiel in einem geraden Linienfokus. Allerdings können die Maxima einer Intensitätsschneide im Allgemeinen auf einer beliebigen Kurve liegen. Von einer Intensitätsspitze ausgehend nimmt die Intensität in allen Richtungen ab. Allerdings ist das Maximum einer Intensitätsspitze bzw. sind die Maxima einer Intensitätsschneide nicht im strengen mathematischen Sinn zu verstehen. Ein Maximum ist also nicht zwangsläufig ein einziger Punkt auf der Probe, sondern kann zum Beispiel auch eine Plateaufläche sein, auf der die Intensität den maximalen Wert annimmt.

Im völligen Gegensatz zum Stand der Technik wird also in erfindungsgemäßen Lasersystemen die räumliche Modulation der Laserstrahlung erhöht, wobei dem Fachmann ersichtlich ist, dass dieses auf vielfältige Weise geschehen kann.

Zum einen kann ein erfindungsgemäßes Lasersystem eine Vorrichtung enthalten, die das Strahlprofil eines einzelnen Laserstrahls räumlich moduliert. Das Strahlprofil wird in der Optik durch die räumliche Verteilung der Intensität und der Phase in einer Ebene senkrecht zur Ausbreitungsrichtung beschrieben (transversale Verteilung), wobei die Phase gegenüber der Intensität weniger intuitiv zu erfassen und schwerer zu messen ist. Für die Beschreibung der Phase wird in der paraxialen Näherung der Wellenoptik ein Phasenterm abgespalten, der in Ausbreitungsrichtung schnell variiert. Ohne diesen Phasenterm verändert sich die transversale Verteilung der Intensität und der Phase entlang der Ausbreitungsrichtung nur langsam.

Die Intensität im Strahlprofil kann zum Beispiel durch eine Maske moduliert werden, die den Laserstrahl an einigen Stellen vollständig oder teilweise absorbiert, reflektiert oder streut, so dass das Strahlprofil hinter der Maske neue Intensitätsmaxima und -minima aufweist. Die Phase des Strahlprofils kann zum Beispiel durch eine transparente Maske räumlich moduliert werden, deren Dicke nicht überall gleich ist, so dass das Strahlprofil eine ortsabhängige Phasenschiebung erfährt. Die räumliche Modulation im Strahlprofil eines Laserstrahls kann sowohl durch die Erzeugung neuer Maxima oder Minima als auch durch die Erhöhung des Modulationsgrades von vorhandenen Maxima vergrößert werden. Der Modulationsgrad M ist definiert als M = (Max – Min)/(Max + Min), wobei Max der Wert der Intensität bzw. der Phase in einem Maximum ist und Min der Wert der Intensität bzw. der Phase im nächstliegenden Minimum ist.

Eine Vorrichtung, die die räumliche Modulation im Strahlprofil eines Laserstrahls erhöht, kann sich an jeder Stelle im Lasersystem befinden, zum Beispiel am Lasermedium, innerhalb des optischen Resonators, zwischen dem optischen Resonator und der Probe, direkt an der Probe selber oder auch im Bereich, der für die Anregung der Lasertätigkeit zuständig ist. Befindet sich die Vorrichtung innerhalb des optischen Resonators, kann der erzeugte Laserstrahl eine Vielzahl von Intensitätsmaxima aufweisen, wenn durch die Vorrichtung die Lasertätigkeit höherer Resonatormoden bevorzugt wird bzw. die Lasertätigkeit der Grundmode unterdrückt wird.

Zum anderen kann in einem erfindungsgemäßen Lasersystem eine Vielzahl von Laserstrahlen erzeugt werden, indem mehr als ein Lasermedium verwendet wird oder ein einzelner Laserstrahl, zum Beispiel durch Strahlteiler, in mehrere Teilstrahlen aufgeteilt wird. Werden diese vielfachen Laserstrahlen auf der Probe. wieder räumlich zusammengeführt, kann dort eine Intensitätsverteilung erzeugt werden, die räumlich moduliert ist und die aus einer Vielzahl von Intensitätsspitzen und auch Intensitätsschneiden besteht.

Eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung der Laserstrahlung auf der Probe kann vollständig oder teilweise einstellbar sein, woraus sich eine Vielzahl neuer physikalischer Parameter ergeben, wie etwa die Anzahl, die Halbwertsbreite, die Intensität und der Modulationsgrad der Intensitätsspitzen bzw. der Intensitätsschneiden. Außerdem kann die Intensität in den Bereichen zwischen den Intensitätsspitzen und Intensitätsschneiden eingestellt werden. Wichtig dabei ist, dass die meisten dieser Parameter unabhängig voneinander eingestellt werden können. Die Halbwertsbreite der Intensitätsspitzen und Intensitätsschneiden ist die Breite, bei der die Intensität eines Maximums auf den halben Wert abgefallen ist.

Diese Parameter der Intensitätsverteilung können genutzt werden, um die Güte und die Robustheit der massenspektrometrischen Analyse zu optimieren, wenn beispielsweise unterschiedliche Analytmoleküle untersucht werden oder die Art der Probenpräparation geändert wird. In MALDI-Anwendungen mit ISD (Abkürzung für „In Source Decay") oder PSD (Abkürzung für „Post Source Decay"), in denen die Analytmolekülen nicht nur ionisiert, sondern auch fragmentiert werden, können durch die Parameter der räumlichen Intensitätsverteilung sowohl die Fragmentierung als auch die Ionisationseffizienz bei guter Auflösung und gutem Signal-Rausch-Verhältnis unabhängig voneinander optimiert werden.

