DE102004053064B4

DE102004053064B4 - Ionisierung durch Tröpfchenaufprall

Info

Publication number: DE102004053064B4
Application number: DE102004053064A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: US20060108539A1; GB2420008B; GB2420008A; GB0522044D0; DE102004053064A1; US7465940B2

Abstract

Ionenquelle für ein Massenspektrometer, bestehend aus
(a) einer Elektrosprühkapillare zur Erzeugung von Mikrotröpfchen bei einem Druck von mehr als 10000 Pascal,
(b) einer Einlasskapillare zwischen dem Elektrosprühbereich und dem Vakuumsystem des Massenspektrometers, wobei die Mikrotröpfchen durch die Einlasskapillare in das Vakuumsystem gelangen,
(c) einer Prallplatte im Vakuumsystem des Massenspektrometers, die derart angeordnet ist, dass die Mikrotröpfchen durch eine gasdynamische Beschleunigung in der Einlasskapillare oder durch eine elektrische Beschleunigung im Vakuumsystem oder beides auf die Prallplatte treffen.

Description

Die Erfindung betrifft eine Ionenquelle und Verfahren zur Ionisierung von Analytmolekülen, vorzugsweise Biomolekülen, die in Flüssigkeiten gelöst oder an Oberflächen fest adsorbiert sind.
Es werden Flüssigkeiten an Atmosphärendruck durch Elektrosprühen zerstäubt. Hoch geladene Mikrotröpfchen, die durch die Einlasskapillare in das Vakuum des Massenspektrometers gelangen, treffen unter Zufuhr von Energie auf eine Prallplatte, wobei sie durch die Coulombsche Abstoßungskraft der Ladungen, durch Aufnahme zusätzlicher thermischer Energie und/oder Umwandlung ihrer kinetischen Energie in thermische Energie zerplatzen und verdampfen. Analytmoleküle, die sich in der zerstäubten Flüssigkeit oder auf der Prallplatte befinden, werden in geladener Form freigesetzt und können durch die Saugwirkung eines mit Hochfrequenz- und Gleichspannungen betriebenen Ionentrichters dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt werden.
Stand der Technik
Das Verfahren des Elektrosprühens in Schutzgas an Atmosphärendruck leidet darunter, dass die entstehenden Sprühtröpfchen nicht alle vollständig verdampfen. Eine Einlasskapillare, die einen Innendurchmesser von etwa 400 bis 600 Mikrometer hat, sollte eigentlich allein Schutzgas mit Analytionen in das Massenspektrometer einführen. Es kommt aber immer wieder vor, dass Sprühtröpfchen durch die Einlasskapillare ins Vakuum des Massenspektrometers eintreten und irgendwo im Massenspektrometer störende Aufladungen erzeugen.
Es gibt eine lange Reihe von Patenten, die vor diesen Aufladungen schützen sollen. So darf die Einlasskapillare nicht direkt auf das Durchgangsloch für Tonen im Gasabstreifer zwischen erster und zweiter Pumpstufe zielen (US Re. 35,413, I. C. Mylcreest, M. E. Hail), die Einlasskapillare kann zur Achse des Massenspektrometers parallel versetzt sein ( US 5,481,107 , T. Yasuaki et al.), die Einlasskapillare kann einen Winkel mit der Achse des Massenspektrometers bilden ( US 5,818,041 , A. Mordehai, S. E. Buttrill), der Weg der Ionen in das Vakuumsystem kann mehrfach abgeknickt werden ( US 5,756,994 , S. Bajic) oder die Sprührichtung kann orthogonal zur Einlasskapillare gewählt werden, damit die Tröpfchen durch ihre Trägheit an der Einlasskapillare vorbeifliegen ( US 5,750,988 , J. A. Apffel et al.).
Die Tröpfchen gelten also als störend, weil ihr Aufprall an Geräteteilen im Vakuum zu Aufladungen führt, und es werden erhebliche Anstrengungen unternommen, sie vom Eindringen in das Massenspektrometer fernzuhalten.
Andererseits gibt es seit mehr als einem Jahrzehnt gelegentliche Arbeiten, die durch Elektrosprühen im Vakuum eines Massenspektrometers hoch geladene Tröpfchen erzeugen, diese beschleunigen und auf eine Prallplatte (target) schießen, wo sie zerplatzen und große Moleküle in geladener Form freisetzen. Die Moleküle können in der versprühten Flüssigkeit enthalten sein (siehe beispielsweise: „Impact desolvation of electrosprayed microdroplets – a new ionization method for mass spectrometry of large biomolecules", S. A. Aksyonov und P. Williams, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2001; 15; 2001-2006); sie können aber auch auf der Prallplatte adsorbiert sein („Formation of multiply-charged ions from large molecules using massive-cluster impact", J. F. Mahoney et al., Rapid Comm. in Mass Spectrom. 1994, 8, 403-406). Dieses Verfahren zur Ionisierung von Ionen ist dabei vom Verfahren der „Surface Induced Dissociation" (SID) zu unterscheiden, in dem Ionen auf eine beheizte Platte geschossen werden, um sie zu fragmentieren ( US 6 204 500 B1 ).
Sind die Analytmoleküle in den Mikrotröpfchen enthalten, so sprechen die Autoren von IDEM (Impact Desolvation of Electrosprayed Microdroplets); befinden sich die Analytmoleküle adsorbiert auf einer Oberfläche, wird das Verfahren als MCI (Massive Cluster Impact) bezeichnet. Die im Vakuum erzeugten Mikrotröpfchen wurden auch direkt zur Reinigung der Oberflächen von adsorbierten Verunreinigungen verwendet („Surface cleaning using energetic microcluster beams", J.F. Mahoney et al., Solid State Technology, 1998, 41, 149). Das Elektrosprühen im Vakuum ist allerdings schwierig und es bedarf erheblicher Anstrengungen, um zu einem kontinuierlich arbeitenden Tröpfchenstrahl zu kommen. Häufig wird dabei Glycerin als Sprühflüssigkeit verwendet.
Diese Art der Ionisierung durch Mikrotröpfchen und sogar zur Reinigung von Oberflächen im Vakuum wird durch eine elektrische Beschleunigung der Tröpfchen ermöglicht, die zu einer genügend hohen kinetischen Energie führt. Die Zufuhr von kinetischer Energie ist notwendig, da die Mikrotröpfchen im Vakuum durch Verdunstung so stark abkühlen, dass sie nicht mehr selbständig verdampfen können. Erst die Umwandlung der kinetischen Energie in thermische Energie ermöglicht das Verdampfen. Dadurch ungenügende kinetische Energie für eine vollständige Verdampfung erklären sich auch die Aufladungserscheinungen, die man bei Elektrosprühen im Massenspektrometer findet, wenn man keine Maßnahmen gegen das Eindringen von Mikrotröpfchen unternimmt.
