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Die
Erfindung bezieht sich auf die schnelle und kostengünstige
Analyse der Aminosäure-Sequenzen von Proteinen mit Massenspektrometern, die
eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI) verwenden.
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Die
Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren für die Aufnahme
von Massenspektren der Fragmentionen aus „In-Source Decay” (ISD)
bereit, mit dem sich lange N- und C-terminale Sequenzen der Aminosäuren
eines Proteins aus nur einem einzigen Massenspektrum bestimmen lassen.
Dazu werden erstens besondere Matrixsubstanzen verwendet, zweitens
Laser mit kurzen Lichtpulsen und geeignetem Strahlprofil eingesetzt,
und drittens die Massenspektren so aufgenommen, dass die Empfindlichkeit im
unteren Massenbereich erniedrigt wird. Durch die Kombination dieser
Maßnahmen wird eine Auswertbarkeit der c- und z-Fragmentionen
im unteren Massenbereich erreicht. Um auch Fragmentionen hoher Massen
aufzunehmen, wird die Verstärkung des Ionendetektors während
repetierender Aufnahmen von Einzelflugzeitspektren allmählich
angehoben, während leichte Ionen durch einen Ionenselektor
zunehmend ausgeblendet werden. Es können damit in Fragmentionenspektren,
deren Aufnahmedauer nur wenige Sekunden beträgt, N-terminale
Sequenzen vom Terminus her bis über 80 Aminosäuren
hinaus, C-terminale Sequenzen bis über 60 Aminosäuren
hinaus direkt gelesen werden. Werden keine zusätzlichen
biochemischen Markierungen verwendet, so bleiben lediglich Leucin/Isoleucin
und Glutamin/Lysin nicht unterscheidbar, was aber für viele
Anwendungsgebiete, beispielsweise für viele diagnostische Essays,
ohne Belang ist.
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Stand der Technik
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Die
Standardmethode für Protein-Sequenzierungen ist die Edman-Sequenzierung,
die in entsprechenden Automaten von gut gereinigten Proteinproben
unter Verbrauch relativ teuerer Chemikalien in etwa 10 Stunden insgesamt
etwa 30 bis 40 Aminosäuren vom N-Terminus her zu lesen
gestattet. C-terminale Aminosäuren können nicht
bestimmt werden. Ist der N-Terminus blockiert, funktioniert das
Verfahren nicht. Da dieses Verfahren heutigen Anforderungen an Kosten,
Analysengeschwindigkeit und Sequenzierungslängen nicht
mehr genügt, wurde die Herstellung der automatischen Edman-Sequenzierer eingestellt.
Es wird gegenwärtig nach Verfahren gesucht, die schneller,
preiswerter und mit größerer Sequenzierungslänge
arbeiten.
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Ein
(bisher noch nicht existierendes, aber denkbares) Gerät
zur massenhaften Proteinsequenzierung mit der Möglichkeit
zu stündlich über tausend Sequenz-Analysen von
Proteinen oder Proteinspaltstücken mit bis zu 150 Aminosäuren
und mehr würde heute viele Anwendungsgebiete beflügeln
und viele neue Anwendungsgebiete eröffnen. Es würde
in weitem Rahmen die Verfolgung der Veränderungen der verschiedenartigsten
Proteine durch die Evolution der Arten zu erforschen gestatten und
die taxonomische Einordnung der Spezies, die heute auf der Basis
von langsamen und teuren DNA-Analysen erfolgt, außerordentlich
erleichtern. Insbesondere aber würde es ermöglichen,
die Variationen der Proteine in den Individuen einer Spezies untersuchen.
In unserem Erbgut gibt es Hunderttausende von SNPs (Single Nucleotide
Polymorphisms), die uns Menschen voneinander unterscheiden. Es ist
zu erwarten, dass sich ein beträchtlicher Teil dieser Polymorphismen auch
in Variationen der Proteine niederschlägt, die wiederum
unseren Phänotyp ausprägen. Dabei treten mit Sicherheit
genetisch bedingte Funktionsänderungen vieler Proteine
auf (Funktionsminderung, Überfunktionen, Fehlfunktionen),
die verändertes Aussehen, verändertes Verhalten,
veränderte Verträglichkeit gegenüber äußeren
und inneren Einflüssen wie Nahrungsmittel, Chemikalien
und Pharmaka und vieles andere mehr bewirken können. Daraus könnten
sich wiederum diagnostische Verfahren für die Aufdeckung
vieler Anomalien bis hin zu genetisch bedingten Unverträglichkeiten
und Krankheitsanlagen ergeben.
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Ein
viel versprechendes Verfahren als Grundlage für einen solchen
Sequenzierautomaten und für entsprechende Assays ist die
MALDI-Analyse der Proteinmoleküle mit einer willkürlich
erzeugten Spontanfragmentierung, die unter dem Kürzel „ISD” (in-source
decay) bekannt geworden ist.
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MALDI
(Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption)
ist eine bedeutende Ionisierungsart für Biomoleküle,
die durch M. Karas und K. Hillenkamp vor etwa zwanzig Jahren entwickelt
wurde. MALDI ionisiert die Biomoleküle, die sich in hoher Verdünnung
in einer Matrixsubstanz in überwiegend festen Proben auf
Probenträgern befinden, durch den Beschuss mit Laserlichtpulsen.
Jeder Laserlichtpuls erzeugt aus einer Probe eine winzige und kurzlebige
Wolke heißen Plasmas mit neutralen Molekülen,
positiven und negativen Ionen.
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Die
Ionen aus dem Plasma jedes einzelnen Laserlichtpulses werden heute
noch überwiegend in besonders dafür konstruierten
MALDI-Flugzeitmassenspektrometern (MALDI-TOF-MS) axial in eine Flugzeitstrecke
hinein beschleunigt und nach Durchlaufen der Flugstrecke einem Detektor
zugeführt, der die massenabhängige Ankunftszeit
der Ionen und ihre Menge misst und die digitalisierten Messwerte als
Flugzeitspektrum speichert. Dabei wurden früher Wiederholfrequenzen
der Laserlichtpulse von 20 bis zu 200 Hertz verwendet, heute sind
MALDI-TOF-Massenspektrometer mit bis zu zwei Kilohertz Lichtpulsfrequenz
erhältlich. Es werden jedoch heute auch zunehmend Flugzeitmassenspektrometer
mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF) mit MALDI-Ionenquellen ausgerüstet;
diese nehmen Massenspektren mit Wiederholungsraten von etwa fünf
Kilohertz auf.
