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Die Erfindung betrifft eine Reaktionszelle für Reaktionen zwischen verschiedenartigen Ionensorten und ein zugehöriges Massenspektrometer zur Analyse der ionischen Produkte.
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Die Erfindung besteht in einem durch Hochfrequenz betriebenen durchgängigen Ionenleitsystem mit einem seitlichen Eingang, insbesondere geeignet für Reaktionen zwischen positiven und negativen Ionensorten, wobei eine Ionensorte durch den seitlichen Eingang zugeführt wird. Besonders günstig ist ein durchgängiges Ionenleitsystem aus einer Schar von koaxialen Lochblenden mit einem leichten axialen Potentialgefälle. Die Reaktionen können unter anderem für eine Fragmentierung von mehrfach geladenen Protein- oder Peptidionen durch Elektronenübertragung oder für die Beseitigung überschüssiger Ladungen vielfach geladener Biopolymerionen verwendet werden.
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Stand der Technik
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Aus der Ionenzyklotronresonanz- oder Fourier-Transform-Massenspektrometrie (ICR-MS oder FTMS) sind in jüngster Zeit neue Verfahren zur Fragmentierung von Biopolymermolekülen, hauptsächlich von Peptiden und Proteinen, bekannt geworden. Sie bestehen darin, mehrfach geladene Ionen mit Elektronen reagieren zu lassen, wobei es zum Bruch der kettenförmigen Moleküle kommt. Wird von mehrfach durch Protonierung positiv geladenen Ionen ausgegangen, so führt die dabei frei werdende Energie der Protonenneutralisierung zu einem Bruch der Kettenmoleküle genau an der Stelle, an der das Proton lokalisiert war. Das Verfahren wird Elektronen-Einfang-Dissoziierung genannt, abgekürzt ECD (electron capture dissociation). Waren die Moleküle doppelt geladen, so bleibt eines der beiden entstehenden Fragmente als Ion zurück. Die Fragmentierung insbesondere von Proteinen und Peptiden folgt dabei sehr einfachen Regeln (für Fachleute: es gibt vorwiegend c-Brüche, die zu relativ hohen Ionensignalen führen, und nur wenige a- und z-Brüche zwischen den Aminosäuren eines Peptids), so dass aus dem Fragmentionenspektrum relativ einfach auf die Aminosäuresequenz geschlossen werden kann. Die Interpretation dieser ECD-Fragmentspektren ist bedeutend einfacher als die Interpretation von stoßerzeugten Fragmentspektren (CID = collision induced dissociation).
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Für eine Fragmentierung durch Elektroneneinfang muss die kinetische Energie der Elektronen gering sein, da sonst kein Einfang stattfinden kann. In der Praxis bietet man Elektronen mit einer Energie von nur wenigen Elektronenvolt an. Dieses Vorgehen ist in den sehr starken Magnetfeldern der Fourier-Transform-Massenspektrometer sehr einfach, da die Elektronen von einer flächigen Glühkathode aus mit nur sehr geringer Beschleunigung einfach längs der magnetischen Feldlinien driften, bis sie die Wolke der Ionen erreichen. Eine zweite Art des Elektroneneinfangs gelingt mit Elektronen einer kinetischen Energie von etwa 10 bis 30 Elektronenvolt, diese wird als „hot electron capture dissociation” bezeichnet, abgekürzt „hot ECD”. Sie führt zu sehr ähnlicher Fragmentierung.
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Es ist auch möglich, dreifach oder mehrfach positiv geladene Ionen in dieser Weise zu fragmentieren, doch zeigt die Methode ihren Glanz besonders an den zweifach geladenen Ionen. Wird eine Elektrosprüh-Ionisierung auf Peptide angewandt, so sind die zweifach geladenen Ionen in der Regel auch die häufigsten Ionen. Elektrosprüh-Ionisierung ist eine Methode der Ionisierung, die für Biomoleküle zum Zwecke der massenspektrometrischen Untersuchung in Fourier-Transform-Massenspektrometern (FTMS) besonders häufig verwendet wird.
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Nach neuesten Erkenntnissen findet eine zur ECD ähnliche Fragmentierung statt, wenn mehrfach positiv geladene Ionen von Biopolymeren mit negativ geladenen Ionen geringer Elektronenaffinität reagieren, z. B. mit negativen Ionen von Fluoranthen. Insbesondere sind negative Radikalkationen günstig. Die Fragmentierung durch Elektronentransfer gleicht weitgehend der Fragmentierung durch Elektroneneinfang. Die Elektronen-Transfer-Dissoziation wird mit ETD abgekürzt.
