-
Technisches
Gebiet
-
Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Ionisation
durch Cluster-Ionen-Stoß.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Ionisationsverfahren und
eine Ionisationsvorrichtung, die zur Massenanalyse (Massenspektrometrie)
von großen
Biomolekülen
wie z.B. Proteinmolekülen
und DNA-Molekülen
ideal sind.
-
Stand der
Technik
-
Ein
ionisiertes Gas muss einem Massenanalysator (Massenspektrograph
oder -spektrometer) zugeführt
werden, um die Massenanalyse durchzuführen. Da ionisierte Moleküle oder
Atome sich mit Ionen oder Elektronen mit der entgegengesetzten Polarität innerhalb
einer sehr kurzen Zeit wiedervereinigen, ist es erforderlich, dies
zu unterdrücken.
-
Das
Ionenstoßverfahren
stellt ein Verfahren zum Durchführen
der Ionisation für
die Massenanalyse einer biologischen Probe dar, die in einer Matrix gemischt
wurde. Mit einem Sekundärionen-Massenanalyseverfahren
unter Verwendung von Ar+ oder Xe+ als Primärion erleiden die Matrixmoleküle eine starke
Beschädigung.
Daher ist das Verfahren zum Analysieren von großen Biomolekülen nicht
geeignet. Außerdem
erscheint chemisches Rauschen und der Rauschabstand ist schlecht.
-
Ein
Massiv-Cluster-Stoß-Verfahren
(nachstehend als "MCI-Verfahren" bezeichnet) wurde
als neues Ionisationsverfahren entwickelt, das diese Nachteile beseitigt.
[Siehe J.F. Mahoney, D.S. Cornett und T.D. Lee, "Formation of Multiply Charged Ions from
Large Molecules Using Massive-Cluster Impact", RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY,
BAND 8, 403–406
(1994).] Dieses Verfahren beinhaltet elektrostatisches Sprühen von
Glycerol und den Beschuss einer Matrixprobe mit Ionen-Clustern mit
Massen von 106 bis 107 u,
die auf eine Valenz von +100 bis +1000 geladen sind. Gemäß diesem
Verfahren werden große
Biomoleküle nicht
zerlegt und Massenspektren mit geringem chemischen Rauschen werden
erhalten.
-
Da
das obige Verfahren Glycerol verwendet, besteht jedoch ein Problem,
das entsteht, darin, dass die Ionenquelle verunreinigt und geladen
wird, was die Intensität
des Ionen-Cluster-Strahls instabil macht. Das Verfahren hat nicht
die Stufe der praktischen Verwendung erreicht.
-
Offenbarung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung beseitigt die Nachteile des vorstehend erwähnten MCI-Verfahrens und
ihre Aufgabe besteht darin, ein Ionisationsverfahren und eine Ionisationsvorrichtung
bereitzustellen, bei denen die Desorption von Proteinmolekülen mit
einem Molekulargewicht von mehr als einigen Zehntausend möglich ist
und es möglich
ist, die Rekombination von Molekülen
mit positivem und negativem Ion zu unterdrücken und eine Massenanalyse mit
hoher Empfindlichkeit durchzuführen.
-
Ein
erfindungsgemäßes Ionisationsverfahren
umfasst die Schritte des Erzeugens von geladenen Tröpfchen (flüssigen Tröpfchen)
einer flüchtigen Flüssigkeit
in einem Zustand, bei dem die Tröpfchen gekühlt sind,
um deren Verdampfung zu unterdrücken;
des Einleitens der erzeugten geladenen Tröpfchen in eine ausgepumpte
bzw. evakuierte (Vakuum-) Kammer; und des Erzeugens eines elektrischen Feldes
in der evakuierten Kammer und des Beschleunigens der geladenen Tröpfchen durch
das elektrische Feld, um zu bewirken, dass sie eine Probe bombardieren,
wodurch die Probe desorbiert und ionisiert wird. Die ionisierten
Moleküle
werden in einen Massenanalysator eingeführt.