Die stigmatische Abbildung in bildgebenden massenspektrometrischen Analyseverfahren kann ebenfalls von einem erfindungsgemäßen Lasersystem profitieren, da durch eine größere Ionisationseffizienz die Anzahl der auf der bestrahlten Fläche erzeugten Analytionen erhöht wird. Sind zudem die Positionen der Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden auf der Probe bekannt, kann das ortsaufgelöste Detektorsignal einem Ort auf der Probe zugeordnet werden.

Beim IR-MALDI-Verfahren kann ein erfindungsgemäßes Lasersystem eine ungeahnte Verbesserung bedeuten, da hier bisher ausschließlich Lasertypen mit einer nahezu gaußförmgen Strahlmode eingesetzt werden und damit die Intensitätsverteilung auf der Probe für einen effektiven MALDI-Prozess wahrscheinlich nicht hinreichend räumlich moduliert ist.

Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die 1a bis 1d zeigen unterschiedliche räumliche Intensitätsverteilungen auf der MALDI-Probe schematisch im Querschnitt.
Die 2 zeigt die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Lasersystems (200), in dem die Intensität im Strahlprofil durch eine gitterförmige Maske (203) räumlich moduliert wird.
Die 3 zeigt eine auf der Probe (221) gemessene Intensitätsverteilung, die durch das Lasersystem (200) mit Hilfe der gitterförmigen Maske (203) erzeugt wird und die aus einem regulären Raster einzelner Intensitätsspitzen besteht.
Die 4a und 4b zeigen zwei Massenspektren eines Flugzeitmassenspektrometers mit axialem Einschuss. In der 4a entspricht die Intensitätsverteilung auf der Probe (221) dem regulären Raster aus Intensitätsspitzen in 3; in der 4b ist die Intensitätsverteilung auf der Probe (221) dagegen räumlich homogen.
Die 5 zeigt die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Lasersystems (500), in dem die Intensität im Strahlprofil durch eine Multimodefaser (503) räumlich moduliert wird. Das Lasersystem (500) erzeugt auf der Probe (521) eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung.
Die 6 zeigt die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Lasersystems (600), in dem die Phase im Strahlprofil durch eine Plastikfolie (603) räumlich moduliert wird.
Die 7 zeigt eine auf der Probe (621) gemessene Intensitätsverteilung, die das Lasersystem (600) mit Hilfe der Plastikfolie (603) erzeugt und die viele einzelne irregulär verteilte Intensitätsspitzen aufweist.
Die 8a und 8b zeigen zwei Massenspektren eines Flugzeitmassenspektro meters mit axialem Einschuss, und zwar für die beiden Intensitätsverteilungen, die das Lasersystem (600) mit bzw. ohne Plastikfolie (603) auf der Probe (621) bei gleichen Lasereinstellungen erzeugt.
Die 9 zeigt die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Lasersystems (900), in dem die Phase im Strahlprofil durch ein Linsenarray (903) moduliert wird. Das Lasersystem (900) erzeugt auf der Probe (921) viele räumlich getrennte Einzelfokusse.
Die 10 zeigt die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Lasersystems (1000), in dem die Intensität und die Phase im Strahlprofil durch ein beugendes optisches Element (1003) moduliert werden. Das Lasersystem (1000) erzeugt auf der Probe (1021) eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die 1a bis 1d zeigen schematisch vier verschiedene Intensitätsverteilungen auf der MALDI-Probe im Querschnitt. Auf den Ordinaten ist jeweils die Intensität der Laserstrahlung entlang einer Richtung auf der MALDI-Probe dargestellt. Da die 1a bis 1d die Intensität nur als Querschnitte längs einer Richtung zeigen, können die dargestellten Intensitätsmaxima sowohl zu einzelnen Intensitätsspitzen als auch zu einer oder mehreren Intensitätsschneiden gehören.
In der 1a sind Maxima (101) dargestellt, die alle die gleiche Intensität und Halbwertsbreite aufweisen. Der Abstand zwischen benachbarten Maxima ist wesentlich größer als die Halbwertsbreite der Maxima. Da außerdem die Intensität in den Bereichen zwischen den Maxima (201) verschwindet, ergibt sich hier ein Modulationsgrad von eins.
Die Intensität der Maxima und der Abstand zwischen den Maxima ist in 1b größer als in 1a. Die Halbwertsbreite der Maxima (102) entspricht genau der Halbwertsbreite der Maxima (101). Der Modulationsgrad der Maxima (102) beträgt nur 3/5, da die Intensität in Bereichen zwischen den Maxima (102) einen konstanten Untergrund aufweist und nicht wie in 1a verschwindet. Des Weiteren ist die Intensität in den Maxima (102) plateauförmig, während die Intensität in den Maxima (101) jeweils in genau einem Punkt maximal ist.
Die 1c zeigt Maxima (103), die im Vergleich zu den Maxima (101) und (102) eine größere Halbwertsbreite aufweisen. Das Verhältnis zwischen dem Abstand und der Halbwertsbreite benachbarter Maxima ist hier im Vergleich zu den 1a und 1b deutlich kleiner. Der Modulationsgrad der Maxima (103) beträgt 1/2.
In 1d sind die Maxima (104) bis (108) im Gegensatz zu den Maxima in den 1a bis 1c irregulär verteilt. Es gibt einen Untergrund (109), der aber nicht konstant ist. Die Maxima unterscheiden sich in der Halbwertsbreite, der Intensität und im Abstand zu den benachbarten Maxima. Im Gegensatz zu den Maxima (105) bis (108) hat das Maximum (104) ein plateauförmiges Maximum mit einem Modulationsgrad von 1/3. Der Modulationsgrad der beiden Maxima (105) und (106) sowie der Maxima (107) und (108) beträgt 2/5 bzw. 3/10.