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Reaktionen zwischen vielfach positiv geladenen Ionen und negativ geladenen Ionen können bei vielfach positiv geladenen Ionen auch zur weitgehenden Ladungsentfernung verwendet werden. Dazu werden negative Ionen mit hoher Elektronenaffinität eingesetzt, die keine Fragmentionen erzeugen. Es ist damit möglich, vielfach geladene Protein-Ionengemische mit breiter Ladungsverteilung durch „charge stripping” in ein Gemisch zu überführen, das praktisch nur noch aus einfach geladenen Ionen besteht. Dieses Gemisch aus einfach geladenen Ionen lässt sich in einfachen Massenspektrometern ohne den Zwang zu einer komplizierten Ladungsentfaltung („charge deconvolution”) des erhaltenen Massenspektrums sehr einfach analysieren.
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Als Multipol-Stabsysteme ausgeführte Ionenleitsysteme werden normalerweise mit einer zweiphasigen Hochfrequenzspannung betrieben, wobei die zwei Phasen reihum abwechselnd an die Polstäbe gelegt werden. Die Hochfrequenzspannung an den Stäben des Stabsystems ist in der Regel nicht sehr hoch, sie beträgt bei handelsüblichen Ionenleitsystemen nur einige Hundert Volt bei einer Frequenz von einigen Megahertz. Im Inneren wird ein multipolares Feld aufgespannt, das mit der Hochfrequenzspannung schwingt und die Ionen oberhalb einer Schwellenmasse zur zentralen Achse treibt, wodurch die Ionen so genannte sekulare Oszillationen in diesem Feld ausführen. Die rücktreibenden Kräfte in der Ionenfalle werden manchmal durch ein so genanntes Pseudopotential beschrieben, das über eine zeitliche Mitteleng der Kräfte des realen Potentials bestimmt wird. In der zentralen Achse befindet sich ein Sattelpunkt des oszillierenden realen Potentials, dieses fällt, je nach Phase der Hochfrequenzspannung, vom Sattelpunkt zu Stabelektroden der einen Phase hin ab und steigt zu den anderen Stabelektroden hin an. Der Sattelpunkt selbst befindet sich normalerweise auf einem Gleichspannungspotential.
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Diese Ionenleitsysteme können für den Transport der Ionen, aber insbesondere auch als Stoßzellen zur Fragmentierung der Ionen oder als Kühlungszellen zur Dämpfung der Oszillationen der Ionen eingesetzt werden. In der Regel sind sie mit Stoß- oder Bremsgas beschickt; die Ionen sammeln sich dann nach Verlust eines Teils ihrer kinetischen Energie unter der Wirkung des Pseudopotentials in der Achse des Ionenleitsystems.
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Es sind auch Ionenleitsysteme bekannt geworden, die längs der Achse einen schwachen Gleichspannungsabfall besitzen und so die Ionen zu einem Ende des Ionenleitsystems vorantreiben; darunter insbesondere Ionenleitsysteme, die nicht als Multipol-Stabsystem aufgebaut sind. Ionenleitsysteme können auch aus Drahtpaaren bestehen, die in Form einer Doppelhelix oder Vierfachhelix gewendelt sind, wobei die Drahtpaare mit Hochfrequenzspannungen belegt sind. Gleichspannungsabfälle an den Drahtpaaren führen zu einem Gleichspannungsabfall in der Achse des Systems und damit zu einem Vortrieb der Ionen. Es können Ionenleitsysteme auch aus einer Vielzahl koaxial angeordneter Lochblenden bestehen, abwechselnd an die beiden Phasen einer Hochfrequenzspannung angeschlossen. Auch hier lässt sich ein Gleichspannungsabfall längs der Achse erzeugen, wie schon in der Offenlegungsschrift
DE 195 23 859 A1 und dem äquivalenten
US-Patent 5,572,035 A beschrieben wurde.
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Eine gängige Art der Ionisierung großer Biomoleküle ist das Elektrosprühen (ESI = electro spray ionization), das die Biomoleküle aus Lösungen heraus bei Atmosphärendruck außerhalb des Massenspektrometers ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlasssysteme bekannter Art in das Vakuum des Massenspektrometers eingebracht. Diese Ionisierung erzeugt praktisch keine Fragmentionen, sondern im wesentlichen nur Ionen der unfragmentierten Moleküle, die durch Anlagerung eines oder mehrerer Protonen an das Molekül entstehen. Da die Masse dieser Ionen wegen der angelagerten Protonen nicht mehr der Masse der Moleküle entspricht, werden sie häufig als „Quasi-Molekülionen” bezeichnet. Es treten bei Elektrosprühen gehäuft durch mehrfache Protonierung mehrfach geladene Ionen der Moleküle auf, abhängig von der Größe der Ionen. Bei Peptiden im Bereich von 800 bis 3000 Dalton herrschen die zweifach protonierten Ionen vor; bei größeren Molekülen überwiegen Ionen mit drei und mehr Protonen. Durch das Fehlen fast jeder Fragmentierung während des Ionisierungsprozesses beschränkt sich die Information aus dem Massenspektrum auf das Molekulargewicht; es fehlen Informationen über interne Molekülstrukturen, die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt werden können. Diese Informationen können erst über die Aufnahme von Fragmentionenspektren (Tochterionenspektren) erhalten werden.