-
Eine
erfindungsgemäße Ionisationsvorrichtung
umfasst: einen Beschleuniger mit einer evakuierten (Vakuum-) Beschleunigungskammer,
in deren Innerem Beschleunigungselektroden und ein Probentisch angeordnet
sind und die außerhalb
einer Ioneneinleitungsöffnung
eines Massenanalysators vorgesehen ist und durch die Ioneneinleitungsöffnung mit
dem Inneren des Massenanalysators in Verbindung steht; und eine
geladene Tröpfchen
erzeugende Vorrichtung, die eine geladene Tröpfchen erzeugende Kammer aufweist,
die mit der evakuierten Beschleunigungskammer über eine Tröpfcheneinleitungsöffnung der
evakuierten Beschleunigungskammer in Verbindung steht, um geladene
Tröpfchen
einer flüchtigen
Flüssigkeit
in der geladene Tröpfchen erzeugenden
Kammer in einem Zustand zu erzeugen, bei dem die Tröpfchen gekühlt sind,
um deren Verdampfung zu unterdrücken;
wobei die durch die geladene Tröpfchen
erzeugende Vorrichtung erzeugten geladenen Tröpfchen von der geladene Tröpfchen erzeugenden
Kammer in die evakuierte Beschleunigungskammer über die Tröpfcheneinleitungsöffnung eingeleitet
werden, die Tröpfchen
durch die Beschleunigungselektroden, an die eine hohe Spannung angelegt
wurde, beschleunigt werden und eine Probe auf dem Probentisch bombardieren,
und Ionen der Probe, die dadurch desorbiert und ionisiert werden,
durch die Ioneneinleitungsöffnung
in den Massenanalysator eingeleitet werden.
-
Das
erfindungsgemäße Ionisationsverfahren wird
unter Verwendung dieser Ionisationsvorrichtung durchgeführt.
-
Eine
Mischlösung
aus Wasser/Methanol (zu der Essigsäure oder Ammoniak usw. zugegeben wurde)
oder Wasser stellt ein Beispiel für die flüchtige Flüssigkeit (Lösungsmittel) dar. Um die Verdampfung (Verdunstung)
der Lösungsmittelmoleküle von den erzeugten
geladenen Tröpfchen
zu unterdrücken, wird
die flüchtige
Flüssigkeit
oder das erzeugte geladene Tröpfchen
vorzugsweise auf eine Temperatur, die unmittelbar vor der Verfestigung
der geladenen Tröpfchen
herrscht, bei der Erzeugung der geladenen Tröpfchen (bis zur Einleitung
in die evakuierte Kammer oder evakuierte Beschleunigungskammer) gekühlt. Geladene
Tröpfchen,
die erzeugt wurden, werden bis in die evakuierte Kammer (oder evakuierte
Beschleunigungskammer) im gekühlten
Zustand geleitet.
-
Vorzugsweise
wird das Elektrosprayverfahren verwendet, um die geladenen Tröpfchen zu
erzeugen. Wenn eine kombinierte Verwendung von gekühltem Stickstoff-
(N2) Gas durchgeführt wird, das einer Temperaturregelung
unterzogen wurde, können
die Kühlung,
Erzeugung (Zerstäubung)
der geladenen Tröpfchen
und die Zufuhr in die evakuierte Kammer (evakuierte Beschleunigungskammer)
effizient durchgeführt
werden. Die Erzeugung der geladenen Tröpfchen kann unter Atmosphärendruck
(einschließlich
verringerten Drucks) durchgeführt
werden.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine flüchtige
Flüssigkeit
und nicht Glycerol wie beim MCI-Verfahren verwendet. Folglich tritt
das Problem der Dekontamination der Ionenquelle nicht auf.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung (insbesondere gemäß dem vorstehend
erwähnten
Elektrosprayverfahren) ist es möglich,
geladene Tröpfchen in
der Größenordnung
von Mikrometern zu erzeugen. Da die geladenen Tröpfchen von der geladene Tröpfchen erzeugenden
Kammer in die evakuierte Kammer (evakuierte Beschleunigungskammer)
im gekühlten
Zustand eingeleitet werden, wird die Verdampfung (Trocknung) der
geladenen Tröpfchen sehr
niedrig gehalten und die Abtastung wird innerhalb der evakuierten
Kammer (evakuierten Beschleunigungskammer) durchgeführt, während die Größe der Tröpfchen in
Mikrometergrößenordnung aufrechterhalten
wird.
-
Solche
massiven Cluster-Ionen werden durch ein elektrisches Feld innerhalb
der evakuierten Kammer (evakuierten Beschleunigungskammer) beschleunigt,
wodurch kinetische Energie auf sie übertragen wird und sie die
Probe (z.B. eine dünne Schicht
einer biologischen Probe) bombardieren. Schockwellen werden an der
Stoßgrenze
erzeugt und die Probe wird in der Größenordnung von Pikosekunden
verdampft und ionisiert.