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In
beiden Arten von Massenspektrometern werden Detektoren für
die Ionenströme eingesetzt, die aus jeweils einem speziellen
Sekundärelektronen-Vervielfacher (SEV) mit nachgeschaltetem
Transientenrekorder bestehen, wobei der Transientenrekorder einen
mit 2 bis 4 Gigahertz sehr schnell arbeitenden Analog-zu-Digital-Wandler
(ADC) mit meist nur 8 bit Wandlungsbreite enthält. Die
Flugzeitspektren können 100 bis 200 Mikrosekunden lang
sein, also 200 000 bis 800 000 Messwerte umfassen. Die Messwerte
von einigen Hundert oder Tausend so aufeinanderfolgend gemessener
Flugzeitspektren der Ionen werden zu einem Summenspektrum addiert. Dieses
wird einer Peak-Erkennung unterworfen, und die Liste mit den Flugzeit-Peaks
wird über eine Kalibrierkurve in eine Liste der ladungsbezogenen
Massen m/z und ihrer Intensitäten i umgewandelt. Die Massenspektren
beider Arten von Massenspektrometern können durch die Verwendung
von energiefokussierenden Reflektoren und andere Maßnahmen wie
beispielsweise verzögerte Beschleunigung (DE = delayed
extraction) Massenauflösungsvermögen von R = m/Δm
= 20 000 bis 50 000 erreichen, wobei Δm die Breite des
Ionenpeaks der Masse m in halber Höhe ist.
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Unter
dem Begriff „Massenspektrum” wird dabei etwas
unscharf entweder die erwähnte Liste der ladungsbezogenen
Massen m/z und ihrer Intensitäten im/z,
ihre graphische Darstellung im/z = f(m/z) („Strichspektrum”),
oder auch die quasianaloge Funktion der Messwerte in =
f(m/z) verstanden, wobei n den Zähler der Messwerte im
Flugzeitspektrum darstellt.
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Wenn
im Folgenden einfach von der „Aufnahme eines Massenspektrums” die
Rede ist, so ist damit in der Regel die beschriebene Aufnahme von Hunderten
oder Tausenden von Einzelflugzeitspektren, deren Zusammenfassung
zu einem Summenflugzeitspektrum und dessen Umwandlung in ein Massenspektrum
gemeint. Das trifft für Massenspektren von Molekülionen
ebenso zu wie für Tochterionenspektren.
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Wenn
der Begriff „Masse der Ionen” oder auch nur einfach
von „Masse” in Verbindung mit Ionen verwendet
wird, so ist in der Massenspektrometrie stets die „elementarladungsbezogene
Masse” m/z gemeint, also die physikalische Masse m der
Ionen geteilt durch die dimensionslose und absolut genommene Anzahl
z der positiven oder negativen Elementarladungen, die dieses Ion
trägt. Die elementarladungsbezogene (oder kürzer „ladungsbezogene”) Masse
m/z wird auch oft etwas unschön als „Masse-zu-Ladungs-Verhältnis” bezeichnet,
obwohl sie die Dimension einer Masse hat. Da aber MALDI praktisch
nur einfach geladene Ionen liefert (z = 1), ist die Unterscheidung
zwischen „Masse” und „ladungsbezogener
Masse” hier meist hinfällig. Als Einheit für
die Masse wird in dieser Schrift das „Dalton” (Da)
verwendet, weil diese Einheit in der Biochemie gebräuchlich
ist, statt der gesetzlichen nichtkohärenten SI-Einheit
mit dem Namen „vereinheitlichte atomare Masseneinheit” und
dem Kürzel „u”.
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Für
die Sequenzierung von Proteinen ist die Aufnahme von Tochterionenspektren
der Proteinmolekülionen erforderlich. Mit MALDI können
zwei verschiedene Verfahren zur Erzeugung und Messung von Tochterionen
ausgewählter Elternionen durchgeführt werden:
- 1) Ein Verfahren mit „ergodischer” (oder „thermischer”)
Fragmentierung durch den Zerfall metastabiler Ionen im Massenspektrometer
nach ihrer Beschleunigung in der Ionenquelle, wobei hauptsächlich
b- und y-Fragmentionen zeugt werden (PSD = post-source decomposition).
Soll PSD so angewendet werden, dass Tochterionenspektren in einem
einzigen Zuge aufgenommen werden können, so erfordert das
ein besonders mit schaltbaren Nachbeschleunigungseinheiten ausgerüstetes
und leider auch teures MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer (siehe dazu Köster
et al., DE 198 56
014 C2 ; GB
2 344 454 B ; US
6,300,627 B1 ).
- 2) Ein Verfahren der Spontan-Fragmentierung (ISD = in-source
decay) vor der um einige hundert Nanosekunden verzögerten
Beschleunigung der Ionen, das vorwiegend c- und z-Fragmentionen liefert.
ISD bietet sich als besonders günstig für eine
Sequenzanalyse an, da es grundsätzlich in einfacheren und
preiswerteren Massenspektrometern ohne Nachbeschleunigungseinheit
durchgeführt werden kann. Aus Proben mit Proteinen, die
etwa dem Reinheitsgrad und der Menge der für Edman-Sequenzierung
präparierten Proteine entspricht, können in Minutenschnelle
sehr gut und einfach auswertbare Fragmentionenspektren erzeugt werden.
Die c-Fragmentionen bilden im Massenspektrum im Massenbereich zwischen etwa
einem Kilodalton und acht Kilodalton eine herausragende und leicht
erkennbare Reihe von Signalen, die alle aus etwa den gleichen Anzahlen von
Ionen bestehen. Auch die z-Fragmentionen bilden eine Reihe von Signalen
mit etwa jeweils gleichen Anzahlen von Ionen, deren Signal-Mittelwerte
aber etwa um einen Faktor 5 bis 10 unterhalb denen der c-Fragmentionen
liegen.
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Die
Intensitätsvariationen beider Reihen von Fragmentionen
liegen jeweils in einem relativ schmalen Intervall, das sich vom
Mittelwert aus nur um einen Faktor 1, 3 nach oben und unten erstreckt.
Alle Aminosäuren fragmentieren also mit etwa gleicher Wahrscheinlichkeit;
eine Ausnahme bildet Prolin, das wegen seiner besonderen Ringstruktur
zwar fragmentieren mag, jedenfalls aber keine zwei getrennte Bruchstücke
liefert. Da die Empfindlichkeit der verschiedenen Ionendetektoren,
die alle auf der Basis der Sekundärelektronen-Vervielfachung
funktionieren, mit steigender Masse abnimmt, nimmt auch der Mittelwert
der Intensitäten der c-Fragmentionen im Massenspektrum
mit zunehmender Masse ab, so dass in heutigen MALDI-TOF-Massenspektrometern die
Auswertbarkeit der c-Fragmentionen bei maximal etwa 70 Aminosäuren
vom N-terminalen Ende her endet. Vom C-terminalen Ende her kann
durch eine Auswertung der z-Fragmentionen eine Sequenz von maximal
etwa 50 Aminosäuren bestimmt werden.
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Leider
weisen die Massenspektren, die in dieser Weise in gegenwärtig
erhältlichen MALDI-TOF-Massenspektrometern aufgenommen
werden, noch erhebliche Mängel auf. So ist der untere Massenbereich
bis zu etwa m/z = 1000 Dalton mit einem so hohen chemischen Untergrund überdeckt, dass
hier eine Auswertung der Massenspektren nicht möglich ist.