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Für die Analyse der Ionen, insbesondere für die Analyse der ionischen Reaktionsprodukte aus positiven und negativen Ionen, eignen sich durchaus verschiedenartige Massenanalysatoren. Als herausragend haben sich allerdings Flugzeitmassenanalysatoren mit orthogonalem Ioneneinschuss erwiesen.
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Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (abgekürzt OTOF) zeichnen sich durch eine hohe Präzision der Massenbestimmung und durch einen hohen Nutzgrad der angebotenen Ionen aus. Sie arbeiten mit einem kontinuierlichen Ionenstrahl und nehmen in der Regel 10 000 bis 20 000 Spektren pro Sekunde auf, die in Echtzeit zu Summenspektren addiert werden können. Addiert man nur 1000 Spektren über eine zwanzigstel Sekunde, so kann das Massenspektrometer mit 20 Summenspektren pro Sekunde auch schnellsten chromatographischen oder elektrophoretischen Separationsvorgängen folgen, wie sie für Chip-basierte Separatoren zu erwarten sind. Addiert man länger, so erhöht man die Messdynamik. Diese Art von Massenspektrometer bietet bei mäßigen Herstellungskosten eine außerordentlich hohe Flexibilität in der Anwendung, die von keinem anderen Massenspektrometer bisher erreicht wird.
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Werden diese Flugzeitmassenspektrometer als Tandem-Massenspektrometer für die Aufnahme von Tochterionenspektren eingerichtet, so wird bisher die Fragmentierung selektierter Elternionen zu Tochterionen durch Stöße in gasbefüllten Stoßzellen vorgenommen. Die Auswahl der Elternionen geschieht gewöhnlich durch vorgeschaltete Quadrupol-Massenfilter; als Stoßzellen zum Fragmentieren dienen Hochfrequenz-Ionenleitsysteme. Die durch Stöße erhaltenen Fragmentionen werden dann in den Flugzeitmassenanalysator eingeschossen und als Tochterionenspektrum gemessen.
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Die Druckschrift
GB 2 392 005 A offenbart ein Massenspektrometer mit einer Hochfrequenz-Ionenführung, die eine Mehrzahl an Plattenelektroden mit einer oberen und einer unteren Plattenelektrode aufweist, welche in der Ebene des Ionenflusses angeordnet sind. In den Plattenelektroden sind ein oder mehrere Kanäle zur Ionenführung vorhanden, die gekrümmt sein können.
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Die Druckschrift
EP 1 339 088 A2 beschreibt ein Massenspektrometersystem mit einer Analytionenquelle, einer weiteren Ionenquelle zur Erzeugung von Ionen einer Polarität, die umgekehrt zu derjenigen der Analytionen ist, einem Ablenker zum Ablenken und gemeinsamen Einführen der Ionen in ein Ionenfallen-Massenspektrometer, das eine Ringelektrode und ein Paar Endkappenelektroden aufweist, und einem Ionendetektor, wobei die verschiedenen Ionensorten in dem Ionenfallen-Massenspektrometer vermischt werden.
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Die Druckschrift
WO 00/63949 A1 betrifft ein Verfahren zur Überführung von Ionen aus einer Hochdruckregion in eine Niedrigdruckregion. Ionen werden bei hohem Druck gebildet und dann von einem voneinander beabstandeten Paar von Zylinderelektroden, in denen niedriger Druck herrscht und an die eine asymmetrische Hochfrequenzspannung und eine Kompensationsgleichspannung derart angelegt werden, dass eine ausgewählte Ionensorte einer stabilen Trajektorie folgt, in eine Niedrigdruckregion geführt.
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Die Druckschrift
GB 2 362 259 A offenbart eine Massenanalysevorrichtung mit einer Vielzahl von Kammern, die Ionenquellen und ein Massenspektrometer aufweisen. Die Kammern mit den Ionenquellen sind mit der Kammer des Massenspektrometers durch eine Zwischenkammer gekoppelt, die einen elektrostatischen Ablenker in Form zweier paralleler Elektroden oder eines Quadrupols enthält. Der Ablenker leitet selektiv Ionen jeweils einer Ionenquelle in die Kammer mit dem Massenspektrometer ein.
