DE60210056T2

DE60210056T2 - Massenspektrometrisches Verfahren mit Elektroneneinfang durch Ionen und Massenspektrometer zum Durchführen des Verfahrens

Info

Publication number: DE60210056T2
Application number: DE60210056T
Authority: DE
Inventors: Roman Zubarev
Original assignee: Syddansk Universitet
Current assignee: Syddansk Universitet
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2022-03-23
Also published as: US20040155180A1; US6958472B2; WO2002078048A1; EP1371083B1; DE60210056D1; CA2441776A1; ATE321356T1; EP1371083A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Ionenfragmentierungstechniken, die bei Tandem-Massenspektrometrie nützlich sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Massenspektrometrie ist eine Analysetechnik, bei der Ionen von Probenmolekülen erzeugt und entsprechend ihren Massen-Ladungsverhältnissen (m/z) analysiert werden. Die Ionen werden durch mannigfache Ionisationtechniken erzeugt, einschließlich Elektronenstoß, schnelles Atombombardement, Elektrospray-Ionisation und matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation. Analyse nach m/z wird in Analysatoren durchgeführt, in denen die Ionen entweder eine Zeitspanne lang abgefangen werden oder in Richtung auf den Detektor hindurchfliegen. Bei den Abfanganalysatoren, wie z. B. Quadrupol-Ionenfallen- (Paul-Fallen) und Ionen-Zyklotronresonanz- (ICR-Zellen- oder Penning-Fallen) -Analysatoren werden die Ionen durch eine Kombination von Magnetfeldern, elektrostatischen Feldern oder elektromagnetischen Wechselfeldern eine Zeitspanne von typischerweise von etwa 0,1 bis 10 Sekunden lang räumlich beschränkt. Bei den Analysatoren vom Durchgangstyp, wie z. B. magnetischen, Quadrupol- und Flugzeit-Analysatoren, ist die Ionenverweilzeit kürzer, im Bereich von etwa 1 bis 100 μs.
Tandem-Massenspektrometrie ist ein allgemeiner Begriff für Massenspektrometrieverfahren, bei denen Proben-Ionen mit gewünschtem Massen-Ladungsverhältnis ausgewählt und innerhalb des Massenspektrometers getrennt werden und die erhaltenen Fragment-Ionen entsprechend ihren Massen-Ladungsverhältnissen analysiert werden. Trennung von nach Masse ausgewählten Ionen kann entweder in einer besonderen Zelle zwischen zwei m/z-Analysatoren oder, bei Abfanginstrumenten, innerhalb der Falle durchgeführt werden. Tandem-Massenspektrometrie kann viel mehr Strukturinformationen über die Probenmoleküle liefern.
Zur Fragmentierung von Ionen innerhalb des Massenspektrometers wird am häufigsten kollisionsinduzierte Trennung (CID) verwendet. Bei der vorherrschenden Technik kollidieren die m/z-ausgewählten Ionen mit Gasatomen oder -molekülen wie z. B. Helium, Argon oder Stickstoff, mit nachfolgender Umwandlung der Kollisionsenergie in innere Energie der Ionen. Alternativ können Ionen mit Infrarotphotonen bestrahlt werden (Infrarotmultiphotonentrennung, IRMPD), was ebenfalls zur Zunahme der inneren Energie führt. Ionen mit hoher innerer Energie erfahren nachfolgende Trennung in Fragmente, von denen eines oder mehrere elektrische Ladung tragen. Die Masse und die Häufigkeit der Fragment-Ionen von einer gegebenen Art liefern Informationen, die benutzt werden können, um die Molekülstruktur der betreffenden Probe zu charakterisieren.
Sowohl Kollisions- als auch Infrarottrennungstechniken haben schwerwiegende Nachteile. Erstens bewirkt Erhöhung der inneren Temperatur intramolekulare Umordnungen, die zu fehlerhafter Strukturzuordnung führen können, wie erörtert in Vachet, Bishop, Erickson und Glish, (1997) Am. Chem. Soc. 119: 5481–5488. Zweitens dominieren niederenergetische Fragmentierungskanäle, welche die Multiplizität von gespaltenen Bindungen und somit die durch Fragmentierung gewonnenen Informationen begrenzen können und im Falle des Vorhandenseins von leicht lösbaren Gruppen im Verlust von Informationen über ihre Lage resultieren. Schließlich werden sowohl Kollisions- als auch Infrarottrennung für große Molekülmassen ineffektiv.
Um diese Probleme wenigstens teilweise zu überwinden, wurde in neuerer Zeit Elektroneneinfangtrennung (ECD) vorgeschlagen (siehe Zubarev, Kelleher und McLafferty (1998), J. Am. Chem. Soc. 120: 3265–3266).
Die ECD-Technik ist technisch verwandt mit, aber physikalisch verschieden von früherer Arbeit der Verwendung von energiereichen Elektronen zum Induzieren von Fragmentierung durch Kollisionen mit Elektronen (Elektronenstoßtrennung, EID). Die US 4,731,533 beschreibt die Verwendung von energiereichen Elektronen (etwa 600 eV), die radial auf einen Ionenstrahl emittiert werden, um Fragmentierung zu induzieren. Ähnlich offenbart die US 4,988,869 die Verwendung von energiereichen Elektronenstrahlen mit 100–500 eV quer zu einem Proben-Ionenstrahl, um Fragmentierung zu induzieren. Das Verfahren leidet jedoch an geringem Wirkungsgrad, mit einem maximalen Wirkungsgrad der Totalfragmentierung der Mutter-Ionen von etwa 5 %.
Im Gegensatz zu EID zerfallen bei der ECD-Technik positive mehrfach geladene Ionen bei Einfang von energiearmen Elektronen (< 1 eV) in einer Ionen-Zyklotronresonanzzelle. Die energiearmen Elektronen werden durch einen geheizten Glühfaden erzeugt. Elektroneneinfang kann mehr strukturell wichtige Spaltungen als Kollisions- und Infrarottrennungen liefern. Bei Polypeptiden, für welche Massenspektrometrieanalyse verbreitet verwendet wird, spaltet Elektroneneinfang die N-C_α-Backbone-Bindungen, während Kollisions- und Infrarotanregung die Amid-Backbone-Bindungen (Peptidbindungen) spaltet. Kombination dieser zwei verschiedenen Spaltungstypen liefert zusätzliche Sequenzinformationen (Horn, Zubarev und McLafferty (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 10313–10317). Außerdem fragmentieren Disulfid-Bindungen innerhalb der Peptide, die bei Kollisions- und Infrarotanregungen gewöhnlich intakt bleiben, insbesondere bei Elektroneneinfang. Schließlich bleiben einige leicht lösbare Gruppen bei Elektroneneinfangtrennung an den Fragmenten haften, was eine Bestimmung von deren Positionen erlaubt.
Der Nachteil der gegenwärtigen Elektroneneinfangtrennungsverfahren liegt in deren relativ niedrigem Wirkungsgrad, was sich in der langen Elektronenbestrahlungszeit manifestiert. Um Elektroneneinfang durch einen gewünschten Anteil Polypeptid-Mutter-Ionen zu erzielen, ist zumindest einige Sekunden Bestrahlung für doppelt geladene Mutter-Ionen nötig (siehe Zubarev et al. (2000) Anal. Chem. 72: 563–573). Typische Parameter für die ECD-Technik sind beschrieben in Zubarev (2000) ebenda. Man verwendet Elektronenstrahlen von 0,3–1 μA mit einer mittleren Elektronenenergie von etwa 0,5 oder 1,0 eV. Es zeigt sich, dass die höheren Ströme keine wirksamere ECD liefern. Es wird behauptet, dass ECD eine Translationsenergiedifferenz nahe null zwischen den Ionen und Elektronen erfordert. Lässt man verschiedene Energiepopulationen von Elektronen in die ICR-Zelle herein, stellt man fest, dass die energieärmeren Elektronen einen höheren ECD-Wirkungsgrad bereitstellen.