Das bekannte Ionisieren von gelösten Analytsubstanzen durch Elektrosprühen in Schutzgas an Atmosphärendruck für deren massenspektrometrische Analyse geht dagegen von einer möglichst vollständigen Verdampfung der Sprühtröpfchen an Atmosphärendruck im Schutzgas aus. Das Schutzgas ist in aller Regel stark erhitzt (auf einige Hundert Grad Celsius). Aber in Schutzgas kann eine Verdampfung auch ohne hohe kinetische Energie und ohne Erhitzung des Schutzgases stattfinden: Hoch geladene Mikrotröpfchen zerspritzen bereits bei relativ sachten Berührungen einer Oberfläche, ohne dass eine hohe kinetische Energie vorhanden sein muss, wie man aus neuesten Experimenten mit Mikrotröpfchen an Atmosphärendruck weiß („Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization", Z. Takats et al. Science, 2004; 306, 471-473). Die Mikrospritzer verdampfen dann vollständig, wahrscheinlich durch Aufnahme thermischer Energie aus dem ungeheizten Umgebungsgas. Dieser Effekt kann dazu verwandt werden, Ionen von Analytmolekülen zu erzeugen, die auf diesen Oberflächen adsorbiert sind.
Elektrosprühen wird vorwiegend in zwei verschiedenen Ausführungsformen betrieben: dem normalen Elektrosprühen und dem Nanoelektrosprühen.
Das normale Elektrosprühen arbeitet mit Sprühkapillaren von 200 bis 300 Mikrometer Innendurchmesser und mit Sprühspannungen von vier bis fünf Kilovolt. Das starke elektrische Feld an der Spitze der Sprühkapillare polarisiert die Oberfläche der Sprühflüssigkeit, meist Wasser vermischt mit organischen Lösungsmitteln, formt die Flüssigkeitsoberfläche zu einem so genannten „Taylor-Konus", und zieht aus dessen Spitze einen Strahl, der sich zu feinen Mikrotröpfchen auflöst. Der Vorgang wird heute überwiegend durch ein koaxial scharf zugeblasenes Sprühgas unterstützt. Die Tröpfchen haben Durchmesser von etwa einem Mikrometer und teilweise etwas darüber. Sie verdampfen überwiegend in entgegengerichtet zugeführtem heißem Schutzgas, in der Regel Stickstoff, zum Teil unter Zerplatzen durch den Coulombschen Ladungsdruck, zum Teil unter Abdampfen von Neutralteilchen und leichten Ionenclustern, wobei gelöste Analytmoleküle in geladener Form zurückbleiben ( US 4,531,056 , M. J. Labowsky, J. B. Fenn, M. Yamashita). Die Analytionen können über eine Einlasskapillare sogar gegen eine Potentialdifferenz in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers eingeführt und dort analysiert werden ( US 4,542,293 , J. B. Fenn et al.). Für die Entwicklung dieser Methode in den 80er Jahren bekam Professor John B. Fenn den Nobelpreis 2002.
Das normale Elektrosprühen kennt stabile und instabile Sprühzustände. Ein stabiler Sprühzustand ergibt Tröpfchen fast gleicher Durchmesser, leicht instabile Sprühzustände, die sich durch ein Oszillieren des Sprühstroms bemerkbar machen, liefern Tröpfchen verschiedener Durchmesser. Häufig liefert der leicht instabile Betrieb mehr nutzbare Analytionen, aber insgesamt wird bei normalem Elektrosprühen stets nur ein sehr kleiner Bruchteil der Analytionen durch den Saugkegel vor der Einlasskapillare erfasst und ins Massenspektrometer überführt.
Beim Nanoelektrosprühen ist die Sprühkapillare an der Spitze dünn ausgezogen, so dass eine Öffnung mit einem Durchmesser von nur etwa vier Mikrometer entsteht ( US 5,504,329 , M. Mann et al.). Dieses Elektrosprühen wird mit Spannungen unterhalb einem Kilovolt betrieben und liefert Mikrotröpfchen, die nur 100 bis 200 Nanometer Durchmesser haben, also nur etwa ein Tausendstel des Volumens normaler Sprühtröpfchen besitzen. Diese Mikrotröpfchen können wesentlich leichter in heißem Stickstoff restlos verdampft werden. Der Sprühstrahl kann direkt in die Einlasskapillare eingesprüht werden. Gelegentlich kommt es auch hier zu Aufladungen im Massenspektrometer, die auf Mikrotröpfchen zurückzuführen sind, die nicht vollständig eingedampft sind. Dieses Nanoelektrosprühen bietet die beste Ausnutzung der Analytmoleküle; es ist kein anderes Ionisierungsverfahren bekannt, das eine so hohe Ausbeute an Ionen der Analytmoleküle besitzt. Es treten lediglich Verluste an Analytionen in der Einlasskapillare auf.
Beide Verfahren des Elektrosprühens arbeiten nach bisherigem Stand der Technik mit einem differentiellen Pumpsystem, bei dem zwischen erster und zweiter Pumpstufe ein so genannter „Abstreifer" (skimmer) verwendet wird. Der Abstreifer lenkt den größten Teil des Gasstroms, der aus der Einlasskapillare in die erste Stufe geblasen wird, so um, dass er nicht durch direkte Reflektion bremsend den Gasjet der Einlasskapillare bricht und so einen Gasstau erzeugt. Nur der zentrale Teil des Gasjets tritt durch die Öffnung des Abstreifers in die zweite Stufe des Pumpsystems ein; dieser Teil enthält einen Teil der Ionen; jedoch nicht zufrieden stellend viele.
In einigen Laboratorien wird inzwischen an Einrichtungen gearbeitet, die den Abstreifer ersetzen und die Ausbeute an weitergegebenen Ionen erhöht. Eine erfolgreiche Anordnung dieser Art ist der Ionentrichter. Der Ionentrichter arbeitet mit Hochfrequenzspannung, um die Analytionen von der Trichterwand fernzuhalten, und mit Gleichspannung, um sie zur engen Trichteröffnung zu führen ( US 6,107,628 A R. D. Smith und S. A. Shaffer, auch US 5,572,035 A ; J. Franzen). Von dort aus werden sie zum Massenanalysator geleitet.
Der Ionentrichter hat eine verhältnismäßig große Ausgangsöffnung, weil sonst leichte Ionen im Ionentrichter reflektiert werden. Dadurch kann aber eine schädlich große Gasmenge des Gasjets aus der Einlasskapillare in die nächsten Pumpstufen, und bei den bisherigen Anordnungen der Massenanalysatoren, die genau in der Achse der Einlasskapillare liegen, bis in den Massenanalysator vordringen. Bei einigen Massenspektrometern, beispielsweise bei Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern, die nur bei bestem Ultrahochvakuum gut arbeiten, ist dieser Gasjet höchst schädlich. Es kann daher der Ionentrichter im Inneren mit einem Jetverwirbler („jet disturber") versehen werden ( US 6,583,408 B2 , R. D. Smith et al.), der den Durchmarsch des Jets in den Massenanalysator hinein unterbricht. Bei Verwendung eines Ionentrichters mit einem Jetwirbler ist auch eine koaxiale Anordnung zwischen der Elektrosprühkapillare und der Einlasskapillare bekannt (US 2004/0188605 A1). Die abgelenkten Analytionen werden vom umgebenden Ionentrichter wieder eingesammelt und zum Massenanalysator geleitet.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, die in die Einlasskapillare eindringenden Mikrotröpfchen nicht einfach zu verwerfen und damit vom Weg in das Massenspektrometer fernzuhalten, sondern sie für die Erzeugung von Analytionen einzusetzen, wobei die Analytmoleküle entweder, wie beim bisherigen Elektrosprühen, in den Mikrotröpfchen gelöst mitgeführt werden oder aber auf eigens eingebrachten Probenträgeroberflächen adsorbiert sein können.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Ionenquelle gemäß Anspruch 1 und Verfahren gemäß den Ansprüchen 13 und 15.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass aus dem Elektrosprühen ein bis zwei Zehnerpotenzen mehr Ionen eingefangen werden können, wenn der Sprühstrahl direkt und mit kurzem Abstand auf die Öffnung der Einlasskapillare gerichtet ist, nur ist dann das Massenspektrometer in wenigen Minuten so verschmutzt, dass es nicht mehr arbeiten kann. Die Erfindung stellt nun Verfahren und Einrichtungen bereit, die nicht nur diese erhöhte Zuführung an Ionen nutzbar macht, sondern auch (in einer ersten Ausführungsform) diejenigen Analytmoleküle zusätzlich ionisiert, die sich in den mitgeführten Mikrotröpfchen befinden. Die mitgeführten Mikrotröpfchen werden gezielt auf eine Prallplatte geschossen, wo sie zerplatzen und weitere Analytionen erzeugen. Die Prallplatte muss in dieser ersten Ausführungsform stark erhitzt sein, um das Zerspritzen (wie bei einer heißen Ofenplatte) zu ermöglichen. Die Ionen, die dann im Vakuum eine größere, nicht fest umrissene Wolke bilden, müssen dann abgesaugt, vom mitgeführten Schutzgas befreit und dem Massenspektrometer zugeführt werden, was durch einen Blendenstapel gelingt, der als Ionentrichter ausgeführt ist.