Die 2 zeigt eine erste bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (200) für die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation in schematischer Darstellung. Der Laserstrahl (202) wird in der schematisch dargestellten Lasereinheit (201) zeitlich gepulst erzeugt. Die zur Anregung der Lasertätigkeit notwendigen Mittel, das Lasermedium selber und ein variabler Energieabschwächer befinden sich in der Lasereinheit (201). Der Laserstrahl (202) beleuchtet die gitterförmige Maske (203), die innerhalb einer quadratischen Öffnung eine Struktur aus orthogonal verlaufenden Gitterstegen hat. Die gitterförmige Maske (203) ist für den Laserstrahl (202) außerhalb der quadratischen Öffnung und auf den Gitterstegen völlig undurchlässig und erhöht die räumliche Modulation der Intensität im Strahlprofil erfindungsgemäß. Die Linse (204) bildet die gitterförmige Maske (203) über den Umlenkspiegel (205) auf die Probe (221) ab.
Die Probe (221) ist mit anderen nicht dargestellten Proben auf einem Probenträger (222) präpariert und enthält die in einer festen Matrix eingebauten Analytmoleküle. Wird die Schwellintensität für den MALDI-Prozess auf der Probe (221) überschritten, setzt die explosionsartige Verdampfung der Matrix ein. Die Analytmoleküle werden mit der Matrix in die Gasphase überführt und liegen in der Verdampfungswolke zu einem gewissen Anteil als Analytionen vor. Durch den Umlenkspiegel (205) wird das Lasersystem (200) räumlich von dem nicht dargestellten Massenspektrometer getrennt, wodurch die Überführung der im MALDI-Prozess erzeugten Ionen in das Massenspektrometer erleichtert wird.
Für diese und alle folgenden Ausführungsformen gilt, dass die Art des Lasermediums für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich ist und alle für den MALDI-Prozess geeigneten Wellenlängen gleichermaßen verwendet werden können. Auch in Bezug auf andere chemische und physikalische Parameter, wie zum Beispiel die Pulsdauer, die Matrixsubstanz oder die Präparation der MALDI-Probe, oder die Art des analysierenden Massenspektrometers gibt es keine Einschränkungen.
Die Linse (204) und der Umlenkspiegel (205) entsprechen einem Projektor, der ein verkleinertes Bild der gitterförmigen Maske (203) auf die Probe (221) wirft und dort eine Intensitätsverteilung erzeugt, die der Transmission auf der Maske (203) entspricht. Für den Fachmann ist leicht ersichtlich, dass neben der gitterförmigen Maske (203) beliebige andere Masken verwendet werden können, bei der die Transmission an jedem Ort auf der Maske einen Wert zwischen null und nahezu eins annehmen kann. Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht nämlich gerade darin, dass auf der Probe (221) eine beliebige räumlich modulierte Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden erzeugt werden kann, indem die Transmission an jedem Ort auf der Maske entsprechend gewählt wird. Die Transmission kann für jeden Ort auf der Maske eingestellt werden, wenn die Maske zum Beispiel mit Hilfe von mikrolithographischen Verfahren oder durch die punktweise Belichtung von lichtempfindlichem Filmmaterial hergestellt wird.
Anstelle der gitterförmigen Maske (203), die vom Laserstrahl (202) be- und teilweise durchleuchtet wird, kann der Laserstrahl (202) natürlich auch eine reflektierende Fläche beleuchten, die auf die Probe (221) abgebildet wird. Es gibt verschiedene Arten von elektrooptischen Chips, die aus einer Vielzahl von einzelnen Pixeln bestehen, die flächig oder linienförmig angeordnet sind und einzeln elektronisch angesteuert werden können, zum Beispiel die DMD-Technologie (Abkürzung für „digital mirror device") von Texas Instruments oder die LCoS- Technologie (Abkürzung für „Liquid Crystal on Silicon") von Philips. Bei diesen beiden elektrooptischen Chips kann das Reflexionsvermögen für jeden einzelnen Pixel frei gewählt werden.
Die räumliche Intensitätsverteilung auf der Probe (221) muss in dieser bevorzugten Ausführungsform nicht konstant sein, sondern kann variiert werden, um zum Beispiel die Ionisationseffizienz oder die Auflösung für unterschiedliche Bedingungen zu optimieren. Mit Hilfe einer Mechanik, wie zum Beispiel bei einem Dia- oder Filmprojektor, können viele Masken in den Laserstrahl gebraucht werden und dadurch auf der Probe (221) unterschiedliche räumlich modulierte Intensitätsverteilungen erzeugt werden, wobei auch mehrere Masken gleichzeitig beleuchtet und abgebildet werden können. Mit den elektrooptischen Chips kann die räumliche Intensitätsverteilung auf der Probe ohne mechanische Bewegung rein elektronisch variiert werden.
Wichtige Parameter der räumlichen Intensitätsverteilung sind sowohl die Anzahl, die Halbwertsbreite und der Modulationsgrad der Intensitätsspitzen und der Intensitätsschneiden als auch die Intensität in den Intensitätsspitzen, in den Intensitätsschneiden und in den Bereichen dazwischen. Die Halbwertsbreiten der Intensitätsspitzen und der Intensitätsschneiden sind dabei vorzugsweise kleiner als fünfzig Mikrometer und besonders bevorzugt kleiner zwanzig Mikrometer, können aber auch kleiner als fünf Mikrometer und sogar kleiner als einen Mikrometer sein. Der Modulationsgrad ist vorzugsweise größer als 3/10 und besonders bevorzugt größer als 1/2, kann aber auch größer als 4/5 sein.
