DE102005044307B4

DE102005044307B4 - Ionisierung desorbierter Moleküle

Info

Publication number: DE102005044307B4
Application number: DE102005044307A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen; Karsten Michelmann
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2005-09-16
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2025-09-17
Also published as: GB201100920D0; GB0618124D0; GB2474172A; US20090039283A1; GB2434911A; GB2474172B; DE102005044307A1; GB2434911B; US7504640B2

Abstract

Verfahren für die Erzeugung von Analyt-Ionen aus Analytmolekülen für eine Analyse in einem Spektrometer, wobei sich die Analytmoleküle in Proben auf einem festen Probenträger befinden, dadurch gekennzeichnet,
– dass die Analytmoleküle in einem Umgebungsgas bei einem Druck zwischen 10 und 1000 Pascal desorbiert werden,
– dass in einer Reaktant-Ionenquelle Reaktant-Ionen erzeugt werden,
– dass die Reaktant-Ionen durch ein Ionenleitsystem der Desorptionsstelle zugeführt werden, und
– dass die desorbierten Analytmoleküle durch die Reaktant-Ionen ionisiert werden.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von Ionen von Analytmolekülen, die von Oberflächen geeigneter Probenträger herunter desorbiert werden.
Die Erfindung desorbiert die Analytmoleküle in einem Druckbereich von etwa 30 bis 300 Pascal und ionisiert sie durch zugeführte Reaktant-Ionen. Die Reaktant-Ionen werden in einer eigenen Ionenquelle erzeugt und durch Ionenleitsysteme an die Stelle vor der Probe geleitet. Die Analytmoleküle können sich in Matrixmaterial befinden, aber auch ohne Zusätze auf einer Oberfläche adsorbiert sein. Die Desorption kann kontinuierlich oder gepulst erfolgen, beispielsweise durch Licht aus Lasern oder Dioden.
Stand der Technik
Eine bedeutende Ionisierungsart für Biomoleküle ist die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI). Diese ionisiert die Biomoleküle aus Proben, die sich in einer Mischung mit den Molekülen einer Matrixsubstanz auf Probenträgern befinden. Das Verhältnis von Analytmolekülen zu Matrixmolekülen beträgt etwa eins zu zehntausend. Auf einem Probenträger können Hunderte von Proben aufgebracht werden. Dafür stehen Pipettierroboter zur Verfügung. Der Transport der Proben auf dem Probenträger in den Fokus eines UV-Pulslasers dauert nur Bruchteile von Sekunden, für die Analyse dieser Probe steht so viel Zeit wie immer nötig zur Verfügung (bis zum vollständigen Verbrauch der Probe). Das unterscheidet MALDI sehr vorteilhaft von der Elektrosprüh-Ionisierung, die nur einen sehr langsamen Probenwechsel bietet, oder, bei Kopplung mit der Chromatographie, eine Beschränkung der Analysenzeit auf die Dauer des chromatographischen Peaks erzwingt. Für die Identifizierung von tryptisch verdauten Proteinen, die durch 2D-Gelelektrophorese getrennt wurden, ist MALDI ideal. Auch die MALDI-Untersuchung von Peptiden, die durch Flüssigkeitschromatographie getrennt und auf MALDI-Probenträger aufgebracht wurden, ist im Vormarsch („HPLC-MALDI").
Es ist jedoch ein Nachteil von MALDI, nur etwa ein Zehntausendstel der Analytmoleküle zu ionisieren. Aus einem Attomol einer Analytsubstanz, also aus etwa 600 000 Molekülen, werden nur etwa 60 Analyt-Ionen gewonnen. Der Rest wird nicht ionisiert, wobei ein Teil der restlichen Moleküle in Spritzern geschmolzener Matrixsubstanz enthalten sein mag und sich einer Ionisierung völlig entzieht, während ein großer Teil der Analytmoleküle im Prozess der Laserdesorption einfach nicht ionisiert wird.
Die matrix-unterstützte Laserdesorption wird bisher überwiegend im Hochvakuum vorgenommen. Sie geht von einer festen Probenpräparation auf einem Probenträger aus. Die Probenpräparation besteht im Wesentlichen aus kleinen Kriställchen der Matrixsubstanz, der in geringen Anteilen (nur etwa ein hundertstel Prozent oder weniger) Moleküle der Analytsubstanz beigemischt sind. Diese Analytmoleküle sind einzeln in das Kristallgitter der Mat rixkristalle eingebaut oder befinden sich in Kristallgrenzflächen. Die so präparierten Proben werden mit kurzen Pulsen von UV-Laserlicht bestrahlt. Die Dauer der Pulse beträgt etwa zwei bis zehn Nanosekunden. Dabei entstehen Verdampfungswolken, die sowohl Ionen der Matrixsubstanz wie auch einige Analyt-Ionen enthalten. Die Analyt-Ionen sind zum Teil bereits in der Probe ionisiert enthalten, entstehen zu einem weiteren Teil direkt bei dem explosionsartigen Verdampfungsprozess im heißen Plasma, und werden zu einem dritten Teil in der sich ausdehnenden Wolke durch Protonenübertragung in Reaktionen mit den Matrix-Ionen gebildet.
