DE10058706C1 - Ionenfragmentierung durch Elektroneneinfang in Hochfrequenz-Ionenfallen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren für die Fragmentierung von großen Molekülen, vorzugsweise Biomolekülen, durch Elektroneneinfang in Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometern nach Wolfgang Paul. Das Ionenfallenmassenspektrometer besteht aus einer Ringelektrode einerseits und zwei Endkappenelektroden andererseits, zwischen denen zum Speichern von Ionen eine Hochfrequenzspannung aufgespannt wird. Durch Öffnungen in der Ring- oder Endkappenelektrode können Elektronen in das Ionenfallenmassenspektrometer eingeschossen werden. Die Fragmentierung durch Elektroneneinfang ist von Fourier-Transform-Massenspektrometern her bekannt. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, die Elektronen als Strahl durch eine Öffnung in der die Hochfrequenzspannung führenden Ionenfallen-Elektrode einzuschießen, wobei sich die Elektronenquelle auf dem höchsten positiven Potential befindet, das vom Zentrum der Ionenfalle während der Hochfrequenzperiode erreicht wird. Nur während einiger weniger Nanosekunden können Elektronen die hier gespeicherten Ionen erreichen; ihre Energie ist dabei sehr gering. Zu allen anderen Zeiten sperrt das Fallenpotential das Eindringen der Elektronen in die Ionenwolke, da deren lokales Potential immer negativer ist als das der Elektronenquelle und daher die negativen Elektronen zurückweist.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren für die Fragmentierung von großen Molekülen, vorzugswei­ se Biomolekülen, durch Elektroneneinfang in Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallenmassen­ spektrometern nach Wolfgang Paul. Das Ionenfallenmassenspektrometer besteht aus einer Ringelektrode einerseits und zwei Endkappenelektroden andererseits, zwischen denen zum Speichern von Ionen eine Hochfrequenzspannung aufgespannt wird. Durch Öfnnungen in der Ring- oder Endkappenelektrode können Elektronen in das Ionenfallenmassenspektrometer eingeschossen werden. Die Fragmentierung durch Elektroneneinfang ist von Fourier- Transform-Massenspektrometern her bekannt.

Die Erfindung besteht darin, die Elektronen als Strahl durch eine Öffnung in der die Hochfre­ quenzspannung führenden Ionenfallen-Elektrode einzuschießen, wobei sich die Elektronen­ quelle auf dem höchsten positiven Potential befindet, das vom Zentrum der Ionenfalle wäh­ rend der Hochfrequenzperiode erreicht wird. Nur während einiger weniger Nanosekunden können Elektronen die hier gespeicherten Ionen erreichen; ihre Energie ist dabei sehr gering. Zu allen anderen Zeiten sperrt das Fallenpotential das Eindringen der Elektronen in die Ionenwolke, da deren lokales Potential immer negativer ist als das der Elektronenquelle und daher die negativen Elektronen zurückweist.

Ionenfallen nach Paul bestehen aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, wobei in der Regel die Ringelektrode mit der Speicherhochfrequenzspannung versorgt wird, es sind jedoch auch andere Betriebsarten möglich. Im Inneren der Ionenfalle können Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld gespeichert werden. Die Ionenfallen können als Mas­ senspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv ausgewor­ fen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen werden. Es sind mehrere verschie­ dene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll.