Die heiße Prallplatte kann sich in einem Ionentrichter in der ersten Stufe des Vakuumpumpsystems befinden, aber auch, da die Tröpfchen mit relativ hoher Geschwindigkeit geradeaus fliegen, in einem zweiten Ionentrichter in einer zweiten Stufe des differentiellen Pumpsystems, wobei bereits in der ersten Stufe ein hoher Anteil des Schutzgases abgepumpt wird.
Die Erfindung stellt aber darüberhinaus auch eine zweite Ausführungsform von Verfahren und Einrichtungen bereit, die gezielt in Schutzgas von nahezu Atmosphärendruck Mikrotröpfchen erzeugen und diese ohne wesentliche Verdampfung in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers einführen. Die Mikrotröpfchen werden in dieser zweiten Ausführungsform im Vakuum auf genügend hohe kinetische Energie beschleunigt und erzeugen durch ihren Aufprall auf Prallplatten, die als Probenträgerplatten ausgebildet sind und adsorbierte Analytmoleküle tragen, Analytionen. Die Analytionen können wiederum durch Ionentrichter abgesaugt und dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt werden. Diese zweite Ausführungsform kann selbstredend auch mit Analytmolekülen in den Mikrotröpfchen betrieben werden, wobei Verluste an Analytmolekülen durch die Überführung ins Vakuum minimiert werden.
Die Erfindung umfasst damit die Erzeugung von Mikrotröpfchen in einem Schutzgas von nahezu Atmosphärendruck, entweder mit oder ohne wesentliche Verdampfung der Mikrotröpfchen, Einsaugen der Ionen und Mikrotröpfchen ins Vakuum mit Aufprall der Mikrotröpfchen auf eine Prallplatte, wobei für das Verdampfen der Mikrotröpfchen eine Energiezufuhr gewährleistet sein muss, und Einsammeln und Weiterleiten der gebildeten Analytionen in den Massenanalysator des Massenspektrometers durch einen Ionentrichter. Die Energiezuführ kann über eine elektrische Beschleunigung der Ionen erfolgen, oder über eine Heizung der Prallplatte. Die Analytmoleküle können sich in den Mikrotröpfchen oder adsorbiert auf der Prallplatte befinden.
Unter Prallplatte soll dabei hier ein beliebig geformter Gegenstand verstanden werden, auf dessen Oberfläche die Mikrotröpfchen aufprallen, also beispielsweise auch ein Pralltöpfchen oder eine Probenträgerplatte. Unter „nahezu Atmosphärendruck" soll jeder Druck oberhalb 10 000 Pascal verstanden werden.
Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt ein Schema einer erfindungsgemäßen Einrichtung mit einer geheizten Prallplatte (5) in einer ersten Stufe (4) des differentiellen Pumpsystems eines (nicht vollständig gezeigten) Massenspektrometers. Die Sprühkapillare (1) nahe an Atmosphärendruck ist auf die Einlasskapillare (3) gerichtet, und die Mikrotröpfchen des Sprühstrahls (2) schlagen in der ersten Pumpkammer (4) auf die geheizte Prallplatte (5) auf. Der Ionentrichter (6) befördert die durch die Einlasskapillare (3) eintretenden Ionen wie auch die durch Verdampfen der Mikrotröpfchen erzeugten Ionen in die nächste Stufe (9) des differentiellen Pumpsystems, wo ein zweiter Ionentrichter (11) die Ionen in Richtung (12) zum Massenanalysator transportiert. Die Pumpkammern (4) und (9) werden durch die Pumpöffnungen (7) und (10) bepumpt.
In 2 ist die geheizte Prallplatte (5) im Ionentrichter (11) der zweiten Pumpstufe (9) angeordnet.
3 zeigt schematisch eine gewollte Mikrotröpfchenbildung einer Elektrosprüheinrichtung in mehr Detail. In der Sprühkapillare (21) befindet sich die Sprühflüssigkeit (22), die durch die Sprühspannung zwischen der Sprühkapillare (21) und der Einlasskapillare (26) zu einem Taylor-Konus (23) ausgezogen wird. Aus der Spitze des Taylor-Konus (23) wird ein feiner Flüssigkeitsstrahl (24) herausgezogen, der sich durch die Zugwirkung des elektrischen Feldes im Schutzgas (29) erst wellenförmig verformt und dann zu einem Strahl (25) getrennter Mikrotröpfchen auflöst. Die scharfe Saugwirkung des Schutzgases (29) in der Verengung (27) am Eingang der Einlasskapillare (26) beschleunigt die Mikrotröpfchen und zieht sie zum einem Strahl (28) weit getrennter Mikrotröpfchen auseinander.
4 gibt ein Schema eine Einrichtung wieder, mit der Analytionen aus Analytmolekülen erzeugt werden, die auf einer beweglichen Probenträgerplatte (13) adsorbiert sind.
Bevorzugte Ausführungsformen
Eine erste günstige Ausführungsform dient der Erhöhung des Nachweisvermögens des Massenspektrometers bei Benutzung einer normalen Elektrosprüh-Ionenquelle durch Erhöhung der Anzahl nutzbarer Ionen pro eingesetztem Analytmolekül. Wird der Sprühstrahl aus der Sprühkapillare einer Elektrosprüheinrichtung direkt auf die Öffnung einer Einlasskapillare gerichtet, so erhöht sich die Anzahl der im Massenspektrometer verfügbaren Ionen um einen Faktor 20 bis 50. Diese Ionen stehen aber nur sehr kurz zur Verfügung, weil die Passage der Ionen zum Massenspektrometer in kurzer Zeit durch Aufladungen an Blenden und anderen Engpässen blockiert ist. Die Erfindung löst dieses Problem durch eine geheizte Prallplatte, die die geradeaus fliegenden Mikrotröpfchen wirksam abfängt und zur Ionisierung der in ihnen mitgeführten Analytmoleküle nutzt, in Verbindung mit einem Ionentrichter, der die gasförmig eintretenden wie auch die im Prallprozess gebildeten Analytionen absaugt, weitgehend vom Schutzgas abtrennt und als feinen Ionenstrahl in das Massenspektrometer weiterleitet. Durch Prallplatte und Ionentrichter kann der Ionenstrom gegenüber bisher üblichem Betrieb um gut einen Faktor 100 steigen.