Die früher nur im Hochvakuum verwendete Laserdesorption wird seit Neuestem auch an Atmosphärendruck benutzt, was die Probenzuführung einfacher macht, aber bisher nicht die Nachweisstärke erhöht. Dieses Verfahren wird mit der Abkürzung AP-MALDI bezeichnet.
Diese Laserdesorption an Atmosphärendruck ist durch die Bildung einer Dampfwolke charakterisiert, die durch den Laserlichtschuss aus pulsförmig verdampftem Probenpräparationsmaterial entsteht, und die sich mit dem Umgebungsgas bewegen lässt. Die Dampfwolke besteht zunächst nur aus Matrixdampf mit ebenfalls in die Gasphase gepusteten Analytmolekülen. Ein nur sehr kleiner Teil in der Größenordnung von einem hundertstel Prozent der Analytmoleküle oder weniger ist ionisiert. Die Matrixsubstanz ist ähnlich schwach ionisiert; in absoluten Zahlen sind aber die Matrix-Ionen um ein vielfaches zahlreicher. Diese Dampfwolke vermischt sich in einer dünnen Grenzschicht mit Umgebungsgas, bleibt aber für längere Zeit beieinander. In der Dampfwolke können daher die Matrix-Ionen weiter durch Stöße mit Analytmolekülen unter Bildung von Analyt-Ionen reagieren. Es mögen auf diese Weise bei Atmosphärendruck mehr Analyt-Ionen gebildet werden als bei MALDI im Hochvakuum, doch steht diesem Vorteil der Nachteil gegenüber, dass die Ionen aus dieser mehr oder weniger ausgedehnten Dampfwolke an Atmosphärendruck herausgeführt und in das Vakuumsystem des Massenspektrometers überführt werden müssen. Die dabei auftretenden Verluste an Analyt-Ionen sind bislang größer als der Gewinn an zusätzlichen Analyt-Ionen – wenn dieser denn überhaupt auftritt.
Es ist auch ein Verfahren der matrix-unterstützten Laserdesorption an Atmosphärendruck bekannt geworden, in dem nicht die Laserdesorption selbst die Ionisierung der Analytmoleküle bewirkt, sondern in dem anschließende Ionen-Molekül-Reaktionen die Ionisierung übernehmen. Die Matrixsubstanz braucht damit nicht mehr die Aufgabe der Ionisierung der Analytmoleküle zu übernehmen. Für die Desorption kann dabei im Besonderen als Matrix eine Substanz verwendet werden, die sich unter Laserbeschuss zu kleinen Gasmolekülen zersetzt und somit lediglich die drei Aufgaben hat, (1) die Analytsubstanzen fest auf der Oberfläche des Probenträgers zu binden, (2) die Laserstrahlung zu absorbieren, und (3) sich zersetzend zu verdampfen und dabei die eingesperrten Analytmoleküle intakt und voneinander isoliert in die Gasphase zu überführen. Anschließend wird die chemische Ionisierung vorge nommen, beispielsweise mit einer Bildung von primären Ionen durch die Elektronen einer Corona-Entladung (J. Franzen und C. Köster, DE 196 08 963 A1 ; entsprechend GB 2 299 445 B und US 5,663,561 A ). Es ist jedoch schwierig, die chemische Ionisierung vorzunehmen, da sich die Gaswolke mit den Analytmolekülen und die Gaswolke mit den Ionen für die chemische Ionisierung nur sehr schlecht in kurzer Zeit genügend intensiv miteinander vermischen lassen.
Die Desorption von Analytmolekülen braucht nicht unbedingt durch Laserlicht zu erfolgen. Es ist möglich, adsorbierte Moleküle auch durch Schockwellen, durch Temperaturschocks und insbesondere durch Vakuumüberschläge (Funken) zu desorbieren, wenn auch die Desorption durch Laserlicht weitaus am bequemsten ist.