Der Untergrund stammt weitgehend von Molekülen der Matrixsubstanz,
die unter Beschuss mit Laserlichtpulsen mit bisher üblichen
Pulsdauern und Energiedichten zerschlagen werden und sich im heißen,
aber rasch adiabatisch abkühlenden Plasma der Desorptionswolke
zu komplexen Ionen verschiedenster Massen zusammensetzen, die einen
fast kontinuierlichen Untergrund bilden. Es können somit die
Sequenzen der ersten acht bis zehn terminalen Aminosäuren
nicht gelesen werden.
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Ein
besonderes Verfahren zum Lesen auch der terminalen Sequenzen durch
metastabilen Zerfall einer ausgewählten ISD-Fragmentionensorte
und auch für eine weitergehende Strukturanalyse von ISD-Fragmentionen
besteht darin, die Instabilität dieser Fragmentionen auszunutzen
und die durch metastabilen Zerfall entstehenden Enkelionen mit einem MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer
zu messen, das für die Aufnahme ergodisch erzeugter Fragmentionen
eingerichtet ist (D. Suckau und A. Resemann:
DE 103 01 522 A1 ;
GB 2 399 218 B ;
US 7,396,686 B2 ).
Das Verfahren ist jedoch für eine massenhafte Proteinsequenzierung
nachteilig, weil nach einer ersten Spektrenauswertung mindestens
zwei weitere Enkelionenspektren von c- und z-ISD-Fragmentionen aufgenommen
werden müssen. Außerdem ist dazu ein teures MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer
mit Nachbeschleunigungseinheit erforderlich, das auch Spektren der
Fragmentionen aus metastabilen Zerfällen aufnehmen kann.
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Es
besteht in der MALDI-Massenspektrometrie eine hohe Kunst darin,
durch Einstellung der Detektor-Verstärkung und durch Einstellung
der MALDI-Bedingungen die 8 bit Wandlungsbreite des Analog-zu-Digital-Wandlers
(ADC) im Transientenrekorder optimal auszunutzen, ohne dessen dynamischen Messbereich
(kurz das „Messfenster”) von nur 1:255 Zähleinheiten
(Counts) zu übersättigen oder durch Untersteuerung
alle einzeln gebildeten Ionen unentdeckt zu verlieren. Der Aufschlag
der Ionen auf den Sekundärelektronen-Vervielfacher (SEV)
erzeugt eine nur geringe Menge zwischen null bis etwa sechs Elektronen,
wobei die Verteilung einer Poisson-Verteilung genügt. Die
Poisson-Verteilung ist dadurch charakterisiert, dass ihre Standardabweichung
gleich dem Mittelwert ist; dadurch gibt es immer auch eine Anzahl
von Aufschlägen von Ionen ohne Erzeugung von Sekundärelektronen
(Null-Ereignisse), deren Anzahl umso größer wird,
je kleiner der Mittelwert wird.
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Die
Verstärkung des SEV in einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
gilt im bisherigen Stand der Technik dann als optimal eingestellt,
wenn ein einzelnes Ion einer Masse von etwa m/z = 1000 Dalton und
einer Energie von etwa 30 Kiloelektronenvolt im Mittel ein Signal
von etwa 2,5 Zähleinheiten des ADC (Counts) im Transientenrekorder
erzeugt; der Messbereich für Ionen im Messzeitintervall
von 0,5 oder 0,25 Nanosekunden beträgt dann 1:100 und der
Verlust der Signale einzelner Ionen ist vernachlässigbar
klein, zumindest im normalerweise aufgenommenen Massenbereich bis
zu m/z = 3000 Dalton. Da das Ionensignal im Allgemeinen mehrere
Messzeitintervalle überstreicht, dürfen sich in
einem Ionensignal mit Ionen der gleichen Masse nicht mehr als wenige
Hundert Ionen befinden, wenn Übersättigung vermieden
werden soll. Diese Einstellung der Ionenmenge bewirkt aber, dass
im höheren Massenbereich oberhalb von drei Kilodalton nicht
mehr alle Ionen erfasst werden, weil zu höheren Massen
hin immer mehr Null-Ereignisse auftreten; darum ist die Sequenzierung
gegenwärtig auf maximal 70 C-terminale (etwa acht Kilodalton)
und 50 N-terminale (etwa sechs Kilodalton) Aminosäuren
begrenzt. Die optimale Einstellung der MALDI-Bedingungen erfordert dabei
sehr viel Wissen über die Einflüsse der Laserlicht-Parameter
auf die MALDI-Prozesse.
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Die
matrixunterstützte Laserdesorption geht (mit wenigen Ausnahmen)
von festen Probenpräparationen auf einem Probenträger
aus. Die Proben bestehen im Wesentlichen aus kleinen Kriställchen
der Matrixsubstanz, der in geringen Anteilen (nur etwa ein hundertstel
Prozent) Moleküle der Analytsubstanzen beigemischt sind.
Die Analytmoleküle sind einzeln in das Kristallgitter der
Matrixkristalle eingebaut oder befinden sich in Kristallgrenzflächen.
Die so präparierten Proben werden mit kurzen Pulsen von UV-Laserlicht
bestrahlt. Die Dauer der Pulse beträgt üblicherweise
etwa einige Nanosekunden und hängt vom verwendeten Laser
ab. Dabei entstehen Verdampfungsplasmen, die neben neutralen Molekülen sowohl
Ionen der Matrixsubstanz wie auch einige Analyt-Ionen enthalten.
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Die
früher meist verwendeten Stickstoff-Laser können
für Hochdurchsatz nicht verwendet werden, weil sie nur
Lebensdauern von einigen Millionen Laserschüssen haben.
Sie werden heute zunehmend durch Festkörperlaser abgelöst,
deren Lebensdauern mehr als tausendmal höher sind. Festkörper-Laser
liefern ein glattes Energiedichteprofil quer über den mit
dem Linsensystem eingestellten Laserspot. Das Energiedichteprofil
hat in etwa die Form einer Gauß-Verteilung.
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Mit
der Einführung von Festkörper-Lasern in die MALDI-Technik
statt der bisher verwendeten Stickstoff-Laser musste man nun überraschend
feststellen, dass das glatte Strahlprofil dieser Festkörperlaser
die Ionenausbeute verringerte. Stickstoff-Laser haben ein Strahlprofil,
das aus Mikrospots besteht, deren Lage von Laserschuss zu Laserschuss
variiert. Es wurde daher für Festkörperlaser ein
Verfahren einer Profilierung des Laserlichtstrahls in mehrere einzelne
Spots optimaler Durchmesser entwickelt, das die Ionenausbeute sogar
noch über die Ionenausbeute der Stickstoff-Laser hinaus
erhöhte. Diese Technik ist unter dem Namen „Smart
Beam” bekannt geworden; sie ist in
DE 10 2004 044 196 A1 ;
GB 2 421 352 A ;
US 7,235,781 C1 (A.
Haase et al.) eingehend beschrieben. Mit dieser Technik kann man durch
Optimierung der Durchmesser und der Anzahl der Laserspots eine Erhöhung
der Ionenausbeute erreichen. Damit hat man ein Mittel an der Hand,
durch Profilierung des Laserstrahls gleichzeitig eine hohe Ausbeute
an Analytionen und eine optimale Anpassung an das Messfenster des
Transientenrekorders zu erreichen.