Diese lange Bestrahlungszeit reduziert den Nutzfaktor des Massenspektrometers auf 3–10 %. Bei Elektrospray-Ionisation werden kontinuierlich Proben-Ionen erzeugt, und aufgrund des schlechten Nutzfaktors kann nur ein kleiner Bruchteil dieser Ionen in ECD-Experimenten analysiert werden, was in geringer Empfindlichkeit resultiert. Außerdem ist Elektroneneinfangtrennung ein energetischer Prozess, der in Streuung der Fragmente resultiert. Unzureichende Sammlung von erzeugten Fragment-Ionen verringert die Empfindlichkeit zusätzlich. Die lange Bestrahlungszeit macht Elektroneneinfangtrennung nur auf Ionen-Zyklotronresonanz-m/z-Analysatoren möglich, die zu den teuersten Typen von Massenspektrometern gehören und nicht in allgemeinem Gebrauch sind. Tatsächlich ist bei Durchgangs-Analysatoren die Aufenthaltszeit der Ionen zu kurz für wirksamen Elektroneneinfang. Bei Paul-Ionenfallen würde die Gegenwart eines elektromagnetischen Wechselfeldes von mehreren hundert Volt Amplitude den Strahl schnell ablenken oder ansonsten die kinetische Energie der Elektronen über 1 eV erhöhen, wobei der Querschnitt für Elektroneneinfang um mindestens drei Größenordnungen sinkt.
Aus diesen Gründen wäre es wünschenswert, die Ion-Elektron-Reaktion zu verkürzen und den Wirkungsgrad der Sammlung von Fragmenten zu verbessern, um ECD nützlicher zu machen. Außerdem wäre es höchst wünschenswert, die ECD-Technik bei anderen Typen von Massenspektrometern verwenden zu können.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Erzeugung von wirksamer Elektroneneinfangtrennung von positiven Ionen bei Tandem-Massenspektrometrie bereitgestellt. Es wird ein breiter Hochfluss-Elektronenstrahl verwendet, der im Wesentlichen die ganze Breite eines von Mutter-Ionen eingenommenen Bereichs zumindest eine Zeitspanne lang quert. Der Strahl erzeugt eine Potentialabsenkung entlang seiner Achse, die zumindest so groß ist wie die kinetische Energie der Bewegung der Ionen radial zur Strahlachse. Die Ionen werden daher während der Zeit der Elektronenbestrahlung innerhalb des vom Elektronenstrahl eingenommenen Volumens abgefangen, wodurch wirksamer Einfang von im Strahl vorhandenen energiearmen Elektronen durch die Ionen geboten wird. Die als Folge des Elektroneneinfangs gebildeten Fragment-Ionen werden ebenfalls im Inneren des Strahls abgefangen, was in deren wirksamen Sammlung resultiert.
Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Massenspektrometer für Anwendung der Verfahren der Erfindung bereit, welches Massenspektrometer eine Elektronenquelle aufweist, die einen Elektronenstrahl von ausreichender Dichte bereitstellt, um Ionen einzufangen, mindestens etwa 50 μA/mm², und bei der mindestens ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie hat, die niedrig genug ist, ausgewählt aus dem Bereich von etwa 0–1,0 eV und dem Bereich von etwa 2–14 eV, um den Elektroneneinfang durch zumindest einen Teil der abgefangenen Ionen bereitzustellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Blockdiagramm eines Tandem-Massenspektrometers (1), das eine Elektronenquelle verwendet, gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Massenspektrometer (1) umfasst eine Elektrospray-Ionenquelle (2), eine Elektrospray-Trennfläche (3), ein Massenfilter (4), eine Fragmentierungszelle (6), eine Elektronenquelle (7), ein zweites Massenfilter (5) und einen Ionendetektor (8).
2 ist eine Skizze eines Ionen-Zyklotronresonanz-Massenspektrometers gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem Graph, der das Potentialfeld auf der Achse der Ionen-Zyklotronresonanzzelle senkrecht (x) und parallel (z) zum Magnetfeld B zeigt.
3 ist eine Skizze eines Ionenfallen-Massenspektrometers gemäß der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine Skizze eines Quadrupol-Massenspektrometers gemäß der vorliegenden Erfindung.
5 ist eine Prinzipskizze der in den begleitenden Beispielen verwendeten instrumentellen Konfiguration und zeigt eine Elektrospray-Ionenquelle (2), eine Elektrospray-Trennfläche (3), eine Ionenführung (40), eine Ionenzelle (10) und eine Elektronenquelle (7) an.
6–7 zeigen mit der Erfindung erzielte Massenspektren, wie in Beispiel 1 beschrieben.
8 zeigt die Fragment-Ionen-Häufigkeiten gegen die Elektronenenergie E_e für 250 ms Elektronenbestrahlung von doppelt geladenen SPR-Peptidmolekül-Ionen: ∎ – N-C_α-Bindungs-Spaltungen, ☐ – C-N-Bindungs-Spaltungen, o – z₄ ^+·-Fragmente, • – w₄ ^+·-Fragmente; 1+:. – C-N-Bindungs-Spaltungen.
9: N-C-Spaltungshäufigkeiten in den Massenspektren von 2+-Ionen von SRP bei verschiedenen Energien von Bestrahlungselektronen.
10: Massenspektren der doppelt geladenen SRP-Peptidmolekül-Ionen bei verschiedenen Energien von Bestrahlungselektronen. Die Y-Skala zeigt die relative Häufigkeit in willkürlichen Einheiten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das Verfahren der Erfindung zum Erzielen eines Elektroneneinfangs durch positive Ionen für die Verwendung in der Massenspektrometrie weist die folgenden Schritte auf: Bereitstellen von positiven Ionen, die zumindest eine Zeitspanne lang in einem räumlich begrenzten Bereich angeordnet sind; Bereitstellen eines Elektronenstrahls, der im wesentlichen so breit wie dieser Bereich ist, wobei der Strahl eine Elektronendichte mit ausreichender Größe hat, so dass die durch die Elektronen erzeugte Potentialvertiefung größer oder gleich der kinetischen Energie der zu dem Strahl radialen Bewegung eines wesentlichen Teils der Ionen ist, um dadurch diesen Anteil von Ionen abzufangen; wobei zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie hat, die niedrig genug ist, um durch mindestens einen Teil der abgefangenen Ionen einen Elektroneneinfang bereitzustellen.
Der räumlich begrenzte Bereich liegt typischerweise innerhalb eines Massenspektrometers oder eines angrenzenden Raums wie z. B. innerhalb einer Reaktionskammer oder eines Bereichs einer Ionisationsquelle, wo Proben-Ionen eingeschränkt oder durchgeleitet werden, so dass sie sich eine Zeitspanne lang in dem Bereich befinden, um mit einem Elektronenstrahl zu reagieren, welcher im Wesentlichen so breit wie jener Bereich ist. Man beachte, dass der räumlich begrenzte Bereich nicht durch die Wände/Oberflächen eingeschränkt sein muss, die den Instrumentbereich definieren, der den räumlich begrenzten Bereich enthält; der räumlich begrenzte Bereich ist häufig ein Teilraum innerhalb des Instrumentbereichs.
