DE69919325T3

DE69919325T3 - Spektrometer mit gepulster Ionenquelle, Kopplungsvorrichtung zur Dämpfung der Ionenbewegung, und Methode zur Verwendung derselben

Info

Publication number: DE69919325T3
Application number: DE69919325.7T
Authority: DE
Inventors: Andrew Krutchinsky; Alexandre Loboda; Victor Spicer; Erich ENS; Kenneth Standing
Original assignee: University of Manitoba
Current assignee: University of Manitoba
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1999-01-25
Publication date: 2017-03-02
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: EP1050061B2; DK1050061T3; CA2227806A1; DE1050061T1; DE69919325D1; DK1050061T4; JP2002502084A; JP4331398B2; EP1050061B1; AU745866B2; ATE273561T2; WO1999038185A3; CA2227806C; EP1050061A2; AU2042899A; DE69919325T2; WO1999038185A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Massenspektrometer und Ionenquellen hierfür. Insbesondere betrifft die Erfindung gepulste Ionenquellen und die Bereitstellung einer Transmissionsvorrichtung, die einer gepulsten Ionenquelle zahlreiche Eigenschaften einer kontinuierlichen Quelle verleiht, so dass sie die Anwendung der Flugzeit-Massenspektrometrie (TOFMS) erweitert und verbessert und sie zusätzlich zusammen mit einer Vielzahl von anderen Spektrometern, neben einem Flugzeit-Massenspektrometer mit orthogonaler Injektion, verwendet werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Bei Ionenquellen für die Massenspektrometrie handelt es sich entweder um kontinuierliche Quellen, z. B. ESI-Quellen (Elektrospray-Ionisationsquellen) oder SIMS-Quellen (sekundäre Ionenmassenspektrometrie-Quellen), oder um gepulste Quellen, z. B. MALDI-Quellen (matrixgestützte Laser-Desorptions-/Ionisationsquellen). Kontinuierliche Quellen werden normalerweise zur Injektion von Ionen in die meisten Typen von Massenspektrometern, wie Sektorinstrument-, Quadrupol-, Ionenfallen- und Ionencyclotronresonanz-Spektrometer, verwendet. In letzter Zeit ist es auch möglich geworden, Ionen aus kontinuierlichen Quellen in Flugzeit(TOF)-Massenspektrometern unter Anwendung einer ”orthogonalen Injektion” einzusetzen, wobei der kontinuierliche Strahl orthogonal in die Haupt-TOF-Achse injiziert und in den gepulsten Strahl, der bei der TOF-Technik erforderlich ist, umgewandelt wird. Dies wird in besonders wirksamer Weise unter Zusatz einer Kollisionsdämpfungsgrenzfläche zwischen der Quelle und dem Spektrometer vorgenommen und im nachstehend genannten Artikel (vier der Autoren sind auch als Erfinder in der vorliegenden Anmeldung genannt) beschrieben: A. N. Krutchinsky, I. V. Chernushevich, V. L. Spicer, W. Ens und K. G. Standing, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, Bd. 9 (1998), S. 569–579.
Andererseits werden gepulste Quellen, z. B. MALDI-Quellen, üblicherweise direkt mit TOF-Massenspektrometern gekoppelt, um die diskrete oder Pulsnatur der Quelle auszunützen. TOF-Massenspektrometer haben gegenüber herkömmlichen Quadrupol- oder Ionenfallen-Massenspektrometern mehrere Vorteile. Ein Vorteil besteht darin, dass TOF-Massenspektrometer einen breiteren Massen/Ladungs-Bereich als Quadrupol- und Ionenfallen-Massenspektrometer analysieren können. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass TOF-Massenspektrometer sämtliche Ionen gleichzeitig ohne Abtasten mit höherer Empfindlichkeit als Quadrupol- und Ionenfallen-Massenspektrometer aufzeichnen können. In einem Quadrupol-Massenspektrometer oder einem anderen Abtast-Massenspektrometer kann auf einmal nur eine Masse übertragen werden, was zu einem Arbeitszyklus führt, der typischerweise 0,1% beträgt, was wenig ist (zu geringer Empfindlichkeit führend). Ein TOF-Massenspektrometer hat daher einen großen Vorteil in Bezug auf die Empfindlichkeit.
Jedoch treten bei TOF-Massenspektrometern Schwierigkeiten mit zahlreichen, weit verbreiteten Quellen auf, die Ionen mit einem Bereich von Energien und Richtungen erzeugen. Die Schwierigkeiten sind besonders dann akut, wenn Ionen, die durch die verbreitete MALDI-Technik (matrixunterstützte Laser-Desorptions/Ionisation) erzeugt werden, zum Einsatz kommen. Bei diesem Verfahren treffen Photonenimpulse aus einem Laser ein Target und desorbieren Ionen, deren Massen im Massenspektrometer gemessen werden. Das Targetmaterial ist aus einer geringen Konzentration von Analytmolekülen, die üblicherweise nur eine mäßige Photonenabsorption pro Molekül aufweisen, unter Einbettung in eine feste oder flüssige Matrix, die aus einer kleinen, stark absorbierenden Spezies besteht, zusammengesetzt. Der plötzliche Zustrom von Energie wird von den Matrixmolekülen absorbiert, was deren Verdampfung und die Erzeugung eines kleinen, supersonaren Strahls von Matrixmolekülen und Ionen, in dem die Analytmoleküle mitgerissen werden, bewirkt. Während dieses Ausstoßvorgangs wird ein Teil der von der Matrix absorbierten Energie auf die Analytmoleküle übertragen. Die Analytmoleküle werden dabei ionisiert, wobei es zumindest im idealen Fall zu keiner übermäßigen Fragmentierung kommt.
Da normalerweise ein gepulster Laser verwendet wird, treten die Ionen ebenfalls als Impulse auf, was ihre bequeme Messung in einem Flugzeit-Spektrometer erleichtert. Jedoch nehmen die Ionen im supersonaren Strahl mit Geschwindigkeiten in der Größenordnung von 700 m/s eine erhebliche Energiemenge auf und können ferner Energie durch Kollisionen mit Matrixmolekülen während der Beschleunigung, insbesondere im hochgradig beschleunigenden Feldern, verlieren. Diese und ähnliche Effekte führen zu einer erheblichen Peakverbreiterung und zu einem sich daraus ergebenden Auflösungsverlust in einem einfachen, linearen Flugzeit-Instrument, wo die Ionen aus dem Target nahezu parallel zur Spektrometerachse extrahiert werden. Eine partielle Lösung für dieses Problem wird durch ein reflektierendes Spektrometer erreicht, das eine partielle Korrektur auf die Geschwindigkeitsverteilung vornimmt, wobei aber eine wirksamere Technik in der Verwendung einer verzögerten Extraktion besteht, entweder allein oder in Kombination mit einem Reflektor. Bei der verzögerten Extraktion lässt man die Ionen für eine kurze Zeitspanne treiben, bevor die Beschleunigungsspannung angelegt wird. Diese Technik entkoppelt teilweise den Ionenerzeugungsvorgang von der Messung, was die Messung in jedem speziellen Fall weniger empfindlich gegenüber dem genauen Muster der Ionendesorption und Beschleunigung macht. Selbst dann ist es für eine erfolgreiche Durchführung erforderlich, die Laser-Fluenz (d. h. die pro Flächeneinheit zugeführte Strommenge) sorgfältig zu steuern und üblicherweise eine gewisse Suche nach einem Target für einen günstigen Spot vorzunehmen. Außerdem weisen die für ein optimales Verhalten erforderlichen Extraktionsbedingungen eine gewisse Massenabhängigkeit auf, was das Eichverfahren erschwert und bedeutet, dass der vollständige Bereich von Massen nicht bei jeder gegebenen Einstellung mit optimaler Auflösung beobachtet werden kann. Ferner war die Technik nur in begrenztem Umfang in Bezug auf eine Verbesserung der Auflösung nach Ionenmassen von mehr als etwa 20000 Da erfolgreich. Zudem ist es schwierig, in herkömmlichen MALDI-Instrumenten hochwertige MS-MS-Daten zu erhalten, was darauf zurückzuführen ist, dass die Ionenselektion und die Fragmentierung sich mit der Peakbreite tendenziell erweitern. Die Erfinder haben festgestellt, dass diese Schwierigkeiten überwunden werden können, indem man den Versuch, die ursprüngliche Pulsbreite aufrechtzuerhalten, aufgibt und statt dessen einen quasi-kontinuierlichen Strahl mit überlegenen Eigenschaften erzeugt und anschließend die Injektionsspannung der TOF-Vorrichtung mit einer unabhängigen Wiederholungsgeschwindigkeit pulst.
Obgleich eine Kopplung mit einem TOF-Instrument vorstehend als Beispiel herangezogen wird, treten Schwierigkeiten auch bei der Kopplung von MALDI und anderen gepulsten Quellen mit anderen Typen eines Massenspektrometers auf, z. B. bei einem Quadrupol-(oder anderen Multipol)-Ionenfallen-, Magnetsektor- und FTICRMS-(Fourier-Transform-Ionencyclotron-Resonanz-Massenspektrometer, auf. Ferner ist es erstrebenswert, zu einer Kopplung von MALDI oder anderen gepulsten Quellen mit Tandem-Massenspektrometern befähigt zu sein, z. B. mit einem 3-fachen Quadrupol- oder Quadrupol-TOF-Hybridinstrument, was es ermöglicht, MS/MS von MALDI-Ionen zu erhalten. Übliche MALDI-Instrumente können nicht zur Ausführung von Hochleistungs-MS/MS konfiguriert werden. Die Streuung in Bezug auf Energie und Winkel von Ionen, die durch eine MALDI-Quelle oder eine ähnliche Quelle erzeugt worden sind, hebt die Schwierigkeit der Ioneninjektion hervor. Da ferner die Verweilzeiten von Ionen bei den meisten anderen Massenspektrometer-Typen erheblich länger als bei TOF-Instrumenten sind, kann die große Raumladung beim Impuls weitere Schwierigkeiten bereiten. Diese Instrumente sind so konzipiert, dass sie mit kontinuierlichen Quellen arbeiten, so dass eine Umwandlung der gepulsten Quelle in eine quasi-kontinuierliche Quelle den Großteil der Schwierigkeiten löst.
DE-19511333 (entsprechend GB-A-2 299 446 ) beschreibt ein Massenspektrometer, das eine kontinuierliche Elektrospray-Ionenquelle umfasst, die Ionen in eine Kapillare injiziert. Die Ionen durchlaufen Kammern mit progressiv abnehmenden Drücken und gelangen nach Passage einer Hexapol-Ionenführung in eine Ionenfalle 12. Die Ionenfalle 12 dient dazu, die Ionen in einer Konfiguration einzuschließen, die zum Auspulsen in das Flugrohr eines Flugzeit-Abschnitts geeignet ist. Es gibt keine Lehre oder einen Hinweis darauf, dass eine Pulsquelle verwendet werden kann.