Die Sprühkapillare ist dabei so auszurichten, dass sie durch das heiße, entgegenströmende Schutzgas hindurch genau in Richtung auf die Einlassöffnung der Einlasskapillare sprüht. Das Sprühen erfolgt durch eine Sprühspannung zwischen der Sprühkapillare und der Einlasskapillare, wobei die Einlasskapillare mindestens um die Einlassöffnung herum elektrisch leitend ist. Der Abstand zwischen Sprühkapillare und Einlasskapillare wird so gewählt, dass der Sprühnebelkegel vor der Einlassöffnung einen Durchmesser von höchstens etwa vier bis acht Millimeter hat. Die Sprühtröpfchen haben dabei die Gelegenheit, im heißen Schutzgas großenteils zu verdampfen. Die nicht eingedampften Sprühtröpfchen werden dann vom Ansaugkegel vor der Einlassöffnung der Einlasskapillare erfasst und zusammen mit einer großen Menge heißen Schutzgases und zusammen mit vielen bereits gebildeten Analytionen in die Einlasskapillare hineingezogen. Die kleineren Sprühtröpfchen werden hier weiter eindampfen und verschwinden, die größeren Sprühtröpfchen treten dann in die erste Pumpstufe des differentiellen Pumpsystems des Massenspektrometers ein und prallen auf die Prallplatte. In dieser Ausführungsform ist die Prallplatte geheizt, um die aufprallenden Sprühtröpfchen bei ihrer Verdampfung zu unterstützen. Die Sprühtröpfchen werden im Folgenden als Mikrotröpfchen bezeichnet. Sie haben in der Regel beim Aufprall Durchmesser von weit weniger als einem Mikrometer.
Die Sprühkapillare kann mit einer weiteren Kapillare koaxial umschlossen sein, durch die ein Sprühgas mit hoher Geschwindigkeit zur Unterstützung des Sprühprozesses zugeführt wird. Zweckmäßigerweise ist das Sprühgas von gleicher Art wie das heiße, entgegenströmende Schutzgas und ebenfalls erhitzt. Als Schutzgas wird vorzugsweise reinster Stickstoff verwendet.
Die Sprühkapillare kann an einen Flüssigkeitschromatographen angeschlossen sein; es werden dann die Analytmoleküle, die im Flüssigkeitschromatographen voneinander separiert wurden, dem Massenspektrometer zeitlich getrennt zugeführt. Der Fluss in der Sprühkapillare sollte aber nicht größer als einige Hundert Mikroliter pro Minute sein, da sonst die Sprühtröpfchen einen zu großen Gasanfall im Vakuumsystem des Massenspektrometers liefern. Liefert der Flüssigkeitschromatograph einen höheren Fluss des Eluenten, so ist ein Split des Eluentenflusses angebracht, wobei selbst bei Splitverhältnissen von 10:1 immer noch eine beträchtliche Erhöhung des Nachweisvermögens zu beobachten ist. Der größere Rest des Eluentenflusses kann anderweitig verwertet werden, beispielsweise zur Beladung einer Probenträgerplatte mit Analytmolekülen. Die Probenträgerplatte kann dann mit der unten beschriebenen zweiten Ausführungsform der Erfindung analysiert werden.
Die Mikrotröpfchen werden in der Einlasskapillare bereits durch das einströmende Schutzgas beschleunigt. Da die Druckverhältnisse in der Kapillare die Geschwindigkeit des Schutzgases im Quadrat zur Entfernung vom Eingang steigern, unterliegen die Mikrotröpfchen einer dauernden, beschleunigenden Reibung und damit einer gasdynamischen Beschleunigung. Sie werden dabei außerdem stets in die Achse der Kapillare hinein fokussiert. Die Fokussierung beruht auf dem Bernoulli-Effekt. Wenn ein Mikrotröpfchen die Achse verlässt, so sieht es wegen des parabolischen Geschwindigkeitsprofils des Schutzgases in der Kapillare zur Achse hin eine höhere Gasgeschwindigkeit des Schutzgases als zur Kapillarenwand hin, und durch den dadurch gegebenen niedrigeren Druck zur Achse hin erfährt es eine fokussierende Kraft zur Kapillarenachse. Beim Austritt aus der Einlasskapillare bilden die Mikrotröpfchen einen sehr feinen Partikelstrahl in der Fortsetzung der Kapillarenachse. Die Mikrotröpfchen haben dabei Geschwindigkeiten von 10 bis 100 Metern pro Sekunde.
Die Mikrotröpfchen treffen dann auf die Prallplatte und zerplatzen dort. Zum Zerplatzen tragen die kinetische Energie der Mikrotröpfchen und die potentielle Energie der Coulombschen Abstoßungskraft durch die hohe Ladung des Tröpfchens bei. Trotzdem reichen in vielen Fällen diese Energien nicht aus, wie man an den oben geschilderten Aufladungserscheinungen im Massenspektrometer sieht. Die Prallplatte muss daher beheizt sein, weil sie sich durch den Aufprall vieler Mikrotröpfchen stark abkühlen kann. Die Prallplatte wird dabei kalt und aufprallende Mikrotröpfchen vermögen ihr keine weitere thermische Energie mehr zu entziehen.
Die Prallplatte kann dabei vorzugsweise so ausgebildet sein, dass die zur Seite wegspritzenden und durch die Coulombschen Abstoßungskräfte beschleunigten Mikrospritzer der Mikrotröpfchen nochmals auf andere Teile der Prallplatte aufschlagen. Das kann durch eine Vertiefung in der Prallplatte erreicht werden. Es entsteht somit ein Pralltöpfchen, das aber nach oben gegebener Definition ebenfalls unter dem Begriff „Prallplatte" verstanden werden soll.
Dem Verdampfen der Mikrotröpfchen kann ein Zerspritzen in Mikrospritzer vorangehen; die Mikrospritzer haben dann durch ihre Kleinheit in der Regel einen solch hohen Dampfdruck, dass sie in kürzester Zeit unter Bildung von Analytionen vollständig verschwinden.
Die geheizte Prallplatte (5) kann sich beispielsweise mitten in einem Ionentrichter (6) befinden, wie schematisch in 1 dargestellt. Der Ionentrichter (6) ist ein Blendenstapel aus parallel eng zueinander koaxial angeordneten Lochblenden, dessen Löcher sich von Blende zu Blende verjüngen und so eine konische innere Trichterwand bilden. Die Blenden sind abwechselnd mit den beiden Phasen einer Hochfrequenzspannung verbunden, daher stößt die Wand Ionen beider Polaritäten ab. Es können damit die Analytionen vom Schutzgas weitgehend befreit werden, wobei das Schutzgas durch die Zwischenräume zwischen den Blenden zu einer Pumpenöffnung (7) hin entweicht. Sehr leichte Ionen unterhalb einer Grenzmasse, die von der Frequenz, der Spannung und den geometrischen Verhältnissen der Lochblenden abhängt, werden durch Anstoßen an die Blendenoberflächen vernichtet, dadurch können Protonen und die nicht analytisch interessierenden leichten Ionen der Flüssigkeitsmoleküle der Mikrotröpfchen sofort ausgeschieden werden. Der Ionentrchter (6) ist aber nicht nur mit der Hochfrequenzspannung versorgt, sondern auch mit einer Gleichspannung. Diese erzeugt einen Gleichspannungsabfall von Blende zu Blende, die die Ionen immer tiefer in den Ionentrichter hineinsaugt und sie durch den Trichterausgang durch die Öffnung (8) in eine nächste Differentialpumpstufe (9) befördert.