Die Hochfrequenzspannung an der Ringelektrode ist sehr hoch, sie beträgt bei handelsübli­ chen Ionenfallenmassenspektrometern zwischen 15 und 30 Kilovolt (Spitze-Spitze). Die Frequenz beträgt etwa ein Megahertz. Im Inneren wird ein hauptsächlich quadrupolares Feld aufgespannt, das mit der Hochfrequenzspannung schwingt und die Ionen oberhalb einer Schwellenmasse zum Zentrum treibt, wodurch diese Ionen so genannte sekulare Oszillationen in diesem Feld ausführen. Die rücktreibenden Kräfte in der Ionenfalle werden manchmal durch ein so genanntes Pseudopotential beschrieben, das über eine zeitliche Mittelung der Kräfte des realen Potentials bestimmt wird. Im Zentrum befindet sich ein Sattelpunkt des oszillierenden realen Potentials, dieses fällt, je nach Phase der Hochfrequenzspannung, vom Sattelpunkt zur Ringelektrode hin quadratisch ab und steigt vom Sattelpunkt aus zu den Endkappenelektroden hin quadratisch an (oder umgekehrt).

Ionenfallenmassenspektrometer haben Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen interessant macht. So können insbesondere ausgewählte Ionensorten (sogenannte "Elternionen") in der Ionenfalle isoliert und fragmentiert werden. Die Spektren dieser Frag­ mentionen werden "Fragmentionenspektren" oder auch "Tochterionenspektren" der betreffen­ den Elternionen genannt. Es können auch "Enkelionenspektren" als Fragmentionenspektren ausgewählter Tochterionen gemessen werden. Die Ionen werden bislang vorwiegend durch eine Vielzahl von Stößen mit einem Stoßgas fragmentiert, wobei die Oszillationen der zu fragmentierenden Ionen durch ein Dipolwechselfeld so angeregt werden, dass die Ionen in den Stößen Energie aufsammeln können, die schließlich zum Zerfall der Ionen führt.

Die Ionen können im Innneren erzeugt, aber auch von außen eingeführt werden. Ein Stoßgas in der Ionenfalle sorgt dafür, dass die ursprünglich vorhandenen Bewegungsschwingungen (Oszillationen) der Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld abgebremst werden; die Ionen versammeln sich dann als kleine Wolke im Zentrum der Ionenfalle. Der Durchmesser der Wolke beträgt in üblichen Ionenfallen etwa ein Millimeter; er bestimmt sich durch ein Gleichgewicht zwischen der zentrierenden Wirkung des Hochfrequenzfeldes (der rücktreiben­ den Kraft des Pseudopotentials) und den abstoßenden Coulombschen Kräften zwischen den Ionen. Die inneren Abmessungen der Ionenfallen sind meist durch einen Abstand von etwa 14 Millimeter der Endkappen voneinander charakterisiert, der Ringdurchmesser beträgt etwa 14 bis 20 Millimeter.

Bei Ionenfallenmassenspektrometern ist auch der Einschuss von Elektronen bekannt, aller­ dings wird er nach dem Stand der Technik für die Ionisierung von Substanzmolekülen im Inneren der Ionenfalle, also nicht für einen fragmentierenden Elektroneneinfang, benutzt. Im grundlegenden Patent DE-PS 9 44 900 von W. Paul und H. Steinwedel (US 2,939,952) werden die Elektronen durch eine Endkappe eingeschossen, eine heute noch gängige Praxis, aber aus der Offenlegungsschrift DE-OS 16 98 216 von P. H. Dawson und N. R. Whetten ist auch der Ein­ schuss durch eine Ringelektrode bekannt.

Eine gängige Art der Ionisierung großer Biomoleküle ist die Elektrosprüh-Methode (ESI = electro spray ionization), die Ionen bei Atmosphärendruck außerhalb des Massenspektrome­ ters ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlaßsysteme bekannter Art in das Vakuum des Massenspektrometers und von dort in die Ionenfalle eingebracht.

Diese Ionisierung erzeugt praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind im wesentlichen die des Moleküls. Wohl aber treten bei Elektrosprühen gehäuft vielfach geladene Ionen der Moleküle auf. Durch das Fehlen fast jeder Fragmention während des Ionisierungsprozesses beschränkt sich die Information aus dem Massenspektrum auf das Molekulargewicht; es fehlen Informationen über interne Molekularstrukturen, die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt werden können. Diese Informationen können erst über die Aufnahme von Fragmentionenspektren erhalten werden.