US 5 373 156 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für die massenspektrometrische Untersuchung von organischen Ionen. Ein Neodym-YAG-Laser 1 erzeugt einen etwa 10 Mikrosekunden dauernden Lichtpuls. Ein Brennpunkt wird auf einer Seite einer Folie 4 erzeugt, wobei auf der gegenüberliegenden Seite eine zu untersuchende Substanz dünn aufgebracht ist. Die von der Folie abgeschüttelten Ionen werden in einer Friktionskammer 23 aufgrund von Kollisionen mit Wasserstoffatomen, die als Friktionsgas wirken und durch die Einlässe 5 und 7 in die Friktionskammer 23 gelangen, verlangsamt. Ein Skimmer 10 leitet die verlangsamten Ionen zur Skimmeröffnung, wobei die Ionen dann in die nächste Kammer 24 transportiert werden. Sodann werden Ionen aufgrund des Potentials eines Skimmers 15 in die Kammer des Massenspektrometers geleitet. Eine ionenoptische Linse 17 verlangsamt die Ionen und fokussiert sie auf den Einlass einer HF-Quadrupol-Ionenfalle 18, wo die Ionen durch ein dämpfendes Gas verlangsamt und eingefangen werden. Zur Untersuchung der Ionen wird die Ionenfalle mit einem Abtastverfahren betrieben, bei dem die Ionen sequentiell nach Massen durch Löcher in einer Abschlusskappe ausgestoßen werden. Die ausgestoßenen Ionen werden mit einem Ionendetektor 19 gemessen.
US 5 689 111 beschreibt ein Ionenspeicher-Flugzeit-Massenspektrometer, das eine kontinuierlich arbeitende Ionenquelle 10 umfasst. Die Ionen werden einer Pumpregion 20 einer ersten Stufe zugeführt, durch eine Multipol-Ionenführung zu einem Strahl geformt, sowie kollimiert und zur pulsierenden Region 26 des Flugzeit-Massenanalysators geleitet. Der Massenanalysator arbeitet in einem orthogonalen Injektionsmodus und verwendet ein gepulstes elektrisches Feld zwischen einer Abweislinse 23 und einer Draw-out-Linse 24. Das gepulte elektrische Feld bestimmt die Startzeit für die Messung der Flugzeitverteilung der am Detektor 36 ankommenden Ionen, wobei die Flugzeit in Beziehung zu den Masse-Ladungs-Verhältnissen der Ionen steht. Im kontinuierlichen Betrieb werden die von der Ionenquelle emittierten Ionen direkt durch die Ionenführung zum Flugzeit-Massenanalysator geleitet. Andererseits werden beim Speicherbetrieb die Ionen zunächst in der Ionenführung mittels eines Potentialttopfes in der Längsrichtung der Ionenführung gespeichert und sodann von der Ionenführung zum Flugzeit-Massenanalysator emittiert, indem für einen kurzen Zeitraum die Spannung an der Ausgangselektrode 15 geschaltet wird, wodurch ein Leck im Potentialtopf entsteht. Nach einer variablen Verzögerung t2 wird das elektrische Feld im Bereich 26 des Massenanalysators für einen kurzen Zeitraum durch die Abweisplatte 23 gepulst, um die Ionen senkrecht zu ihrer ursprünglichen Richtung zum Flugrohr 35 hin zu beschleunigen, um für die Massenanalyse erfasst zu werden.
Kurze zusammenfassende Darstellung der vorliegenden Erfindung
Demzufolge ist es erstrebenswert, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die es ermöglichen, eine Pulsquelle, z. B. eine MALDI-Quelle mit einer Vielzahl von Spektrometerinstrumenten in einer Weise zu koppeln, die das Spektrometer in vollständigerer Weise von der Quelle entkoppelt und einen kontinuierlicheren Ionenstrom mit kleinerer Winkel- und Geschwindigkeitsstreuung bereitstellt.
Insbesondere ist es erstrebenswert, ein verbessertes TOF-Massenspektrometer mit einer gepulsten Ionenquelle bereitzustellen, bei dem die Energiestreuung im Ionenstrahl verringert ist, bei dem die Quelle im Vergleich zu vorhandenen Instrumenten in vollständigerer Weise vom Spektrometer entkoppelt ist, bei dem Schwierigkeiten aufgrund einer Ionenfragmentierung vermindert sind, wodurch neue Messtypen ermöglicht werden, und bei dem die Ergebnisse des Massenspektrometers und dessen einfache Betriebsweise infolgedessen verbessert sind.
Ferner ist es erstrebenswert, ein TOF-Massenspektrometer sowohl mit kontinuierlichen als auch gepulsten Quellen, z. B. sowohl mit ESI- als auch MALDI-Quellen bereitzustellen, so dass beide Quellen ausgewählt werden können.
Erfindungsgemäß wird ein Massenspektrometersystem gemäß Anspruch 1 bereitgestellt.
Da Flugzeit-Massenspektrometer einen gepulsten Strahl benötigen, besteht die herkömmliche Lehre darin, dass eine gepulste Quelle unter Aufrechterhaltung der Pulseigenschaften gekoppelt werden soll. Die Erfinder haben jedoch nunmehr festgestellt, dass sich Vorteile ergeben, indem man einen gepulsten Strahl in einen kontinuierlichen oder zumindest quasi-kontinuierlichen Strahl umwandelt und sodann wieder in einen gepulsten Strahl zurückverwandelt. Dabei ergeben sich folgende Vorteile: Verbesserung der Strahlqualität durch Kollisionsdämpfung; Entkopplung der Ionenerzeugung von der Massenmessung; Fähigkeit zur Messung des Strahlstroms durch Einzelionenzählung aufgrund von dessen Umwandlung von einigen großen Impulsen in zahlreiche kleine Impulse, z. B. von etwa 1 Hz zu etwa 4 kHz oder einen Faktor von 4000; Verträglichkeit mit einer kontinuierlichen Quelle, z. B. ESI, was die Möglichkeit des Betriebs beider Quellen an einem Instrument bietet.
Vorzugsweise stellt die Ionenquelle den Analyt zur Ionisierung durch Bestrahlung bereit und es wird eine Quelle einer elektromagnetischen Strahlung, vorzugsweise ein gepulster Laser, die auf die Ionenquelle gerichtet ist, zur Erzeugung von Strahlungsimpulsen bereitgestellt, um eine Desorption und Ionisation von Analytmolekülen herbeizuführen.
Vorteilhafterweise umfasst die Ionenquelle ein Targetmaterial, das aus einer Matrix und Analytmolekülen in der Matrix zusammengesetzt ist, wobei die Matrix eine Spezies umfasst, die zur Absorption von Strahlung aus der Strahlungsquelle geeignet ist, um die Desorption und Ionisierung der zu analysierenden Moleküle zu fördern.
Vorzugsweise umfasst die Transmissionsvorrichtung einen Multipol-Stabsatz. Es können zwei oder mehr Multipol-Stabsätze und Mittel zum Anlegen unterschiedlicher Hochfrequenz- und Gleichstromspannungen an die Stabsätze vorhanden sein.
Eine Kollisionsdämpfung kann auch in einer Kammer erreicht werden, in der kein Hochfrequenzfeld vorhanden ist, vorausgesetzt, dass ein ausreichender Puffergasdruck gegeben ist. In diesem Fall können Ionen mit verminderten Geschwindigkeiten zum Auslass der Kammer durch einen Gasstromschleppvorgang oder ein elektrostatisches Gleichstromfeld bewegt werden. Kombinationen von elektrostatischen Feldern, Hochfrequenzfeldern und einem Gasstrom können ebenfalls in einer Kollisionsdämpfkammer verwirklicht werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Kollisionskühlung der Ionen dazu beiträgt, den Fragmentierungsanteil der Molekülionen zu verringern. Üblicherweise ist es erstrebenswert, ein einfaches Massenspektrometer zu erzeugen, das nur Ionen, die für die Molekülspezies repräsentativ sind, enthält. In typischen MALDI-Ionenquellen muss daher die Laser-Stärke sorgfältig optimiert werden, so dass sie nahe an der Ionisierungsschwelle liegt, um die Fragmentierung zu verringern. Die Erfinder haben jedoch festgestellt, dass die Anwesenheit eines Gases um die Probenoberfläche herum in starkem Maße zu einer Verringerung der Fragmentierung beiträgt, selbst bei einer relativ hohen Laser-Stärke. Vermutlich ist dies auf die Wirkung von Kollisionen mit Gasmolekülen zurückzuführen, die die innere Energie von der desorbierten Spezies entfernen, bevor sie einer Fragmentierung unterliegen können. Dies bedeutet, dass die Laser-Stärke erhöht werden kann, um die Signalionenstärke zu verbessern, ohne dass eine übermäßige Zersetzung hervorgerufen wird.
Die Erfinder haben festgestellt, dass das Ausmaß der Fragmentierung mit steigendem Druck bis zu etwa 1 Torr (etwa 130 N/m²) abnimmt. Höhere Drücke können noch vorteilhafter sein, wobei aber möglicherweise elektrische Felder benötigt werden, um bei einem höheren Druck Cluster-Reaktionen zu vermeiden.
Das Massenspektrometersystem kann eine kontinuierliche Ionenquelle und Mittel zum Auswählen der Ionenquelle, d. h. der gepulsten Ionenquelle oder der kontinuierlichen Ionenquelle, umfassen. Damit sind dann die Eigenschaften von zwei getrennten Instrumenten in einem Instrument verwirklicht. Die beiden Ionenquellen können eine MALDI-Quelle und eine ESI-Quelle umfassen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren gemäß Anspruch 23 bereitgestellt.
Der Gasdruck des Dämpfungsgases kann im Bereich von etwa 10^–4 Torr (etwa 0,013 N/m²) bis zu mindestens 760 Torr (etwa 1013 × 10⁵ N/m²) liegen. Vorzugsweise umfasst die Stufe (3) das Bereitstellen eines Hochfrequenz-Stabsatzes innerhalb der Transmissionsvorrichtung. Ferner kann ein Gleichstromfeld zwischen der Ionenquelle und dem Spektrometer bereitgestellt werden, um eine Bewegung von Ionen in Richtung zum Spektrometer zu fördern.
Das Verfahren kann die Bereitstellung von zwei oder mehr Stabsätzen in der Ionentransmissionsvorrichtung und das Betreiben von mindestens einem Stabsatz mit einer Gleichstromverschiebung umfassen, um die Auswahl von Ionen mit einem erwünschten Massen/Ladungs-Verhältnis zu ermöglichen. Zwischen zwei benachbarten Stabsätzen kann eine ausreichende Potenzialdifferenz bereitgestellt werden, um Ionen zum stromabwärtigen Stabsatz zu beschleunigen, um dadurch eine durch Kollision induzierte Dissoziation im stromabwärtigen Stabsatz zu bewirken.
Bei Verwendung eines gepulsten Lasers werden für jeden Laserpuls eine Mehrzahl von Ionenpulsen in den Flugzeit-Massenspektrometer abgegeben.
Die Ionen können zunächst eine oder mehrere differenziell gepumpte Regionen passieren, die einen Übergang vom Druck an der Ionenquelle zum Druck im Spektrometer ergeben. Die Ionenquelle kann sich auf atmosphärischem Druck oder zumindest auf einem Druck, der erheblich höher als der Druck in den stromabwärtigen Quadrupol-Stufen und im Massenspektrometer ist, befinden. Zumindest eine dieser Regionen kann ohne einen Stabsatz sein und die Ionenbewegung zum Massenspektrometer wird sodann durch den Gasstrom und/oder ein elektrostatisches Potenzial getrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und zur klareren Darstellung zu deren Ausführung wird nachstehend beispielhaft auf die beigefügte Zeichnung verwiesen, in der bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dargestellt sind.
1 zeigt ein Blockdiagramm eines Massenspektrometersystems.
2 zeigt in schematischer Darstellung ein MALDI-TOF-Massenspektrometer mit orthogonaler Injektion der MALDI-Ionen in den Spektrometer durch eine Kollisions-Dämpfungsgrenzfläche (Quadrupol-Ionenleitvorrichtung) gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt ein Massenspektrum eines Gemisches von mehreren Peptiden und Proteinen, nämlich Leucin-enkephalin-Arg (Le-R), Substanz P (Sub P), Melittin (ME), CD4-Fragment 25–58 (CD4) und Insulin (INS), das im Spektrometer von 2 aufgenommen worden ist.