Ein Kraftfeld kann geeignet verwendet werden, um dazu beizutragen, die positiven Ionen innerhalb des räumlich begrenzten Bereichs anzuordnen, wie z. B. ein Magnetfeld, ein elektrisches Feld, ein elektromagnetisches Feld oder jede Kombination davon.
Das Verfahren der Erfindung zum Bereitstellen von Elektroneneinfang der Proben-Ionen wird in nutzbaren Ausführungsformen bewirken, dass diese zerfallen, um Fragment-Ionen bereitzustellen. Elektroneneinfangtrennung verwendet die folgende Ion-Elektron-Reaktion: [M + nH]ⁿ⁺ + e^– → Fragmentierung wobei Moleküle [M + nH]ⁿ⁺(n ≥ 2) mit mehrfachem Protonenüberschuß bereitgestellt werden, am geeignetsten durch Elektrospray-Ionisation (die Mutter-Ionen müssen eine Ladung von 2 oder höher haben, um nach Einfang eines Elektrons, wobei die positive Ladung um eine Einheitsladung verringert wird, mindestens ein geladenes Fragment zu erzielen). Der Querschnitt für Elektroneneinfang wird mit der Elektronenenergie schnell kleiner, und daher sollten für eine wirksame Reaktion die Elektronen (oder ein wesentlicher Anteil davon) bevorzugt kinetische Energien unter etwa 1 eV, noch mehr bevorzugt unter etwa 0,5 eV und am meisten bevorzugt etwa 0,2 eV oder weniger haben. Der Querschnitt für Elektroneneinfang ist außerdem quadratisch abhängig vom Ionenladungszustand, was bedeutet, dass Einfang durch doppelt geladene Ionen vier mal so wirksam wie durch einfach geladene Ionen ist. Daher fangen die weniger geladenen Fragmente, die aus den Mutter-Ionen gebildet werden, Elektronen mit einer sehr geringen Rate verglichen mit den Mutter-Ionen ein.
Der Anmelder hat jedoch überraschend festgestellt, das "heiße" Elektronen mit Energien im Bereich von etwa 2–14 eV und vorzugsweise 3–13, wie z. B. etwa 6–12 eV, ebenfalls für Elektroneneinfangtrennung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese Variante von ECD, hierin 'HECD' (Heiß-ECD) genannt, kann eine signifikante Rate von Trennungseinfang ergeben, vorausgesetzt der Elektronenfluss ist hoch genug.
Es wird hierin postuliert, dass solche heißen Elektronen direkt eingefangen werden und gleichzeitig elektronische Anregung erzeugen. Sie sind somit energiearm genug, um Elektroneneinfang durch zumindest einen Teil der abgefangenen Ionen zu ermöglichen. Dieses wirksame Verfahrensvariante von ECD ist nach unserer Kenntnis im Stand der Technik nicht versucht oder vorgeschlagen worden.
Wie in dem begleitenden Beispiel 2 erörtert, ist die Heißelektroneneinfangtrennungsreaktion auf der Energieskala von dem, was "normale" ECD genannt wird (d. h. ECD unter Verwendung von Elektronen mit Energien niedriger als etwa 1 eV, wie oben erörtert), durch einen Bereich getrennt, der etwa 2–3 eV breit ist, in welchem Bereich wesentlich weniger Fragmentierung beobachtet wird.
Man beachte, dass die Überschussenergie bei HECD typischerweise in sekundären Fragmentierungsreaktionen dissipiert wird, wie z. B. Verlusten von ·H und größeren Radikalgruppen nahe der Position der primären Spaltung. Dies hat ein nützliches Merkmal der Bildung von Spezies d und w mit geradzahligen Elektronen aus Radikalfragmenten a· und z· durch einen Verlust aus der an die Radikalstelle angrenzenden Seitenkette. Für Isoleucin und Leucin sind die Verlustgruppen ·C₂H₅ bzw. ·C₄H₇, was es erlaubt, zwischen diesen isomeren Aminosäureresten zu unterscheiden. Dies wird mit der Ausbildung von Fragmenten w in Schema 1 dargestellt:
Schema 1
Die hierin verwendete Terminologie für Peptid-Fragmentierung ist diejenige eines konventionellen Gebrauchs (Schema 2).
Schema 2
Für Backbone-Spaltung ergibt Aufbrechen der C-N-Bindungs-Spaltung N-Ende- b und C-Ende- y -Produkte; N-C_α-Bindungs-Spaltung erzeugt N-Ende- c und C-Ende- z -Fragmente; C_α-C-Spaltung ergibt N-Ende- a und C-Ende- x -Fragmente. Die Gegenwart eines ungepaarten Elektrons ist als ein Radikalzeichen · gezeigt, der Verlust eines Wasserstoffatoms ist durch das Fehlen des Radikalzeichens gezeigt; die Gegenwart eines zusätzlichen Wasserstoffatoms verglichen mit homolytischer Spaltung ist durch gegeben.
Mit der vorliegenden Erfindung geeignet analysierte positive Ionen umfassen viele verschiedene Klassen von chemischen Spezies, die ionisiert werden können, um mehrfach geladene Ionen bereitzustellen, z. B. Polymere, Carbohydrate und Bipolymere, insbesondere Proteine und Peptide, beide einschließlich modifizierten Proteinen und Peptiden. Der Ausdruck Polypeptid wird hierin verwendet, um sowohl Proteine und Teile von Proteinen als auch kürzere (2 bis 10 Aminosäurereste) und längere Peptide wie z. B. zwischen 10 bis 100 Reste lang einzuschließen.
Es wird hierin postuliert, dass es im Gegensatz zu dem, das durch den Stand der Technik nahegelegt wird, nicht die Differenz der Translationsenergien zwischen Elektronen und Ionen ist, welche für wirksamen Elektroneneinfang kritisch ist, sondern vielmehr die Differenz der Geschwindigkeiten. Da Geschwindigkeit eine Funktion der Energie eines Teilchens geteilt durch seine Masse ist und die Massendifferenz zwischen Elektronen und Proben-Ionen mindestens 2000-fach ist, werden Elektronen mit niedriger Energie wie oben erwähnt für Proben-Ionen mit ziemlich variablen Energien bevorzugt.
Das Konzept der Elektroneneinfangtrennung ist zwar nicht per se neu, wie oben erörtert, der Stand der Technik kann aber keine Techniken bereitstellen, um dieses Ziel wirksam zu erreichen, insbesondere bei anderen Instrumentierungstypen als Ionen-Zyklotronresonanz-Massenspektrometern.
Die vorliegende Erfindung erreicht dieses Ziel unter Verwendung der Eigenschaft des Elektronenstrahls, positive Ionen anzuziehen und sie abzufangen. Intensive energiearme Elektronenstrahlen hat man vorher niemals verwendet, um sowohl Ionen abzufangen als auch Elektroneneinfang durch abgefangene Ionen und nachfolgende Elektroneneinfangtrennung durchzuführen, und so eine Verwendung wurde durch den Stand der Technik auch nicht nahegelegt.
Die Potentialvertiefung (Abfangpotential) V, erzeugt durch einen Elektronenstrahl, kann durch die folgende Gleichung (I) beschrieben werden: V[eV] = 15,5·Ie[mA]/{(Ee[eV])1/2·(a[mm])2} (I)worin I_e der Elektronenstrom ist und E_e die Elektronenenergie ist und a der Elektronenstrahldurchmesser ist (siehe Hendrickson, Hadjarab und Laude (1995) Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 141: 1161–170). Die Abfangbedingungen werden erfüllt, wenn die Potentialvertiefung größer als die kinetische Energie der Ionen ist. Insbesondere ist es wichtig, die kinetische Energie der Entweichbewegung der Ionen zu berücksichtigen, d. h. der Bewegung senkrecht zur Richtung des Elektronenstrahls.