Innerhalb einer räumlich modulierten Intensitätsverteilung wird die Probe (221) möglicherweise nicht an allen Stellen gleichmäßig ionisiert. Das kann dazu führen, dass die Probe (221) an einigen Stellen wenig oder gar nicht ionisiert wird. Um eine Probe (221) mit einer Folge von Laserpulsen möglichst vollständig zu verbrauchen, kann es notwendig sein, die Lage oder die Position der räumlich modulierten Intensitätsverteilungen relativ zur Probe (221) zu verändern oder die räumliche Intensitätsverteilung selber zu variieren. Die räumlich modulierte Intensitätsverteilung kann zum Beispiel während einer Folge von Laserpulsen relativ zur Probe (221) verschoben oder gedreht werden, indem die Maske (203), die Linse (204), der Umlenkspiegel (205) oder der Probenträger (222) mechanisch bewegt wird. Wird anstelle der Linse (204) ein Linsensystem verwendet, kann auch der Abbildungsmaßstab variabel geändert werden. Es können auch Analytionen von den Proben erzeugt werden, die sich neben der Probe (221) auf dem Probenträger (222) befinden.
Wird die Probe (221) schräg beleuchtet, kann das Bild der Maske (203) auf der Probe (221) unscharf und verzerrt sein. Aus der Photographie sind Verfahren bekannt, wie diese Abbildungsfehler ausgeglichen werden können, zum Beispiel durch eine Verkippung der Linse (204) und der Maske (203) gegen die optische Achse.
Für den Fachmann ist ersichtlich, dass eine Abbildung durch eine Vielzahl unterschiedlicher optischer Systeme realisiert werden kann, zum Beispiel auch durch so genannte Phasenkontrastverfahren, bei denen die räumliche Modulation der Phase in einen Intensitätskontrast umgewandelt wird. Die Intensitätsverteilung auf der Probe (221) wird auch dann räumlich moduliert, wenn die Abbildungsbedingungen nicht genau erfüllt sind, also zum Beispiel die Bildebene nicht mit dem Ort der Probe (221) zusammenfällt oder sich die Maske (203) nicht in der Objektebene befindet. Bei einer Abweichung von den Abbildungsbedingungen ist die Vorhersage der auf der Probe (221) erzeugten Intensitätsverteilung zwar prinzipiell möglich, aber erschwert.
Die 3 zeigt eine gemessene Intensitätsverteilung, die mit dem erfindungsgemäßen Lasersystem (200) auf der Probe (221) erzeugt wird. Dabei wird ein frequenzverdreifachter gepulster Nd:YAG Laser mit einer Wellenlänge von 355 Nanometern und einer Pulsdauer von etwa 3 Nanosekunden verwendet, der ein gaußförmiges Strahlprofil hat und die gitterförmige Maske (203) beleuchtet.
Die gitterförmige Maske (203) hat eine nahezu quadratische Öffnung mit einer Kantenlänge von etwa 720 Mikrometern. Die Gitterstege sind in beiden Richtungen etwa 120 Mikrometer breit und formen transparente Öffnungen mit einer Kantenlänge von 60 Mikrometern. Bei einer sechsfachen Verkleinerung der gitterförmigen Maske (203) ergibt sich auf der Probe (221) ein reguläres Raster aus 30 Intensitätsspitzen mit einer Halbwertsbreite von zehn Mikrometern. Die räumlich modulierte Intensitätsverteilung hat somit auf der Probe (221) nur eine Kantenlänge von etwa 150 Mikrometern, so dass die erzeugten Analytionen durch ein axiales Flugzeitmassenspektrometer mit geringen Verlusten und hoher Auflösung analysiert werden können. Die Intensitätsspitzen sind dabei fast vollständig durchmoduliert, d.h., dass der Modulationsgrad fast eins ist. Die Kanten der Intensitätsspitzen sind aufgrund der begrenzten optischen Auflösung des Messaufbaus steiler als in der 3 dargestellt. Das gaußförmige Strahlprofil des Laserstrahls (202) hat am Ort der gitterförmigen Maske (203) eine Halbwertsbreite von etwa 4 Millimetern, so dass die quadratische Blende bei einer Kantenlänge von weniger als einem Millimeter in guter Näherung räumlich homogen beleuchtet wird.
In der 4a ist ein Massenspektrum dargestellt, das in einem Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss gemessen wird, wenn für den MALDI-Prozess die in 3 gezeigte Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen verwendet wird. Die MALDI-Probe wird hier mit einer Dünnschichtpräparation hergestellt. Entgegen der weitläufigen Meinung erhält man ein signalreiches Massenspektrum mit guter Auflösung und gutem Signal-Rausch-Verhältnis. In der 4a ist auf der Ordinate die relative Häufigkeit der detektierten Ionen gegen deren Masse zu Ladungsverhältnis (m/z) aufgetragen, das auf der Abszisse bis 3400 atomaren Masseneinheiten reicht. Das Massenspektrum in 4a ist ein Summenspektrum, das sich aus einer Folge von Laserpulsen ergibt, wenn die Probe (221) auf einer Fläche mit einer Kantenlänge von 150 Mikrometern vollständig aufgebraucht wird. Dazu ist es bei der Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen notwendig, dass die gitterförmige Maske (203) oder der Probenträger (222) verschoben wird.