Mit üblichen Pumpsystemen und üblichen Einlasskapillaren (3) lassen sich in einer ersten Pumpstufe (4) Drucke von 100 bis 300 Pascal, in der zweiten Pumpstufe (9) Drucke um ein Pascal herum aufrecht erhalten.
Die beheizte Prallplatte (5) kann sich aber auch in einem Ionentrichter (11) befinden, der sich in der zweiten Differentialpumpstufe (9) befindet, wie schematisch in 2 gezeigt. In der ersten Pumpstufe (4) kann sich entweder nur ein Gasabstreifer befinden, oder, wie in 2, ein erster Ionentrichter (6). Die Mikrotröpfchen fliegen durch ein Loch im Gasabstreifer oder durch den Trichterausgang des ersten Ionentrichters (6) hindurch und treffen die Prallplatte (5) im Ionentrichter (11) der zweiten Pumpstufe (9). Die Prallplatte (5) im Ionentrichter (11) der zweiten Pumpstufe (9) hat den Vorteil, dass die Ionen in einer Kammer (9) besseren Drucks entstehen und nicht wie in der ersten Pumpkammer (4) Gefahr laufen, gegen die Abstoßung der aus Blenden bestehenden Trichterwand des Ionentrichters (6) bei einigen Hundert Pascal durch den starken Gassog durch die Blenden zur Pumpenöffnung (7) mitgerissen zu werden.
Die Ionentrichter können auch komplizierter aufgebaut sein. So sind Ionentrichter bekannt geworden, die aus Ringquadranten bestehen, wobei die Phasen der Hochfrequenzspannung bereits abwechselnd an den vier Quadranten liegen. Andere Ionentrichter bestehen aus einem Blendenstapel mit Rundblenden, und einem nachfolgenden Blendenstapel mit Blendenlochfomen, die ein Quadrupolfeld aufspannen und so die Ionen in die Achse fokussieren. Auf diese durchaus vorteilhaften Formen soll hier nicht näher eingegangen werden.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist in 4 schematisch dargestellt. Hier werden in einer Elektrosprüheinrichtung Mikrotröpfchen möglichst gleicher Größe willkürlich hergestellt Diese Mikrotröpfchen werden alle ohne Eindampfung durch die Einlasskapillare ins Vakuumsystem des Massenspektrometers eingeleitet. Die Mikrotröpfchen können dabei aus einem reinen Lösungsmittelgemisch ohne Analytmoleküle bestehen; sie dienen dann lediglich dazu, im Inneren des Massenspektrometers Analytmoleküle von einer Prallplatte, die als Probenträgerplatte ausgebildet ist, ionisierend zu desorbieren. Auch hier entsteht eine diffuse Wolke aus Analytionen, die mit Hilfe eines Ionentrichters eingefangen und an den Massenanalysator im Inneren des Massenspektrometers weitergeleitet werden müssen. In diesem Fall ist es zweckmäßig, die Prallplatte nicht zu erhitzen, sondern die notwendige Verdampfungsenergie durch eine elektrische Beschleunigung der Mikrotröpfchen, also durch eine Erhöhung der kinetischen Energie, zuzuliefern.
Dieses Ionisierungsverfahren, das für vakuumintern erzeugte Mikrotröpfchen MCI (Massive Cluster Impact) genannt wird, kann zu einem Konkurrenzverfahren für MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) ausgebildet werden. Das Verfahren hat den Vorteil, keine Matrixsubstanz und keinen Laser zu brauchen, eine viel höhere Ionenausbeute zu haben und mehrfach geladene Ionen zu erzeugen, die sich einfacher und informationsreicher fragmentieren lassen.
Zunächst werde hier darauf eingegangen, wie ein kontinuierlicher Strahl von Mikrotröpfchen etwa gleicher Größe erzeugt werden kann. Wie in 3 gezeigt, kann man durch eine Sprühkapillare (21), die zu einer Spitze mit einer Öffnung von etwa 20 Mikrometern Durchmesser ausgezogen ist, mit etwa zwei Kilovolt Sprühspannung zwischen der Sprühkapillare (21) und der Einlasskapillare (26) einen sehr gleichmäßigen Strom von Mikrotröpfchen aus einem Methanol-Wasser-Gemisch (22) herstellen. Eine leichte Ansäuerung mit Trifluoressigsäure (TFA) oder Ameisensäure ist günstig. Das Methanol setzt die Oberflächenspannung der Flüssigkeit herab und erleichtert das Elektrosprühen. Die Mikrotröpfchen (25, 28) haben Durchmesser von etwa 300 Nanometer, sie sind kleiner als normale Sprühtröpfchen. Durch eine an sich bekannte elektrische Beschaltung kann man Oszillationen des Strahlstroms vermeiden und so sehr gleichmäßig große Mikrotröpfchen herstellen. Die Sprühkapillare (21) wird dabei auf die Eingangsöffnung der Einlasskapillare (26) ausgerichtet. Die Einlasskapillare (26) wird von genau temperiertem und angefeuchtetem Reinststickstoff (29) umspült. Durch die Wahl des Flüssigkeitsgemischs (22), der Größe der Sprühkapillarenöffnung (21), der Temperatur und des Feuchtigkeitsgehaltes des Reinststickstoffs (29) kann man einen Betrieb erhalten, in dem die hoch geladenen Mikrotröpfchen (25, 28) nicht verdampfen und einen beständigen Partikelstrahl (28) in das Vakuumsystem hinein bilden.
An der Spitze der Sprühkapillare (21) entsteht ein Taylor-Konus (23), aus dessen Spitze ein feiner Flüssigkeitsstrahl (24) herausgezogen wird. Dieser löst sich durch Reibung am Schutzgas in feine Mikrotröpfchen (25) auf, die im elektrischen Feld beschleunigt dicht hintereinander her fliegen. Durch richtige Einstellung der Sprühparameter lassen sich etwa 100 000 Mikrotröpfchen pro Sekunde erzeugen. Wenn im positiven Modus gearbeitet wird, ist jedes Mikrotröpfchen mit einigen Tausend Protonen geladen; im negativen Modus mit einigen Tausend OH^–-Gruppen. Bei längerem Flug in mäßig bewegtem Schutzgas, der hier nicht zugelassen wird, würden die Mikrotröpfchen abgebremst, wobei sie zunehmend nebeneinander her fliegen müssen und sich durch Coulombsche Abstoßung zu dem bekannten konusförmig auseinander driftenden Sprühnebel erweitern würden. Werden die Mikrotröpfchen dagegen, wie in 3 gezeigt, durch einen kurzen Abstand zwischen Sprühkapillare (21) und Einlasskapillare (26) sofort in den Saugkegel der Einlasskapillare (26) gezogen, so können sie weiterhin hintereinander her fliegen. Hat die Einlasskapillare beispielsweise (bei einem sonst konstanten Innendurchmesser von etwa 500 bis 600 Mikrometer) am Eingang eine auf etwa 300 Mikrometer Durchmesser eingeschnürte Laval-Düse (27), so herrscht hier eine Geschwindigkeit des eingesogenen Schutzgases (29) von einigen Metern pro Sekunde. Nehmen die Mikrotröpfchen (25) dabei durch die Mitnahme im Gas eine Geschwindigkeit von etwa einem Meter pro Sekunde an, so haben selbst 100 000 Mikrotröpfchen pro Sekunde einen Abstand von jeweils etwa zehn Mikrometer voneinander, bei Durchmessern von 300 Nanometern. Die im Schutzgas in der Laval-Düse (27) beschleunigten Mikrotröpfchen (28) fliegen also allein in relativ weiten Abständen hintereinander her. Für diesen Betrieb ist also eine Einengung der Einlasskapillare (26) an ihrem Eingang nach Art einer Laval-Düse sehr günstig.