Ist die mittlere kinetische Energie der Entweichbewegung der Ionen z. B. 1 eV, so ist ein Abfangpotential von mindestens 1 eV erwünscht: wenn die Elektronenenergie 1 eV ist und der Strahldurchmesser 1,6 mm² ist, ist ein Strom von 100 μA erforderlich. Dieser ist viel größer als der Strom von 0,3 bis 1 μA, der im Stand der Technik (siehe Zubarev (2000) ebenda) für die früheren ECD-Verfahren empfohlen wurde.
Der Gesamtbetrag N_q der Ionen, die innerhalb des Elektronenstrahls abgefangen werden können, kann durch Gleichung (II) berechnet werden: Nq = 3,33·103·Ie[μA]·L[cm]/(Ee[keV])1/2 (II)worin L die Länge des Abfangbereichs ist (siehe Beebe und Kostroun (1992) Rev. Sci. Instr. 63: 3399–3411). Für eine typische Quadrupol-Ionenfalle mit L = 2 mm erhält man eine maximale Zahl abgefangener Ionen von Nq = 2·10⁶. In einer Penning-Falle (ICR-Zelle) ist L typischerweise wesentlich länger, was mögliches Abfangen einer höheren Zahl von Ionen bereitstellt. Da sowohl Paul- als auch Penning-Ionenfallen normalerweise mehr als 10⁶ Ladungen enthalten, ist ein Elektronenstrahl mit Parametern wie oben im Stande, im Wesentlichen alle Ionen abzufangen.
Folglich hängt ausreichende Elektronendichte gemäß der Erfindung von der Abmessung des Abfangbereichs, der mittleren Energie der Elektronen, der Energie der abzufangenden Ionen und der Breite des Elektronenstrahls ab, kann aber etwa 50 μA/mm² oder höher sein, wie z. B. etwa 100 μA/mm² oder höher, wie z. B. im Bereich von etwa 100 μA/mm² bis 1 A/mm²; im Allgemeinen erfüllt aber eine Dichte von etwa 100 μA/mm² bis 1 mA/mm² die Kriterien der Erfindung. Solche Elektronendichten kann man typischerweise mit emittierten Elektronenströmen in der Größenordnung von etwa 50 μA bis etwa 5 mA erzielen, wie z. B. im Bereich von etwa 100 μA bis etwa 2 mA, wie z. B. etwa 100 μA bis 1 mA, oder etwa 100–500 μA.
In Ausführungsformen, in denen die Ionen, die mit den Elektronen reagieren sollen, als Strahl hindurchgehen, wie z. B. in einer Quadrupol-Ionenführung oder -Reaktionszelle, oder in einer ICR, wo Ionen radial entlang der Mittelachse eines Magnetfeldes eingeschränkt werden, ist es für wirksames Abfangen höchst vorteilhaft, dass der Elektronenstrahl im Wesentlichen axial zur Richtung des Ionenstrahls ist.
Wie oben erörtert, liefert das Elektronenstrahl-Abfangen von Ionen und Elektroneneinfang zwar häufig nutzbare Fragment-Spektren, in anderen vorteilhaften Ausführungsformen werden aber zusätzliche Fragmentierungseinrichtungen angewandt, um die Ionen zu trennen, die eingefangene Elektronen aufweisen. Diese Spezies zeigen dann typischerweise andere Fragmentierungsmuster als die entsprechenden "vor-ECD"-Ionen bei den jeweiligen Fragmentierungstechniken, und die so erhaltenen Spektren können zusätzliche Informationen verglichen mit Verwendung von nur ECD oder nur der zusätzlichen Fragmentierungstechniken bereitstellen. Die zusätzlichen Fragmentierungseinrichtungen sind z. B. Einrichtungen zur Erzeugung von kollisionsausgelöster Trennung, eine Quelle von elektromagnetischer Strahlung, insbesondere wie z. B. ein Infrarot-Laser, oder eine Quelle von Schwarzkörperstrahlung.
Der gemäß der Erfindung verwendete Elektronenstrahl ist entweder ein kontinuierlicher oder ein gepulster Elektronenstrahl, und dies kann von dem verwendeten Instrumenttyp und dem Zeitfenster abhängen, während dessen der Elektronenstrahl mit den entsprechenden Ionen wechselwirken kann.
In besonders nützlichen Ausführungsformen werden die Verfahren der Erfindung für Tandem-Massenspektroskopie angewandt, bei der positive Ionen mit gewünschtem Massen-Ladungsverhältnis vor Elektroneneinfang und Fragmentierung ausgewählt werden, oder alternativ nach dem Schritt des Elektroneneinfangs, aber vor Anwendung anderer Fragmentierungseinrichtungen, um Fragment-Ionen der ausgewählten Mutter-Ionen, die eingefangene Elektronen aufweisen, zu erhalten.
Wie sich aus der Beschreibung hierin ergibt, stellt die Erfindung nützliche Verfahren zum Erzielen von Massenspektren von Fragment-Ionen einer Probe bereit, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: Erzielen von Elektroneneinfangtrennung durch Proben-Ionen durch die hierin beschriebenen Verfahren; Detektieren des Massen-Ladungsverhältnisses der erhaltenen Fragment-Ionen mit einem Massenspektrometer-Detektor, um ein Massenspektrum der Fragment-Ionen zu erhalten. Alternativ erhält man die Fragmente durch Anwendung anderer Trennungseinrichtungen wie z. B. den oben erwähnten auf Ionen, die eingefangene Elektronen aufweisen, unter Verwendung der Verfahren der Erfindung.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Massenspektrometer bereitgestellt, das zur Realisierung der Verfahren der Erfindung geeignet ist. Ein Massenspektrometer gemäß der Erfindung für die Analyse von Proben umfasst eine Ionenquelle, um positiv geladene Ionen bereitzustellen; Einrichtungen, um zumindest einen Teil der positiv geladenen Ionen während mindestens einer Zeitspanne in einem räumlich begrenzten Bereich wie z. B. oben beschrieben anzuordnen; eine Elektronenquelle, welche Quelle einen Elektronenstrahl bereitstellt, der im wesentlichen so breit wie der räumlich begrenzte Bereich ist, wobei die Elektronendichte des Elektronenstrahls mindestens etwa 50 μA/mm² beträgt, wodurch eine hinreichende Größe bereitgestellt wird, so dass das anziehende Potential der Elektronen in dem Strahl größer oder gleich der mittleren kinetischen Energie der Bewegung der abgefangenen Ionen radial zu dem Strahl ist, und wobei zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie hat, die niedrig genug ist, ausgewählt aus dem Bereich von etwa 0–1,0 eV und dem Bereich von etwa 2–14 eV, um Elektroneneinfang durch zumindest einen Teil der abgefangenen Ionen bereitzustellen; einen Detektor zum Ermitteln des Massen-Ladungsverhältnisses von Proben-Ionen; Ausgabeeinrichtungen, um ein Massenspektrum der erkannten Proben-Ionen bereitzustellen.
Wie oben erwähnt, wird bevorzugt, dass das Massenspektrometer der Erfindung eine Elektronenquelle aufweist, die in den Ausführungsformen, in denen die Ionen als Strahl bereitgestellt werden oder entlang einer Mittelachse eingeschränkt werden, den Elektronenstrahl im wesentlichen axial zur Richtung des Ionenstrahls bereitstellt; oder – wie z. B. wenn die Ionen nicht im Wesentlichen axial entlang einer Mittelachse eingeschränkt werden – dass der Elektronenstrahl im wesent lichen axial zur Richtungseintrittstrajektorie in den räumlich begrenzten Bereich der positiven Ionen ist.