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Für
die ISD-Fragmentierung kann nicht jede Matrixsubstanz verwendet
werden. Die für Peptidanalysen durch PSD-Fragmentierung
außerordentlich gut geeignete Matrixsubstanz α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure
(CHCA) liefert praktisch keine ISD-Fragmentionen. Bisher wurde für
ISD hauptsächlich die Matrixsubstanz Dihydroxybenzoesäure
(DHB) eingesetzt. In jüngster Zeit wurde bekannt, dass
sich die Ausbeute an ISD-Fragmentionen durch die Verwendung geeigneter
Matrixsubstanzen, die leicht Wasserstoff-Radikale abgeben, entscheidend
verbessern lässt (K. Demeure et al.: „Rational
Selection of the Optimum MALDI Matrix for Top-Down-Proteomics by In-Souce
Decay", Anal. Chem. A; Web 10/17/2007). Eine dieser
Matrixsubstanzen ist 1,5-Diaminonaphtalin (1,5-DAN), es steht jedoch
zu erwarten, dass es hier in naher Zukunft noch besser wirkende
Matrixsubstanzen geben wird. Die ISD-Spontanfragmentierung wird
nach diesen Erkenntnissen im Wesentlichen durch chemische Reaktionen
eingeleitet. Diese neuen Matrixsubstanzen mit leichter Abgabe von Wasserstoff-Radikalen
haben darüber hinaus die Fähigkeit, Disulfid-Brücken
in größeren Proteinen, die zu Ringstrukturen führen,
aufzuschneiden. Die Ringstrukturen haben bisher eine Sequenzaufklärung
durch ISD jenseits der Disulfid-Brücke verhindert, da hier
eine Fragmentierung zu Spaltstücken führt, die über
die Ringstruktur noch zusammenhängen. Das Aufbrechen der
Disulfid-Brücken wird durch das basische Milieu im Plasma
durch die Aminogruppen des 1,5-DAN und durch die abgegebenen Wasserstoff-Radikale
bewirkt.
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Das
ISD-Verfahren ist zwar seit etwa zehn Jahren bekannt, erst in jüngerer
Zeit sind aber solche Fortschritte zu verzeichnen, die ISD leicht
einzusetzen gestatten. Die Fortschritte beruhen mindestens teilweise
auf neueren Erkenntnissen über die MALDI-Prozesse; zum
vollen Verständnis der Phänomene wird aber noch
viel Forschungsarbeit benötigt.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren bereitzustellen, die Massenspektren
der ISD-Spontanfragmentionen von Proteinen liefern, mit denen die Sequenzen
von den endständigen Aminosäuren bis in Bereiche
hoher Anzahlen von Aminosäuren schnell, einfach und kostengünstig
bestimmt werden können.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung stützt sich auf die Beobachtung, dass bei Anwendung
von ISD begünstigenden Matrixsubstanzen und von kurzen
Laserlichtpulsen erstens die Ausbeute an ISD-Fragmentionen steigt, zweitens
der Probenverbrauch drastisch vermindert wird und insbesondere drittens
der Untergrund im unteren Massenbereich des Massenspektrums stark zurückgeht.
Unter Verwendung geeigneter Matrixsubstanzen, wie beispielsweise
1,5-DAN werden mit diesen kurzen Laserlichtpulsen von maximal einer Nanosekunde
Dauer außerordentlich viele ISD-Spontanfragmentionen erzeugt,
von denen zumindest die c-Fragmentionen bei optimaler Wahl aller MALDI-Parameter
auch im unteren Massenbereich des Massenspektrums über
dem Untergrund auswertbar werden. Mit zunehmender Länge
der Laserlichtpulse nimmt der Untergrund zu; für besonders geeignete
Matrixsubstanzen mag die Auswertbarkeit auch noch für Laserlichtpulse
von zwei Nanosekunden Dauer gegeben sein.
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Die
Erfindung stellt Verfahren für eine schnelle und kostengünstige
Sequenzanalyse von Proteinen durch eine Aufnahme von ISD-Tochterionenspektren
in Flugzeitmassenspektrometern bereit, die eine Auswertbarkeit der
Spektren von den sehr kleinen Massen endständiger Aminosäuren
bis zu sehr hohen Massen von über zehn Kilodalton hinaus ergeben.
Das für die Verfahren verwendeten Flugzeitmassenspektrometer
enthalten daher einen Kurzpulslaser, vorzugsweise mit Strahlprofilierungseinheit;
außerdem wird für bevorzugte Verfahren zwischen
Ionenquelle und Ionendetektor ein Ionenselektor benötigt,
der leichte Ionen unterhalb einer einstellbaren Flugzeitgrenze ausblenden
kann.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren bestehen grundsätzlich
aus den Schritten (a) der Präparation der Proben auf einem
Probenträger mit Matrixsubstanzen, die eine ISD-Fragmentierung
chemisch unterstützen, (b) der Einstellung der Verstärkung
des Sekundärelektronen-Vervielfachers auf einen so niedrigen
Wert, dass die Signale der ISD-Fragmentionen über dem Untergrund
gut auswertbar werden, und (c) der Aufnahme einer Serie von Einzelflugzeitspektren
aus einer Probe, wobei während der Aufnahmeserie sowohl
die Verstärkung des SEV wie die untere Massengrenze der
in den Einzelflugzeitspektren aufgenommen Ionensignale allmählich
erhöht werden. Damit werden die Untergrundionen nicht weiter
aufgenommen. Die Einzelflugzeitspektren werden wie üblich
zu einem Summenflugzeitspektrum addiert. Letzteres kann dann anhand
einer Kalibrierkurve in ein Massenspektrum umgewandelt werden.
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Die
Erhöhung der unteren Massengrenze der aufgenommenen Ionensignale
kann durch einen immer späteren Beginn der Digitalisierung
im Transientenrekorder, bevorzugt aber durch eine immer weiter ausgedehnte
Unterdrückung der Ionen leichter Massen vor dem Erreichen
der Ionendetektors erfolgen. Das kann in MALDI-TOF-Geräten
durch einen Flugzeitselektor, in MALDI-OTOF-Geräten durch eine
Einstellung der unteren Massengrenze des Ionenführungssystems
zwischen Ionenquelle und Flugstrecke geschehen.
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Die
Erfindung enthält eine (zumindest anfängliche)
Herabsetzung der Verstärkung des SEV durch Herabsetzen
seiner Versorgungsspannung. Es soll eine Verstärkung eingestellt
werden, die bewirkt, dass alle Signale der ISD-Fragmentionen über
dem Untergrund gut und einfach auswertbar werden. Dabei ist es günstig,
wenn der Ausgangselektronenstrom des SEV nur dann in das Messfenster
des ADC im Transientenrekorder fällt, wenn mehrere Ionen, beispielsweise
fünf oder sogar zehn Ionen, den SEV im gleichen Messintervall
treffen. Es werden dadurch die meisten Ionensignale des chemischen
Untergrunds vollkommen unterdrückt, und die Auswertbarkeit
der Massenspektren in diesem Massenbereich wird verbessert.