-
Da
die Probe mit Cluster-Ionen mit massiver Größe beschossen wird, tritt eine
elektronische und Schwingungsanregung des Zielmoleküls zum Zeitpunkt
des Stoßes
nicht auf und nur die kinetische Energie der Moleküle in der
Probendünnschicht
wird selektiv angeregt. Da die Probe einem weichen Stoß durch
massive Cluster-Ionen ausgesetzt wird, werden folglich sogar Moleküle mit Molekulargewichten, die
mehrere Zehntausende überschreiten,
ionisiert, ohne eine Beschädigung
zu erleiden.
-
Da
die Probe in einem kurzen Zeitraum von Pikosekunden, der kürzer ist
als die Rekombinationslebensdauer von positiven und negativen Ionen,
verdampft und ionisiert wird, wird ferner die Rekombination unterdrückt und
die erzeugten Ionen können
effizienter in den Massenanalysator eingeleitet werden.
-
Als
verwendete biologische Probe kann eine, die gefroren wurde, um das
Trocknen zu verhindern, verwendet werden.
-
Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
-
1 stellt
ein Diagramm des Aufbaus einer Ionisationsvorrichtung dar.
-
Beste Art
zur Ausführung
der Erfindung
-
In 1 ist
ein Teil eines Massenanalysators (Massenspektrographen oder -spektrometers) 10, der
eine Ioneneinleitungsöffnung
umfasst, mit einer Ionisationsvorrichtung 20 ausgestattet.
-
Ein
Abscheider 11 mit einem Loch 11a ist am Teil des
Massenanalysators (z.B. eines Flugzeit-Massenanalysators) 10,
der die Ioneneinleitungsöffnung
aufweist, angebracht. Gebündelt
ausgerichtete Ionen werden in den Massenanalysator durch das Loch
(Ioneneinleitungsöffnung) 11a eingeleitet.
Das Innere des Massenanalysators 10 wird durch eine Evakuierungs-
bzw. Absaugvorrichtung (nicht dargestellt) auf einem Hochvakuum
gehalten.
-
Die
Ionisationsvorrichtung 20 umfasst eine geladene Tröpfchen erzeugende
Vorrichtung 30, die eine geladene Tröpfchen erzeugende Kammer (eine Ionenquellenkammer
oder eine Kammer für
kaltes Elektrospray) 31 aufweist, und einen Beschleuniger 40 mit
einer evakuierten Beschleunigungskammer 41, die sich von
der geladene Tröpfchen
erzeugenden Kammer 31 in einer geraden Linie fortsetzt.
-
Die
geladene Tröpfchen
erzeugende Vorrichtung 30 weist eine Einheit 32 für kaltes
Elektrospray, die eine Metallelektrisch leitende) Kapillare 33 aufweist,
an die eine hohe Spannung angelegt wird, und eine umgebende Röhre 34 auf,
die den Umfang der Kapillare in beabstandeter Beziehung bedeckt.
Die Enden der Metallkapillare 33 und der umgebenden Röhre 34 stehen
in das Innere der geladene Tröpfchen
erzeugenden Kammer 31 vor. Eine flüchtige Flüssigkeit (Lösungsmittel), die zu geladenen
Tröpfchen
wird, wird der Metallkapillare 33 zugeführt. Der Raum zwischen der
Metallkapillare 33 und der umgebenden Röhre 34 wird mit einem
Kühlmittel,
z.B. kaltem Stickstoff- (N2) Gas, als Zerstäubungsgas
beliefert. Das Stickstoffgas wird aus flüssigem Stickstoff erzeugt und
wird in die Umgebungsröhre 34,
nachdem seine Temperatur geregelt wurde, eingeleitet.
-
Stark
geladene, sehr feine Tröpfchen
(mit einem Durchmesser in der Größenordnung
von mehreren Mikrometer) D werden von der Spitze der Metallkapillare 33,
an die eine hohe Spannung angelegt wurde, in die geladene Tröpfchen erzeugende
Kammer 31 gesprüht.