Aus der Ionencyclotronresonanz- oder Fourier-Transform-Massenspektrometrie ist in jüngster Zeit ein Verfahren zur Fragmentierung von Biomolekülen, hauptsächlich von Peptiden und Proteinen bekannt geworden, z. B. J. Axelson et al. "Electron Capture Dissociation of Substance P Using a Commercially Available Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer" Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 474-477 (1999). Es besteht darin, Elektronen von den Ionen einfangen zu lassen, wobei die dabei freiwerdende Ionisierungs­ energie zum Bruch der in der Regel kettenförmigen Moleküle führt. Das Verfahren wird ECD genannt (electron capture dissociation). Waren die Moleküle doppelt geladen, so bleibt eines der beiden entstehenden Fragmente als Ion zurück. Die Fragmentierung folgt dabei sehr einfachen Regeln. Es gibt im Wesentlichen nur C-Brüche und ganz wenige Y- Brüche zwischen den Aminosäuren eines Peptids, so dass aus dem Fragmentierungsmuster sehr einfach auf den Aufbau des Moleküls geschlossen werden kann. Insbesondere wird die Sequenz von Peptiden oder Proteinen in einfacher Weise aus dem Fragmentierungsspektrum sichtbar. Die Interpretation dieser ECD-Fragmentspektren ist einfacher als die Interpretation von stoßerzeugten Fragmentspektren.

Es ist auch möglich, einfach oder dreifach geladene Ionen in dieser Weise zu fragmentieren, doch zeigt die Methode ihren Glanz besonders an den zweifach geladenen Ionen. Wird eine Elektrosprüh-Ionisierung auf Peptide angewandt, so sind die zweifach geladenen Ionen in der Regel auch die häufigsten Ionen. Elektrosprüh-Ionisierung ist eine Methode der Ionisierung, die für Biomoleküle zum Zwecke der massenspektrometrischen Untersuchung in Ionenfallen besonders häufig verwendet wird.

Für eine Fragmentierung durch Elektroneneinfang muss die kinetische Energie der Elektronen sehr gering sein, da sonst kein Einfang stattfinden kann. In der Praxis bietet man Elektronen mit einer Energie an, die nur wenig über der thermischen Energie der Elektronen liegt. Das geht in den sehr starken Magnetfeldern der Fourier-Transfom-Massenspektrometer sehr gut, da die Elektronen einfach längs der magnetischen Feldlinien driften, bis sie die Wolke der Ionen erreichen.

In elektrischen Hochfrequenz-Ionenfallen nach Paul geht das jedoch nicht. Ionenfallen besit­ zen in der Regel Perforationen in den Endkappen, durch die die Ionen eintreten und austreten können. Im Falle innerer Ionisierung wird auch die ionisierende Strahlung durch diese End­ kappenperforation eingeführt. In der Regel verwendet man dazu einen Elektronenstrahl. Das stark schwingende Hochfrequenzfeld im Inneren der Ionenfalle beschleunigt entweder die Elektronen so, dass sie durch das Fallenvolumen mit erheblicher Energie hindurchsausen, oder es werden die Elektronen bereits am Eingangsloch zurückgewiesen. Für den Elektroneneinfang sind diese Elektronen wenig geeignet. Nur für eine außerordentlich kurze Zeit, für nur Bruchteile von Nanosekunden im Nulldurchgang der Hochspannung, herrscht kein Feld und niederenergetische Elektronen können niederenergetisch die Ionenwolke erreichen. Diesen wenigen niederenergetischen Elektronen stehen jedoch außerordentlich viel mehr Elektronen gegenüber, die auf erhebliche Energien beschleunigt sind; die Fragmentierung durch hoch­ energetischen Elektronenstoß überlagert die Fragmentierung durch Elektroneneinfang um ein Vielfaches und macht so die Fragmentionenspektren unbrauchbar.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, Elektronen in eine Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle so einzuführen, dass sie in genügender Anzahl eine im Zentrum der Ionenfalle gespeicherte Wolke von Ionen mit sehr niedriger kinetischer Energie erreichen, ohne dass höherenergeti­ sche Elektronen die Ionenwolke erreichen können.