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Durch
die niedrige Verstärkung des SEV werden dann aber bei höheren
Massen keine Ionensignale mehr registriert. Das erfindungsgemäße
Verfahren besteht daher des Weiteren darin, während der
Aufnahme einer Serie von Hunderten oder Tausenden von Einzelflugzeitspektren
die Verstärkung des Sekundärelektronen-Vervielfachers
zunehmend zu erhöhen, synchron dazu aber die Ionen unterhalb einer
zunehmend erhöhten Massengrenze auszublenden, so dass kein
weiterer Untergrund mehr aufaddiert wird. Die Verstärkung
des SEV und die Massengrenze des Ausblendens leichter Ionen können
in Stufen, aber auch kontinuierlich erhöht werden. Die Verstärkung
des SEV soll so hohe Werte erreichen, dass im oberen Massenbereich
bis zu etwa 10 Kilodalton und darüber keine Ionensignale
mehr verloren gehen, sofern die Ionen bei ihrem Aufprall überhaupt mindestens
ein Sekundärelektron auslösen. Es wird so ein
Massenspektrum gewonnen, das von den terminalen Aminosäuren
bis zu sehr hohen Massen von 10 bis 12 Kilodal ton gut auswertbar
ist. Die c-Fragmentionen können bis zu etwa mindestens
80 Aminosäuren, die z-Fragmentionen bis zu etwa 60 Aminosäuren
gelesen werden.
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In
Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Einschuss der Ionen
(OTOF-MS) kann das Verfahren in analoger Weise eingesetzt werden,
wobei aber die Auswahl des jeweils aufgenommenen Massenbereichs
nicht durch den Ionenselektor, sondern durch ein entsprechend gesteuertes
Ionenführungssystem erfolgt.
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Es
lassen sich mit dem Verfahren beispielsweise diagnostische Assays
erstellen, mit dem sehr schnell Polymorphismen in ausgewählten
und gereinigten Proteinen erkannt werden können. Die Assays können
mit kleinen Proteinsequenzdatenbanken ausgestattet sein, die alle
Polymorphismen und alle posttranslationalen Modifikationen dieser
Proteine umfasst. Es lässt sich dann mit kommerziellen
Protein-Identifizierungsprogrammen sehr schnell und mit wenig Rechenaufwand
feststellen, zu welcher Gruppe die untersuchten Proteine jeweils
gehören.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1 zeigt
schematisch ein einfaches und preiswert herzustellendes MALDI-TOF-Flugzeitmassenspektrometer,
das für diese Erfindung verwendet werden kann. Eine größere
Anzahl von Proben befinden sich auf der Probenträgerplatte
(1) gegenüber den Beschleunigungselektroden (2)
und (3) und die Proben können durch Bewegung der
Probenträgerplatte (1) in das Muster der Bestrahlungsspots
des strahl-profilierten Laserlichtpulsstrahles (4) des
Lasers (5) hineingeführt und dort ionisiert werden.
Die pulsartig erzeugten Ionen werden durch die Beschleunigungselektroden
(2) und (3) zu einem Ionenstrahl (6)
beschleunigt, der den Ionenselektor (7) passieren muss
und dessen leichte Ionen unterhalb einer Flugzeitgrenze als Strahl
(8) abgelenkt werden können. Der restliche Ionenstrahl
(9) schwererer Ionen wird dann vom Reflektor (10)
auf den Sekundärelektronen-Verstärker (11)
reflektiert. Der Ausgangsstrom des Sekundärelektronen-Verstärkers
wird dem Transientenrekorder (12) zugeführt und
dort in eine Serie digitaler Messwerte gewandelt.
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2 stellt
schematisch ein sehr viel aufwändigeres MALDI-TOF-TOF-Flugzeitmassenspektrometer
dar, das auch Massenspektren von Fragmentionen aufnehmen kann, die
entweder durch Stoßfragmentierung (CID) in der Gaszelle
(13) oder durch erhöhte innere Energie der Analytionen
durch Anregung mit längeren Laserlichtpulsen (LID = laser induced
decomposition) mit ergodischen Zerfällen und Nachbeschleunigung
in der Nachbeschleunigungseinheit (14) gemessen werden
können. Die nicht zerfallenen Elternionen können
durch die Elternionen-Unterdrückungseinheit (15)
ausgeblendet werden. Mit diesem Massenspektrometer lassen sich auch
die Paare Leucin/Isoleucin und Glutamin/Lysin unterscheiden, die
voneinander leicht verschiedene CID- und LID-Tochterionenspektren
liefern.
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In 3 ist
schematisch ein MALDI-OTOF-Flugzeitmassenspektrometer zu sehen,
in dem die Ionen aus der lasererzeugten Plasmawolke von einem Ionenführungssystem
(16) zu einem Ionenpulser (17) geführt
werden. Der Pulser (17) beschleunigt einen Teilstrahl (9)
der Ionen in die Flugstrecke des OTOF hinein, wo ein Reflektor (10)
die Ionen auf den Detektor (11) reflektiert. Das Hochfrequenz-Ionenführungssystem
(16), hier als Multipol-Stabsystem ausgeführt,
kann dazu verwendet werden, Ionen unterhalb einer Grenzmasse auszufiltern.
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Die 4 und 5 stellen
schematisch die Aussteuerung des Messfensters des ADC im Transientenrekorder
vor und nach Anwendung dieser Erfindung dar. Das Messfenster reicht
von einer Untergrenze (20) mit null Counts bis zu einer
Obergrenze (21) mit 255 Counts.
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4 zeigt
die Aussteuerung des Messfensters vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Der untere Massenbereich ist hier bis zu etwa einem Kilodalton voll
mit Untergrund (22) belegt. Der Mittelwert (24)
der c-Fragmentionen und insbesondere deren untere Intensitäts-Variationsgrenze
(25) verschwinden im höheren Massenbereich aus
dem Messfenster und begrenzen die Auswertbarkeit. Das gilt in noch
stärkerem Maße für Mittelwert (27)
und untere Variationsgrenze (28) der z-Fragmentionen.
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In 5 ist
zu sehen, dass nach Anwendung der Erfindung wegen der Absenkung
der Verstärkung, wegen der kurzen Laserlichtpulse und wegen
der günstigen Matrixsubstanz der Untergrund (22)
gegenüber den Fragmentionensignalen stark zurückgegangen
ist. Der Mittelwert (24) der c-Fragmentionen und deren
untere Variationsgrenze (25) reichen jetzt zu höheren
Massen. Gleiches gilt für Mittelwert (27) und
untere Variationsgrenze (28) der z-Fragmentionen.