4 zeigt Diagramme der Übergangszeiten durch die Grenzfläche für verschiedene Ionen.
5 zeigt ein Massenspektrum von Substanz P.
6 zeigt ein Massenspektrum eines tryptischen Verdaus von Citrat-synthase.
7A zeigt in schematischer Darstellung einen Teil des Spektrometers von 2, wobei die Kollisionsgrenzfläche dargestellt ist und die angelegten Spannungen angegeben sind.
7B, 7C und 7D zeigen verschiedene Betriebsbedingungen des Massenspektrometers von 2.
8A, 8B, 8C und 8D zeigen Massenspektren, die für Substanz P bei den verschiedenen Betriebsbedingungen gemäß den 7B, 7C und 7D erhalten worden sind.
9 zeigt das Verhalten des Ionenstroms aus einem einzelnen Target-Spot als eine Funktion der Zeit.
10 zeigt in schematischer Darstellung kombinierte ESI- und MALDI-Quellen für einen Massenspektrometer.
11 zeigt ein MALDI-QqTOF-Massenspektrometer unter Verwendung einer Kollisions-Dämpfgrenzfläche unter Einschluss von zusätzlichen Ionenmanipulationsstufen, die zwischen der Grenzfläche und dem Flugzeit-Massenspektrometer hinzugefügt sind.
12 zeigt Massenspektren, die am MALDI-QqTOF-Gerät von 11 in einzelnen MS- und MS-MS-Moden erhalten worden sind.
13 zeigt einen alternativen Kollisionsdämpfungsaufbau für das MALDI-QqTOF-Massenspektrometer von 11, wobei die Ionengeschwindigkeiten in einem Bereich ohne Hochfrequenzfelder partiell gedämpft sind.
14 zeigt eine experimentelle Vorrichtung, die zur Untersuchung des Einflusses des Drucks und der elektrischen Feldstärke auf den MALDI-Ionenstrom herangezogen worden ist.
15 zeigt ein Diagramm zur Darstellung des gesamten Ionenstroms, der durch die in 14 dargestellte MALDI-Quelle als eine Funktion der angelegten Spannungsdifferenz bei verschiedenen Drücken in der Kammer erzeugt wird.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die in 1 dargestellte erste Ausführungsform stellt ein Blockdiagramm eines allgemeinen Massenspektrometersystems dar. Dabei bedeutet das Bezugszeichen 1 eine beliebige Art einer gepulsten Ionenquelle (z. B. MALDI), 2 eine Kollisions-Fokussierkammer oder -region, die mit einem Puffergas gefüllt ist und einen bei gleicher Hochfrequenzspannung betriebenen Multipol 3 aufweist. Daran schließen sich eine fakultative Manipulationsstufe 4 und anschließend ein Massenanalysator 5 an. Die Kollisions-Ionenleitvorrichtung 3 bewirkt erfindungsgemäß eine zeitliche Verteilung des gepulsten Ionenstroms und verbessert dessen Strahlqualität (d. h. Raum- und Geschwindigkeitsverteilung) durch Dämpfung der Anfangsgeschwindigkeit und Fokussieren der Ionen in Richtung zur Mittelachse. Anschließend wird der Strahl quasi-kontinuierlich und kann in eine fakultative Manipulationsstufe 4 gelangen, wo Ionen einer beliebigen Art einer weiteren Manipulation unterworfen werden können. Schließlich werden die erhaltenen Ionen im Massenanalysator 5 analysiert.
Ein einfaches Beispiel für eine weitere Manipulation in Stufe 4 ist die Dissoziation der Ionen durch Kollisionen in einer Gaszelle, so dass die erhaltenen Tochterionen im Massenanalysator untersucht werden können.
Dies kann zur Bestimmung der Molekülstruktur eines reinen Analyten angebracht sein. Wenn es sich beim Analyt um ein komplexes Gemisch handelt, muss die Stufe 4 komplizierter ausgestaltet sein. In einem Dreifach-Quadrupol oder einem QqTOF-Instrument (beschrieben von A. Shevchenko et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., Bd. 11 (1997), S. 1015) umfasst die Stufe 4 ein Quadrupol-Massenfilter zur Auswahl eines Ausgangsions von Interesse und eine Quadrupol-Kollisionszelle zur Zersetzung des Ions durch eine kollisionsinduzierte Dissoziation (CID). Sowohl die Ausgangs- als auch die Tochterionen werden sodann im Abschnitt 5 analysiert, wobei es sich um ein Quadrupol-Massenfilter im Dreifach-Quadrupol oder um ein TOF-Spektrometer mit orthogonaler Injektion im QqTOF-Instrument handelt. In beiden Fällen bestehen die Stufen 1 und 2 aus einer gepulsten Quelle und einer Kollisionsdämpfungs-Ionenleitvorrichtung.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Kollisions-Fokussierkammer 2 mit einem Multipol-Stabsatz 3 dargestellt ist, bei dem es sich um einen beliebigen geeigneten Stabsatz handeln kann, z. B. um einen Quadrupol, Hexapol oder Octopol. Der spezielle gewählte Stabsatz hängt von der bereitzustellenden Funktion ab.
Alternativ kann eine Hochfrequenz-Ringführungsvorrichtung für die Kollisions-Fokussiervorrichtung verwendet werden und eine Ionenerzeugung kann innerhalb des durch das Hochfrequenzfeld definierten Volumens vorgenommen werden, so dass darin Ionen enthalten sind.
2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen MALDI-TOF-Massenspektrometers 10. Der Spektrometer 10 umfasst eine herkömmliche MALDI-Targetsonde 11, eine Wellendichtungskammer 12, die in bekannter Weise einem Pumpvorgang unterliegt, und ein in der Target-Halterelektrode 13 installiertes Target. Ein Gemisch aus der zu untersuchenden Probe und einer geeigneten Matrix wird im Anschluss an das übliche Vorbereitungsverfahren für MALDI-Targets auf die Probensonde aufgebracht. Ein gepulster Laser 14 wird mittels einer Linse 16 auf die Targetoberfläche 15 fokussiert und durchläuft ein Fenster 17. Der Laserstrahl ist mit dem Bezugszeichen 20 bezeichnet. Der Laser wird sodann mit einer Taktfrequenz irgendwo im Bereich von unter einigen Hz bis einigen 10 kHz betrieben und bei der getesteten Ausführungsform speziell mit einer Frequenz von 13 Hz. Ein Einlass 18 ist für Stickstoff oder ein anderes neutrales Gas vorgesehen. Jeder Laserschuss erzeugt eine Wolke von neutralen und geladenen Molekülen. Ionen des Probenanalyten werden erzeugt und in der Wolke mitgerissen, die sich in die Vakuumkammer 30 ausdehnt, wobei diese Kammer zwei Quadrupol-Stabsätze 31 und 32 enthält. Die Kammer 30 unterliegt einem Pumpvorgang mit einer (nicht dargestellten) Pumpe, die mit einer Öffnung 34 verbunden ist, auf etwa 70 mTorr (etwa 9,33 N/m²), wobei der Druck aber über einen erheblichen Bereich variiert werden kann, indem man den Gasstrom durch ein gesteuertes Dosierventil 18 einstellt. Drücke bis zu 1 Atmosphäre (1,013 × 10⁵ N/m² können ebenfalls für die Ionenerzeugungsregion herangezogen werden, indem man die Ionisierungsregion in eine oberhalb von der Kammer 30 befindliche Kammer bringt und eine schmale Apertur vorsieht, durch die Ionen in die Kammer 30 gezogen werden. Es können niedrigere Drücke herangezogen werden, wobei eine wichtige Eigenschaft in dem Produkt aus Druck und Stablänge besteht. Somit kann ein Wert des Produkts Gesamtlänge × Druck von mindestens 10,0 mTorr-cm (etwa 1,33 N/m²-cm) herangezogen werden, obgleich ein Druck von 22,5 mTorr-cm (etwa 3,0 N/m²-cm) wie im US-Patent 4 963 736 bevorzugt wird. Das Gas in der Kammer 30 (typischerweise Stickstoff oder Argon oder ein anderes geeignetes Gas, vorzugsweise ein Inertgas) wird als Dämpfungsgas, Kühlgas oder Puffergas bezeichnet.
In der getesteten Ausführungsform wurden die Quadrupol-Stabsätze 31 und 32 aus Stäben von 4,45 cm Länge und 11 mm Durchmesser gefertigt. Der Abstand betrug 3 mm, d. h. der Abstand zwischen Stäben an benachbarten Ecken des Stabsatzes. Die Quadrupole 31 und 32 wurden mit einer Stromversorgung betrieben, die Betriebssinuswellenfrequenzen von 50 kHz bis 2 MHz und Ausgangsspannungen von 0 bis 1000 Volt von Peak zu Peak bereitstellt. Typische Frequenzen betragen 200 kHz bis 1 MHz und typische Spannungsamplituden 100 bis 1000 V von Peak zu Peak. Beide Quadrupole wurden von der gleichen Stromversorgung über einen Transformator mit 2 Sekundärspulen betrieben. Unterschiedliche Amplituden können an die Quadrupole unter Verwendung einer unterschiedlichen Anzahl an Windungen in den beiden Sekundärspulen angelegt werden. Gleichstrom-Vorspannungen oder Offsetpotenziale werden an die Stäbe der Quadrupole 31 und 32 und an die verschiedenen anderen Komponenten mit einer Mehrfachausgangs-Stromversorgung angelegt. Die HF-Quadrupole 31 und 32 mit dem Dämpfungsgas zwischen ihren Stäben können in einem ausschließlichen HF-Modus betrieben werden, wobei sie in diesem Fall dazu dienen, die axiale Energie, die radiale Energie und die Energiestreuung der Ionen, die hindurchlaufen, zu verringern, wie nachstehend ausgeführt wird. Bei dem Verfahren wird im wesentlichen die Ionenwolke entlang des Ionenwegs gestreut, wodurch der ursprüngliche Strahl, der mit etwa 13 Hz gepulst ist, in einen quasi-kontinuierlichen Strahl abgeändert wird, wie nachstehend ausführlich beschrieben ist. Der erste Quadrupol 31 kann auch durch Anlegen einer geeigneten Gleichstromspannung im Massenfiltermodus betrieben werden. Der zweite Quadrupol 32 kann dann als Kollisionszelle (und eine HF-Führungsvorrichtung) bei kollisionsinduzierten Dissoziationsexperimenten (vergl. die nachstehenden Ausführungen) verwendet werden.
Aus der Kammer 30 passieren die Ionen entlang eines Ionenwegs 27 und durchlaufen eine Fokussierungselektrode 19 und gelangen sodann durch eine Öffnung 38 in eine einem Pumpvorgang mittels einer Pumpe (nicht dargestellt) unterworfene Vakuumkammer 40, die mit einer Öffnung 42 verbunden ist. Dort werden die Ionen mittels Gitter 44 durch einen Schlitz 46 in eine Ionenlagerregion 48 eines TOF-Spektrometers, der allgemein mit dem Bezugszeichen 50 bezeichnet ist, fokussiert.