Das Verfahren der Erfindung schießt die Elektronen in seiner einfachsten Ausführungsform nicht durch eine der Endkappenperforationen, sondern durch eine zusätzlich angebrachte Öffnung in der Ringelektrode in die Ionenfalle ein, wobei sich die Elektronenquelle auf einem so hohen positiven Potential befindet, dass es vom oszillierenden Potential des Zentrums der Ionenfalle nur kurz, nur für wenige Nanosekunden im Maximum der Hochfrequenzspannung, erreicht oder überschritten wird. Nur in diesen wenigen Nanosekunden erreichen die Elektro­ nen die Ionenwolke, aber auf sehr geringe Reste ihrer kinetischen Energie abgebremst, also ideal für den Elektroneneinfang. Zu allen anderen Zeiten können die Elektronen das Zentrum der Ionenfalle überhaupt nicht erreichen, weil das Potential des Zentrums negativer ist als das Potential der Elektronenquelle und die immer negativ geladenen Elektronen zurückweist.

Das Abbremsen der Ionen findet dabei auf dem Weg von der Ringelektrode zum Zentrum statt, wobei die Elektronen das sattelförmige Potentialgebirge erklimmen müssen (siehe Abb. 1 und 2). Die Ionenwolke befindet sich Sattelpunkt. Das Sattelpotential fokus­ siert dabei die Elektronen auf die Ionenwolke, seitliche abweichende Elektronen werden wieder auf den richtigen Pfad in der Sattelrinne zurückgetrieben.

Die Fragmentierung in der Ionenfalle findet gewöhnlich bei einer Hochfrequenzspannung statt, die etwa ein Zehntel bis ein Fünftel der für die Spektrenaufnahme gebrauchten maxima­ len Spannung beträgt. Für eine Fragmentierung wird dabei eine Hochfrequenzspannung von beispielsweise etwa 3 Kilovolt (Spitze zu Spitze) eingestellt, die am Ring im Potentialbereich von -1,5 bis +1,5 Kilovolt gegen Masse sinusförmig schwingt. Die Endkappenelektroden werden auf Massepotential gehalten. Das Zentrum der Ionenfalle folgt der Ringspannung mit etwa der halben Ringelektrodenspannung, wenn der innere Radius der Ringelektroden das 1,4-fache des Abstandes zwischen den Endkappenelektroden beträgt, also von etwa -750 bis +750 Volt. Befindet sich nun die Elektronenquelle auf einem Gleichspannungspotential von +750 Volt, so können die Elektronen das Zentrum nur dann erreichen, wenn sich die Ring­ spannung im Spannungsmaximum bei +1,5 Kilovolt und das Zentrum demgemäß auf +750 Volt befindet. Die Elektronen werden dabei außerhalb der Ionenfalle vom Potential der Elektronenquelle (+750 V) auf das Potential der Ringelektrode beschleunigt (+1,5 kV), erhalten also eine Energie von 750 Elektronenvolt. Im Inneren der Ionenfalle wird die kineti­ sche Energie von 750 Elektronenvolt wieder auf praktisch null Elektronenvolt abgebremst, da sich das Zentrum auf dem Potential von +750 Volt befindet. Zu allen anderen Zeiten befindet das Zentrum auf einem negativerem Potential, die negativen Elektronen werden zurückgewie­ sen.

Für eine Ionenfalle, bei der Endkappenabstand und Ringelektrodenradius etwa gleich groß sind, folgt das Potential des Zentrums dem Potential der Ringelektrode mit etwa 2/3 des Wertes.