Werden die Gitterstege der gitterförmigen Maske (203) entfernt und ausschließlich die quadratische Öffnung abgebildet, erhält man das Massenspektrum in 4b, bei dem eine unverbrauchte Stelle auf der Probe (221) benutzt wird, aber die Einstellungen des Lasersystems ansonsten konstant gehalten werden. Die Intensität auf der Probe (221) ist in diesem Fall nahezu räumlich homogen, da die Halbwertbreite des gaußförmigen Laserstrahls (202) deutlich größer als die Kantenlänge der Öffnung ist. Die Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen liefert im Vergleich zur räumlich homogenen Intensitätsverteilung im gesamten Messbereich ein typischerweise fünf- bis zehnmal größeres Ionensignal, obwohl die maximale Intensität auf der Probe (221) in beiden Fällen gleich ist. Die Energie auf der Probe (221) ist mit der gitterförmigen Maske (203) sogar kleiner, da diese an den Gitterstegen nicht transparent ist. Gegenüber dem Massenspektrum in 4b sind das Signal-Rausch-Verhältnis und die Massenauflösung in 4a etwa um einen Faktor fünf bis sechs verbessert.
Wird die Energie der Laserpulse variiert, zeigt sich bei einem Vergleich der gemessenen Massenspektren, dass das optimierte Ionensignal der Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen mindestens einen Faktor zwei größer als das optimierte Ionensignal der homogenen Intensitätsverteilung ist, und zwar für Analytionen im gesamten Messbereich. Da das Ionensignal aus dem gleichen Probenvolumen gewonnen wird, lässt sich daraus schließen, dass die Ionisationseffizienz des MALDI-Prozesses durch die Intensitätsspitzen mindestens verdoppelt wird. Wird sowohl die räumlich homogenen Intensitätsverteilung als auch die Intensitätsverteilung mit den Intensitätsspitzen bezüglich der Massenauflösung und des Signal-Rausch-Verhältnisses optimiert, werden diese beiden Kenngrößen ebenfalls mindestens um einen Faktor zwei verbessert. Für die Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen ist zudem der optimale Bereich mit hoher Ionisationseffizienz, guter Auflösung und gutem Signal-Rausch-Verhältnis weit ausgedehnt und somit die massenspektrometrische Analyse gegenüber der Energie der Laserpulse sehr robust.
Die 5 zeigt eine zweite bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (500). In der Lasereinheit (501) wird ein gepulster Laserstrahl erzeugt und durch die Linse (502) in eine Faser (503) (Multimodefaser) eingekoppelt. Der Faserausgang (504) wird durch die Linse (505) und den Umlenkspiegel (506) auf die Probe (521) abgebildet.
Im Gegensatz zum Stand der Technik wird die Multimodefaser (503) nicht zur Homogenisierung des Strahlprofils, sondern erfindungsgemäß zur Erhöhung der räumlichen Modulation der Intensität eingesetzt. Dazu wird die Länge der Multimodefaser (503) so gewählt, dass die zeitliche Kohärenz der Laserstrahlung größer als der Laufzeitunterschied der transversalen Fasermoden ist. In diesem Fall ergibt sich die Intensitätsverteilung am Faserausgang (504) nicht mehr aus der Überlagerung der Intensitäten der transversalen Fasermoden, sondern aus der Interferenz der elektromagnetischen Felder der einzelnen Fasermoden. Diese Interferenz der Fasermoden erzeugt eine räumlich stark modulierte Intensitätsverteilung, die bei Vielstrahlinterferenzen als Granulationsmuster (im Englischen „Speckle Pattern") bekannt ist.
Durch die Abbildung des Faserausgangs (504) wird auf der Probe (521) eine Intensitätsverteilung erzeugt, die eine Vielzahl von Intensitätsspitzen aufweist, die irregulär im Bild des Faserausgangs (504) verteilt sind und eine Halbwertsbreite von weniger als fünf Mikrometern aufweisen. Es wird wie in der ersten bevorzugten Ausführungsform auch dann eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung auf der Probe (521) erreicht, wenn sich der Faserausgang (504) nicht in der Objektebene der Abbildung befindet. Während im Lasersystem (200) die Intensität durch die gitterförmige Maske (203) nur abgeschwächt wird, ist die Intensitätsverteilung am Faserausgang (504) gegenüber der Intensitätsverteilung am Fasereingang punktuell deutlich überhöht. Für einen Nd:YAG Laser beträgt die Faserlänge zur Erhöhung der Modulation typischerweise weniger als etwa 50 Zentimeter und bevorzugt weniger als 30 Zentimeter. Für einen Stickstofflaser kann die Faserlänge aufgrund der geringeren zeitlichen Kohärenz deutlich kürzer sein.
Durch die Bewegung der Faser (503) am Faserausgang (504), der Linse (502), des Umlenkspiegels (506) oder des Probenträgers (522) kann die räumliche Intensitätsverteilung relativ zur Probe (521) bewegt werden. Zusätzlich kann die Intensitätsverteilung am Faserausgang (504) variiert werden, indem die Multimodefaser (503) zum Beispiel bewegt, gebogen oder einer mechanischen Spannung ausgesetzt wird, da sich dann die Interferenzbedingungen der transversalen Fasermoden ändern und die Intensitätsspitzen am Faserausgang (504) an anderen Stellen entstehen.