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Beste Ausführungsformen
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Die
Erfindung kann in verschiedenen Massenspektrometern durchgeführt
werden, wobei insbesondere MALDI-TOF-Massenspektrometer verschiedner
Komplexität, aber auch MALDI-OTOF-Massenspektromter verwendet
werden können. Die Verwendung anderer Massenspektrometer
ist trotz ihrer gegenüber Flugzeitmassenspektrometern eingeschränkteren
Massenbereiche ebenfalls möglich, ist in aller Regel jedoch
nicht so günstig.
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Für
das erfindungsgemäße Verfahren kann für
Hochdurchsatz unter Verzicht auf die direkte Unterscheidbarkeit
von Leucin/Isoleucin und Glutamin/Lysin ein relativ einfaches Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer
verwendet werden, wie es in 1 schematisch
dargestellt ist. Die Erfindung stellt Verfahren für eine
schnelle und kostengünstige Sequenzanalyse von gereinigten
Proteinen durch eine Aufnahme von deren ISD-Tochterionenspektren mit
weitem Massenbereich in diesem Flugzeitmassenspektrometer bereit.
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Das
hier verwendete Flugzeitmassenspektrometer enthält die
folgenden Untereinheiten:
- – eine Ionenquelle
für eine Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption, die aus einer Probenträgerplatte (1),
zwei Beschleunigungselektroden (2) und (3), und
einem Laser (5) besteht, der Laserlichtpulse von maximal
zwei Nanosekunden Dauer und vorzugsweise mit Strahlprofilierung
liefert;
- – einen Ionenselektor (7), der leichte Ionen
unterhalb einer einstellbaren Flugzeitgrenze unterdrücken
kann;
- – einen Reflektor (9), der in Verbindung mit
einer verzögert einsetzenden Beschleunigung in der Ionenquelle
ein hohes Massenauflösungsvermögen erzeugt; und
- – einen Ionendetektor, der aus einem Sekundärelektronen-Vervielfacher
(11) und einem Transientenrekorder (12) besteht.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren für dieses Massenspektrometer
besteht aus den Schritten
- (a) der Präparation
der Proben auf dem Probenträger (1) mit Matrixsubstanzen,
die eine ISD-Fragmentierung chemisch unterstützen,
- (b) der Einstellung der Verstärkung des Sekundärelektronen-Vervielfachers
(11) auf einen so niedrigen Wert, dass sich die Signale
aller ISD-Fragmentionen aus dem Untergrund herausheben,
- (c) der Aufnahme einer Serie von Einzelflugzeitspektren von
einer Probe, jedes Einzelflugzeitspektrum ausgelöst durch
einen Laserlichtpuls, wobei während der Aufnahmeserie sowohl
die Verstärkung des SEV wie auch die Flugzeitgrenze des
die leichten Ionen unterdrückenden Ionenselektors angehoben
werden.
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Die
Einzelflugzeitspektren können in üblicher Weise
zu einem Summenflugzeitspektrum addiert werden. Die Addition kann
sofort alle Flugzeitspektren der Probe umfassen, sie kann aber in
Gruppen erfolgen. Das Summenflugzeitspektrum kann dann, ebenfalls
in üblicher Weise, anhand einer Kalibrierkurve in ein Massenspektrum überführt
werden. Aus dem Massenspektrum können anhand der ISD-Fragmentionensignale
die N-terminalen und C-terminalen Sequenzen jeweils von den endständigen
Aminosäuren bis zu sehr hohen Massen bestimmt werden, wobei
jedoch jeweils nicht zwischen Leucin und Isoleucin und nur bei hoher
Massenauflösung und Massengenauigkeit zwischen Glutamin
und Lysin unterschieden werden kann. Hat das Massenspektrometer nach 1 eine
Aufnahmefrequenz für ISD-Fragmentionenspektren von zwei
Kilohertz, so können in fünf Sekunden etwa 10
000 Einzelflugzeitspektren aufgenommen werden, von denen vorzugsweise
einige Hundert für den unteren Massenbereich, und mehrere
Tausend für den obersten Massenbereich verwendet werden,
um hier für genügend Empfindlichkeit zu sorgen.
Die Aufnahme von 10 000 Einzelflugzeitspektren aus einer Probe wird
nur durch den sehr geringen Probenverbrauch des Kurzpulslasers ermöglicht.
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Es
sind, wie schon oben ausgeführt, dem einschlägigen
Fachmann mehrere Matrixsubstanzen bekannt, die ISD-Fragmentierungen
chemisch unterstützen, beispielsweise DHB (Dihydroxybenzoesäure),
insbesondere aber 1,5-DAN (1,5-Diaminonaphtalin), oder besser noch
Mischungen aus 1,5-DAN mit PA (Picolinsäure). Es ist zu
erwarten, dass in naher Zukunft weitere Matrixsubstanzen gefunden
werden, die noch besser zu einer ISD-Fragmentierung beitragen. Diese
Matrixsubstanzen erhöhen die Ausbeute der ISD-Fragmentionen,
ermöglichen das Lesen der Sequenzen über Stellen
mit Ringschlüssen durch Sulfid-Brücken hinaus
und erniedrigen, in Verbindung mit einem Kurzpulslaser, den chemischen
Untergrund im Spektrum. Die Probenpräparationen können
beispielsweise auf Probenträgerplatten vorgenommen werden,
die für die Aufnahme der Probentröpfchen hydrophile
Ankerflächen in stark hydrophober Umgebung besitzen. Auf
kommerziell erhältlichen Probenträgerplatten in
der Größe einer standardisierten Mikrotiterplatte
sind beispielsweise 384 hydrophile Ankerflächen von jeweils
0,8 Millimeter Durchmesser vorhanden. Die Probenträgerplatte kann
in allen Automaten verwendet werden, die Mikrotiterplatten verarbeiten
können, beispielsweise in Pipettierautomaten.
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Der
Kurzpulslaser wird verwendet, um den chemischen Untergrund im unteren
Massenbereich des Massenspektrums möglichst niedrig zu
halten, damit in Verbindung mit den ISD unterstützenden Matrixsubstanzen
eine Auswertbarkeit des Massenspektrums bis zu den terminalen Aminosäuren
herunter erreicht wird. Dazu sollen die Laserlichtpulse nicht länger
als maximal zwei Nanosekunden, möglichst nur eine Nanosekunde
oder weniger dauern. Der Laser ist bevorzugt ein Festkörper-Kurzpulslasers
mit einer Strahlprofilierung, wie sie in der Einleitung beschrieben
wurde.