In bevorzugten Ausführungsformen weist das Massenspektrometer der Erfindung eine Elektrospray-Ionenquelle auf, da so eine Ionenquelle besonders wirkungsvoll positive mehrfach geladene Ionen für viele Typen von Proben-Ionen und -Molekülen und verschiedenen Probenlösungen bereitstellt. Gemäß der Erfindung kann man aber auch andere Ionenquellen verwenden, vorausgesetzt, dass positive Proben-Ionen mit einer Ionenladung von 2 oder höher bereitgestellt werden. Solche anderen Quellen umfassen matrixgestützte Laserdesorptionsionisations(MALDI), Thermospray-, Elektronenstoß- und schnelle Atombombardement(FAB)-Quellen.
Es ist zu würdigen, dass das Massenspektrometer der Erfindung irgendeiner der am häufigsten verwendeten Typen sein kann, vorausgesetzt sie weisen die notwendigen Merkmale für Ausführung der Verfahren der Erfindung auf. Diese umfassen ein Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotronresonanz(FT-ICR)-Massenspektrometer, Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer, Ionenfallen-Massenspektrometer, oder Hybrid-Instrumente wie z. B. Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer. Die tatsächliche Gestaltung und Dimensionierung des Bereichs, in dem die Ionen zumindest eine Zeitspanne lang angeordnet sind, um mit dem Elektronenstrahl zu wechselwirken, hängt von dem besonderen Typ des verwendeten Massenspektrometers ab. Besondere Ausführungsformen werden unten detaillierter erörtert. Der Bereich kann z. B. innerhalb einer Quadrupol-Ionenfalle, einer Penning-Falle eines ICR-Massenspektrometers oder eines Multipol-Ionenführung/Massenfilters liegen.
Wie oben erwähnt, kann es nützlich sein, ein Kraftfeld zu haben, das zur Anordnung der positiven Ionen innerhalb des räumlich begrenzten Bereichs beiträgt, wie z. B. ein Magnetfeld, ein elektrisches Feld, ein elektromagnetisches Feld oder irgendeine Kombination davon. Ein FT-ICR-Massenspektrometer besitzt immanent ein starkes Magnetfeld, welches in dieser Hinsicht vorteilhaft ist. Bei anderen Typen von Massenspektrometern, welche konventionell kein Magnetfeld in dem den räumlichen Bereich aufweisenden Raum verwenden würden, kann jedoch ein Magnetfeld zu dem Zweck vorgesehen werden, zu der Anordnung von Ionen in dem räumlich begrenzten Bereich gemäß der vorliegenden Erfindung beizutragen.
In einer besonders nützlichen Ausführungsform ist das Massenspektrometer der Erfindung ein Tandem-Massenspektrometer. So ein Tandem-Massenspektrometer weist geeignete Einrichtungen zum Auswählen von Ionen mit einem gewünschten Massen-Ladungsverhältnis für die Anordnung in dem räumlich begrenzten Bereich vor dem Elektroneneinfangschritt oder alternativ zum Auswählen von Ionen nach Elektroneneinfang für nachfolgende Fragmentierung auf.
Ausführungsbeispiele von dreien der oben erwähnten Massenspektrometer werden unten detaillierter beschrieben:
ECD in einem Ionen-Zyklotronresonanz-Massenspektrometer
In einer ersten besonderen Ausführungsform werden die Elektronen durch eine Vorratskathode in Kreisform erzeugt, die außerhalb der Zelle eines Ionen-Zyklotronresonanz-Massenspektrometers auf der Achse liegt. Der Kathodendurchmesser ist etwa 1,3 mm, und sie erzeugt einen Strom von bis zu 1 mA mit der Elektronenenergie von 1 eV. Der Elektronenstrahl deckt die Wolke der innerhalb der Zelle gespeicherten Ionen im Wesentlichen vollständig ab und fängt sie in der Radialrichtung ab. Im Zentrum der Zelle liegt die Elektronenenergie unterhalb 1 eV, was in wirksamem Elektroneneinfang durch die Ionen resultiert. Das Abfangpotential des Elektronenstrahls beträgt mindestens 0,5 V, was ausreicht, um die erzeugten Fragmente einzuschränken.
Eine besondere Ausführungsform des obigen Typs ist in 2 gezeigt, die eine Prinzipskizze einer rechtwinkligen Ionen-Zyklotronresonanzzelle darstellt, die aus sechs Metallelektroden besteht, von denen vier gezeigt sind. Die Zelle (10) ist zentral entlang des Magnetfeldes B eines supraleitenden Magneten mit einer typischerweise zwischen 3 und 9,4 Tesla liegenden Stärke angeordnet. Man beachte aber, dass die tatsächliche Form der Zelle und der Elektroden, aus denen sie zusammengesetzt ist, wie auch die tatsächliche Stärke des Magneten für die vorliegende Erfindung nicht wichtig sind. An die Abfangelektroden 11 und 13 wird ein Abfangpotential zwischen etwa 0,5 und 5 V angelegt. Für die Berechnungen der vorliegenden Ausführungsform wurde ein Potential von +1,8 V gewählt. Die anderen vier Elektroden der Zelle können ein Potential nahe null haben, wodurch ein Potentialminimum im Zentrum der Zelle auf der zum Magnetfeld parallelen Achse z erzeugt wird, wie durch das untere Diagramm gezeigt. Die Mutter-Ionen gelangen durch das Loch in der Abfangelektrode 11 in die Zelle und werden durch eine Kombination des magnetischen und elektrostatischen Feldes in der Zelle abgefangen. Nach mehrfachen Kollisionen mit einem Restgas (z. B. Stickstoff oder Argon, bereitgestellt durch ein Impulsventil) sammeln sich die Ionen in Form einer Wolke von etwa 0,2 bis 2 mm Durchmesser im Zentrum der Zelle. Das Abfangen in der Richtung x ist auf das Magnetfeld zurückzuführen und ist nicht dauerhaft, wegen des Vorhandenseins des Potentialmaximums des elektrostatischen Feldes in der Ebene senkrecht zum Magnetfeld, wie durch das Potentialdiagramm rechts gezeigt.