In der Einlasskapillare (26) selbst werden die Mikrotröpfchen (28) durch die immer größer werdende Geschwindigkeit des Schutzgases auf 10 bis 100 Meter pro Sekunde beschleunigt. Die Abstände der Mikrotröpfchen (28) voneinander werden dabei immer größer. Dabei ist die oben geschilderte Fokussierung der Mikrotröpfchen (28) in die Achse der Einlasskapillare hinein in Kraft. Es entsteht ein feiner Strahl (28) an Mikrotröpfchen, die mit hoher Geschwindigkeit in der Achse der Einlasskapillare säuberlich getrennt hintereinander her fliegen.
Nach Passieren der Laval-Düse (27) tritt eine adiabatische Abkühlung des Schutzgases (29) und damit eine mögliche Übersättigung des Feuchtigkeitsgehaltes ein. Der Feuchtigkeitsgehalt des zugeführten Schutzgases ist daher so einzustellen, dass nach dieser Abkühlung keine Kondensation von Flüssigkeit an den Mikrotröpfchen (28) stattfindet, dass andererseits die Mikrotröpfchen (28) aber auch nicht durch Verdampfung in zu trockenem Schutzgas zu stark an Masse verlieren, da sonst die Gefahr besteht, dass die dadurch labil werdenden Mikrotröpfchen unterwegs durch die Coulombkraft explodieren.
Wir wenden uns jetzt dem Schema in 4 zu. Die Sprühkapillare (1) wird hier über einen Schlauch (15) aus einer Flüssigkeitsmenge (16) in einem Flüssigkeitsreservoir (17) gespeist, wobei eine Druckgaszufuhr (18) einen Überdruck im Reservoir herstellt. Durch den Überdruck und die Kapillarkräfte in der Sprühkapillare (1) wird die richtige Menge an Sprühflüssigkeit nachgeliefert. Durch eine Sprühspannung zwischen der Sprühkapillare (1) und der metallischen Endkappe (3a) der Einlasskapillare (3) wird der Sprühstrahl (2) hergestellt, wobei die Details aus 3 zu entnehmen sind. Das Versprühen findet bei Atmosphärendruck in einer Kammer (19) statt, die mit temperatur- und feuchtegeregeltem Schutzgas, vorzugsweise Stickstoff, beschickt wird.
Hoch geladene Mikrotröpfchen können einen labilen Zustand erreichen, wenn sie so stark eindampfen, dass die Coulombsche Abstoßung der Ladungen, die auf der Kugeloberfläche gleichmäßig verteilt sind, in etwa die Oberflächenspannung aufhebt. Die leichteste Verformung der Kugelform führt dann zur Einschnürung und fast explosiven Teilung des Mikrotröpfchens in zwei oder mehrere kleinere Mikrotröpfchen. Durch die Regelung der Feuchte des Schutzgases kann dieser labile Zustand vermieden werden. Ist aber andererseits die Dichte der Ladungen auf der Oberfläche zu klein, so wird der Ionisierungsprozess beim Aufprall schwieriger, weil nicht genügend potentielle Abstoßungsenergie zur Verdampfung der Mikrospritzer zur Verfügung steht.
Die Einlasskapillare (3) kann ganz aus Metall bestehen, besteht aber hier aus isolierendem Material, beispielsweise Glas. Die Einlasskapillare (3) ist dabei mit zwei metallenen Endkappen (3a) und (3b) versehen, die sich auf getrennte Potentiale legen lassen. In der isolierenden Einlasskapillare (3) lassen sich die Ionen und Mikrotröpfchen gegen eine Potentialdifferenz auf ein um mehrere Kilovolt höheres Potential schieben, wobei die Reibung des Gases als transportierende Kraft wirkt ( US 4,542,293 , J. B. Fenn et al.). Es ist günstig, wenn die Glaskapillare (3) im Inneren eine Beschichtung mit einem Widerstandsmaterial trägt, sodass ein Längswiderstand von etwa 10⁹ Ohm entsteht ( DE 195 15 271 C2 , J. Franzen, entsprechend US 5,736,740 A ). Es können dann mitfliegende Ionen, die auf die Wand der Einlasskapillare prallen, entladen werden, ohne dass es zu Aufladungen der Oberfläche kommt.
Durch ein Gegenpotential in der Einlasskapillare wird die Geschwindigkeit der austretenden Mikrotröpfchen verringert, sie bedürfen dann auf jeden Fall einer starken Nachbeschleunigung. Andererseits wird durch das Gegenpotential die Fokussierung der Mikrotröpfchen in der Achse der Einlasskapillare verstärkt. Es ist hier experimentell ein Kompromiss zu finden.
Dieser feine, gut fokussierte Strahl vielfach geladener und gut beschleunigter Mikrotröpfchen (2) kann, wie schematisch in 4 gezeigt, zur ionisierenden Desorption von Substanzen benutzt werden, die in kleinen Probenbereichen auf einer beweglichen Probenträgerplatte (13) adsorbiert sind. Durch die Geschwindigkeit der Mikrotröpfchen und durch die starke Aufladung explodieren die Mikrotröpfchen bei ihrem Aufprall auf die Probenträgerplatte (13) in viele kleine Mikrospritzer, nehmen dabei adsorbierte Moleküle auf, die dann, bei schneller vollständiger Verdampfung der Mikrospritzer als Ionenwolke (14) zurückbleiben. Die Mikrospritzer haben wegen ihrer winzigen Dimensionen ein weit erhöhten Dampfdruck. Bei der vollständigen Verdampfung entstehen in der Ionenwolke (14) neben einfach geladenen Ionen auch mehrfach geladene, die sich besonders für Fragmentierungen und damit für Strukturuntersuchungen der Moleküle eignen.
Der Prozess beim Aufprall der Mikrotröpfchen kann sehr stark durch die Geschwindigkeit der Mikrotröpfchen (2) gesteuert werden. Zur Steuerung der Geschwindigkeit werden die Mikrotröpfchen (2) nach Verlassen der Einlasskapillare einer Nachbeschleunigung unterzogen, wobei eine Nachbeschleunigungsspannung bis zu einigen Kilovolt zwischen dem Ende (3b) der Einlasskapillare (3) und einem Gasabstreifer (8), der die Öffnung von der ersten Pumpstufe (4) zur nächsten Pumpstufe (9) bildet, angelegt sein kann. Durch eine Formung der Kammer (4) kann eine Gasentladung vermieden werden. Der Gasabstreifer (8) kann beispielsweise, wie auch die Probenträgerplatte (13), auf Massepotential liegen, wobei das Potential zur Beschleunigung der Mikrotröpfchen allein am metallisierten Ende (3b) der Einlasskapillare (3) liegt. Die Probenträgerplatte (13) befindet sich dabei vorzugsweise hinter dem Gasabstreifer (8) in der zweiten Stufe (9) des differentiellen Pumpsystems.