Auf bekannte Weise werden Ionen aus der Lagerregion 48 extrahiert und durch eine herkömmliche Beschleunigungssäule 51 beschleunigt, die die Ionen auf eine Energie von etwa 4000 Elektronenvolt pro Ladung (4 keV) beschleunigt. Die Ionen wandern im allgemeinen orthogonal zum Ionenweg 27 zwischen der Ionenlagerregion durch ein Paar von Ablenkplatten 52. Die Ablenkplatten 52 können in der Weise zur Einstellung der Ionenbahnen dienen, dass die Ionen anschließend auf einen herkömmlichen elektrostatischen Ionenspiegel 54 geleitet werden, der die Ionen zu einem Detektor 56 reflektiert, an dem die Ionen erfasst werden. Die Ionen werden unter Verwendung einer Einzelionenzählung erfasst und mit einem Zeit-Digital-Wandler (TDC) aufgezeichnet. Die Beschleunigungssäule 51, die Platten 52, der Spiegel 54 und der Detektor 56 sind in einer Haupt-TOF-Kammer 58 enthalten, die mit einer Pumpe (nicht abgebildet), die mit einem Ausgang 60 verbunden ist, auf etwa 2 × 10⁷ Torr (2,67 × 10^–3 N/m² einem Pumpvorgang unterworfen wird.
Die Verwendung einer orthogonalen Injektion von MALDI-Ionen aus der Quelle 13 in den TOF-Spektrometer 50 ergibt gegenüber der üblichen axialen Injektionsgeometrie einige potenzielle Vorteile. Sie dient in größerem Maße zur Entkopplung des Ionenerzeugungsvorgangs von der Massenmessung, als es bei der üblichen MALDI mit verzögerter Extraktion möglich ist. Dies bedeutet, dass ein höherer Freiheitsgrad zur Variation der Targetbedingungen ohne Beeinträchtigung des Massenspektrums besteht und dass die Ionenwolke mehr Zeit zur Expansion und zur Abkühlung hat, bevor das elektrische Feld angelegt wird, um sie in den Spektrometer zu injizieren. Eine gewisse Verbesserung der Verhaltensweise lässt sich auch aufgrund der Tatsache erwarten, dass die stärkste Streuung der Geschwindigkeiten entlang der Ausstoßachse, d. h. des Ionenwegs 27, senkrecht zum Target, das in diesem Fall orthogonal zur TOF-Achse steht, erfolgt. Jedoch weist eine orthogonale Injektion von MALDI-Ionen in die TOF-Vorrichtung 50 ohne Kollisionskühlung mehrere Probleme auf, die die Geometrie scheinbar unzweckmäßig machen:

(1) Die radiale Energieverteilung ist zwar wesentlich kleiner als die axiale Energie, reicht aber immer noch aus, um eine erhebliche Streuung und Expansion des Strahls beim Verlassen des Quadrupol-Stabsatzes 32 und bei der Wanderung in Richtung zur TOF-Achse herbeizuführen. Die räumliche Streuung des Strahls entlang der TOF-Achse beschränkt die Auflösung. Die Wirkung kann durch Kollimation verringert werden, jedoch unter einer erheblichen Empfindlichkeitseinbuße. Ein Kollimationsschlitz muss in ausreichender Entfernung von der TOF-Achse platziert werden, um eine Verzerrung des Extraktionsfelds zu verhindern. Somit muss das Target weit genug vom Kollimationsschlitz platziert werden, um einen in vernünftiger Weise parallelen Strahl zu erzeugen.
(2) Die axiale Geschwindigkeit der Ionen, d. h. die Geschwindigkeit entlang des Ionenwegs 27, in der Wolke ist weitgehend unabhängig von der Masse, was bedeutet, dass die Energie massenabhängig ist. Da die axiale Energie die Richtung der Bahn nach Beschleunigung in den TOF-Spektrometer bestimmt, ist die instrumentale Akzeptanz (oder Akzeptanz durch den TOF-Spektrometer) massenabhängig, d. h. es besteht eine Massendiskriminierung. Die gleiche Wirkung wird beobachtet, wenn ESI-Ionen ohne Kollisionskühlung injiziert werden, wie ausführlich in der vorerwähnten früheren Veröffentlichung erläutert worden ist.
(3) Die Breite der axialen Energieverteilung ist in der Größe mit der axialen Energie selbst vergleichbar, so dass der Strahl entlang seiner Achse um einen Betrag streut, der mit der Trennung zwischen dem Ziel und der TOF-Achse vergleichbar ist. Die Größe der Apertur, die Ionen den Zutritt von der Lagerregion in den Spektrometer erlaubt, muss deutlich kleiner sein als zur Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Extraktionsfelds, insbesondere wenn ein Schlitz zwischen dem Target und der TOF-Achse platziert wird. Dadurch wird die Empfindlichkeit weiter verringert.

Bei verzögerter Extraktions-MALDI in der üblichen axialen Geometrie, d. h. nicht in der dargestellten orthogonalen Konfiguration, ist die Akzeptanz nahezu vollständig, und während die größte Geschwindigkeitsstreuung entlang der TOF-Achse erfolgt, ermöglicht die gut definierte Targetebene senkrecht zur TOF-Achse eine Kombination einer zeitverzögerten Fokussierung (verzögerte Extraktion mit optimierten Werten der Verzögerung und der angelegten Spannung) und der elektrostatischen Fokussierung (optimierter Wert der Reflektorspannung) in einem Ionenspiegel unter Erzeugung einer Auflösung, die in einigen Fällen über 10000 liegt.
Von den Erfindern durchgeführte Experimente lassen darauf schließen, dass eine konkurrenzfähige Auflösung mit einem akzeptablen Signal unter Anwendung einer orthogonalen Injektion nicht erreicht werden kann, es sei denn man bedient sich der erfindungsgemäßen Kollisionskühlung. Außerdem bleiben einige Nachteile einer verzögerten Extraktions-MALDI (die Abhängigkeit der optimalen Extraktionsbedingungen von der Masse und die erforderliche kompliziertere Kalibration) bei der orthogonalen Injektions-MALDI ohne Kühlung immer noch bestehen, wenngleich in einem geringeren Ausmaß als bei axialer Injektion.
Die Einführung eines HF-Quadrupols oder eines anderen Multipols mit Kollisionskühlung der Ionen zwischen dem MALDI-Target und der orthogonalen Injektionsgeometrie vermeidet die vorstehend beschriebenen Probleme und bietet zusätzliche Vorteile. Diese werden nachstehend unter Bezugnahme auf die übrigen Figuren beschrieben.
Durch Verringerung der radialen Energien der Ionen lässt sich ein annähernd paralleler Strahl erzeugen, wodurch die Verluste, die sich aus einer Kollimation vor Eintritt der Ionen in die Lagerregion ergeben, stark verringert werden. Dies ermöglicht die Verwendung einer größeren Einlassapertur in das TOF-Spektrometer 50, wodurch Verluste weiter verringert werden. Aufgrund der Verringerung der axialen Energien der Ionen und der anschließenden Beschleunigung der Ionen auf eine gleichmäßige Energie ist die vorerwähnte Massendiskriminierung nicht mehr vorhanden.
Die gleichmäßige Energieverteilung der Ionen nach dem Abkühlen beseitigt jegliche Massenabhängigkeit von den optimalen Extraktionsbedingungen und ermöglicht eine einfache quadratische Beziehung zwischen TOF und Masse, die für die Kalibration mit zwei Kalibrationspeaks heranzuziehen ist. 3 zeigt ein Spektrum eines äquimolaren Gemisches von mehreren Peptiden und Proteinen mit Massen von 726 bis 5734 Da in einer α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix. Das Spektrum wurde in einem einzigen Ansatz aufgenommen und zeigt eine gleichmäßige Massenauflösung (M/ΔM_FWHM) von etwa 5000 im gesamten Massenbereich. Bei Anwendung einer einfachen externen Kalibration mit Substanz P und Melittin ist die Massenbestimmung für die einzelnen Molekülionen innerhalb von etwa 30 ppm genau. Dabei werden die Peaks für die verschiedenen Substanzen folgendermaßen identifiziert: Peak 60 für Leucin-enkephalin; Peak 61 für Substanz P; Peak 62 für Melittin; Peak 63 für CD4-Fragment 25–28; und Peak 64 für Insulin. Sämtliche Peaks werden sowohl für das Gesamtspektrum als auch für ein vergrößertes Teilspektrum identifiziert. Die in 3 dargestellte Auflösung liegt ziemlich nahe bei der Auflösung, die mit dem gleichen Instrument unter Verwendung einer ESI-Quelle erzielbar ist. In der vorliegenden Ausführungsform war die Eingangsöffnung geringfügig größer, als sie normalerweise bei ESI angewandt wird, nämlich ein Durchmesser von etwa 1 mm im Vergleich zum normalen Durchmesser von etwa 1/3 mm, um die Einstellungen bei den Vorversuchen zu erleichtern. Dies ist offensichtlich nicht erforderlich, so dass man berechtigterweise eine verbesserte Auflösung bei Verwendung einer kleineren Öffnung erwarten kann. Eine Auflösung bis zu 10000 wurde mit ESI-Ionen im gleichen Instrument und dem nachstehend beschriebenen MALDI-QqTOF-Instrument erreicht.
Die mit der Masse abnehmende relative Intensität der Molekülionen spiegelt in gewissem Ausmaß den mit steigender Masse abnehmenden Nachweiswirkungsgrad wider. Der Nachweiswirkungsgrad hängt stark von der Geschwindigkeit ab, die bei einer gegebenen Energie für einfach geladene Ionen mit der Masse abnimmt. Bei dieser Ausführungsform beträgt die Energie von einfach geladenen Ionen nur etwa 5 keV (verglichen mit 30 keV bei typischen MALDI-Experimenten), so dass der Nachweiswirkungsgrad den praktischen Anwendungsbereich auf weniger als etwa 6000 Da beschränkt. Die relativen Intensitäten der Molekülionenpeaks in 3 stimmen mit den Werten überein, die bei der gleichen Probe beobachtet wurden, wenn sie in einem herkömmlichen MALDI-Experiment unter Anwendung einer 5 keV-Beschleunigung analysiert wurde. Der Nachweiswirkungsgrad in der vorliegenden Ausführungsform kann gesteigert werden, indem man die Spannung erhöht, die die Ionen in den Spektrometer beschleunigt, oder indem man die Spannung am Detektor erhöht.