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Die Druckschrift
US 2003/0052269 A1 beschreibt eine Transferkapillare und Schnittstelle, mit denen Proben eines multiplen Fluidstroms einem Einzelmassenanalysator zugeführt werden. Die Transferkapillare hat zwei oder mehr Kanäle und liegt zwischen einer Kammer, in der Ionen erzeugt werden, und einer Kammer, die mit dem Massenanalysator in Fluidkommunikation steht. Die Schnittstelle beinhaltet Ionisierer für die Fluidströme, die ionisierte Proben zu den Kanälen der Transferkapillare führen. Die Transferkapillare enthält einen Multiplex-Selektor, der die Ionen durch ausgewählte Kanäle strömen lässt und sequentiell die Auswahl der Kanäle, durch die die Ionen strömen sollen, verändert.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist die Aufgabe der Erfindung, Reaktionszellen bereitzustellen, mit denen die Reaktionsprodukte aus Reaktionen von Analytionen und Reaktantionen erzeugt, als auch Massenspektrometer bereitzustellen, mit denen die Reaktionsprodukte analysiert werden können. Insbesondere sollen Fragmentionen aus Elektronenübertragungsreaktionen und Gemische einfach geladener Ionen nach Ladungsverminderung gemessen werden können.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung stellt eine Reaktionszelle für Reaktionen zwischen Analytionen und Reaktantionen bereit, wobei die Reaktionszelle aus einem durchgängigen Hochfrequenz-Ionenleitsystem für den Durchgang einer Ionensorte mit einem seitlichen Eingangssystem für die Zufuhr der anderen Ionensorte besteht, wobei das seitliche Eingangssystem bevorzugt ebenfalls als Hochfrequenz-Ionenleitsystem ausgebildet ist.
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Für diese Reaktionszelle können sowohl das durchgängige Hochfrequenz-Ionenleitsystem wie auch das seitliche Eingangssystem als Multipol-Stabsysteme ausgebildet sein, wie es beispielsweise in für ein durchgängiges Oktopol-Stabsystem mit seitlich einmündendem Hexapol-Stabsystem gezeigt ist. In ist ein Quadrupol-Stabsystem gezeigt, in das ein zweites Quadrupol-Stabsystem unter 45° einmündet.
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Besonders günstig ist das in gezeigte System, in dem das durchgängige lineare Hochfrequenz-Ionenleitsystem aus koaxialen Lochblenden (21) besteht und das seitliche Eingangssystem (22) als Hexapol-Stabsystem ausgebildet ist. Das Hexapol-Stabsystem des seitlichen Eingangs greift kontaktierend in Einschnitte der Lochblenden hinein und verwendet deren HF-Potentiale. Da sich in einem solchen System aus einzelnen Lochblenden sehr leicht ein schwaches Potentialgefälle längs der Achse einrichten lässt, strömen die in Richtung 23 eingebrachten positiven Ionen den negativen Ionen, die über das Hexapol-Stabsystem eingebracht werden, entgegen. Dabei können die koaxialen Lochblenden alle den gleichen Innendurchmesser besitzen, wie es in Ionenleitsystemen oder Stoßzellen der Fall ist; die koaxialen Lochblenden können aber auch einen konischen oder trompetenförmigen Verlauf der Innendurchmesser aufweisen, wie es bei Ionentrichtern („ion funnel”) der Fall ist. Solche Ionentrichter werden bekanntlich häufig im Eingangsbereich eines Massenspektrometers verwendet, um das mit extern erzeugten Ionen in das Vakuumsystem des Massenspektrometers einströmende Umgebungsgas weitgehend zu entfernen.
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Es kann sich bei dem durchgängigen Ionenleitsystem aber auch um eine mit Hochfrequenzspannung beaufschlagte Doppelhelix handeln, in die ein Quadrupol- oder Hexapol-Stabsystem einmündet, wie in
dargestellt. Auch für die Doppelhelix, wie schon für die Ringsysteme, lässt sich längs der Achse des jeweiligen Systems ein Gleichspannungsabfall herstellen, wie schon in
US 5 572 035 A beschrieben. Mit diesem Gleichspannungsabfall strömen auch hier positive und negative Ionen einander entgegen.
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Für die Reaktionen in Ionenleitsystemen mit schwachem Potentialgradienten in der Achse wirkt ein Bremsgas besonders günstig, da es sowohl die positiven wie negativen Ionen in der Achse des durchgängigen Ionenleitsystems sammelt und für ein langsames Strömen der Ionen in Gegenrichtung sorgt. Es wird die Reaktionswahrscheinlichkeit erhöht, weil günstige Bedingungen für Reaktionen zwischen positiven und negativen Ionen gegeben sind.