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Die
Erfindung enthält als wesentliches Element die Herabsetzung
der Verstärkung des SEV durch Herabsetzen seiner Versorgungsspannung
zu Beginn einer Aufnahmeserie. Wegen der hochohmigen Beschichtung
dauert die Einstellung der Oberflächenspannungen einige
Millisekunden; es ist daher nicht möglich, die Verstärkung
eines SEV während der Aufnahme eines einzigen Einzelflugzeitspektrums,
die nur etwa 100 bis 200 Mikrosekunden dauert, hochzuziehen. Es
soll eine Verstärkung eingestellt werden, die das Verhältnis
von ISD-Fragmentionensignalen zu Untergrundrauschen optimiert. Es ist
dafür günstig, wenn der Ausgangselektronenstrom
nur dann in den Wandlungsbereich des Transientenrekorders fällt,
wenn mehrere Ionen (mindestens zwei) den SEV im gleichen Messintervall
treffen. Es kann beispielsweise eine Verstärkung eingestellt werden,
bei der mindestens fünf oder sogar zehn Ionen im gleichen
Messintervall eintreffen müssen, um einen Zähler
(Count) des ADC (Analog-zu-Digital-Wandler) im Transientenrekorder
zu erzielen. Es werden dadurch die meisten Ionensignale des chemischen
Untergrunds unterdrückt, und die Auswertbarkeit der Massenspektren
in diesem Massenbereich wird verbessert. Durch die Einstellung der
Laserenergie und durch die Aufteilung der Laserstrahlung auf genügend
Bestrahlungsspots mit jeweils genügend Leistungsdichte
kann sichergestellt werden, dass für alle z-Fragmentionen
in diesem Massenbereich genügend hohe Signale registriert
werden. Da die Signale der c-Fragmentionen um etwa einen Faktor
zehn höher sind, werden diese ebenfalls mit Sicherheit
registriert.
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Durch
die niedrige Verstärkung des SEV werden dann aber bei höheren
Massen keine Ionensignale mehr registriert. Das erfindungsgemäße
Verfahren besteht daher darin, während Aufnahme einer Serie
von Einzelflugzeitspektren die Verstärkung des Sekundärelektronen-Vervielfachers
zunehmend zu erhöhen, synchron dazu aber die Ionen in einem
immer größer werdenden unteren Massenbereich auszublenden.
Das kann im Falle des Massenspektrometers nach 1 durch
den Ionenselektor (7) zwischen Ionenquelle (1, 2, 3)
und Ionendetektor (11) erreicht werden. Der Ionenselektor
(7) kann beispielsweise ein Ablenkkondensator sein, der
die Ionen erst darin passieren lässt, wenn er zu einer
bestimmten Flugzeit zeitgeschaltet spannungslos wird. Dadurch lassen
sich leichte Ionen mit kurzer Flugzeit unterhalb einer einstellbaren
Flugzeitgrenze vom Ionenselektor (7) durch Ablenkung eines
Strahls (8) ausblenden. Die Verstärkung des SEV
(11) und der Massenbereich des Ausblendens können
in Stufen, aber auch kontinuierlich erhöht werden. Die
Verstärkung des SEV soll letztendlich so hohe Werte erreichen, dass
im oberen Massenbereich bis zu etwa 10 Kilodalton keine Ionensignale
mehr verloren gehen, sofern die Ionen überhaupt mindestens
ein Sekundärelektron auslösen. Durch die fortschreitende
Addition der Einzelflugzeitspektren wird dann ein Massenspektrum
gewonnen, das von den endständigen Aminosäuren
bis zu sehr hohen Massen von mindestens 10 Kilodalton gut auswertbar
ist. Durch die Zunahmefunktion der Verstärkung des SEV
kann erreicht werden, dass die c-Fragmentionen über den
ganzen Massenbereich hinweg weitgehend eine ausreichend hohe Intensität
haben, bis statistisch verteilt immer mehr Lücken auftreten. Ähnliches
gilt für die z-Fragmentionen, deren Intensitäten
aber um einen Faktor fünf bis zehn unter denen der c-Fragmentionen
liegen. Die c-Fragmentionen können bis zu etwa 80 Aminosäuren,
die z-Fragmentionen bis zu etwa 60 Aminosäuren gelesen
werden.
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Wird
ein noch einfacheres Massenspektrometer ohne Flugzeitselektor verwendet,
so kann das Ausblenden des unteren Massenbereichs auch einfach dadurch
geschehen, dass im Transientenrekorder die Digitalisierung oder
die Speicherung erst bei zunehmend höheren Ionenmassen,
also bei späteren Flugzeiten, begonnen wird. Diese Lösung
mit Steuerung der Einsatzzeit der Digitalisierung oder Speicherung
wird hier aber nicht bevorzugt, weil der Detektor durch die Ionen
leichter Massen, die nicht ausgeblendet werden, bei höheren
Verstärkungen so überladen wird, dass seine Lebensdauer
herabgesetzt wird.
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Das
Massenspektrum zeigt dann die c-Fragmentionen in einer fast gleichmäßig
intensiven Reihe von Signalen an, da alle Aminosäuren mit
Ausnahme von Prolin etwa gleich gut aufspalten. Aus den Abständen
können die Aminosäuren in bekannter Weise bestimmt
werden, wobei nur Leucin und Isoleucin nicht, und Glutamin und Lysin
nur schwer und nur bei sehr hoher Massengenauigkeit des Massenspektrometers
zu unterscheiden sind. Die Lücke, die das nicht spaltende
Prolin erzeugt, kann durch die Kenntnis geschlossen werden, dass
hier Prolin plus eine weitere Aminosäure einpassen muss.
Dieses ISD-Verfahren ist dem Fachmann im Prinzip seit einigen Jahren
bekannt; die erreichbare Güte der Massenspektren ist aber
gegenüber früher unvergleichbar angestiegen.
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Die 4 und 5 zeigen
in einem groben Schema an, wie die Aussteuerung des Intensität-Messfensters
(oder des dynamischen Messbereichs) des Analog-zu-Digital-Wandlers
(ADC) im Transientenrekorder längs der Massenskala durch die
Erfindung geändert wird. Es sind dabei neben dem Auftreten
des Untergrundes (22) die Kurven der Mittelwerte (24)
und (27) der c- bzw. z-Fragmentionen und deren Ober- und
Untergrenzen (23, 25) und (26, 28)
für die Variationen der Intensitäten eingezeichnet,
und zwar jeweils für die Verhältnisse vor und
nach Anwendung der Erfindung.
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Der
Begriff „Transientenrekorder”, der sich für
Flugzeitmassenspektrometer eingebürgert hat, soll hier
aber nicht zu eng ausgelegt werden. Es soll darunter jede Anordnung
verstanden werden, die den Ausgangsstrom des SEV verstärkt,
digitalisiert und die Digitalwerte so speichert, dass daraus das Flugzeitspektrum
wiedergewonnen werden kann. Vorzugsweise soll die Anordnung auch
die Addition der Flugzeitspektren vornehmen können. Hat
die Anordnung eine Einsatzzeit für den Beginn der Digitalisierung
oder der Speicherung der Digitalwerte mit steuerbarer Verzögerung
gegenüber dem Einsatz der Beschleunigung der Ionen, so
kann diese Anordnung auch für die Unterdrückung
der Ionensignale aus dem unteren Massenbereich verwendet werden.
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Der
Verzicht auf die Unterscheidung von Leucin/Isoleucin und Glutamin/Lysin
kann in vielen Assays hingenommen werden, da Polymorphismen mit
Austausch von Leucin und Isoleucin oder Austausch von Glutamin und
Lysin relativ selten sind und häufig für das diagnostische
Ziel durch andere Polymorphismen ersetzt werden können.