Die Beschleunigung der Mikrotröpfchen kann aber auch an anderer Stelle auf dem Wege zur Probenträgerplatte erfolgen.
Die Analytionen, die vor der Probenträgerplatte (13) erzeugt werden, bilden eine nicht fest abgegrenzte Ionenwolke (14), die dem Massenanalysator zugeführt werden muss. Dazu dient erfindungsgemäß der Ionentrichter (11), dessen Funktion oben bereits näher beschrieben wurde. Der Ionentrichter (11) leitet die Ionen der Ionenwolke (14) sachte zu seinem engen Austrittsende und sendet sie in Richtung (12) zum Massenanalysator.
Die Ausbeute an Analytionen ist außerordentlich hoch, um mehrere Zehnerpotenzen höher als die Ausbeute einer Ionisation durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) im Vakuum. Ein weiterer Vorteil gegenüber MALDI besteht darin, dass der Strahl der Mikrotröpfchen insbesondere aus adsorbierten Biomolekülen (wie bei Elektrosprühen) auch mehrfach geladene Ionen erzeugt, die sich in geeigneten Massenspektrometern sehr viel besser und informationsreicher fragmentieren lassen als die ganz überwiegend einfach geladenen MALDI-Ionen. Zur Fragmentierung können dabei die bekannten Verfahren wie Stoßfragmentierung bei niedrigen oder hohen Stoßenergien, Elektroneneinfang, Elektron-Transfer-Reaktionen oder andere verwendet werden.
Ein Mikrotröpfchen mit seinen Tausenden von Protonen kann beim Aufprall auf die Probenträgerplatte (13) eine große Menge an positiv geladenen Analytionen erzeugen. Es gibt in der Literatur Hinweise, dass ein Mikrotröpfchen von 300 Nanometer Durchmesser einen Bereich der Oberfläche von etwa 300 Nanometer Durchmesser vollkommen von adsorbierten Analytmolekülen leer fegen kann, wenn die Belegung nicht übermäßig groß ist, und die dabei desorbierten Analytmoleküle weitgehend ionisiert. Im Negativmodus können mit den dann negativ geladenen Mikrotröpfchen negativ geladene Analytionen erzeugt werden.
Die kleinsten Konzentrationen von Peptiden, die sich mit Sorgfalt und schnellem Arbeiten noch ohne größere Verluste an Gefäß- und Pipettenwänden handhaben lassen, liegen bei etwa zehn Femtomol pro Mikroliter. Bringt man einen Mikroliter dieser Lösung auf einen Probenbereich von einem Quadratmillimeter auf, so entsteht nach Eintrocknen des Lösungsmittels ein Schicht aus adsorbierten Peptiden, die einem Hundertstel einer monomolekularen Belegung entspricht. Die Schicht besteht also aus vereinzelten Peptidmolekülen, die auf der Oberfläche adsorbiert sind, obwohl sich auf dem Quadratmillimeter insgesamt etwa sechs Milliarden Peptidmoleküle befinden. In einem Aufprallbereich eines Mikrotröpfchens mit etwa 300 Nanometer Durchmesser befinden sich dabei 600 Peptidmoleküle, die zu einem großen Teil ionisiert werden. Nimmt dabei eine Ionenausbeute von nur zehn Prozent an, so erhält man etwa 60 Ionen pro Mikrotröpfchen, bei 100 000 Mikrotröpfchen pro Sekunde etwa sechs Millionen Ionen pro Sekunde. Könnte man durch sorgfältiges Scannen des Probenbereichs alle Mikrotröpfchen dicht an dicht nebeneinander setzen, so könnte man diesen erheblich großen analytischen Ionenstrom über 100 Sekunden hinweg aufrecht erhalten.
Geringfügig kleinere Ionenströme erhält man, wenn man nur 10 000 Mikrotröpfchen pro Sekunde erzeugt, aber mit Durchmessern von 500 bis 600 Nanometern.
Für ein sehr gutes Massenspektrum braucht man, je nach Signalreichtum des Massenspektrums, nur etwa einige Hundert bis zu maximal 10 000 Ionen. Man erhält also von diesen zehn Femtomol an Peptidmolekülen einen Ionenstrom, mit dem sich selbst bei beträchtlichen Ionenverlusten im Massenspektrometer Hunderte von Massenspektren aufnehmen lassen. Mit diesem Ionenstrom lassen sich in dazu geeigneten Massenspektrometern große Anzahlen von Fragmentspektren aufnehmen, obwohl für Fragmentspektren größere Anzahlen von Analytionen gebraucht werden. Die Nachweisgrenze wird vermutlich bei wenigen Attomolen oder sogar weit darunter liegen, sie hängt im Wesentlichen von Verunreinigungen ab, deren Signalrauschen die Ionenmessung stört. Die tiefe Nachweisgrenze ist besonders für Gemischanalysen sehr wertvoll.
Da dieses Verfahren keine Matrixmoleküle zur Unterstützung der Desorption braucht, ist das Massenspektrum weit weniger mit chemischen Rauschen durch die Matrixsubstanz belastet, die in der Regel im Laserplasma zahlreiche Clusterionen und Fragmente daraus bildet. Das Massenspektrum ist also weit weniger durch chemisches Rauschen gestört als MALDI-Massenspektren. Schon aus diesem Grund liegen die Nachweisgrenzen für dieses Verfahren erheblich tiefer als bei MALDI.
Für höhere Analytkonzentrationen kann es aber auch im erfindungsgemäßen Verfahren von Vorteil sein, die Analytmoleküle durch mit aufgebrachte Matrixsubstanzen zu verdünnen und zu vereinzeln, damit sie nicht als Cluster ionisiert werden können. Es können hier aber Matrixsubstanzen ganz anderer Art als für MALDI verwendet werden, weil sie weder für Aufnahme der Laserenergie, noch für die Protonierung der Analytmoleküle zur Verfügung stehen müssen. Es sind hier insbesondere Substanzen mit sehr niedrigen Molekulargewichten von Vorteil, deren Ionen im Ionentrichter ausgeschieden werden können, weil sie unterhalb der Massenschwelle liegen.
Im Gegensatz zu MALDI, bei dem die Probenträgerplatte außerordentlich eben und präzise geformt sein muss, braucht man für dieses Verfahren keine ebene Ausbildung. Es kann der Probenbereich sogar rau oder mikrostrukturiert sein. Beispielsweise können im Probenbereich Mikrobeads aufgelagert werden, auf deren Oberfläche die Analytmoleküle adsorbiert sind. Mikrobeads erlauben den verlustarmen Umgang mit sehr kleinen Probenmengen. Die Probenträgerplatte (13) kann sogar aus elektrisch isolierendem Material, beispielsweise aus Polytetrafluorethylen (PTFE), oder aus Metall mit elektrisch isolierenden Oberflächenbeschichtungen hergestellt sein.