Ferner wird das Stickstoffgas vom Ende der umgebenden Röhre 34 am
Umfang des Endes bzw. Mundstücks
der Metallkapillare 33 in die geladene Tröpfchen erzeugende
Kammer 31 eingeleitet. Das Stickstoffgas unterstützt das
Sprühen
der geladenen Tröpfchen,
kühlt die
geladenen Tröpfchen und
befördert
die geladenen Tröpfchen
D in Richtung der evakuierten Beschleunigungskammer 41 im
gekühlten
Zustand. Das Stickstoffgas wird aus der geladene Tröpfchen erzeugenden
Kammer 31 über
eine Auslaßöffnung zur
Außenseite
abgeführt.
-
Die
geladenen Tröpfchen
bilden eine flüchtige
Flüssigkeit.
Wenn die geladenen Tröpfchen
verdampft (getrocknet) werden, vermindert sich die Tröpfchengröße. Um die
Verdampfung der geladenen Tröpfchen
zu unterdrücken,
ist es das Stickstoffgas, das die geladenen Tröpfchen bei deren Erzeugung
und, bis die geladenen Tröpfchen
die evakuierte Beschleunigungskammer 41 erreichen, kühlt. Vorzugsweise
liegt die Kühltemperatur
ganz knapp vor jener, bei der sich die geladenen Tröpfchen verfestigen.
-
Beispiele
von flüchtigen
Flüssigkeiten,
die zu den geladenen Tröpfchen
werden und die erwähnt werden
können,
sind ein Wasser/Methanol-Gemisch (zu dem Essigsäure oder Ammoniak usw. zugegeben wurde)
oder Wasser (zu dem Essigsäure
oder Ammoniak zugegeben werden kann). Eine Kühltemperatur zum Verhindern
der Verdampfung der geladenen Tröpfchen
ist eine Temperatur in der Nähe
von Trockeneis – Aceton
im Fall des Wasser/Ethanol-Gemisches (zu dem Essigsäure oder
Ammoniak usw. zugegeben wurde).
-
Bei
diesem Ausführungsbeispiel
werden die geladenen Tröpfchen
durch das temperaturgeregelte Stickstoffgas gekühlt. Es kann jedoch so beschaffen sein,
dass die Gesamtheit der geladene Tröpfchen erzeugenden Vorrichtung 30 oder
der geladene Tröpfchen
erzeugenden Kammer 31 durch die Kühlvorrichtung auf eine vorgeschriebene
Temperatur gekühlt
wird. Eine Ultraschallschwingungsvorrichtung stellt ein weiteres
Beispiel einer geladene Tröpfchen erzeugenden
Vorrichtung dar. Obwohl das Innere der geladene Tröpfchen erzeugenden
Kammer 31 auf Atmosphärentemperatur
liegt, kann die Kammer in einem Zustand mit verringertem Druck gehalten
werden.
-
Eine
Blende 34 ist an der Grenze zwischen der geladene Tröpfchen erzeugenden
Kammer 31 und der evakuierten Beschleunigungskammer 41 vorgesehen
und ein winziges Loch 34a ist in der Blende 34 ausgebildet.
Das winzige Loch 34a stellt eine Einleitungsöffnung 34a für geladene
Tröpfchen dar.
Die geladene Tröpfchen
erzeugende Kammer 31 und die evakuierte Beschleunigungskammer 41 stehen über die
Einleitungsöffnung 34a für geladene Tröpfchen miteinander
in Verbindung.
-
Die
geladenen Tröpfchen
D, die von der Spitze der Metallkapillare 33 weggesprüht werden,
bewegen sich in der Richtung der evakuierten Beschleunigungskammer 41 zusammen
mit dem gekühlten
Stickstoffgas innerhalb der geladene Tröpfchen erzeugenden Kammer 31 und
werden in die evakuierte Beschleunigungskammer 41 durch
das winzige Loch 34a der Öffnung 34 eingeleitet.
-
Beschleunigungselektroden 42 und
ein Probentisch 43 sind innerhalb der evakuierten Beschleunigungskammer 41 vorgesehen.
Eine positive oder negative (welche auch immer zur Polarität der geladenen
Tröpfchen
entgegengesetzt ist) hohe Spannung (z.B. 10 kV) wird an die Beschleunigungselektroden 42 angelegt.