Wie vorstehend erwähnt, streut die Kollisionskühlung die Ionen entlang der Ionenstrahlachse unter Veränderung des anfänglichen, mit 13 Hz gepulsten Strahls zu einem quasi-kontinuierlichen Strahl. Dies ist in 4 dargestellt, wo die Zählrate als eine Funktion der Zeitspanne nach dem Laserpuls dargestellt ist, d. h. die Verteilung der Durchgangszeiten durch die Ionenleitvorrichtung. Die Breite der zeitlichen Verteilung liegt in der Größenordnung von 20 ms, was eine Zunahme der zeitlichen Streuung um einen Faktor von mindestens 10⁷ bedeutet, da jeder Laserpuls etwa 2 ns dauert. Es ist ersichtlich, dass es nicht notwendig ist, eine zeitliche Verteilung in der Größenordnung von 20 ms zu erzeugen; beispielsweise kann der quasi-kontinuierliche Puls von kurzer Dauer von nur 0,1 ms sein. Eine Verteilung entlang der Achse stellt bei MALDI mit orthogonaler Injektion ohne Kühlung einen Nachteil dar, während erfindungsgemäß aufgrund der Tatsache, dass die optimalen Extraktionsbedingungen nicht von der zeitlichen Verzögerung nach dem Laserschuss abhängen, mehrfache Injektionspulse in die TOF-Lagerregion 48 für jeden Laserschuss eingesetzt werden können. In der erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden 256 Injektionspulse in die TOF-Lagerregion 48 für jeden Laserschuss verwendet. Die Verluste werden sodann durch das Tastverhältnis (duty cycle) des Instruments, das in diesem Fall etwa 20% beträgt, bestimmt. Beim Tastverhältnis handelt es sich um den prozentualen Anteil der Zeitspanne, in der Ionen aus der Lagerregion in den TOF-Spektrometer injiziert werden können. Hier bedeutet dieser Wert tatsächlich den Bruchteil der Zeit, in der die TOF-Lagerregion 48 zur Aufnahme von Ionen verfügbar ist. Ein quasi-kontinuierlicher Strahl stellt in der Tat einen Vorteil bei diesem Betriebsmodus dar. Etwa 10⁴ bis 10⁶ Ionen werden aus der Targetsonde mit jedem Laserschuss mit einer Wiederholungsrate von 13 Hz ausgestoßen, wobei aber infolge der Streuung entlang der Strahlachse oder des Strahlwegs 27 (und einiger Verluste) etwa 2 bis 5 Ionen mit jedem Injektionspuls in das Instrument injiziert werden, weniger als 1 Ion im Durchschnitt einer bestimmten Spezies. Dies ermöglicht die Anwendung einer Einzelionenzählung mit einem TDC (Zeit-Digital-Wandler), was die Kombination einer hohen zeitlichen Auflösung (0,5 ns) und einer hohen Wiederholungsrate (wesentlich für ein maximales Tastverhältnis) technisch wesentlich einfacher macht als bei Verwendung eines transienten Rekorders, der bei herkömmlichen MALDI-Experimenten erforderlich ist. Ferner beseitigt die Anwendung einer Einzelionenzählung Schwierigkeiten mit einer Detektorabschattung durch intensive Matrixpeaks und Schwierigkeiten mit einer Peaksättigung, auf die man bei herkömmlicher MALDI aufgrund der starken Abhängigkeit des Signals von der Laserfluenz und der Variationen von Schuss zu Schuss achten muss. Schließlich stellt eine Einzelionenzählung wesentlich geringere Anforderungen an die zeitliche Auflösung des Detektors und Verstärkers, da die elektronische Verringerung und Digitalisierung des Pulses gegenüber der Detektor-Pulsgestalt recht unempfindlich ist.
In 4 sind vier Diagramme dargestellt, die die Zählrate im zeitlichen Verlauf zeigen, und zwar für Leucin-enkephalin mit dem Bezugszeichen 70, Substanz P mit 72, Melittin mit 74 und Insulin mit 76. Ferner sind für jede dieser Substanzen Diagramme oder Spektren 71, 73, 75 und 77 eingesetzt, die die normalen TOF-Spektren ähnlich wie in 3 zeigen.
Unter der Annahme, dass 10⁴ Ionen einer einzelnen Molekülionenspezies mit jedem Laserschuss erzeugt werden, liegt der Transmissionswirkungsgrad des HF-Quadrupols im Bereich von 10%. Unter Berücksichtigung des Gastverhältnisses werden etwa 2% der am Target erzeugten Ionen im Massenspektrometer nachgewiesen. Dies stellt erhebliche Verluste im Vergleich zum herkömmlichen axialen MALDI-Experiment dar, bei dem die Transmission vermutlich 50% oder mehr beträgt. Jedoch können vom Standpunkt der Datenrate aus die Verluste weitgehend durch die höhere Wiederholungsrate und die höhere Fluenz des Lasers ausgeglichen werden. Bei diesen Experimenten betrug die Wiederholungsrate 13 Hz, lässt sich aber mit dem derzeitigen Laser leicht auf 20 Hz steigern oder im Prinzip auf bis zu 100 Hz, bevor das Zählsystem eine Sättigung erreicht. Im Gegensatz dazu wird das übliche MALDI-Experiment bei etwa 1 oder 2 Hz durchgeführt. Die Laserfluenz bei einem herkömmlichen MALDI-Experiment muss nahe am Schwellenwert gehalten werden, um die beste Leistung zu erzielen, wobei der Schwellenwert die minimale Energie darstellt, die zur Herbeiführung der Verdampfung der Probe zur Erzeugung eines geeigneten Signals unter Verwendung eines herkömmlichen transienten Recordings mit Analog-Digital-Wandlung geeignet ist. Erfindungsgemäß kann die Laserfluenz auf die Fluenz erhöht werden, bei der der Ionenerzeugungsvorgang eine Sättigung erreicht. Da der Quadrupol dazu dient, dem durch den Laser erzeugten Ionenburst zu glätten, kann ein kurzer intensiver Ionenburst akzeptiert werden. Vom Standpunkt der absoluten Empfindlichkeit aus ermöglicht offensichtlich die Unabhängigkeit des Spektrums von den Laserbedingungen (vergl. die nachstehenden Ausführungen) eine wirksamere Ausnutzung der auf dem Target abgeschiedenen Probe. Unter Verwendung einer Fluenz, die mehrfach höher als der Schwellenwert ist, werden Ionen erzeugt, bis die Matrix vollständig von der Targetsonde entfernt ist. 5 zeigt, dass die praktische Empfindlichkeit, die mit Substanz P erreicht wird, im gleichen Bereich liegt, wie bei herkömmlicher MALDI. Fünf Femtomol der Substanz P wurden auf das Target unter Verwendung von 4 HCCA als Matrix aufgebracht. Die linke Seite des Spektrums ist mit dem Bezugszeichen 80 versehen und die rechte Seite ist um den Faktor 44 vergrößert mit dem Bezugszeichen 81 dargestellt. Ein Teil dieses Spektrums ist beim Bezugszeichen 82 vergrößert dargestellt und zeigt das Molekülion (MH⁺). 6 zeigt das mit einem tryptischen Verdau von Citrat-synthase erhaltene Spektrum 85, wobei sich wiederum die gleichmäßige Massenauflösung über den Massenbereich ergibt. Der Einsatz 86 zeigt das Spektrum, das bei Auftragen von 20 fMol auf das Target erhalten worden ist.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wirkungsweise der Erfindung für Peptide mit herkömmlichen MALDI-Experimenten vergleichbar ist, wobei sich aber der Vorteil einer massenunabhängigen Kalibration und eines einfachen Kalibrationsverfahrens ergibt. Die wichtigsten Vorteile ergeben sich jedoch aus der nahezu vollständigen Entkoppelung der Ionenerzeugung von der Massenmessung. Bei einem herkömmlichen MALDI-Experiment müssen die Position des Laserspots am Target und die Laserfluenz und -position sorgfältig im Hinblick auf eine optimale Wirkungsweise ausgewählt werden. Diese Bedingungen unterscheiden sich in typischer Weise für verschiedene Matrizes und auch für verschiedene Target-Präparationsverfahren. Die Situation wurde mit der Einführung einer verzögerten Extraktion verbessert, wobei aber immer noch zahlreiche handelsübliche Instrumente mit einer Software zur Einstellung der Laserfluenz, der Detektorverstärkung und der Laserposition und zur Verhinderung von Shots, bei denen Sättigung eintritt, ausgerüstet wurden. Keine dieser Techniken ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung notwendig. Die erzielte Wirkungsweise zeigt keine Abhängigkeit von den Target- oder Laser-Bedingungen. Der Laser wird lediglich auf die maximale Fluenz (ein mehrfaches des üblichen Schwellenwerts) eingestellt und belassen, während das Target gelegentlich in eine neue Position bewegt wird. Dies bedeutet, dass alternative Targets (einschließlich isolierende Targets) leicht erprobt werden können und alternative Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen oder Pulsbreiten verwendet werden können.
Die Entkoppelung der Ionenerzeugung von der Massenmessung bietet auch die Möglichkeit, verschiedene Manipulationen der Ionen nach ihrem Ausstoß vor der Messung vorzunehmen. Ein Beispiel besteht in der anfänglichen Ionenselektion und einer anschließenden Fragementierung (MS/MS). Dies wird in besonders geeigneter Weise mit einem zusätzlichen Quadrupol-Massenfilter gemäß den nachstehenden Ausführungen durchgeführt, wobei aber sogar in der vorliegenden Ausführungsform von 2 eine gewisse Selektivität und Fragmentierung möglich ist.
Die 7A, 7B und 7C zeigen drei unterschiedliche Betriebsweisen des in 2 dargestellten Instruments. Die Bezugszeichen von 2 sind entlang der z-Achse aufgeführt, um auf die Entsprechung zwischen dem Potenzialniveau und den verschiedenen Elementen der Vorrichtung hinzuweisen. Die Spannungen für die Quadrupol-Abschnitte 31, 32 sind bei U₁(t) und U₂(t) angegeben.
7A zeigt den einfachen Kollisions-Ionenleitmodus, der bei der Erzielung der in der 4–6 dargestellten Ergebnisse herangezogen wurde. Dabei wurden die gleichen Amplituden der HF-Spannung und keine Gleichstrom-Verschiebungsspannungen an die verschiedenen Abschnitte des Quadrupols angelegt. Die Potenzialdifferenzen in Längsrichtung wurden gering gehalten, um die Fragmentierung aufgrund von CID auf ein Minimum zu beschränken.
7B zeigt einen Massenfiltermodus, der analog zum gleichen Filtermodus ist, der in herkömmlichen Quadrupol-Massenfiltern eingesetzt wird. Dabei wird eine Gleichstrom-Offsetspannung V am ersten Abschnitt des Quadrupols hinzugefügt, um ein Ion von Interesse auszuwählen, während der zweite Abschnitt wieder als übliche Ionenleitvorrichtung wirkt, da aufgrund der geringen Potenzialdifferenz zwischen den Abschnitten kein CID vorliegt. Die Amplitude der im zweiten Quadrupol-Abschnitt 32 angelegten Spannung beträgt nur ein Drittel der im ersten Abschnitt 31 angelegten Spannung.
7C zeigt einen MS-MS-Modus, der sich vom Modus von 7B durch eine höhere Potenzialdifferenz zwischen den Quadrupol-Abschnitten 31, 32 unterscheidet, so dass Ionen in diesem Bereich beschleunigt werden und mit hoher kinetischer Energie in den zweiten Abschnitt gelangen, wobei die zusätzliche Energie als Δ Kollisionenergie bezeichnet wird. In diesem Fall wirkt der zweite Abschnitt als eine Kollisionszelle und Ausgangsionen werden dort durch Kollisionen mit dem Puffergas (CID) zersetzt. Hier beträgt wiederum die Amplitude der HF-Spannung im zweiten Abschnitt nur ein Drittel der Amplitude der HF-Spannung im ersten Abschnitt, was es ermöglicht, dass Tochterionen, die wesentlich leichter als die Ausgangsionen sind, stabile Bahnen aufweisen und durch den zweiten Quadrupol befördert werden.
8 zeigt Beispiele der in den in 7 dargestellten unterschiedlichen Modi erhaltenen Spektren und zeigt insbesondere ein Beispiel für eine mögliche Strahlmanipulation. Sämtliche Spektren wurden unter Verwendung der gleichen Anfangsprobe aufgenommen.
8A zeigt ein Massenspektrum, wobei Ionen in einer fokussierenden Kollisionsionenleitvorrichtung gekühlt werden (Modus von 7A). 8B zeigt ein Beispiel, bei dem Ionen von Interesse im ersten Quadrupol 31 ausgewählt und im zweiten Quadrupol-Abschnitt 32 gekühlt wurden (Modus von 7B). Nachdem Ionen von Interesse ausgewählt worden sind, können sie für die Fragmentierung bei der CID herangezogen werden, um ausführliche Informationen über die Zusammensetzung und die Struktur zu erhalten.