Die 6 zeigt eine dritte bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (600). In der Lasereinheit (601) wird ein gepulster Laserstrahl erzeugt, der eine transparente Plastikfolie (603) beleuchtet. Die Plastikfolie (603) ist an verschiedenen Stellen unterschiedlich dick, so dass die räumliche Modulation der Phase im Strahlprofil des Laserstrahls (602) erhöht wird. Wie in den anderen bevorzugten Ausführungsformen befinden sich das Lasermedium, die zur Anregung der Lasertätigkeit notwendigen Mittel und ein variabler Abschwächer in der Lasereinheit (601).
Falls sich der phasenmodulierte Laserstrahl (602) ungestört ausbreitet kann, entsteht in einer gewissen Entfernung das Fernfeldbeugungsbild der Plastikfolie (603), das eine Vielzahl von irregulär verteilten Intensitätsspitzen aufweist. Die Intensitätsspitzen entstehen wie in einem Granulationsmuster aufgrund der zufälligen räumlich stark modulierten Dickeschwankungen der Plastikfolie (603). Allerdings bilden sich Intensitätsspitzen nicht erst im Fernfeldbeugungsbild aus, sondern sind bereits am Ort der kreisförmigen Blende (604) im Strahlprofil des Laserstrahls (602) vorhanden, wenn der Abstand zwischen der Plastikfolie (603) und der Blende (604) hinreichend groß ist. Die inhomogen beleuchtete Blende (604) wird durch die Linse (605) und den Umlenkspiegel (606) verkleinert auf die Probe (621) abgebildet und erzeugt dort eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen. Durch den Umlenkspiegel (605) wird das Lasersystem (600) räumlich von dem nicht dargestellten Massenspektrometer getrennt, wodurch die Überführung der im MALDI-Prozess erzeugten Ionen in das Massenspektrometer erleichtert wird. Neben der Probe (621) befinden sich andere nicht dargestellte Proben auf dem Probenträger (622).
Ein Nachteil der Plastikfolie (603) besteht darin, dass die Intensitätsverteilung auf der Probe (621) aufgrund der zufälligen Dickeschwankungen der Plastikfolie (603) nicht frei gestaltbar ist. Ein Vorteil ist der geringe Aufwand, mit dem viele Intensitätsspitzen mit kleinen Halbwertsbreiten erzeugt werden können. Neben einer Plastikfolie (603), die nur die Phase des Strahlprofils moduliert, kann selbstverständlich auch eine beugende Maske verwendet werden, die die Intensität oder die Phase (oder beides) räumlich moduliert und dadurch auf der Blende (604) eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung erzeugt. Statt einer beugenden Maske kann ebenso gut eine reflektierende Fläche das Strahlprofil des Laserstrahls räumlich modulieren.
Falls der Abstand zwischen der Plastikfolie (603) und der kreisförmigen Blende (604) hinreichend groß ist, entsteht am Ort der Blende (604) das Fernfeldbeugungsbild der Plastikfolie (603). Durch die Blende (604) wird ein Ausschnitt des Fernfeldbeugungsbildes definiert und verkleinert auf die Probe (621) abgebildet. Mit dem Lasersystem (600) kann eine beliebige Intensitätsverteilung auf der Probe (621) erzeugt werden, wenn anstelle der Plastikfolie (603) eine (beugende) Maske eingesetzt wird, bei der die Transmission und die Phasenschiebung in jedem Punkt der Maske eingestellt werden können. Der Fachmann weiß, dass sich das Fernfeldbeugungsbild aus der zweidimensionalen Fouriertransformierten des elektrischen Feldes hinter der Maske ergibt. Durch die Transmission und die Phasenschiebung der Maske werden das elektrische Feld hinter der Maske und somit auch das Fernfeldbeugungsbild am Ort der Blende (604) festgelegt. In der Praxis ist es allerdings schwierig und oft nicht notwendig sowohl die Transmission als auch die Phasenschiebung in jedem Punkt der Maske einzustellen, so dass in den meisten Fällen entweder die Transmission oder die Phasenschiebung eingestellt wird. Es gibt zum Beispiel auch elektrooptische Chips, bei denen die Phase im Strahlprofil in jedem Pixel auf dem Chip eingestellt werden kann.
Um eine Probe (621) mit einer Folge von Laserpulsen möglichst vollständig und mit einer hohen Ionisationseffizienz zu verbrauchen, kann es notwendig sein, die Lage oder die Position der räumlich modulierten Intensitätsverteilung oder diese selber zu verändern, zum Beispiel durch den Austausch der Plastikfolie (603). Wie schon in der ersten bevorzugten Ausführungsform beschrieben wird, kann eine Mechanik die Plastikfolie (603) bewegen oder gegen eine andere beugende Maske austauschen, so dass am Ort der Blende (604) und somit auf der Probe (621) unterschiedliche räumlich modulierte Intensitätsverteilungen erzeugt werden. Weitere Möglichkeiten bestehen zum Beispiel darin, den Probenträger (622), die Linse (605) oder den Umlenkspiegel (606) mechanisch zu bewegen und somit die Lage der Intensitätsverteilung relativ zur Probe (621) zu verändern. Wird anstelle der Linse (604) ein optisches System mit variabler Brennweite verwendet, kann das Abbildungsverhältnis variiert werden. Eine schräge Beleuchtung kann analog zur ersten Ausführungsform ausgeglichen werden.