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Die Erfindung umfasst aber auch ein Massenspektrometer für die Aufnahme von Reaktionsprodukten aus Reaktionen von unterschiedlich geladenen Analytionen und Reaktantionen, wobei das Massenspektrometer mindestens folgende Teile enthalten muss: (a) eine Ionenquelle zur Erzeugung der Analytionen, (b) eine Ionenquelle zur Erzeugung der Reaktantionen, (c) eine erfindungsgemäße Reaktionszelle mit Seiteneingang für die Reaktantionen und (c) einen Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem Ioneneinschuss zur Aufnahme der Massenspektren der Reaktionsprodukte. Ein solches Massenspektrometer ist schematisch in gezeigt.
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Die Reaktantionen werden günstig in einer Zelle für chemische Ionisierung (9) hergestellt. Diese Zellen arbeiten gewöhnlich bei einem Druck von etwa 1–5 × 102 Pascal. Ein solcher Druck herrscht normalerweise im Eingangsbereich des Massenspektrometers nach der Einlasskapillare (6) für extern erzeugte Ionen, so dass hier, wie in sichtbar, ein günstiger Ort für eine solche Ionenquelle (9) ist. Mit chemischer Ionisierung können sowohl positive wie auch negative Ionen gebildet werden. Negative Reaktantionen können aus einer Substanz, die durch eine Kapillare (10) zugeführt wird, mit Hilfe von Elektronen aus einer Glühkathode über eine Reihe von Zwischenschritten erzeugt werden.
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Ein alternative Art für die Erzeugung negativer Ionen ist eine Ionisierung über Elektroneneinfang. Besonders einfach kann der Elektroneneinfang in einer geeigneten Zelle durch einen Schwarm von Elektronen erzeugt werden, die ihrerseits durch einen Alpha-Strahler in einem Stoßgas wie beispielsweise Stickstoff generiert werden. Eine solche Ionenquelle mit Alpha-Strahler (32) ist in dargestellt.
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Die Zuführung der Reaktantionen in die Reaktionszelle sollte an- und abschaltbar sein, beispielsweise durch ein Blendensystem (34), um Spektren mit und ohne Reaktionen aufnehmen zu können.
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Die Erzeugung der Analytionen, meist positive Ionen, wird am besten durch eine Elektrosprüh-Ionenquelle vorgenommen. Die Analytsubstanz zur Erzeugung der Analytionen wird dabei für gewöhnlich der Sprühflüssigkeit in der Sprühkapillare (1) zugesetzt; es können die Analytsubstanzen aber auch dem Sprühnebel (2) durch Laserablation aus festen Proben einer Probenträgerplatte (3) zugeführt werden.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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zeigt eine Reaktionszelle nach dieser Erfindung, die als Oktopol-Stabsystem mit einem seitlich einmündenden Hexapol-Stabsystem ausgebildet ist.
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stellt ein Ionenleitsystem aus parallelen Ringblenden (21) mit gleich bleibenden Innendurchmessern als Reaktionszelle dar, mit einem seitlich einmündendem Hexapol-Stabsystem (22), das hier nur stirnseitig sichtbar ist. Das Hexapol-Stabsystem (22) ist so mit einigen Ringblenden (21) des Ionenleitsystems verbunden, dass die Hochfrequenzspannung für das Ringblendensystem auch das Hexapol-Stabsystem speist. Das Ringblendensystem kann außerdem einen Gleichspannungsabfall längs der Achse besitzen.
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zeigt in Aufsicht ein zuführendes Quadrupol-Stabsystem, das in ein durchgängiges Quadrupol-Stabsystem unter einem Winkel seitlich einmündet.
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In mündet ein Hexapol-Stabsystem in ein Ionenleitsystem, das aus einer Doppelhelix aus Drahtpaaren besteht. Das Hexapol-Stabsystem ist nur stirnseitig sichtbar. Auch hier wird das Hexapol-Stabsystem durch die zweiphasige Hochfrequenzspannung an der Doppelhelix betrieben.
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zeigt schematisch ein Massenspektrometer nach dieser Erfindung, wobei die im Sprühkegel (2) erzeugten Ionen zusammen mit Umgebungsgas durch die Kapillare (6) in einen Ionentrichter (7) aus koaxialen Ringblenden eingeführt werden. Dem trompetenförmigen Ionentrichter (7) werden über ein Hexapol-Stabsystem (8) Reaktantionen aus einer Ionenquelle (9) für chemische Ionisierung zugeführt; der trompetenförmige Ionentrichter (7) dient hier auch als Reaktionszelle. Der trompetenförmige Ionentrichter (7) kann einen schwachen Gleichspannungsabfall längs seiner Achse besitzen (hier nicht gezeigt), der die positiven Ionen zum engen Ende driften lässt, gleichzeitig driften die negativen Ionen zum weiten Ende hin.