8C zeigt ein MS/MS-Spektrum von Substanz P, das auf diese Weise erhalten worden ist. Molekülionen von Substanz P werden im ersten Quadrupol-Abschnitt ausgewählt und durch Kollisionen im zweiten Quadrupol-Abschnitt fragmentiert (gemäß dem Modus von 7C). Die Potenzialdifferenz, die Kollisionsenergie Δ, betrug zwischen dem ersten und zweiten Quadrupol 100 V. Die Intensitäten der Fragmentionen waren im Vergleich zur Intensität des primären Ions gering, so dass der Bereich innerhalb der punktierten Linien um den Faktor 56 erweitert ist. 8D zeigt das mit dem gleichen Modus erhaltene Spektrum, wobei aber die Potenzialdifferenz zwischen den Quadrupolen 31 und 32 150 V betrug. In diesem Fall werden mehr Fragmentionen beobachtet und der Ausgangsionenpeak ist erheblich verringert.
9 zeigt, wie lang ein Signal vom gleichen Spot am MALDI-Target anhalten kann. Bei diesem Experiment wurde ein gegebener Spot mit einer Reihe von Schüsse aus dem Laser, der mit 13 Hz betrieben wurde, bestrahlt. Die Laserintensität betrug das 2- oder 3-fache der ”Schwellen”-Intensität. Durchschnittlich hielt die Probe etwa 1 Minute an. Die Gestalt der Kurve lässt darauf schließen, dass die Laserschüsse immer tiefer in die Probe eindringen, bis sie erschöpft ist. An dem Punkt, an dem der Laser das Metallsubstrat bestrahlt, wird kein Signal mehr beobachtet.
In der Vergangenheit war es nicht möglich, sowohl kontinuierliche Quellen, wie eine Elektrospray-Ionisierung (ESI), als auch gepulste Quellen, wie MALDI, im gleichen Instrument einzusetzen, was erhebliche Vorteile bieten würde. Nach Kenntnis der Erfinder waren die einzigen erfolgreichen ESI-TOF-Instrumente bisher die orthogonalen Injektionsspektrometer (von den vorliegenden Erfindern, Dodonov und nunmehr die herkömmlichen Maschinen von PerSeptive und andere), so dass es den Anschein hat, dass eine orthogonale Injektion für ESI-TOF erforderlich ist, mit oder ohne Kollisionsdämpfung, obgleich die erstgenannte Möglichkeit die Situation verbessert, wie ausführlich von A. N. Krutchinsky, I. V. Chernushevich, V. L. Spicer, W. Ens, K. G. Standing, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, Bd. 9 (1989), S. 569–579, dargelegt wurde. Bisher erfolgten Versuche zum Einsatz von MALDI bei einem orthogonalen Injektionsinstrument ohne Kollisionsdämpfung (beispielsweise von den vorliegenden Erfindern und von Guilhaus, wobei in beiden Fällen wenig Erfolg versprechende Ergebnisse erzielt wurden). Die vorliegende Erfindung macht es möglich, dass zwei derartige Quellen in einem einzigen Instrument verfügbar sind. Dabei kann die MALDI-Sonde 11 in 2 durch eine ESI-Quelle ersetzt werden, um eine Messung von ESI-Spektren im Instrument zu ermöglichen. Das Instrument wäre dann im wesentlichen das gleiche, wie das im Artikel von A. N. Krutchinsky, A. V. Loboda, V. L. Spicer, R. Dworschak, W. Ens, K. G. Standing, Rapid Commun. Mass Spectrom., Bd. 12 (1998), S. 508–518, dargestellte Instrument. Diese Veränderung könnte selbstverständlich durchgeführt werden, indem man die eine Quelle entfernt und sie durch die andere ersetzt, wobei aber eine Reihe von zweckmäßigeren Anordnungen bereitgestellt werden können.
Beispielsweise zeigt 10 eine weitere Ausführungsform, bei der eine Elektrospray-Ionenquelle 94a am Eingang einer Kollisionsdämpfungsschnittelle 92, die einen Quadrupol- oder anderen Multipol-Stabsatz 93 umfasst, angebracht ist. Eine MALDI-Ionenquelle 94b wird auf einer Sonde 95, die seitlich eintritt, eingeführt und kann nach innnen und außen verschoben werden. Zu diesem Zweck ist ein Stielende 96 verschiebbar und unter Abdichtung in das Gehäuse der Kollisionsschnittstelle 92 eingepasst. Die MALDI-Ionenquelle 94b ist ähnlich der in 2 dargestellten Quelle, mit der Ausnahme, das in diesem Fall die Probe auf einer ebenen Oberfläche, die auf der Seite des Sondenstiels 95 durch maschinelle Bearbeitung ausgebildet ist, abgeschieden ist, und nicht am Ende einer zylindrischen Sonde. Die Probe wird mit einem Laser mit entsprechender Optik (allgemein mit dem Bezugszeichen 97 bezeichnet) bestrahlt und Ionen werden in ein Spektrometer, das mit dem Bezugszeichen 98 bezeichnet ist, übertragen. Wenn die ESI-Quelle 94a in Betrieb ist, wird der Stiel 96 weit genug herausgezogen, um den Weg für die ESI-Ionen freizumachen. Wenn die MALDI-Ionenquelle 94b in Betrieb ist, wird der Stiel 96 wieder eingeführt, so dass das MALDI-Target 94b sich in der zentralen Position befindet.
Derzeit werden MALDI- und ESI-Techniken häufig als komplementäre Verfahren für die biochemische Analyse angesehen, so dass sich in zahlreichen biochemischen oder pharmazeutischen Laboratorien beide Instrumente im Einsatz befinden. Offensichtlich ergeben sich erhebliche Vorteile durch eine Kombination beider Ionenquellen in einem einzigen Instrument, wie es in den vorstehenden Ausführungsformen verwirklicht ist. Insbesondere lässt sich erwarten, dass die Kosten für ein Kombinationsinstrument wenig mehr als die Hälfte für die Kosten von zwei getrennten Instrumenten betragen. Außerdem können ähnliche Verfahren für die Ionenmanipulation, den Nachweis und die Massenkalibration herangezogen werden, da die Ionenerzeugung weitgehend von der Ionenmessung abgekoppelt ist. Dies würde eine Vereinfachung der Analyse und der Bearbeitung von getrennten Spektren und deren Vergleich erleichtern.
Die Möglichkeit der Verwendung sowohl von MALDI- als auch von ESI-Quellen in einem einzigen Instrument ist nicht auf das in 1 dargestellte Spektrometer beschränkt, vielmehr ist es auf beliebige Massenspektrometer mit einer Kollisionsdämpfungsschnittstelle anwendbar. Insbesondere ist es auf das QqTOF-Instrument anwendbar, das vorstehend erörtert wurde und nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
Vorstehend wurden spezielle Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Es ist dabei ersichtlich, dass im Rahmen der Erfindung zahlreiche Variationen möglich sind. So kann die Vorrichtung einen einzigen Multipol-Stabsatz gemäß der Darstellung in 1 oder zwei Stabsätze gemäß der Darstellung in 2 umfassen. Während Quadrupol-Stabsätze bevorzugt werden, sind auch andere Stabsätze, wie Hexapol- und Oktapol-Stabsätze, möglich. Ferner kann der Stabsatz auf der Basis bekannter Eigenschaften der verschiedenen Stabsätze ausgewählt werden. Außerdem ist es möglich, dass drei oder mehr Stabsätze vorgesehen sind. Während in 2 die beiden Stabsätze 31 und 32 in einer gemeinsamen Kammer vorgesehen sind, können die Stabsätze in bekannter Weise in getrennten Kammern, die bei unterschiedlichen Drücken arbeiten, vorgesehen sein, um unterschiedliche Operationen durchführen zu können. So kann zur Durchführung einer herkömmlichen Massenselektion eine Kammer vorliegen, die bei einem sehr niedrigen Druck arbeitet, so dass es zu einer geringen oder gar keinen Kollisionsaktivität zwischen den Ionen und dem Dämpfungsgas kommt. Außerdem kann der Druck des Gases zwischen verschiedenen Kammern variiert werden, um die Erfordernisse für eine Kollisionsdämpfung zu erfüllen, wo eine relativ große Anzahl von Kollisionen erwünscht ist, im Gegensatz zu einer kollisionsinduzierten Fragmentierung, wo übermäßige Kollisionen nicht wünschenswert sind.
Nachstehend wird auf 11 Bezug genommen. Aus Gründen der Einfachheit und Kürze sind Komponenten, die gleich wie bei der Vorrichtung oder dem Spektrometer von 2 sind, mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet. Eine Beschreibung dieser Komponenten wird nicht wiederholt.
Das MALDI-Target wird bei 100 bereitgestellt und erzeugt einen Ionenstrahl mit der Bezeichnung 102. Das MALDI-Target 100 befindet sich in einer differentiell evakuierten Kammer 104, die in bekannter Weise mit einer mit dem Bezugszeichen 106 bezeichneten Pumpe verbunden ist. Ein erster Stabsatz Q0 wird in der Kammer 104 angeordnet. Eine Apertur und eine Interquad-Aperturplatte 108 sorgen für eine Verbindung durch eine Hauptkammer 110. Auch hier ist in bekannter Weise an der Position 112 eine Verbindung mit einer Pumpe vorgesehen.
Innerhalb der Hauptkammer 110 befindet sich ein kurzer Stabsatz 111, der gelegentlich als ”Stumpen” bezeichnet wird. Er dient zur Kollimation des Strahls. Ein erster Quadrupol-Stabsatz in der Kammer 110 ist mit Q1 bezeichnet und ein zweiter Stabsatz mit Q2.
Der Stabsatz Q2 befindet sich in einer Kollisionszelle 114, die mit einem Anschluss (mit der Bezeichnung 116) für ein Kollisionsgas versehen ist.
Beim Verlassen der Kollisionszelle 114 gelangen Ionen nach Durchlaufen eines Gitters und anschließend einer Apertur in den Lagerbereich 48 des TOF-Instruments, das mit 50 bezeichnet ist. Dabei ist das TOF-Instrument 50 mit einer Auskleidung 118 um den Flugbereich versehen.
Die differentiell evakuierte Kammer 104 wird auf einem Druck von etwa 10^–2 Torr gehalten. Die Hauptkammer 110 wird auf einem Druck von etwa 10^–5 Torr gehalten, während die Kollisionszelle 114 auf einem Druck von 10^–2 Torr gehalten wird. Der Druck in der Kollisionszelle 114 kann in bekannter Weise gesteuert werden, indem man die Zufuhr von Stickstoff in die Zelle durch den Anschluss 116 steuert.
Dabei wird eine Kollisionsdämpfung von Ionen, die aus dem MALDI-Target 100 stammen, durch den relativ hohen Druck in der differentiell evakuierten Kammer 104 erreicht. Die Ionen gelangen sodann zum Quadrupol-Stabsatz Q1, der so betrieben werden kann, dass eine Massenselektion eines erwünschten Ions vorgenommen wird.
Das der Massenselektion unterzogene Ion gelangt sodann in die Kollisionszelle 114 und zum Stabsatz Q2. Die Potenziale sind so beschaffen, dass die Ionen zum Stabsatz Q2 mit ausreichender Energie gelangen, um eine kollisionsinduzierte Dissoziation zu erreichen. Die durch diese CID erzeugten Fragmentionen gelangen sodann zu Analysezwecken in das TOF-Instrument 50.