Die Bedingungen für den Zugang niederenergetischer Elektronen herrscht nur für kurze Zeit im Maximum der Hochfrequenzspannung. Die Zeit beträgt nur etwa 1% der Schwingungspe­ riode, also etwa zehn Nanosekunden. Es lassen sich mit einer Elektronenquelle sehr leicht Elekt­ ronenströme von etwa 100 Mikroampère erreichen, das sind etwa 6 . 10⁶ Elektronen in zehn Nanosekunden. In der Ionenwolke dürfen sich für ein gutes Spektrum nur etwa 10⁴ Ionen befinden, da es sonst zu einer Verschlechterung des Massenauflösungsvermögens durch die Einwirkung der Raumladung kommt. Selbst wenn man zur Kompensation der Fragmentie­ rungsausbeuteverluste eine hundertmal größere Anzahl von Ionen speichert, ist die Anzahl der Elektronen bereits in einer einzigen Hochfrequenzperiode schon vielfach über der Anzahl der Ionen. Da die Zulieferung von Elektronen aber über 1000 oder mehr Hochfrequenzperioden anhalten darf, kann leicht ein genügend hohes Angebot an Elektronen erzeugt werden.

Es kann das Verfahren auch mit Einschuss der Elektronen durch eine Öffnung in einer der Endkappen ausgeführt werden. Dann sind aber (unüblich) die Endkappen gleichphasig mit der Hochfrequenzspannung zu versorgen, und die Ringelektrode ist auf Massepotential zu halten.

Abb. 1 zeigt den symbolischen Potentialverlauf (1, 2, 3, 4) vom Ort der Elektronen­ quelle (1) bis zum Ort der Ionenwolke (4) zur Zeit des Spannungsmaximums der Hochfre­ quenzperiode. Die Positionen (5) und (6) zeigen die Ringelektrode an, im Bereich (7) ist die Ionenwolke angesiedelt. Die Elektronen (9) rollen zunächst den Potentialabhang (2) zwischen Elektronenquellenpotential (1) und der Ringelektrode (5) hinab und werden dann an der aufsteigenden Potentialpiste (3) zum Potential (4) der Ionenwolke hin abgebremst. Dieser Potentialverlauf herrscht nur in den wenigen Nanosekunden des maximalen Potentials der Hochspannungsperiode. Der Potentialverlauf (8) zeigt einen Verlauf in einer anderen Phase der Hochfrequenzperiode. Die Richtung zu positiven Potentialen zeigt nach unten, zu negati­ ven Potentialen nach oben, um das Abrollen der Elektronen (9) deutlicher zu machen.

Abb. 2 zeigt den Potentialsattel in einer Ionenfalle in einer festen Phase der Hochfre­ quenz. Im Punkte (11) werden die Elektronen eingeschossen. Der Potentialanstiegspfad (3) in der Potentialrinne führt die Elektronen (9) zur Ionenwolke (10), die genau im Sattelpunkt (10) gespeichert ist.

Abb. 3 stellt eine Ionenfalle mit einer zusätzlichen Elektronenquelle dar. Die Ionenfalle besteht aus Ringelektrode (20) und aus den beiden Endkappenelektroden (21) und (22), die je ein Eintritts- und ein Austrittsloch (23) bzw. (24) für die Ionen besitzen. Im Zentrum der Ionenfalle befindet sich die Ionenwolke (25). Die Ringelektrode ist für den Eintritt des Elek­ tronenstrahls durchbohrt, die Elektronen treten durch die Eintrittsöffnung (26) in das Innere der Inenfalle ein. Die Elektronenquelle besteht aus einem Glühdraht mit Halter (27) und einigen Linsenblenden (28), die den Elektronenstrahl in seiner Stärke zu regeln gestatten und den Elektronenstrahl ein- und abschalten können. Zwischen den Linsenblenden und der Ringelektrode ändert sich der Potentialunterschied mit der Periode der Speicherhochfrequenz an der Ringelektrode (20). Der Potentialunterschied bewirkt im Zwischenraum (29) eine Fokussierung oder Defokussierung des Elektronenstrahls. Dieser Effekt kann ausgenutzt werden, um nur im Spannungsmaximum der Ringelektrode eine Fokussierung des Elektro­ nenstrahls durch die Öffnung (26) hindurch zu erhalten, in allen anderen Zeit ist der Elektro­ nenstrahl defokussiert und es treten nur wenige Elektronen in die Ionenfalle ein.