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zeigt schematisch die Erzeugung negativer Reaktantionen in einer Ionenquelle (9) und ihre Einführung in den trompetenförmigen Ionentrichter (7) durch ein Hexapol-Stabsystem (8) im Detail. Die negativen Reaktantionen werden durch den Einfang von Elektronen (33) erzeugt, die als starker Schwarm durch einen Alpha-Strahler (32) generiert werden.
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Günstige Ausführungsformen
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Für die Reaktionszelle gibt es mehrere günstige Ausführungsformen. Besonders günstig sind solche Reaktionszellen, in denen die negativen und positiven Ionen, durch ein Bremsgas in der Achse versammelt, einander in einem engen Kanal entgegenströmen. Das kann durch ein schwaches axiales Gleichspannungsgefälle in einem mit Bremsgas gefüllten Ionenleitsystem erreicht werden. Zu den Ionenleitsystemen, in denen sich leicht ein axiales Gleichspannungsgefälle einrichten lässt, gehören Ionenleitsysteme aus doppelhelixförmig gewendelten Drahtpaaren, und besonders Ionenleitsysteme aus einer Schar von koaxial angeordneten Lochblenden, an denen abwechselnd die beiden Phasen der Hochfrequenzspannung anliegen. Bei den doppelhelixförmig gewendelten Drahtpaaren lässt sich leicht ein Spannungsabfall längs der Drähte erreichen, insbesondere, wenn Widerstandsmaterial für die Drähte verwendet wird. Bei den koaxial angeordneten Lochblenden lässt sich eine Beschaltung mit Widerständen und Kondensatoren so organisieren, dass neben der Hochfrequenzbeschaltung auch ein Gleichspannungsgefälle entsteht.
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Ein günstiger Betrieb besteht darin, positive Ionen der Analytsubstanz durch das Ionenleitsystem zu leiten und die negativen Ionen der Reaktantsubstanz ihnen entgegenströmen zu lassen (oder umgekehrt, was hier nicht weiter diskutiert wird). Dazu müssen die negativen Ionen in die Reaktionszelle eingeleitet werden, ohne die Durchleitung der positiven Ionen zu stören.
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Erfindungsgemäß wird die Zuleitung einer Ionensorte von der Seite her vorgenommen, und zwar bevorzugt durch ionenleitende Hochfrequenz-Stabsysteme, die seitlich in das Ionenleitsystem einmünden, dort in Kontakt mit den Elektroden des Ionenleitsystems stehen und auch von dort mit Hochfrequenzspannung versorgt werden. Dazu müssen die Elektroden des durchgängigen Ionenleitsystems in einem kleinen Gebiet durchbrochen werden. Wird ein Quadrupol-Stabsystem angeschlossen, so ist eine Unterbrechung nur einer Elektrode des durchgehenden Ionenleitsystems notwendig, zusätzlich werden zwei T-förmige Verbindungen zu den Nachbarelektroden gebraucht. Für den Anschluss eines Hexapol-Stabsystems müssen zwei Elektroden unterbrochen werden, und es sind wieder zwei T-Verbindungen zu benachbarten Elektroden notwendig. Für ein Oktopol-Stabsystem werden drei Unterbrechungen und zwei T-Verbindungen gebraucht. Dabei ist es unerheblich, ob es sich bei den Elektroden des durchgängigen Ionenleitsystems um ein Stabsystem, eine Doppel- oder Vierfachhelix oder um ein Ringblendensystem handelt.
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Die seitliche Einmündng in das durchgängige Ionenleitsystem muss für Ionen-Reaktionen mit Ionen gefüttert werden, und zwar mit Ionen der entgegengesetzten Polarität zu den im durchgängigen Ionenleitsystem enthaltenen Ionen. Diese seitlich eingeführten Ionen werden vorzugsweise in gesonderten Ionenquellen hergestellt. Das kann beispielsweise in Ionenquellen für chemische Ionisierung geschehen, wobei diese sowohl positive als auch negative Ionen herstellen können. Ionenquellen für chemische Ionisierung arbeiten am besten bei Drucken von einigen 102 Pascal. Da ein solcher Druck in der ersten Pumpstufe des Vakuumsystems nach dem Kapillareinlass zu finden ist, können diese Ionenquellen hier besonders gut installiert werden.
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Die Ionenquellen für chemische Ionisierung sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht besonders beschrieben zu werden. Neben der chemischen Ionisierung können aber auch negative Ionen durch Elektroneneinfang gebildet werden.