Typische Spektren, die mit einem MALDI-QqTOF-Instrument erhalten worden sind, sind in 12 dargestellt. Das in 12a dargestellte Spektrum wurde bei Betreiben von Q1 in einem breiten Bandmodus erhalten, so dass sämtliche in der MALDI-Ionenquelle erzeugten Ionen dem TOF-Massenanalysator zugeführt wurden. Drei Peaks (121, 122, 123) in 12a entsprechen den Ionen von Leucin-enkephalin, Substanz P bzw. Mellitin. Wenn Q1 im Selektionsmodus betrieben wird, wird das in 12b dargestellte Spektrum beobachtet. Dabei wurde Q1 so gewählt, dass sich nur Ionen von Substanz P (Peak 122) bei m/z um 1347,7 herum befanden. Es ist darauf hinzuweisen, dass keine anderen Peaks oder ein Hintergrund im Massenspektrum beobachtet wurden, da die Bedingungen in Q1 die Übertragung von anderen Ionen verhinderte. 12c zeigt das Ergebnis der Selektion bei Substanz P (Peak 122) und die kollisionsinduzierte Dissoziation der Substanz P-Ionen. Dabei wurde Q1 auf den Selektionsmodus wie in 12b eingestellt, wobei aber die Potenzialdifferenz zwischen Q0 und Q2 erhöht wurde, um die CID zu fördern. Bei dem im unteren Massenbereich beobachteten Peaks handelt es sich um Fragmente der Substanz P-Ionen.
Nachstehend wird auf 13 Bezug genommen, wobei wiederum gleiche Komponenten mit den gleichen Bezugszeichen wie in den 11 und 2 versehen sind.
In 13 ist die MALDI-Quelle mit 130 und der Ionenstrahl mit 132 bezeichnet. Ein Probenkegel 134 wurde zwischen die MALDI-Quelle 130 und den Stabsatz Q0 gebracht. Dadurch wird in wirksamer Weise die differentiell evakuierte Region in eine erste differentiell evakuierte Region 136 und eine zweite differentiell evakuierte Region 138 getrennt. Diese differentiell evakuierten Regionen 136, 138 sind mit entsprechenden Anschlüssen 137 und 139 zum Anschluss an Pumpen versehen.
Wie zuvor wird ein kurzer Satz von Stäben oder Stumpen 140 zusammen mit einem Stabsatz Q1 in einer Kammer mit der Bezeichnung 142 vorgesehen.
Der alternative Kollisionsdämpfungsaufbau von 13 wurde in einem MALDI-Qq-TOF-Instrument realisiert, kann aber mit beliebigen Konfigurationen von Kollisions-HF-Ionenleitvorrichtungen eingesetzt werden, z. B. mit der früher beschriebenen und in 2 dargestellten einfacheren Geometrie. In der Konfiguration von 13 wird eine gewisse Kollisionsdämpfung im ersten Bereich oder der Kammer 136 erreicht, wo fast kein HF-Feld vorhanden ist. Diese Kammer wird (ebenso wie in 2) mit Stickstoff versorgt. Auch die Kammer 104 in 11 wird mit Stickstoff versorgt. Dies ist vergleichbar mit 2, obgleich in diesen späteren Figuren kein Stickstoffanschluss dargestellt ist. Der Druck im ersten differentiell evakuierten Bereich oder der Kammer 136 ist typischerweise höher als in der zweiten differentiell evakuierten Kammer 138. Ionen werden durch Kombination eines Gleichstromfeldes und des Gasstroms in Richtung zum Einlass von Q0 geschleppt. Trotz des höheren Drucks wird keine signifikante Veränderung im Spektrum beobachtet. Die Signalintensität bei dieser Konfiguration war im wesentlichen die gleiche wie bei der in 11 dargestellten Konfiguration, vorausgesetzt der Durchmesser der Kegelöffnung war größer als 1 mm. Bei einer Öffnung mit einem kleineren Durchmesser sinkt die Signalintensität ab, vermutlich aufgrund der Tatsache, dass die Öffnung kleiner als der Durchmesser des Ionenstrahls wird.
14 zeigt eine Vorrichtung, die zur Untersuchung des Einflusses von Druck und elektrischem Feld auf die Intensität des durch MALDI erzeugten Signals herangezogen wird. MALDI-Ionen werden durch einen gepulsten UV-Laserstrahl 152 am Target 150 erzeugt. Der Laserstrahl 152 durchläuft sodann eine Linse 154 und ein Fenster 156, wie es bei den vorstehend beschriebenen Spektrometerkonfigurationen beschrieben wurde. Das Fenster 156 ist in einer Kammer 158 vorgesehen, deren Innendruck in bekannter Weise variiert werden kann (Anschlüsse für Pumpen und dergleichen sind nicht dargestellt). Eine Potenzialdifferenz U zwischen dem Target 150 und einer Kollektorelektrode 162 wird durch eine Stromquelle 160 erzeugt.
Somit wandern Ionen, die am Target 150 erzeugt worden sind, entsprechend dem Bezugszeichen 164 zur Kollektorelektrode 162. Ein annähernd homogenes elektrisches Feld wird im Bereich zwischen dem Target 150 und der Kollektorelektrode 162 erzeugt. Die Feldstärke ist proportional zur angelegten Potenzialdifferenz U. Der Abstand zwischen dem Target und dem Kollektor betrug etwa 3 mm. Der Laser wurde mit 20 Hz betrieben. Der gesamte Ionenstrom wurde unter Verwendung eines Verstärkers 166 gemessen.
15 zeigt die Abhängigkeit des durch MALDI bei verschiedenen Drücken innerhalb der Kammer 158 erzeugten gesamten Ionenstroms als eine Funktion der zwischen dem Target 150 und der Kollektorelektrode 162, die in 14 dargestellt sind, angelegten Spannung. Es ist ersichtlich, dass die Ionenausbeute mit steigendem Druck abnimmt und eine erhebliche Ausbeuteabnahme zwischen 14 und 47 Torr auftritt. Jedoch kann die Ausbeuteabnahme durch Erhöhung der elektrischen Feldstärke ausgeglichen werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die MALDI-Technik bei beliebigen erwünschten Drücken eingesetzt werden kann, selbst außerhalb des Bereiches, in dem HF-Kollisionsmultipole eingesetzt werden können. Eine Kollisionsdämpfung der Ionen kann zumindest teilweise im Bereich ohne HF-Feld neben dem Probentarget erreicht werden. Die Erfinder nehmen an, dass eine ähnliche Abhängigkeit von Druck und elektrischem Feld in einigen anderen gepulsten Ionenquellen beobachtet werden kann und dass diese Ionisationstechniken ebenfalls zusammen mit einer Kollisionsdämpfung bei höheren Drücken eingesetzt werden können.

Claims

Massenspektrometer-System (10) umfassend: eine Ionenquelle (1; 11, 14, 15) zum Bereitstellen von zu analysierenden Ionen; einen Massenspektrometer (50), eine Ionenbahn (27), die sich zwischen der Ionenquelle (1; 11, 14, 15) und dem Massenspektrometer (50) erstreckt, und eine Ionentransmissionsvorrichtung, die in der Ionenbahn (27) angeordnet ist und ein Dämpfungsgas in wenigstens einem Abschnitt der Ionenbahn (27) aufweist; dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenquelle eine gepulste Ionenquelle (1; 11, 14, 15) umfasst, wobei die Ionen einer Kollisionsdämpfung unterworfen sind und eine Umwandlung von Ionenpulsen aus der Ionenquelle in einen quasi-kontinuierlichen Ionenstrahl (102; 132) bewirkt wird; wobei das Massenspektrometer ein orthogonales Flugzeit-Massenspektrometer umfasst, bei dem der quasi-kontinuierliche Ionenstrahl (102; 132) in das orthogonale Flugzeit-Massenspektrometer eintritt und gepulst ist, um den quasi-kontinuierlichen Ionenstrahl (102; 132) in Ionenpulse zurückzuwandeln.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 1, wobei das Dämpfungsgas einen Druck in einem Bereich von etwa 0,013 N/m² (10^–4 Torr) bis zu etwa 1,013 × 10⁵ N/m² (760 Torr) aufweist.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Dämpfungsgas neben der gepulsten Ionenquelle (1; 11, 14, 15) bereitgestellt ist und einen Druck, der ausreicht, um eine Verminderung der Energiestreuung von aus der Ionenquelle emittierten Ionen zu bewirken, aufweist.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Ionentransmissionsvorrichtung eine RF-Ionenleitvorrichtung (3; 31, 32; 93) einschließt und das Dämpfungsgas in der RF-Ionenleitvorrichtung (3; 31, 32; 93) bereitgestellt ist.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 4, wobei die RF-Ionenleitvorrichtung ein RF-Multipol-Stabsatz (3; 31, 32; 93) ist und wobei das Produkt aus dem Druck des Dämpfungsgases innerhalb des RF-Multipol-Stabsatzes (3; 31, 32, 93) mal der Länge der Stäbe des RF-Multipol-Stabsatzes (3; 31, 32; 93) wenigstens 1,33 N/m²-cm (10,0 mTorr-cm) beträgt.
Massenspektrometer-System nach Anspruch 4 oder 5, wobei die RF-Ionenleitvorrichtung und das Dämpfungsgas neben der gepulsten Ionenquelle bereitgestellt sind.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 6, das wenigstens einen RF-Multipol-Stabsatz (3; 31, 32; 93) und einen Ringsatz mit der hindurchgehenden Ionenbahn (27) einschließt, und wobei das Dämpfungsgas in wenigstens einem RF-Multipol-Stabsatz (3; 31, 32; 93) und dem RF-Ringsatz bereitgestellt ist, falls vorhanden.
Massenspektrometer-System nach Anspruch 1, wobei die Länge des Abschnitts der Ionenbahn (27) mit dem Dämpfungsgas und der Druck des Dämpfungsgases ausreichen, um Ionenpulse in einen quasi-kontinuierlichen Ionenstrahl (102; 132) umzuwandeln.
Massenspektrometer-System (10) nach einem der vorstehenden Ansprüche, das eine erste Differenzdruckkammer (136) einschließt, wobei die gepulste Ionenquelle (1; 11, 14, 15) in der ersten Differenzdruckkammer (136) bereitgestellt ist.
Massenspektrometer-System (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend eine erste Differenzdruckkammer (136), wobei die gepulste Ionenquelle (1; 11, 14, 15) in einer ersten Differenzdruckkammer (136) bereitgestellt ist, eine zweite Diffenzdruckkammer (138), die zwischen der ersten Differenzdruckkammer (136) und dem Massenspektrometer (50) angeordnet ist, und einen Skimmer (134) zwischen der ersten (136) und zweiten (138) Differenzdruckkammer zur Aufrechterhaltung einer Druckdifferenz zwischen der ersten und zweiten Differenzdruckkammer (136; 138).
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 9, wobei die erste Differenzdruckkammer (30, 104, 136) einen RF-Multipol-Stabsatz (3; 31, 32; 93), der als Ionenleitvorrichtung konfiguriert ist, einschließt.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 10, wobei die zweite Differenzdruckkammer (138) einen RF-Multipol-Stabsatz (Q0), der als Ionenleitvorrichtung konfiguriert ist, einschließt.
Massenspektrometer-System (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend einen Massenanalysator (31, Q1) und eine Kollisionszelle (32; 114), die vor dem Massenspektrometer (50) und in der Ionenbahn (27) bereitgestellt sind, wobei der Massenanalysator (31, Q1) einen Multipol-Stabsatz (31, Q1), der zur Auswahl eines Vorläuferions konfiguriert ist, einschließt, und in der Kollisionszelle (32; 114) ein gebräuchliches Dämpfungsgas bereitgestellt ist, um eine Fragmentierung von ausgewählten Vorläuferinnen zu bewirken, um Fragmentionen zur Analyse im Massenspektrometer (50) zu bilden.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 13, wobei die Kollisionszelle (114) als eine vom Massenanalysator (Q1) getrennte Kammer bereitgestellt ist.