Eine beste Ausführungsform ist in Abb. 3 wiedergegeben. Es wird eine Elektrosprüh- Ionenquelle außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung von Biomolekülen verwen­ det. Es werde hier angenommen, dass eine Mischung von Verdaupeptiden eines größeren Proteins untersucht werden soll. Die Ionen werden in üblicher Weise durch eine Kapillare und anschließende Druckstufen mit Ionenleitvorrichtungen in die Ionenfalle geführt und dort eingefangen. Ein erstes Massenspektrum gibt eine Übersicht über die Verdaupeptide. Sollen jetzt ein oder mehrere Peptide auf ihre Sequenz aus Aminosäuren hin untersucht werden, so isoliert man mit üblichen Mitteln die doppelt geladenen Ionen dieses Peptids; das heißt, man wirft alle Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht doppelt geladene Ionen dieses Peptids sind. Die doppelte Ladung erkennt man am Abstand der Isotopenlinien voneinander, die für doppelt geladene Ionen genau ½ atomare Masseneinheit beträgt.

Diese doppelt geladenen Ionen werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas in das Zentrum der Falle hinein abgebremst. Sie bilden dort eine kleine Wolke von etwa einem Millimeter Durchmesser.

Die Ringelektrode der Ionenfalle ist mit zwei gegenüberliegenden Löchern von etwa je zwei Millimeter Durchmesser versehen. Vor einem der Löcher ist ein Elektronenemitter mit Elek­ troden für den Elektronenabzug und die Elektronenstrahlfokussierung angebracht. Dieser Elektronenemitter befindet sich auf dem Potential, den der Sattelpunkt des Fallenpotentials zum Zeitpunkt seines positiven Maximums annimmt.

Wird der Elektronenabzug eingeschaltet, so wird ein Elektronenstrahl auf die Eingangsöff­ nung in der Ringelektrode gebildet. Dieser Elektronenstrahl wird von der Ringelektrode so lange zurückgetrieben, wie das Hochfrequenzpotential der Ringelektrode negativer ist als das Potential des Elektronenemitters. Wird das Potential der Ringelektrode im Verlaufe der Hochfrequenzperiode positiver, so werden die Elektronen zunehmend auf die Ringelektrode zu beschleunigt. Sie treten dann in die Ionenfalle ein und sehen hier einen entgegenstehenden, abbremsenden Potentialverlauf, den sie nicht voll ersteigen können. Sie werden also wieder reflektiert. Erst im Maximum des Potentials der Hochfrequenzperiode können die Elektronen bis zum Sattelpunkt vordringen. Bei der Ankunft in der Ionenwolke sind sie praktisch auf die kinetische Energie null abgebremst. Sie können jetzt zunächst vom Raumladungspotential der Ionenwolke und in dieser dann von einzelnen Ionen eingefangen werden.

Da sich die Spannung hier im Maximum der Amplitude befindet, ist die Bewegung der Ionen durch die eingeprägten elektrischen Kräfte in seinem Minimum. Auch diese minimale Bewe­ gung der Ionen hilft für den Elektroneneinfang.