Gegenüber dem Austrittsloch in der Elektrode 13 und senkrecht zur Achse z ist eine Elektronenquelle 7 angeordnet, die einen Heizfaden 14 und die emittierende Oberfläche 15 aufweist. Die Oberfläche 15 mit einer Fläche im Bereich von etwa 1 bis 50 mm² kann vorzugsweise aus Wolfram bestehen und ist mit einem Material mit niedriger Austrittsarbeit bedeckt, wie z. B. vorzugsweise Bariumoxid. Der Heizfaden hat zwei Kontakte, an die positive U⁺ und negative U^– Potentiale angelegt werden, mit einer Potentialdifferenz zwischen etwa 3 bis 12 V, je nach dem gewünschten Elektronenstrom. Bei den Berechnungen der vorliegenden Ausführungsform wurde die Potentialdifferenz 6 V verwendet. Die Stärke des elektrischen Stroms durch den Heizfaden hängt vom Heizfadenwiderstand ab und kann zwischen etwa 0,3 und 5 A liegen. Die emittierende Oberfläche 15 ist elektrisch mit einem Potential U^– verbunden. Vor der emittierenden Oberfläche 15 liegt ein optionales flaches Gitter 16 aus nichtmagnetischem Metall wie z. B. Gold, Kupfer oder Edelstahl. An das Gitter 16 wird ein in Bezug auf die emittierende Oberfläche 15 positives Potential angelegt, um zur Elektronenemission aus der Oberfläche beizutragen. Die aus der Oberfläche 15 ausgestoßenen Elektronen werden durch das Gitter 16 beschleunigt und gelangen durch ein Loch der Elektrode 13, optional durch ein Gitter 17 auf der Elektrode 13, in die Zelle. Wie durch die Potentialdiagramme gezeigt, wird das Potential auf der Achse z in Gegenwart des Elektronenstrahls niedriger, wobei das Maximum in der Richtung x ein Minimum wird. Das Potential U^– auf der emittierenden Oberfläche 15 der Elektrode wird so gewählt, dass die Elektronenenergie im Zentrum der Zelle unter 1 eV liegt. Der Strom der Elektronen wird so gewählt, dass das Abfangen von positiven Ionen in der x-Richtung erzielt wird. In der vorliegenden Ausführungsform ist die berechnete Tiefe des Potentialtopfes 0,4 eV, wie auf dem Potentialdiagramm gezeigt. Die Kombination des Ionenabfangs und der niedrigen Energie der Elektronen gewährleistet wirksamen Elektroneneinfang durch die Mutter-Ionen und Einschränkung der Fragmente innerhalb des Elektronenstrahls. Aufgrund des geringen Querschnitts für Elektroneneinfang fängt die Mehrheit der Fragmente keine Elektronen ein und wird daher nicht neutralisiert. Nachdem der gewünschte Fragmentierungsgrad von Mutter-Ionen erzielt ist, z. B. nach einer Zeitspanne im Bereich von etwa 10 bis 1000 ms, wie z. B. etwa 20–100 ms, wird das Potential U^– positiver als das Potential an der Abfangplatte 13 eingestellt, was den Elektronenstrom durch die Zelle beendet. Die Fragment-Ionen können nun angeregt und durch konventionelle ICR-MS-Verfahren nachgewiesen werden.
Zu Erzeugung von Massenspektren höherer Ordnung wird Elektronenbestrahlung eines ausgewählten Fragment-Ions durchgeführt. Die Fragmente, die im zweiten Fragmentierungsschritt als Mutter-Ionen dienen, werden z. B. durch Elektroneneinfang oder durch Kollisions- oder Infrarottrennung aus Mutter-Molekül-Ionen erzeugt. Infrarottrennung wird bevorzugt, da sie schnell ist, keinen erhöhten Gasdruck in der Zelle erfordert und häufige Fragmente erzeugt. Die Infrarotphotonen (in der Figur mit hv bezeichnet) werden zweckmäßig durch einen außerhalb des Massenspektrometers installierten Laser erzeugt. Das optionale Loch 18 in der Elektronenquelle gewährleistet die Transmission des Infrarotstrahls in die Zelle entlang der Achse z. Dieses Loch hat geeignet etwa 1 bis 3 mm Durchmesser. Das Vorhandensein des Lochs macht den Boden des Potentialdiagramms in der x-Richtung flacher, zerstört aber nicht die Abfangeigenschaften des Elektronenstrahls. Der kleinere Betrag von Elektronen auf der Achse z kann durch einen intensiveren Elektronenstrahl oder längere Bestrahlungszeit der Mutter-Ionen durch Elektronen kompensiert werden.
ECD in einem Ionenfallen-Massenspektrometer
In einer zweiten Ausführungsform ist eine Vorratskathode ein wenig außeraxial gegenüber dem Eintrittsloch in dem Abfangbereich eines Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometers angeordnet. Während des kurzen Elektronenbestrahlungsereignisses wird die Amplitude der schwingenden Abfangspannung an den Becherelektroden auf etwa 3 V Spitze-zu-Spitze abgesenkt. Während des Teils des Schwingungszyklus, in dem die absolute Größe der Abfangspannung oberhalb von 1 V ist, wird der Elektronenstrahl durch diese Spannung abgelenkt. Die Ionen können die Zelle jedoch verlassen, da sie die Abfangspannung erfahren. Während des anderen Teils des Zyklus, in dem die absolute Größe der Abfangspannung unterhalb von 1 V ist, werden die Ionen in erster Linie durch den Elektronenstrahl abgefangen. Während dieser Zeit des Zyklus wird wirksamer Elektroneneinfang und wirksame Fragmentrückhaltung erzielt.
In 3, auf die Bezug genommen wird, ist eine Paul-Ionenfalle 20 gezeigt, bestehend aus der Ringelektrode 21 und den Becherelektroden 22 und 23 und außerdem der Elektronenquelle 7. Die Quelle 7 ist derjenigen in der obigen ersten Ausführungsform im Wesentlichen ähnlich und enthält das zentrale Loch, durch das die Mutter-Ionen in die Zelle 20 eintreten und wie üblich abgefangen werden. Der Unterschied in der Elektronenquellengestaltung verglichen mit der für ein ICR-MS beschriebenen Quelle ist, dass es statt des Gitters vor der emittierenden Oberfläche eine Elektrode 24 mit einem zentralen Loch gibt. Während des Ereignisses des Füllens der Falle mit Ionen ist das Potential an der Elektrode um 1 bis 10 V in Bezug auf das Potential an der emittierenden Oberfläche negativ, was verhindert, dass Elektronen von der Oberfläche desorbiert werden und die durch das Loch hindurchgehenden Ionen neutralisieren. In der gefüllten Zelle nehmen die abgefangenen Ionen ein zentrales Volumen von etwa 2 mm Durchmesser ein. Während des Fragmentierungsereignisses wird das Potential an der Elektrode 24 in Bezug auf das Potential an der emittierenden Oberfläche positiv, was in Emission eines Strahls von Elektronen entlang der Achse z der Zelle resultiert. Gleichzeitig wird die Amplitude der Abfang-Wechselspannung zwischen der Ringelektrode 21 und den Becherelektroden 22 und 23 auf etwa 1 bis 10 V Spitze-zu-Spitze vermindert. Die Ionen werden nun im Zentrum der Zelle eingeschränkt, teils durch den Elektronenstrahl und teils durch die Wechselspannung, am meisten jedoch durch den Elektronenstrahl. Nach etwa 10 bis 100 ms Elektronenbestrahlung wird der Elektronenstrahl beendet, indem das Potential an der Elektrode 24 etwa 1 bis 10 V negativ relativ zum Potential an der emittierenden Oberfläche gemacht wird. Die Fragment-Ionen werden aus der Paul-Zelle ausgestoßen und wie üblich durch den Detektor 8 nachgewiesen.