Massenspektrometer-System (10) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gepulste Ionenquelle (1; 11, 14, 15) eine Oberfläche (15), die zu analysierende Moleküle enthält, und einen auf die Oberfläche (15) gerichteten gepulsten Laser (14) zum Bereitstellen von Laserpulsen umfasst, um eine Ionisierung der zu analysierenden Moleküle zu bewirken.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 15, wobei die Oberfläche (15) ein Targetmaterial enthält, das aus einer Matrix und zu analysierenden Molekülen in der Matrix zusammengesetzt ist, wobei die Matrix eine Spezies, die Strahlung aus dem gepulsten Laser (14) absorbiert, umfasst, um die Desorption und Ionisierung der zu analysierenden Moleküle zu fördern.
Massenspektrometer-System (10) nach einem der vorstehenden Ansprüche, das zusätzlich eine kontinuierliche Ionenquelle (94a) und Mittel zum Auswählen einer kontinuierlichen Ionenquelle (94a) oder der gepulsten Ionenquelle (94b) einschließt.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 17, das wenigstens eines der Folgenden einschließt: eine Vielzahl von gepulsten Ionenquellen (94b) und eine Vielzahl von kontinuierlichen Ionenquellen (94a), wobei das Mittel zum Auswählen die Auswahl jeder der kontinuierlichen und gepulsten Ionenquellen ermöglicht.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 1, das ein Auswahlmittel zum Bewirken einer Massenauswahl eines Vorläuferions und eine Kollisionszelle zum Bewirken einer Kollisions-induzierten Dissoziation von Vorläuferionen zur Bildung von Fragmentionen einschließt, wobei das Auswahlmittel und die Kollisionszelle in der Ionenbahn (27) vor dem Massenspektrometer (50) angeordnet sind.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 19, wobei das Auswahlmittel eine Ionenfalle zum Bewirken sowohl der Massenauswahl eines Vorläuferions als auch der Kollisions-induzierten Dissoziation umfasst.
Massenspektrometer-System (10) nach Anspruch 19, wobei die Kollisions-induzierte Dissoziation durch Ultraviolett- oder Infrarot-Strahlung oder durch Oberflächeninduzierte Dissoziation bewirkt ist.
Massenspektrometer-System (10) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei auch wenigstens eines der Folgenden bewirkt ist; Verminderung der Energiestreuung von aus der Ionenquelle emittierten Ionen; zumindest eine teilweise Unterdrückung von unerwünschter Fragmentierung von zu analysierenden Ionen; und räumliches und zeitliches Streuen von Ionen entlang der Ionenbahn.
Verfahren zur Erzeugung von Ionen aus einer Ionenquelle und Abgeben der Ionen entlang einer Ionenbahn (27), die sich durch eine Ionentransmissionsvorrichtung zu einem Flugzeit-Massenspektrometer (50) erstreckt, zur Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: (1) Bereitstellen einer gepulsten Ionenquelle (1; 11, 14, 15) als die Ionenquelle, (2) Erzeugen von Ionenpulsen aus der gepulsten Ionenquelle (1; 11, 14, 15), (3) Versorgen der Ionentransmissionsvorrichtung mit einem Dämpfungsgas in wenigstens einem Abschnitt der Ionenbahn (27), um eine Kollisionsdämpfung der Ionenbewegung zu bewirken und um eine Umwandlung von Ionenpulsen aus der Ionenquelle in einen quasi-kontinuierlichen Ionenstrahl (102; 132) zu bewirken, (4) Anordnen der Ionenbahn (27), orthogonal zur Achse des Flugzeit-Massenspektrometers (50); (5) Passieren des quasi-kontinuierlichen Ionenstrahls (102; 132) im Wesentlichen kontinuierlich in das Flugzeit-Massenspektrometer (50); und Pulsen der Ionen im Flugzeit-Massenspektrometer (50), um eine Massenanalyse zu bewirken.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Gas mit einem Druck in einem Bereich von etwa 0,013 N/m² (10^–4 Torr) bis zu etwa 1,013 × 10⁵ N/m² (760 Torr) bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, das das Bereitstellen von Dämpfungsgas neben der Ionenquelle (1; 11, 14, 15) umfasst, welches einen Druck aufweist, der ausreicht, um eine Verminderung der Energiestreuung von aus der Ionenquelle (1; 11, 14, 15) emittierten Ionen zu bewirken.
Verfahren nach Anspruch 23, 24 oder 25, wobei der Gasdruck so ist, dass aus der Ionenquelle (1; 11, 14, 15) emittierte Ionen ausreichend gedämpft werden, um eine wesentlich unerwünschte Fragmentierung von Ionenzu vermindern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, das das Bereitstellen einer RF-Ionenleitvorrichtung (3; 31, 32; 93) entlang der Ionenbahn (27) und das Bereitstellen eines Gasdrucks in der RF-Ionenleitvorrichtung einschließt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die RF-Ionenleitvorrichtung ein RF-Multipol-Stabsatz ist und der Gasdruck so ist, dass das Vielfache der Länge der RF-Ionenleitvorrichtung (3; 31, 32; 93) mal dem Gasdruck wenigstens 1,33 N/m²-cm (10,0 mTorr-cm) beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28, das das Passieren der Ionen entlang der Ionenbahn (27) durch wenigstens einen RF-Multipol-Stabsatz (3; 31, 32; 93) und einen RF-Ringsatz einschließt.
Verfahren nach Anspruch 23, das weiter umfasst: Bereitstellen der Länge des Abschnitts der Ionenbahn (27), in dem das Dämpfungsgas und ein Druck des Dämpfungsgases in einer Weise bereitgestellt werden, dass die Ionenpulse in einen quasi-kontinuierlichen Strahl umgewandelt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 30, das das Bereitstellen eines Differenzdruck-Bereichs (104), der sich von der Ionenquelle (1; 11, 14, 15) aus erstreckt und Einschließen einer RF-Ionenleitvorrichtung, die einen Multipol-Stabsatz (3; 31, 32; 93) umfasst, einschließt, wobei das Verfahren ein Aufrechterhalten eines gewünschten Drucks im Differenzdruck-Bereich (104) und ein Betreiben der Ionenleitvorrichtung zum Sammeln und Leiten der Ionen entlang der Ionenbahn (27) einschließt.
Verfahren nach Anspruch 31, das einschließt: Bereitstellen eines ersten Differenzdruck-Bereichs (136) unmittelbar neben der Ionenquelle (130), Bereitstellen der Ionenleitvorrichtung (Q0) in einem zweiten Differenzdruck-Bereich (138) neben dem ersten Differenzdruck-Bereich (136) und Bereitstellen eines Skimmers (134), der den ersten und den zweiten Differenzdruck-Bereich (136; 138) trennt, und Bewirken, dass von einer Ionenquelle (130) erzeugte Ionen entlang der Ionenbahn (132) von dem ersten Differenzdruck-Bereich (136) zu dem zweiten Differenzdruck-Bereich (138) mittels wenigstens eines Gasstroms und eines elektrostatischen Potentials wandern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 29, das das Bereitstellen eines Massenanalysators einschließt, der einen Multipol-Stabsatz (31, Q1) und eine Kollisionszelle (32, 114), die einen Multipol-Stabsatz (32, Q2) einschließt, umfasst, wobei das Verfahren ein Passieren der Ionen durch den Massenanalysator zum Auswählen von Vorläuferionen, ein Passieren der Vorläuferionen in die Kollisionszelle (32, 114) zum Bewirken von Kollisions-induzierter Dissoziation, wodurch Fragmentionen gebildet werden, und anschließend ein Passieren der Fragmentionen in das Massenspektrometer (50) zur Massenanalyse, einschließt.
Verfahren nach Anspruch 33, das das Passieren der Ionen aus der Kollisionszelle (114) orthogonal in besagte Flugzeitvorrichtung (50) und Pulsen der Ionen in der Flugzeitvorrichtung (50), um eine Massenanalyse zu bewirken, einschließt.
Verfahren nach Anspruch 33, das das Passieren der Ionen durch ein weiteres Massenfilter, das einen Quadrupol-Stabsatz zum Auswählen eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses zum Nachweis einschließt, und Nachweisen der ausgewählten Ionen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 35, das das Erzeugen von Ionen durch Bereitstellen einer Quelle von zu analysierenden Molekülen und Bestrahlen der Quelle von zu analysierenden Molekülen mit einem gepulsten Laserstrahl (20) einschließt, wodurch Ionenpulse erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 23, 29 oder 35, das das Erzeugen von Ionen in der gepulsten Ionenquelle durch Bereitstellen einer Quelle von zu analysierenden Molekülen und Bestrahlen der Quelle von zu analysierenden Molekülen mit einem gepulsten Laserstrahl, wodurch man Ionenpulse erzeugt, und Injizieren von Ionenpulsen in das Flugzeit-Massenspektrometer mit einer Rate, die wesentlich größer als die der Erzeugungsrate der Laserpulse ist, einschließt, wobei jeder Ionenpuls aus der gepulsten Ionenquelle eine Vielzahl von Injektionspulsen für das Flugzeit-Massenspektrometer bereitstellt.
Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, das das Bereitstellen der zu analysierenden Moleküle in einem Targetmaterial (15; 50), das eine Matrix einer Spezies, die zur Absorption von Strahlung aus dem Laser (14) angepasst ist, und die zu analysierenden Moleküle umfasst, einschließt, wobei das Verfahren ein Bestrahlen der Matrix mit dem gepulsten Laser (14) umfasst, wodurch die Spezies die Laserstrahlung absorbiert, um eine Desorption und Ionisierung der zu analysierenden Moleküle zu bewirken.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 38, das ferner ein Bereitstellen einer kontinuierlichen Ionenquelle (94a) und Auswählen einer der vorerwähnten Ionenquelle (94b) für gepulste Ionen und der kontinuierlichen Ionenquelle (94a) einschließt, um Ionen zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 39, das ferner ein Bereitstellen wenigstens eines der Folgenden einschließt: eine Vielzahl von gepulsten Ionenquellen (94b) und eine Vielzahl von kontinuierlichen Ionenquellen (94a), wobei das Verfahren ferner ein Auswählen einer der kontinuierlichen oder gepulsten Ionenquellen zum Bereitstellen von Ionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, das vordem Passieren der Ionen in das Massenspektrometer (50) ein Auswählen eines Vorläuferions und das Bewirken von Kollisions-induzierter Dissoziation der Vorläuferinnen zum Bilden von Fragmentionen und anschließendem Passieren der Fragmentionen in das Massenspektrometer (50) zur Massenanalyse einschließt.
Verfahren nach Anspruch 41, das das Bewirken einer Massenauswahl eines Vorläuferions und das Bewirken von Kollisions-induzierter Dissoziation in einer einzigen Vorrichtung einschließt.
Verfahren nach Anspruch 41, das das Bewirken von Kollisions-induzierter Dissoziation durch Ultraviolett oder Infrarot-Strahlung oder durch Oberflächeninduzierte Dissoziation einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 43, wobei wenigstens eines der Folgenden bewirkt wird: Verminderung der Energiestreuung von aus der Ionenquelle emittierten Ionen; zumindest teilweises Unterdrücken von unerwünschter Fragmentierung von zu analysierenden Ionen; und räumliches und zeitliches Streuen von Ionen entlang der Ionenbahn.