Die Ionen, die durch das Zerplatzen der Mikrotröpfchen erzeugt werden, fliegen durch ihre Coulombsche Abstoßung, aber auch schon durch den Zerplatzungsprozess, in alle Richtungen auseinander. Sie müssen wieder eingesammelt und konzentriert werden. Es ist daher die Verwendung eines Ionentrichters (11) ein essentieller Grundbestandteil der Erfindung.
Als Massenspektrometer zur Analyse der Ionen des Ionenstrahls (12) kann im Prinzip jede Art von Massenspektrometer verwendet werden. Es gibt jedoch besonders günstige Arten von Massenspektrometern, so beispielsweise Ionenzyklotronresonanzspektrometer für besonders genaue Bestimmungen der Ionenmasse, mit Genauigkeiten besser als einem Millionstel der Masse, oder Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen für die Untersuchung der Struktur der Analytmoleküle durch die Bildung von Enkel- und Urenkelionen.
Ganz besonders günstig sind aber Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss, weil sie bei relativ kleiner Bauform eine sehr gute Massengenauigkeit (einige Millionstel der Masse) mit einer hohen Messdynamik und sehr schneller Spektrenaufnahme verbinden. Einigen dieser Flugzeitmassenspektrometern sind auch Stationen zur Auswahl von Elternionen und zur Fragmentierung dieser Elternionen in Tochterionen vorgeschaltet, die zum Studium der Struktur der Analytionen verwendet werden können.
Die hier geschilderte Einrichtung aus 4 kann insbesondere in der Proteinanalytik eingesetzt werden. So können beispielsweise einzelne Proteine, die durch 2D-Gelelektrophorese getrennt und einzeln durch Verdauenzyme, beispielsweise Trypsin, zu Verdaupeptiden verdaut wurden, durch diese Einrichtung identifiziert und auf Abweichungen und Modifizierungen hin untersucht werden. Das Gemisch der Verdaupeptide wird dazu in Lösung auf einen Probenbereich der Probenträgerplatte (13) aufgetragen. Nach Trocknung der Probe wird die Probenträgerplatte in die Einrichtung der 4 durch eine nicht gezeigte Schleuse eingeschleust und durch die Bewegungseinrichtung der Probenträgerplatte so justiert, dass der Strahl aus Mikrotröpfchen genau auf den belegten Probenbereich trifft. Die Ionen der Verdaupeptide ergeben ein Massenspektrum, das die Masse jedes einzelnen Verdaupeptids sehr genau bestimmen lässt. Es können Massengenauigkeiten in der Größenordnung weniger Millionstel der Masse oder darunter erzielt werden, womit sich sehr eindeutige Identifizierung durch Suchen in Proteindatenbanken ergeben. Sollten sich Abweichungen für einzelne Verdaupeptide zeigen, so können die Ionen dieser Verdaupeptide fragmentiert werden. Die Massenspektren der Fragmentionen lassen dann mutative Änderungen oder posttranslationale Modifikationen erkennen. Auch Sequenzbestimmungen de novo sind möglich, wenn keine sonstigen Kenntnisse über das Protein vorliegen.
Hat die Probenträgerplatte (13) die Größe einer Mikrotiterplatte, so lassen sich auf ihr leicht 384 oder sogar 1536 einzelne Probenbereiche definieren, da, wie oben geschildert, bereits sehr kleine Probenbereiche von nur etwa einem Quadratmillimeter für eine Analyse der Analytionen ausreichen. Die einzelnen Probenbereiche können beispielsweise jeweils mit einem eingefrästen Ringgraben umgeben sein, der ein Auseinanderfließen der Probenlösung verhindert.
Es werde hier davon Abstand genommen, weitere Anwendungsverfahren und weitere Ausformungen der erfindungsgemäßen Einrichtungen zu schildern. In Kenntnis der grundlegenden Erfindung ist es dem Fachmann ein Leichtes, weitere Ausformungen der Verfahren und Einrichtungen vorzunehmen.

Claims

Ionenquelle für ein Massenspektrometer, bestehend aus (a) einer Elektrosprühkapillare zur Erzeugung von Mikrotröpfchen bei einem Druck von mehr als 10000 Pascal, (b) einer Einlasskapillare zwischen dem Elektrosprühbereich und dem Vakuumsystem des Massenspektrometers, wobei die Mikrotröpfchen durch die Einlasskapillare in das Vakuumsystem gelangen, (c) einer Prallplatte im Vakuumsystem des Massenspektrometers, die derart angeordnet ist, dass die Mikrotröpfchen durch eine gasdynamische Beschleunigung in der Einlasskapillare oder durch eine elektrische Beschleunigung im Vakuumsystem oder beides auf die Prallplatte treffen.
Ionenquelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenquelle eine Vorrichtung zum Heizen der Prallplatte aufweist.
Ionenquelle nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einlasskapillare am Eingang mit einer Verengung nach Art einer Laval-Düse versehen ist.
Ionenquelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroprühkapillare koaxial zur Einlasskapillare angeordnet ist.
Ionenquelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung zur Zuführung von temperiertem und befeuchtetem Schutzgas zwischen Elektroprühkapillare und Einlasskapillare vorhanden ist.
Ionenquelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung zur Regelung oder Steuerung der Temperatur und der Feuchte des Schutzgases vorhanden ist.
Ionenquelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Prallplatte als Probenträgerplatte ausgeführt ist.
Ionenquelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenträgerplatte voneinander getrennte Probenbereiche aufweist.
Ionenquelle nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass Ionenquelle eine Vorrichtung zur Bewegung der Probenträgerplatte parallel zu ihrer Oberfläche aufweist.
Ionenquelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenträgerplatte die Größe einer Mikrotiterplatte hat.
Ionenquelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Prallplatte innerhalb eines Ionentrichters oder an der Eingangsöffnung eines Ionentrichters angeordnet ist.
Ionenquelle nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Prallplatte in einer ersten oder zweiten Druckstufe des Vakuumsystems befindet.
Verfahren zur Ionisierung von Analytmolekülen, mit den folgenden Schritten: (a) Erzeugung von geladenen Mikrotröpfchen durch Elektrosprühen in einem Schutzgas bei einem Druck von mehr als 10000 Pascal, (b) Überführung von Mikrotröpfchen zusammen mit Schutzgas durch eine Einlasskapillare in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers, (c) Beschleunigung der Mikrotröpfchen in einem elektrischen Feld, (d) Aufprall der Mikrotröpfchen auf eine Prallplatte zur Erzeugung von Analytionen aus den Analytmolekülen, die auf der Prallplatte bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Analytionen durch einen Ionentrichter eingesammelt und weitergeleitet werden.
Verfahren zur Ionisierung von Analytmolekülen, mit den folgenden Schritten: (a) Erzeugung von geladenen Mikrotröpfchen durch Elektrosprühen einer Sprühflüssigkeit, in der Analytmoleküle gelöst sind, in einem Schutzgas bei einem Druck von mehr als 10000 Pascal, (b) Überführung von Mikrotröpfchen zusammen mit Schutzgas und bereits gebildeten Analytionen durch eine Einlasskapillare in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers, (c) Aufprall der Mikrotröpfchen auf eine beheizte Prallplatte zur Erzeugung von Analytionen aus Analytmolekülen, die vor dem Aufprall auf die beheizte Prallplatte noch in den Mikrotröpfchen gelöst sind.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Analytionen durch einen Ionentrichter eingesammelt und weitergeleitet werden.