ECD in einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer
Eine dritte Ausführungsform, die ein Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer verwendet, ist in 1 dargestellt. Eine detailliertere Ansicht der Fragmentierungszelle 30 ist in 4 gezeigt, mit einer geraden Anzahl von Stäben 31 (z. B. Quadrupol, Hexapol oder Oktupol). Wie für Quadrupol-Ionenführungen als Massenfilter üblich, haben die Stäbe 31 kreisförmige oder hyperbolische Oberflächen, wobei jedes Paar einander gegenüberliegende Stäbe elektrisch miteinander verbunden sind. Eine Wechselspannung zwischen den Elektroden 31 wird mit einer Frequenz von etwa 0,5 bis 4 MHz, wie z. B. vorzugsweise etwa 1 MHz, angelegt, um Elektronentransmission durch die Vorrichtung 30 sicherzustellen. Die Amplitude der Wechselspannung ist im Allgemeinen etwa 1 bis 10 Spitze-zu-Spitze. Die Elektronenquelle 34 ist auf der Achse hinter der Zelle 30 installiert, mit der emittierenden Oberfläche zur Zelle weisend. In der Zelle 30 nimmt der Durchgangs-Ionenstrahl mit einer Translationsenergie von etwa 10 eV pro Einheits-Ionenladung ein zentrales Volumen von etwa 2 bis 6 mm Durchmesser ein. Das Potential an der Elektrode 32 ist um etwa 1 bis 10 V positiv relativ zum Potential an der emittierenden Oberfläche, was in Emission eines Strahls von Elektronen entlang der Achse z der Zelle resultiert, während dessen der Ionenstrahl teils durch den Elektronenstrahl und teils durch die Wechselspannung eingeschränkt wird, am meisten jedoch durch den Elektronenstrahl. Der Elektronenstrom und die Elektronenenergie werden so gewählt, dass während der Durchgangs-Zeitspanne, in der Ionen durch die Zelle hindurchgehen, welche typischerweise etwa 50 bis 100 μs ist, ein wesentlicher Bruchteil der Mutter-Ionen Elektronen einfangen. Die aus der Zelle austretenden Fragment-Ionen durchlaufen die Elektrode 32, das zentrale Loch in der Elektronenquelle 34 und die Fokussierelektrode 33, bevor sie in das Massenfilter (Massenfilter 5 von 1) eintreten.
BEISPIELE
Beispiel 1
Eine Prinzipskizze der für eine experimentelle Demonstration der vorliegenden Erfindung verwendeten instrumentellen Anordnung ist in 5 gezeigt. Die instrumentelle Konfiguration umfasst ein Ultima-Ionen-Zyklotronresonanz- Massenspektrometer (IonSpec, Irvine, Kalifornien, USA), das derart modifiziert wurde, dass die standardmäßige Heizfaden-basierte Elektronenquelle durch eine indirekt geheizte Vorratskathode mit einer emittierenden Oberfläche von 1,6 mm² ersetzt wurde. Die Kathode wurde erhalten von PO Horizont, Moskau, Russland. Die Betriebspotentiale waren U⁺ = +5 V, U^– = –1 V während des Elektronenbestrahlungsereignisses und U⁺ = +15 V, U^– = +9 V während aller anderen Ereignisse. Der Strom durch die Kathode ist in allen Fällen 0,6 A. Die emittierende Oberfläche ist elektrisch mit U^– verbunden. Vor der emittierenden Oberfläche ist ein zu 80 % transparentes Kupfergeflechtgitter installiert und mit U⁺ verbunden. Derselbe Typ von Gitter ist an der Abfangplatte der rechtwinkligen Ionen-Zyklotronresonanzzelle installiert. Der Abstand zwischen den zwei Gittern ist 3 mm, und der Abstand zwischen der emittierenden Oberfläche und dem ersten Gitter ist ebenfalls 3 mm. Das Potential an den Abfangplatten während der Elektronenbestrahlung ist +3 V. Der an diesem Gitter während des Bestrahlungsereignisses gemessene Elektronenstrom ist 1 mA. Die Zelle und die Elektronenquelle werden in das Feld eines supraleitenden Magneten mit 4,7 Tesla (Cryomagnetics, Oak Ridge, Tennessee, USA) gesetzt. Die primären Ionen werden durch eine Elektrospray-Ionenquelle erzeugt und durch eine Elektrospray-Trennfläche (Analytica of Branford, Boston, Massachusetts, USA) hindurch in das Massenspektrometer und dann durch eine 1,2 m lange Quadrupol-Ionenführung zur Zelle übertragen. Die in die Zelle geleiteten Mutter-Ionen werden darin abgefangen, indem das Potential an der Abhangplatte beeinflusst wird, wie beschrieben im Artikel von Senko, Hendrickson, Emmet, Shi und Marshall (1997), J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8: 970–976. Während des Elektronenstrahlereignisses werden die Ionen auch durch den Elektronenstrahl abgefangen.
Wie 6 zeigt, erhält man ein Elektroneneinfangtrennungsspektrum mit einer Elektronenbestrahlung, die nur 1 ms dauert, verglichen mit Strahlzeiten von 1–3 Sekunden, die man bei ECD-Verfahren nach dem Stand der Technik verwendet (Zubarev (2000), ebenda). Die meisten Bindungen zwischen den Aminosäureresten werden durch Elektroneneinfangtrennung aufgebrochen, die Fragmente a, c und z in der konventionell akzeptierten Notation erzeugte (siehe Roepstorff und Fohlman (1984), Biomed. Mass Spectrom. 11: 601). Diese drastische Verkürzung des Bestrahlungsereignisses erlaubt Einbeziehung von mehr Daten, was zu höherer Empfindlichkeit führt.
7 zeigt, dass es die vergrößerte Empfindlichkeit erlaubt, MS³ an Peptid-Mutter-Ionen durchzuführen. Der Einsatz (a) zeigt das Massenspektrum von Mutter-Ionen mit den Ladungszuständen von 2+ bis 4+. Vergrößern der Verweilzeit von Ionen in der Elektrospray-Trennfläche von 0,5 auf 3,5 Sekunden führt zu Trennung ihrer Peptid-Bindungen mit Erzeugung von Ionen b und y, wie im Einsatz (b) gezeigt. Die intensiven Fragment-Ionen b₁₃ ²⁺ wurden in der Zelle abgetrennt und 50 ms lang mit Elektronen bestrahlt, was im Spektrum (c) resultierte. Unterhalb des Spektrums in 7 zeigen zwei Aminosäuresequenzen das bei Elektroneneinfangtrennung von Molekül-Mutter-Ionen bzw. b₁₃ ²⁺-Ionen erhaltene Fragmentierungsmuster. Im letzteren Fall werden mehr Spaltungen erzielt, welche neue und ergänzende Strukturinformationen verglichen mit Spektren von Elektronenbestrahlung von Molekül-Ionen lieferten.
Beispiel 2
ECD mit "heißen" (3–13 eV) Elektronen – HECD
Das folgende Experiment veranschaulicht die Merkmale der oben beschriebenen HECD-Reaktion. Das Experiment wurde mit einem Fourier-Transformations-Massenspektrometer wie oben beschrieben durchgeführt. Elektrospray-erzeugte Dicationen des synthetischen Decapeptids SDREYPLLIR (SPR, Signalerkennungspartikel von Saccharomyces cerevisiae) wurden 250 ms lang mit 0–13 eV Elektronen bestrahlt. Im Querschnittsdiagramm für N-C_α-Bindungs-Spaltung werden zwei Maxima beobachtet, eines bei etwa 0 eV und ein anderes bei etwa 7 eV, mit voller Breite bei halbem Maximum gleich 1 eV bzw. 6 eV. Der erste Bereich der wirksamen N-C_α-Bindungs-Spaltung entspricht dem Regime "normale ECD', wie oben beschrieben. Das zweite Maximum postulieren wir als auf die neue Reaktion der Heißelektroneneinfangtrennung (HECD) zurückzuführen. Dass die beobachteten N-C_α-Bindungs-Spaltungen tatsächlich Elektroneneinfang einbezogen, wird durch die Beobachtung gestützt, dass noch längere (400 ms) Bestrahlung von Monocationen nur N-C-Spaltung (Fragmente b und y), aber keine N-C_α-Spaltungen erzeugte (wir glauben, dass diese Fragmente b und y' sowie ähnliche Fragmente in HECD-Massenspektren von Dicationen von Nichteinfang-EIEIO-Prozessen ausgehen).
Die Erweiterung des normalen ECD-Bereichs auf die negativen Energiewerte und seine 0,2 eV übersteigende Breite sind beide auf die Spreizung der kinetischen Energie der von einer heißen Oberfläche emittierten Elektronen zurückzuführen.