Die geladenen Tröpfchen
D, die in das Innere der evakuierten Beschleunigungskammer 41 eingeleitet
wurden, werden durch die Beschleunigungselektroden 42 beschleunigt
und gebündelt
(fokussiert) und bombardieren eine Probe S, die auf dem Probentisch 43 vorgesehen
wurde, in einem Winkel und Moleküle,
die von der Probe ionisiert wurden, werden desorbiert. Das Innere
des Massenanalysators 10 und der evakuierten Beschleunigungskammer 41 stehen über die
Ioneneinleitungsöffnung 11a,
die im Abscheider 11 vorgesehen ist, in Verbindung. Ionenmoleküle (oder
-atoms), die durch den Beschuss mit geladenen Tröpfchen erzeugt wurden und die
senkrecht von der Oberfläche
der Probe S (des Probentischs 43) wegströmen, werden
durch die Ioneneinleitungsöffnung 11a in
den Massenanalysator 10 eingeleitet.
-
Die
so durch die geladene Tröpfchen
erzeugende Vorrichtung 30 erzeugten geladenen Tröpfchen weisen
eine Größe in der
Größenordnung
von Mikromatern auf. Diese werden als massive Cluster-Ionen bezeichnet.
Die massiven Cluster-Ionen werden von der geladene Tröpfchen erzeugenden Kammer 31 in
die evakuierte Beschleunigungskammer 41 eingeleitet, während ihre
Tröpfchengröße in der
Größenordnung
von Mikrometern aufrechterhalten wird, und werden durch das elektrische
Feld der Beschleunigungselektroden 42 beschleunigt. Auf
die massiven Cluster-Ionen wird beispielsweise eine kinetische Energie
in der Größenordnung
von 10 keV übertragen.
-
Die
Dünnschicht
S der biologischen Probe, die gefroren wurde, um das Trocknen zu
verhindern, wird beispielsweise durch den Probentisch 43 gehalten.
Die beschleunigten massiven Cluster-Ionen bombardieren die Dünnschicht
S der biologischen Probe (z.B. eine biologische Probe, die auf poröses Silizium
aufgebracht wurde). Folglich wird die Dünnschichtprobe in einer kurzen
Zeit von Pikosekunden verdampft. Obwohl positive und negative Ionen
in der Probe in gleichen Mengen existieren, werden die Ionen in
einer Zeitspanne erzeugt, die kürzer
ist als die Rekombinationslebensdauer dieser Ionen. Folglich wird
die Rekombination von (eine Neutralisationsreaktion zwischen) den
erzeugten Ionen verhindert und viele Ionen werden von der evakuierten
Beschleunigungskammer 41 durch die Ioneneinleitungsöffnung 11a in
den Massenanalysator 10 geliefert. Dies macht eine sehr
empfindliche Massenanalyse möglich.
-
Da
die Probe mit Cluster-Ionen mit massiver Größe beschossen wird, tritt ferner
eine elektronische und Schwingungsanregung des Zielmoleküls zum Zeitpunkt
des Stoßes
nicht auf und nur die kinetische Energie wird selektiv angeregt.
Folglich werden selbst Moleküle
wie z.B. Proteine mit Molekulargewichten, die mehrere Zehntausende überschreiten,
ionisiert, ohne eine Beschädigung
zu erleiden. Mit anderen Worten, eine Massenanalyse (z.B. orthogonale
Flugzeit-Massenanalyse) von biologischen Molekülen, einschließlich Protein,
wird möglich.
-
Zusammenfassung:
-
(von der WIPO veröffentlicht)
-
VERFAHREN ZEIT IONISATION
DURCH CLUSTER-IONEN-BESCHUSS UND VORRICHTUNG DAFÜR
-
Ionisation
von Biomolekülen
wie z.B. Proteinmolekülen
ohne irgendeine Beschädigung.
Insbesondere wird die Ionisation von Biomakromolekülen durch
Bilden von gigantischen Cluster-Ionen eines Wasser/Methanol-Gemisches
in Mikrometergrößenordnung
(Essigsäure
oder Ammoniak usw. zugegeben) (nahe der Trockeneis/Aceton-Temperatur)
usw. mittels eines kalten Elektrosprays (32) in einer Aufladungskammer
(31) zur Erzeugung flüssiger
Tröpfchen,
Beschleunigen derselben mittels eines elektrischen Feldes mit hoher
Spannung von etwa 10 kV in einer Vakuumbeschleunigungskammer (41)
und Beschießen
einer gekühlten
Bioproben-Dünnschicht, die
auf ein Probensubstrat aufgebracht wurde, mit beschleunigten Ionen
erreicht.