Eine vierte bevorzugte Ausführungsform erhält man aus dem Lasersystem (600), wenn sich die Probe (621) in der hinteren Brennweite der Linse (605) befindet und die Plastikfolie (603) (oder eine beugende Maske) ohne Blende (604) in die vordere Brennweite der Linse (605) gestellt wird. Aus der kohärenten Optik ist dem Fachmann bekannt, dass die Linse (605) dann in der hinteren Brennebene auf der Probe (621) ein verkleinertes Fernfeldbeugungsbild erzeugt. Wird anstelle der Linse (604) ein optisches System mit variabler Brennweite verwendet, kann das Fernfeldbeugungsbildes auf der Probe (621) vergrößert bzw. verkleinert werden.
Die 7 zeigt eine gemessene Intensitätsverteilung, die das erfindungsgemäße Lasersystem (600) auf der Probe (621) erzeugt. Es wird dafür ein frequenzverdreifachter gepulster Nd:YAG Laser mit einer Wellenlänge von 355 Nanometern und einer Pulsdauer von etwa 3 Nanosekunden verwendet, der ein gaußförmiges Strahlprofil hat. Die kreisförmige Blende (604) hat einen Durchmesser von 375 Mikrometern und wird durch die Linse (605) und den Umlenkspiegel (606) fünffach verkleinert auf die Probe (621) abgebildet. Ohne die Plastikfolie (603) hat das gaußförmige Strahlprofil des Laserstrahls (602) am Ort der Blende (604) eine Halbwertsbreite von etwa 4 Millimetern, so dass die Blende (604) in guter Näherung räumlich homogen beleuchtet wird. Durch die Plastikfolie (603) weist die räumlich nahezu homogene Intensitätsverteilung am Ort der Blende (604) zusätzlich eine Vielzahl von irregulär verteilten Intensitätsspitzen auf. Auf der Probe (621) haben diese Intensitätsspitzen eine Halbwertsbreite von weniger als fünf Mikrometer. Aufgrund der begrenzten optischen Auflösung des Messaufbaus kann die Halbwertsbreite auch deutlich weniger als fünf Mikro meter betragen. In den Intensitätsspitzen ist die Intensität gegenüber der homogenen Intensitätsverteilung ohne Plastikfolie (603) deutlich überhöht. Der Modulationsgrad der Intensitätsspitzen beträgt in den meisten Fällen mehr als 4/5.
In der 8a ist ein Massenspektrum dargestellt, das in einem Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss gemessen wird, wenn für den MALDI-Prozess die in 7 dargestellte Intensitätsverteilung mit zufällig verteilten Intensitätsspitzen verwendet wird. Die Probe (621) wird mit einer Dünnschichtpräparation hergestellt. In der 8a ist auf der Ordinate die relative Häufigkeit der detektierten Ionen gegen deren Masse zu Ladungsverhältnis aufgetragen, das auf der Abszisse bis 3400 atomaren Masseneinheiten reicht. Die 8a zeigt ein signalreiches Massenspektrum, das sich als Summe aus etwa 30 einzelnen Massenspektren ergibt und eine gute Auflösung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist. Wenn die Plastikfolie (603) aus dem Lasersystem (600) entfernt wird, kann auf einer neuen unverbrauchte Probenstelle kein Ionensignal erzeugt werden (siehe 8b). Durch die Plastikfolie (603) wird die Intensität auf der Probe (621) in den Intensitätsspitzen stark überhöht, allerdings ist die Energie in der räumlich modulierten Intensitätsverteilung auf der Probe (621) kleiner, da die Plastikfolie (603) die Energie der Laserpulse teilweise absorbiert und streut. Wenn eine Intensitätsverteilung auf der Probe (621) eine Vielzahl von Intensitätsspitzen aufweist, ist also gegenüber einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung weniger Energie in den Laserpulsen notwendig, um Analytionen im MALDI-Prozess zu erzeugen.
Die 9 zeigt eine fünfte bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (900). In der Lasereinheit (901) wird ein gepulster Laserstrahl erzeugt, der eine flächige Anordnung aus Linsen (903) beleuchtet. Dieses Linsenfeld (903) erhöht die räumliche Modulation der Phase im Strahlprofil des Laserstrahls (902). Die Linsen des Linsenfeldes (903) erzeugen am Ort der Blende (904) einzelne räumlich getrennte Fokusse, die durch die Linse (905) und den Umlenkspiegel (906) verkleinert auf die Probe (921) abgebildet werden. Wie in den anderen bevorzugten Ausführungsformen befinden sich das Lasermedium, die zur Anregung der Lasertätigkeit notwendigen Mittel und ein variabler Abschwächer in der Lasereinheit (901).
Durch die Vielzahl der räumlich getrennten Fokusse entsteht auf der Probe (921) eine Intensitätsverteilung aus vielen Intensitätsspitzen. Die Halbwertsbreiten der Intensitätsspitzen sind dabei vorzugsweise kleiner als fünfzig Mikrometer und besonders bevorzugt kleiner als zwanzig Mikrometer, können aber auch kleiner als fünf Mikrometer und sogar kleiner als einen Mikrometer sein. Der Modulationsgrad ist vorzugsweise größer als 3/10 und besonders bevorzugt größer als 1/2, kann aber auch größer als 4/5 sein.
Bei dem Linsenfeld (903) treten Beugungseffekte auf, die sich grundlegend von der geometrischen Optik unterscheiden. So wird der so genannte Talbot-Effekt beobachtet, bei dem der Laserstrahl (902) in mehr als einer Ebene fokussiert wird und die Anzahl der Einzelfokusse in diesen Ebenen größer als die Anzahl der Linsen im Linsenfeld (903) ist. Der Tal bot-Effekt kann genutzt werden, um die Flächendichte und Anzahl der Intensitätsspitzen auf der Probe (921) zu variieren.