Es lassen sich dann mit dem einfachen Flugzeitmassenspektrometer
der 1 Assays für die massenhafte Identifizierung
von Polymorphismen oder Modifikationen erstellen. In einem Tischgerät
von 40 mal 60 Zentimetern Grundfläche und anderthalb Meter
Höhe können die Massenspektren von 384 Proteinproben
auf einer Probenträgerplatte in etwa einer halben Stunde
vollautomatisch gemessen werden, jeweils zusammengesetzt aus 10
000 Einzelflugzeitspektren. Steht für die Proteine eine
kleine Sequenzdatenbank mit allen Formen der Polymorphismen und
Modifikationen des untersuchten Proteins zur Verfügung,
so können am Ende dieser halben Stunde auch alle Eingruppierungen
der Proteinproben vorliegen. Kommerzielle Suchprogramme stehen für
diese Aufgabe zur Verfügung. Für die Aufbereitung
der Proteinproben, meist auf der Basis von immobilisierten Anti körpern
in geeigneten Extraktionsröhrchen, stehen bereits jetzt Automaten
zur Verfügung, die aus Körperflüssigkeiten
einige Dutzend verschiedener Proteine herausziehen und aufreinigen
können. Größere Proteine, die mehr als
etwa 140 Aminosäuren umfassen, können mit geeigneten
Enzymen geschnitten werden.
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Neben
den oben bereits beschrieben Proteinanalysen zur Feststellung genetischer
Unverträglichkeiten und Krankheitsanlagen, aber auch zur Feststellung
von Modifikationszuständen einzelner Aminosäuren
können viele andere Einsatzgebiete bedient werden, beispielsweise
die Identifizierung einer Fleischart (Rind, Gazelle oder Känguru?)
oder die Zuordnung von Fleisch zu einem Herkunftsland oder möglicherweise
sogar zu einem Bauernhof. Ähnlich wie die SNPs der DNA
(single nucleotide polymorphisms) können die Polymorphismen
(oder auch die Modifikationszustände) der Proteine dazu verwendet
werden, Abstammungen von Lebewesen zu klären. Für
alle diese Fragen lassen sich entsprechende Assays entwickeln, die
außerordentlich kostengünstig sind. Es sind neben
Hunderten solcher routinemäßigen Anwendungen auch
viele andere Probleme der heutigen Proteinforschung lösbar.
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Müssen
für die analytische Zielsetzung aber auch die Aminosäuren
Leucin, Isoleucin, Glutamin und Lysin eindeutig unterschieden werden,
so können auch hier Verfahren zu verfeinerter Bestimmung eingesetzt
werden. So können beispielsweise biochemische Verfahren
eingesetzt werden, um die in Frage stehenden Aminosäuren
vor ihrer massenspektrometrischen Analyse chemisch zu markieren. Es
können aber auch massenspektrometrische Verfahren zur Unterscheidung
eingesetzt werden, allerdings in einem aufwändigeren MALDI-TOF-TOF-Flugzeitmassenspektrometer
nach 2. Es werden dann ausgewählte ISD-Tochterionen
durch Stöße in der Stoßzelle (13)
oder durch längere Laserlichtpulse zu ergodischen Zerfällen
angeregt, im Ionenselektor (7) ausgewählt, in
der Nachbeschleunigungseinheit (14) beschleunigt und in üblicher
Weise als PSD-Enkelionenspektrum gemessen. Ein Vergleich zwischen
einem Stoßfragmentspektrum (CID) und einem laserinduzierten
ergodischen Zerfallsspektrum (LID) weist Unterschiede zwischen Leucin
und Isoleucin, und auch zwischen Glutamin und Lysin auf. Diese weitergehende
Analyse wird ebenfalls dadurch ermöglicht, dass der Probenverbrauch
für die erste ISD-Analyse der Proteinsequenz außerordentlich
gering ist, selbst wenn sehr hohe Anzahlen von Einzelflugzeitspektren
aufgenommen werden müssen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren kann aber auch auf
einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss
(OTOF-MS) ausgeführt werden, wie es als grobes Schema in 3 wiedergegeben
ist. Für die Auswahl des Massenbereichs, der jeweils zusammen
mit der Verstärkung des SEV geändert wird, steht
in einem solchen Massenspektrometer das Ionenführungssystem
(16) zur Verfügung, das die Ionen von der Ionenquelle
zu einem Ionenpulser (17) zu Beginn der Flugstrecke führt.
Ionenführungssysteme sind in der Regel als Hochfrequenz-Multipolsysteme
ausgebildet. Diese haben jeweils einen Massenbereich, der nach unten
durch eine scharfe Massengrenze und nach oben durch einen allmählich
auslaufenden Massenbereich charakterisiert ist. Die untere Massengrenze
ist durch den Stabilitätsbereich der Matthieuschen Differentialgleichungen
vorgegeben, der obere durch die immer schwächer werdende
Fokussierung des Pseudopotentials, die die Coulombsche Abstoßung
der Ionen nicht mehr überwinden kann. Untere und obere
Massengrenze unterscheiden sich durch etwa einen Faktor 20. Man
kann also beispielsweise zunächst die Ionen im Massenbereich
von 50 bis 2000 Dalton messen, und dann durch Anheben der Hochfrequenzspannungen
am Ionenführungssystem (16) den Bereich allmählich
oder in Stufen so erhöhen, dass der Untergrund bis zur
Masse 1000 Dalton weggeschnitten wird.
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Für
die Verwendung eines MALDI-OTOF-MS ist besonders wichtig, dass ein
Kurzpulslaser mit einer Pulslänge von möglichst
maximal einer Nanosekunde verwendet wird. Dieser erzeugt relativ
stabile ISD-Fragmentionen, da erst die Bestrahlung der Ionen nach
der ersten Nanosekunde zur Erhöhung ihrer inneren Energie
und damit zur Instabilität führt. Das ist wichtig,
da sonst die ISD-Spontanfragmentionen im Ionenführungssystem
(16), in dem sie sich einige Millisekunden aufhalten können,
zerfallen und im Massenspektrum erschienen. Die Mischung der ISD-Fragmentionen
und ihrer durch ergodischen Zerfall gebildeten Enkelionen wird aber
unentwirrbar.
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Der
massenspektrometrische Fachmann kann durch Kenntnis dieser Erfindung
weitere analytische Verfahren zu verfeinerten Untersuchungen entwickeln,
beispielsweise für die Untersuchung der posttranslationalen
Modifikationen und ihrer Strukturen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 19856014
C2 [0012]
- - GB 2344454 B [0012]
- - US 6300627 B1 [0012]
- - DE 10301522 A1 [0015]
- - GB 2399218 B [0015]
- - US 7396686 B2 [0015]
- - DE 102004044196 A1 [0020]
- - GB 2421352 A [0020]
- - US 7235781 C1 [0020]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - K. Demeure
et al.: „Rational Selection of the Optimum MALDI Matrix
for Top-Down-Proteomics by In-Souce Decay”, Anal. Chem.
A; Web 10/17/2007 [0021]