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zeigt eine solche Ionenquelle (9) für die Herstellung negativer Reaktantionen durch Elektroneneinfang im Detail. Die Reaktantsubstanzen für die Herstellung negativer Reaktantionen werden über eine Kapillare (10) zugeführt. Diese Substanzen werden hier durch einen Schwarm (33) von Elektronen durch Elektroneneinfang ionisiert. Der Schwarm von Elektronen entsteht aus dem Stoßgas in der Ionenquelle durch den Beschuss mit Alphateilchen aus einer radioaktiven Folie (32). Das Stoßgas wird zusammen mit der Substanz durch die Kapillare (10) eingelassen. Die gebildeten Ionen und die überschüssigen Elektronen werden durch das Linsensystem (34) abgesaugt und in das Hexapol-Stabsystem (8) eingebracht, wobei die Elektronen sofort aus dem Hexapol-Stabsystem entweichen. Die negativen Ionen werden eingefangen und weitergeleitet. Überschüssiges Stoßgas, das über die Kapillare (10) mit der Reaktantsubstanz zusammen eingeführt wird, bläst die negativen Reaktantionen gasdynamisch durch das Hexapol-Stabsystem (8) in den Ionentrichter (7), wo sie den positiven Analytionen diffus entgegendriften und mit ihnen reagieren können.
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Die Reaktionen von positiven Ionen mit negativen Ionen können sehr verschiedenen Klassen angehören. Es sind dabei (a) chemische Reaktionen zwischen den Ionen möglich, (b) Ladungsminderungen bei vielfach protonierten Ionen und (c) Fragmentierungen mehrfach positiv geladener Ionen durch Elektronentransfer („Elektronen-Transfer-Dissoziation” ETD). Alle diese Reaktionen können in einer erfindungsgemäßen Reaktionszelle ausgeführt und ihre Produkte können in einem erfindungsgemäßen Massenspektrometer analysiert werden.
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Eine günstige Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Massenspektrometers ist in schematisch wiedergegeben und zeigt eine Elektrosprüh-Ionenquelle mit Sprühkapillare (1) und Sprühwolke (2), ferner eine Einlasskapillare (6), die die Analytionen aus der Sprühwolke zusammen mit Umgebungsgas in das Vakuumsystem des Massenspektrometers überführt, einen Ionentrichter (7) zur Abtrennung des überschüssigen Umgebungsgases und eine Ionenquelle (9) für negative Reaktantionen, die über das Hexapol-Stabsystem (8) dem Ionentrichter (7) zugeführt werden können. Der Ionentrichter (7) dient als Reaktionszelle für die Reaktionen der positiven Analytionen aus der Sprühwolke (2) mit den negativen Reaktantionen aus der Ionenquelle (9). Er sollte durch entsprechende Beschaltung einen schwachen Potentialgradienten längs der Achse aufweisen. Die Produktionen werden durch das Linsensystem (16) in ein weiteres Ionenleitsystem (11) eingeführt. Das Ionenleitsystem (11) führt die Produktionen der Reaktion durch ein weiteres Linsensystem (17) zum Flugzeitmassenanalysator mit Pulser (12), Reflektor (13) und Detektor (14). Die Funktion des Flugzeitmassenanalysators ist jedem Fachmann bekannt und braucht hier nicht näher beschrieben zu werden.
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Die Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2) ist in kommerziellen Massenspektrometern weit verbreitet und braucht hier ebenfalls nicht näher erläutert zu werden. Die Elektrosprüh-Ionenquelle enthält aber hier des Weiteren eine Einrichtung, mit der feste Proben, in der Analytmoleküle in einer verpuffbaren Matrix auf einer Probenträgerplatte (3) präpariert sind, durch einen Laserstrahl (5) aus einem Pulslaser (4) in verdampfter Form in die Sprühwolke (2) hineintransportiert und dort ionisiert werden können. Damit können aus laserdesorbierten Proben mehrfach ionisierte Analytionen erzeugt werden, wie sie besonders für eine Fragmentierung der Ionen durch Elektronentransfer benötigt werden. Bekanntlich liefert die gewöhnlich für feste Proben verwendete matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) nur einfach geladene Ionen, die für manche Zwecke, beispielsweise für Elektronen-Transfer-Dissoziationen ETD, nicht verwendet werden können.
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Die Analytionen werden nach Einlass durch die Einlasskapillare (6) ins Vakuumsystem durch einen Ionentrichter (7) („ion funnel”) von dem mitgeführten Umgebungsgas (meist sauberem Stickstoff) befreit. Gleichzeitig finden hier die Reaktionen mit negativen Reaktantionen statt. Die Pumpen (15) bilden eine differentielle Druckstufenkaskade; die hier gezeigten drei Stufen sind nur eine schematische Andeutung, für kommerzielle Massenspektrometer dieser Art werden vier bis fünf Stufen eingesetzt. Die Produktionen aus der Reaktionszelle (7) werden durch Lochblendensysteme (16, 17) und das Ionenleitsystem (11) dem Flugzeitmassenanalysator mit Pulser (12), Reflektor (13) und Detektor (14) zugeführt. Die Lochblendensysteme (16, 17) dienen der Weiterleitung der Ionen zwischen den verschiedenen Abschnitten des Massenspektrometers.