Beim Einfangen der Elektronen durch ein Ion wird die Ladungsstufe des Ions herabgestuft. Eine Ionisierungsstelle des Ions wird neutralisiert. Aus dem zweifach geladenen Ion wird ein einfach geladenes Ion. Dabei wird die Ionisierungsenergie frei. (Genauer: bei den Ionen handelt es sich ganz überwiegend um protonierte Biomoleküle. Es wird also die Anlagerungs­ energie des Protons frei). Die freiwerdende Energie wird im Ion absorbiert und führt zu einem sehr genau definierten Bruch zwischen zwei Aminosäuren. Andere Ionen der gleichen Art erleben einen Bruch zwischen jeweils zwei anderen Aminosäuren. Statistisch gesehen entsteht ein Gemisch aus Fragmentionen, die in ihrer Länge die ganze Kette der Aminosäuren wider­ spiegeln, oder zumindest einen Teil dieser Kette.

Der Elektronenstrahl wird abgestellt, sobald eine genügende Fragmentierung eingetreten ist. Die Fragmentionen werden jetzt (nach einer kurzen Beruhigungspause) in üblicher Weise als Massenspektrum aufgenommen. Die Interpretation dieses Massenspektrums ergibt die Se­ quenz oder zumindest eine Teilsequenz der Aminosäuren in diesem Peptid.

Dieses Verfahren kann dann für andere Peptide aus dem Gemisch wiederholt werden. Es ergibt sich so eine sehr sichere Identifizierung des Eiweißes. Es können sogar Unterschiede des untersuchten Eiweißes zu solchen aus Proteinsequenzdatenbanken festgestellt werden.

Dieses Verfahren erfordert natürlich zuerst eine Einjustierung der günstigsten Potentiale des Ionenemitters für jede Einstellung der Hochfrequenzspannung. Es wird hierfür experimentell eine Kalibrierkurve erstellt. Auch für die Elektronenstromstärke und für die Zeitdauer der Einwirkung des Elektronenstrahls werden die optimalen Daten experimentell ermittelt.

Das der Eintrittsöffnung für die Elektronen gegenüberliegende Loch hat den Sinn, während der Potentialeinstellung des Elektronenemitters über den Potentialsattel hinausschießende Elektronen aus der Ionenfalle hinauszuführen, um keine Einbrennstellen zu bekommen.

Natürlich werden in der Ionenfalle während des Eindringens der Elektronen durch Elektro­ nenstoß auch Ionen des Stoßgases erzeugt. Meist wird Helium als Stoßgas benutzt, es können aber auch andere, leichte Gase verwendet werden. Die Masse der Ionen dieser Gase liegen regelmäßig unterhalb der Speicherschwelle der Ionenfalle, die Ionen verlassen die Ionenfalle innerhalb sehr weniger Hochfrequenzzyklen.

Das Verfahren benötigt eine Ionenfalle mit Öffnungen in der Ringelektrode, einen Elektro­ nenemitter mit einstellbarem Elektronenemissionsstrom und einstellbarer Dauer für den Elektronenstrahl, und eine einstellbare Spannungsversorgung für das Emitterpotential. Als Emitter kann eine einfache Glühkathode dienen. Stromstärke und Strahldauer kann über ein Potential an einem einfachen Wehnelt-Zylinder eingestellt werden. Der Elektronenstrom braucht nicht übermäßig groß zu sein. Da die Hochfrequenzspannung für eine handelsübliche Ionenfalle im Bereich von 10 bis 30 Kilovolt liegt, sollte das Emitterpotential etwa im Bereich von 100 bis 1000 Volt einstellbar sein.

Die Bedingungen für den Zugang niederenergetischer Elektronen zur Ionenwolke herrschen nur für die kurze Zeit des Maximums der Hochfrequenzspannung. Die Zeit beträgt nur etwa 1% der Schwingungsperiode, also etwa zehn Nanosekunden. Es lassen sich selbst mit einer sehr einfachen Elektronenquelle leicht Elektronenströme von etwa 100 Mikroampère errei­ chen, das sind etwa 6 . 10⁶ Elektronen in zehn Nanosekunden. In der Ionenwolke dürfen sich für ein gutes Spektrum nur etwa 10⁴ Ionen befinden, da es sonst zu einer Verschlechterung des Massenauflösungsvermögens durch die Einwirkung der Raumladung kommt.