Die 10 zeigt eine sechste bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (1000). In der Lasereinheit (1001) wird ein gepulster Laserstrahl erzeugt, der ein beugendes optisches Element (1003) (DOE, Abkürzung für „Diffractive Optical Element") beleuchtet, das die räumliche Modulation sowohl der Intensität als auch der Phase im Strahlprofil des Laserstrahls erhöhen kann. Wie der Fachmann weiß, können beugende optische Elemente sogar ohne weitere brechende oder reflektierende Optiken verwendet werden, um auf der Probe (1021) eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung mit Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden zu erzeugen. Durch die Gestaltung der Transmission oder der Phasenschiebung an jedem einzelnen Punkt des beugenden optischen Elementes (1003) kann zum Beispiel aus einem gaußförmigen Strahlprofil ein reguläres Raster aus Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden erzeugt werden. Das optische Design des beugenden optischen Elementes (1003) bestimmt die Anzahl, die Halbwertsbreite und den Modulationsgrad der Intensitätsspitzen und der Intensitätsschneiden; es kann sogar die schräge Beleuchtung der Probe (1021) ausgleichen. Mit einem Energieabschwächer können die Intensitäten sowohl in den Intensitätsspitzen und Intensitätsschneiden als auch in den Bereichen dazwischen eingestellt werden. Durch einen mechanischen Austausch der beugenden optischen Elemente können unterschiedliche räumliche Intensitätsverteilungen auf der Probe (1021) erzeugt werden.
Für den Fachmann ist klar, dass es neben den dargestellten bevorzugten Ausführungsformen eine Vielzahl weiterer Ausführungsformen von Lasersystemen gibt, mit denen auf einer MALDI-Probe eine Intensitätsverteilung erzeugt werden kann, die räumlich moduliert ist und Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden aufweist. So kann zum Beispiel die Laserstrahlung im optischen Resonator so geformt werden, dass das Strahlprofil schon im optischen Resonator räumlich inhomogen ist. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, aus einem Laserstrahl mehrere räumlich getrennte Teilstrahlen zu erzeugen, zum Beispiel durch Strahlteiler oder beugende optische Elemente. Die Teilstrahlen können an unterschiedlichen Stellen auf der Probe fokussiert werden oder auf der Probe zur Interferenz gebracht werden, wie zum Beispiel in einem Michelson Interferometer. In beiden Fällen entsteht auf der Probe eine räumlich modulierte Intensitätsverteilung. Neben der Aufteilung eines Laserstrahls können in einem erfindungsgemäßen Lasersystem auch Laserstrahlen in mehr als einem Lasermedium erzeugt werden.
Mit der Kenntnis der Erfindung ist es dem Fachmann möglich, weitere Ausformungen von erfindungsgemäßen Lasersystemen zu entwerfen.

Claims

Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasersystem außerhalb des Lasermediums eine Vorrichtung enthält, die die räumliche Modulation eines Laserstrahls erhöht, und die Intensitätsverteilung der Laserstrahlung am Ort der Probe aus mehr als einer Intensitätsspitze oder aus mindestens einer Intensitätsschneide oder aus einer Mischung aus beiden besteht.
Lasersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Vorrichtung innerhalb des optischen Resonators befindet.
Lasersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Vorrichtung zwischen dem optischen Resonator und der Probe befindet.
Lasersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserstrahl in der Vorrichtung in einer Faser geführt wird, die eine Länge von weniger als fünfzig Zentimeter hat.
Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass Laserstrahlung in mehr als einem Lasermedium erzeugt wird und die Intensitätsverteilung der Laserstrahlung am Ort der Probe aus mehr als einer Intensitätsspitze oder aus mindestens einer Intensitätsschneide oder aus einer Mischung aus beiden besteht.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Modulationsgrad für einen Teil der Intensitätsspitzen oder der Intensitätsschneiden oder für alle Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden größer als 3/10 ist.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Halbwertsbreite für einen Teil der Intensitätsspitzen oder der Intensitätsschneiden oder für alle Intensitätsspitzen oder Intensitätsschneiden kleiner als 20 Mikrometer ist.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung am Ort der Probe teilweise oder vollständig einstellbar ist.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserstrahlung aus einer Folge von Laserpulsen besteht.
Lasersystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung von mindestens zwei Laserpulsen am Ort der Probe unterschiedlich ist.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Ionisationseffizienz von Analytionen im Vergleich zu einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung mindestens verdoppelt wird.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Massenauflösung in der massenspektrometrischen Analyse der Analytionen im Vergleich zu einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung mindestens verdoppelt, wenn die Analytionen mit einem Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss gemessen werden.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Signal-Rausch-Verhältnis in der massenspektrometrischen Analyse der Analytionen im Vergleich zu einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung mindestens verdoppelt, wenn die Analytionen mit einem Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss gemessen werden.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsspitzen und/oder die Intensitätsschneiden am Ort der Probe räumlich irregulär verteilt sind.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsspitzen und/oder die Intensitätsschneiden am Ort der Probe ein räumlich reguläres Raster bilden.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die in einzelnen Punkten oder in einzelnen Bereichen erzeugten Analytionen getrennt massenspektrometrisch nachgewiesen werden.
Verfahren zur Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Probe mit Analytmolekülen hergestellt wird, b) die Analytmoleküle mit einem Lasersystem aus einem der Ansprüche 1 oder 5 ionisiert werden und c) die ionisierten Analytmoleküle massenspektrometrisch gemessen werden.