Die statistische Korrelation zwischen den relativen Häufigkeiten von N-C_α-Spaltungs-Fragmenten bei der Elektronenenergie entsprechend den zwei Maxima war 0,70, was anzeigt, dass der Bindungs-Spaltungs-Mechanismus wahrscheinlich derselbe oder ähnlich ist. Der Elektronenstrom durch die FTMS-Zelle war 70 pA im Falle von normalem ECD und 7,8 μA für HECD, was einen 100-mal größeren Querschnitt für den ersten Prozess ergibt.
Zweite Fragmentierung: Außer der oben erörterten N-C_α-Bindungs-Spaltung ergab HECD andere Fragmentierung, wobei viel mehr Bindungen gespalten werden als bei normalem ECD (vgl. 10). Einige der häufigsten Fragmente sind auf sekundäre Fragmentierung zurückzuführen. Dies kann man aufgrund der Überschussenergie bei HECD erwarten, welche gleich der kinetischen Energie der Elektronen vor Einfang ist. Die Dissipationskanäle für die Überschussenergie umfassen Verlust von H und größeren Radikalgruppen nahe der Position der primären Spaltung, wie oben erörtert.

Claims

Verfahren zum Erzielen eines Elektroneneinfangs durch positive Ionen für die Verwendung in der Massenspektrometrie, welches die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen von positiven Ionen, die zumindest eine Zeitspanne lang in einem räumlich begrenzten Bereich angeordnet sind; Bereitstellen eines Elektronenstrahls, der im wesentlichen so breit wie dieser Bereich ist, wobei der Strahl eine Elektronendichte mit ausreichender Grösse hat, so dass die durch die Elektronen erzeugte Potentialvertiefung grösser oder gleich der kinetischen Energie der zu dem Strahl radialen Bewegung eines wesentlichen Teils der Ionen ist, um dadurch diesen Anteil von Ionen abzufangen; dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie hat, die niedrig genug ist, um durch mindestens einen Teil der abgefangenen Ionen einen Elektroneneinfang bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Teil der Ionen, die eingefangene Elektronen haben, zerfällt, um Fragment-Ionen zu liefern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Kraftfeld, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die ein Magnetfeld, ein elektrisches Feld, ein elektromagnetisches Feld oder jede Kombination daraus enthält, verwendet wird, um dazu beizutragen, die positiven Ionen in dem räumlich begrenzten Bereich anzuordnen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Elektronenstrahl im wesentlichen axial zur Richtung eines Strahls oder einer Eintrittstrajektorie in den räumlich begrenzten Bereich der positiven Ionen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Elektronenstrahl ein gepulster Elektronenstrahl ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei zusätzliche Fragmentierungseinrichtungen angewendet werden, um Ionen mit eingefangenen Elektronen zu trennen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die zusätzlichen Fragmentierungseinrichtungen eine durch Kollision ausgelöste Trennung von Ionen mit eingefangenen Elektronen bereitstellen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die zusätzlichen Fragmentierungseinrichtungen eine Quelle elektromagnetischer Strahlung, einschliesslich Infrarotstrahlung, aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor dem Elektroneneinfangsschritt die positiven Ionen mit gewünschtem Massen-Ladungsverhältnis ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei zumindest ein Teil der nach Massen-Ladungsverhältnis ausgewählten Ionen mit eingefangenen Elektronen zerfallen, um Fragment-Ionen der ausgewählten Ionen bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die positiven Ionen mehrfach geladene Ionen sind, die durch Elektronenspray-Ionisation bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die positiven Ionen mehrfach geladene Polypeptid-Ionen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie im Bereich von etwa 0 bis etwa 1,0 eV hat, um einen Elektroneneinfang durch mindestens einen Teil der Ionen bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie von weniger als etwa 0,5 eV hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie im Bereich von etwa 2–24 eV hat, um einen Elektroneneinfang durch mindestens einen Teil der Ionen bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie im Bereich von etwa 6–12 eV hat.
Verfahren zum Erzielen eines Massenspektrums von Fragment-Ionen einer Probe, das die folgenden Schritte aufweist: Erzielen einer Trennung von Probenionen mittels Elektroneneinfang durch das Verfahren von Anspruch 2; Ermitteln des Massen-Ladungsverhältnisses erzielter Fragment-Ionen mit einem massenspektrometrischen Detektor, um ein Massenspektrum der Fragment-Ionen zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Probenionen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Polypeptid-Ionen, Kohlenhydrat-Ionen und organischen Polymer-Ionen besteht.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Probenionen Polypeptid-Ionen aufweisen.
Massenspektrometer (1) für die Analyse von Proben, das aufweist: eine Ionenquelle (2), um positiv geladene Ionen bereitzustellen; Einrichtungen (10, 20, 30), um zumindest einen Teil der positiv geladenen Ionen während mindestens einer Zeitspanne in einem räumlich begrenzten Bereich anzuordnen; eine Elektronenquelle (7), wobei diese Quelle einen Elektronenstrahl bereitstellt, der im wesentlichen so breit wie der räumlich begrenzte Bereich ist, und eine Elektronendichte von mindestens etwa 50 .μ.A/mm² hat, wodurch eine hinreichende Grösse bereitgestellt wird, so dass das anziehende Potential der Elektronen in dem Strahl grösser oder gleich der mittleren kinetischen Energie der Bewegung der abgefangenen Ionen radial zu dem Strah ist; einen Detektor (8) zum Ermitteln des Massen-Ladungsverhältnisses von Probenionen; und eine Ausgabeeinrichtung, um ein Massenspektrum der erkannten Probenionen bereitzustellen, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teil des Elektronenstrahls eine Energie hat, die aus dem Bereich von etwa 0–1,0 eV und dem Bereich von etwa 2–14 eV ausgewählt ist, um den Elektroneneinfang durch zumindest einen Teil der abgefangenen Ionen bereitzustellen.
Massenspektrometer nach Anspruch 20, wobei der Elektronenstrahl im wesentlichen axial zur Richtung eines Strahls oder einer Eintrittstrajektorie in den räumlich begrenzten Bereich der positiven Ionen ist.
Massenspektrometer nach Anspruch 20, wobei die Ionenquelle eine Elektronenspray-Ionenquelle ist, die mehrfach geladenen Ionen bereitstellt.
Massenspektrometer nach Anspruch 20, wobei die Einrichtungen zum Anordnen von zumindest einem Teil der positiv geladenen Ionen eine Ionenfalle innerhalb eines Fourier-Transformations-Massenspektrometers aufweisen.
Massenspektrometer nach Anspruch 20, wobei die Einrichtungen zum Anordnen von zumindest einem Teil der positiv geladenen Ionen eine Quadrupol-Ionenfalle aufweisen.
Massenspektrometer nach Anspruch 20, wobei die Einrichtungen zum Anordnen von zumindest einem Teil der positiv geladenen Ionen eine Multipol-Ionenführung aufweisen.
Massenspektrometer nach Anspruch 20, das Einrichtungen zum Auswählen von Ionen mit einem gewünschten Massen-Ladungsverhältnis für die Anordnung in dem räumlich begrenzten Bereich vor dem Elektroneneinfangschritt aufweist.
Massenspektrometer nach Anspruch 20, wobei der Detektor zum Ermitteln des Massen-Ladungsverhältnisses von Probenionen aus der Gruppe ausgewählt wird, die umfasst: eine Quadrupol-Ionenfalle, ein Quadrupol-Massenspektrometer; ein Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotronresonanz-Massenspektrometer, ein Flugzeit-Massenspektrometer und ein Magnetsektor-Massenspektrometer.