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In anderen Ausführungsformen kann das Massenspektrometer die Reaktionszelle auch an anderer Stelle enthalten, beispielsweise erst hinter einem Quadrupolmassenfilter, das Primärionen einer gewünschten Sorte ausfiltert und der Reaktionszelle zuführt. Massenfilter sind dadurch charakterisiert, dass sie nur Ionen einer Masse (genauer: eines Verhältnisses von Masse zu Ladung) oder nur einen kleinen Bereich von Massen durchlassen.
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Alle Ionenleitsysteme sind für gewöhnlich mit Dämpfungsgas gefüllt, wobei das Dämpfungsgas bewirkt, dass sich sowohl die positiven wie die negativen Ionen durch die Wirkung des Pseudopotentials in Achsennähe des Systems sammeln. Die Sammlung ist umso besser, je schlanker das System ist. Ein günstiger Druckbereich dafür liegt zwischen 10–5 und 10–2 Pascal.
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Eine besondere Anwendung des erfindungsgemäßen Massenspektrometers liegt in der Möglichkeit zur einfachen Strukturuntersuchung von Biopolymerionen durch ETD-Fragmentierung. Das Massenspektrometer wird zu diesem Zweck mit einem gut substanzseparierenden Trennsystem, beispielsweise einem Nano-HPLC, verbunden. Die zeitlich getrennt zugeführten Substanzen werden in der Elektrosprüh-Ionenquelle vorwiegend mehrfach geladen ionisiert. Sie reagieren mit geeigneten negativen Ionen geringer Protonenaffinität unter vorwiegender Fragmentierung in Fragmentionen des c-Typs, die ein leicht zu entschlüsselndes Fragmentionenspektrum ergeben. Durch periodische Einschaltung und Abschaltung der Zuführung negativer Ionen mit Hilfe der Extraktionslinse (34) können abwechselnd Spektren mit und ohne Fragmentierung erhalten werden. Durch den Vergleich der Spektren können die zu den Fragmentionen gehörenden Peaks des Fragmentionenspektrums ermittelt werden.
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Das Massenspektrometer kann dabei eine weitere Einrichtung für Fragmentierungen enthalten. So ist in neben einer Prallplatte (31) zum Unterbrechen des Jets aus der Kapillare auch eine Ringelektrode (30) enthalten, die bei entsprechend angelegter Spannung eine Stoßfragmentierung (CD „collision induced dissociation”) der eingeführten Analytionen erlaubt. Der Vergleich stoßfragmentierter Ionen mit Fragmentionen durch Elektronentransfer gibt besondere Aufschlüsse über die Struktur der Ionen; besonders günstig ist ein Betrieb, in dem sich Normalspektren, CID-Spektren und ETD-Spektren einander in kurzem, zeitlichen Rhythmus ablösen. Besondere Programme können die charakteristischen Fragmentionen aus diesen Gemischen von Spektren herauslesen.
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Weitere Einsatzgebiete für die erfindungsgemäßen Massenspektrometer liegen in der Untersuchung von Substanzgemischen mit hohen Molekulargewichten, die normalerweise in der Elektrosprüh-Ionenquelle jeweils mit breiter Ladungsverteilung vielfach geladen werden und daher ein kaum zu entschlüsselndes Peakgemisch im Spektrum liefern. Durch Beseitigung der überschüssigen Ladungen kann ein Gemisch erzeugt werden, das praktisch nur noch aus einfach geladenen Ionen besteht und daher einfach zu interpretieren ist. Gerade ein Flugzeitmassenanalysator eignet sich für die Aufnahme von Spektren mit Ionen hoher Massen; die Massengrenze ist dabei nur durch den verwendeten Detektor begrenzt.
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Selbstverständlich lassen sich statt des Flugzeitmassenanalysators auch andere Arten von Massenanalysatoren für die Aufnahme der Produktionenspektren verwenden. Zum heutigen Zeitpunkt erscheint jedoch der Flugzeitmassenanalysator im Sinne eines Preis-Leistungs-Verhältnisses am günstigsten für die Erzielung einer hohen Massengenauigkeit, einer hohen Messdynamik, eines hohen Massenbereichs und einer schnellen und flexibel anpassbaren Messzeit.
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Dem Fachmann wird es in Kenntnis dieser Erfindung ermöglicht, auch andersartige Massenspektrometer mit einer Fragmentierung der Ionen durch Elektronentransferreaktionen zu konstruieren, wobei die Reaktionen mit den negativen Ionen nicht, wie bisher einzig bekannt, im Massenanalysator selbst stattfinden müssen.