Bei der Fragmentierung durch Elektroneneinfang an doppelt geladenen Ionen lässt es sich nicht vermeiden, dass auch eine Anzahl von bereits gebildeten, einfach geladenen Fragmenti­ onen durch einen weiteren Elektroneneinfang vernichtet werden. Glücklicherweise ist jedoch so, dass die Einfangsquerschnitte für doppelt geladene Ionen etwa viermal höher sind als die für einfach geladene Ionen. Es lässt sich damit ein guter Kompromiss finden zwischen restli­ chen doppelt geladenen Elternionen, einfach geladenen Fragmentionen und durch vollständige Entladung vernichteten Ionen. Es ist aber notwendig, mit einer wesentlich höheren Anzahl von Ionen zu beginnen, als für das schlussendlich aufgenommene Fragmentionenspektrum gebraucht werden. Diese Betrachtung muss bei der Einspeicherung der Ionen und bei ihrer Isolierung berücksichtigt werden.

Selbst wenn man zur Kompensation der Fragmentierungsausbeuteverluste eine hundertmal größere Anzahl von Ionen speichern muss, liegt die Anzahl der Elektronen bereits in einer einzigen Hochfrequenzperiode schon vielfach über der Anzahl der gespeicherten Ionen. Da die Zulieferung von Elektronen aber über 1000 oder mehr Hochfrequenzperioden (eine Millisekunde oder länger) angehalten werden kann, ist es einfach, ein genügend hohes Ange­ bot an Elektronen zu erzeugen.

Der Elektroneneinschuss kann auch - wie üblich - durch die Endkappenelektroden erfolgen. Dann muss aber die Ringelektrode geerdet sein; die Speicherhochfrequenzspannung muss dann gleichphasig an den beiden Endkappen anliegen. Das Potential des Fallenzentrums folgt dann dem Endkappenpotential in etwa mit einem Abschwächungsfaktor von 3/5.

Es lassen sich durch den Fachmann auch noch kompliziertere Potentialversorgungen ausden­ ken, die den gleichen Effekt haben, die Ionenwolke im Zentrum nur mit nullenergetischen Elektronen zu versorgen, beispielsweise dadurch, dass das Potential des Elektronenemitters auch auf einer Hochfrequenzspannung liegt. Alle diese Lösungen sind jedoch aufwendiger als die oben vorgeschlagene Lösung des Problems.

Claims (2)

1. Verfahren zur Fragmentierung von Ionen durch den Einfang niederenergetischer Elektro­ nen in einem Hochfrequenz-Ionenfallenmassenspektrometer, das aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden besteht, bei dem
das Ionenfallenmassenspektrometer durch eine Hochfrequenzspannung an der Ring­ elektrode mit den Endkappenelektroden auf Massepotential oder durch eine Hochfre­ quenzspannung an beiden Endkappenelektroden mit der Ringelektrode auf Massepotenti­ al betrieben wird,
die Elektronen durch eine Öffnung in der mit der Hochfrequenzspannung beaufschlag­ ten Ringelektrode oder durch eine Öffnung in einer der mit der Hochfrequenz beauf­ schlagten Endkappenelektroden in das Ionenfallenmassenspektrometer eingeschossen werden, wenn die Hochfrequenzspannung ihr positives Maximum durchläuft, und
die Elektronen auf einem Gleichspannungspotential erzeugt werden, das mit geringen Abweichungen mit dem maximalen positiven Potential im Zentrum des Ionenfallenmas­ senspektrometers übereinstimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenstrahl durch das Potential der mit der Hochfrequenzspannung beaufschlagten Elektrode so beinflusst wird, dass er nur im Maximum des Potentials in das Ionenfallenmassenspektrometer hinein fo­ kussiert wird.