Es wurde auch bereits über MALDI in einem Umgebungsgas bei einem Druck von etwa 10 Pascal (A. N. Krutchinski et al., Rapid Comm. Mass Spectrom. 12, 1998, 508-518) und in einem Druckbereich zwischen 10 Pascal und 1000 Pascal ( WO 00/77822 A1 ) berichtet. Eine MALDI-Ionenquelle, die ebenfalls in dem Druckbereich zwischen 1 und 10 Pascal, jedoch unter einem Druckstoß eines pulsförmig zugeführten Gases arbeitet, ist in DE 199 11 801 C1 (G. Baykut) beschrieben worden. In US 2005/0092918 A1 und US 6 903 334 B1 werden sogenannte Ionentrichter verwendet, um die in einer Ionenquelle erzeugten Ionen in ein Ionenmobilitätsspektrometer oder ein Massenspektrometer zu überführen. Die Ionenquelle kann dabei auch eine MALDI Ionenquelle sein. Durch ein abfallendes Gleichspannungspotential entlang des Ionentrichters können Ionen in einem solchen Ionentrichter aktiv geleitet werden ( EP 1 367 632 A2 ). Aus der Offenlegungsschrift EP 1 536 452 A1 ist bekannt, dass Analytmoleküle durch das Aufheizen einer Probe bei Umgebungsdruck desorbiert werden und über eine Zwischenkammer in eine Messkammer eines Massenspektrometers überführt werden. Der Druck beträgt dabei in der Zwischenkammer etwa 100 Pascal und in der Messkammer etwa 1/1000 Pascal.
Wenn hier von „Masse der Ionen" oder auch nur einfach von „Masse" in Verbindung mit Ionen die Rede ist, so ist stets die „ladungsbezogene Masse" m/z gemeint, also die physikalische Masse m der Ionen geteilt durch die dimensionslose und absolut genommene Anzahl z der positiven oder negativen Elementarladungen, die dieses Ion trägt.
Unter „Desorption" sollen hier, wie schon beim Begriff MALDI (matrix-unterstützte Laserdesorption und Ionisierung) üblich, alle Arten der Freisetzung von Molekülen aus der festen Phase in die Gasphase verstanden werden. Dabei soll es keine Rolle spielen, ob die zu desorbierenden Moleküle nackt auf einer Oberfläche adsorbiert sind, oder ob sie sich in oder an anderem Material, gleich welcher Art, eingeschlossen oder angelagert befinden.
Unter „Ionenleitsystem" soll hier eine Einrichtung verstanden werden, mit der Ionen gezielt von einem Ort zu einem anderen transportiert werden können. Das kann aerodynamisch oder durch elektrische und magnetische Elektroden- oder Jochsysteme geschehen, insbesondere aber durch Stabsysteme oder Lochblendensysteme, die mit den Phasen einer Hochfrequenzspannung beaufschlagt werden.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Gerät bereitzustellen, mit denen in Proben auf Probenträgern befindliche Analytmoleküle mit hoher Ausbeute ionisiert werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird durch die nebengeordneten Ansprüche 1, 14 und 17 gelöst. Die Erfindung beruht auf einer Desorption der Analytmoleküle in einem Umgebungsgas in einem Druckbereich von vorzugsweise 30 bis 300 Pascal und auf einer Ionisierung der desorbierten Analytmoleküle durch geeignete Reaktant-Ionen, wobei die Reaktant-Ionen in einer eigenen Reaktant-Ionenquelle hergestellt und dem Ort vor der desorbierenden Probe durch ein Ionenleitsystem kontinuierlich oder getaktet zugeleitet werden. In diesem Druckbereich werden die desorbierten Analytmoleküle einerseits effizient durch das Umgebungsgas gekühlt und so vor Zersetzung bewahrt, und andererseits schnell mit den Reaktant-Ionen gemischt. Die Desorption kann kontinuierlich, aber auch gepulst erfolgen. Sie kann insbesondere durch Licht aus Laser oder Dioden erfolgen.
Die Erfindung desorbiert zunächst die Analytmoleküle aus den Proben auf der Oberfläche eines Probenträgers bei einem Druck eines Umgebungsgases zwischen etwa 30 und 300 Pascal vorzugsweise durch Licht aus einem Laser oder einer Laserdiode. Je nach Umgebungsgas und Probenpräparation kann der optimale Druck auch zwischen 10 und 1000 Pascal liegen. Als Umgebungsgas kann insbesondere Reinststickstoff, aber auch Helium, Argon oder ein anderes leichtes Gas verwendet werden. Vorzugsweise soll das Umgebungsgas inert sein. Sind die Analytmoleküle auf der Oberfläche des Probenträgers in Matrixmaterial eingeschlossen, so befinden sie sich nun in einer Wolke aus desorbierendem Probenmaterial, sonst befinden sie sich allein im Umgebungsgas. Es kann die Desorption im Prinzip statt durch Licht auch durch andere Desorptionsprozesse vorgenommen werden, doch ist die Desorption durch Licht geeigneter Wellenlänge eine eingeführte, vielfach bewährte und leicht handhabbare Methode. Durch das Umgebungsgas wird die Desorptionswolke in ihrer schnellen Ausdehnung genügend gehemmt und es werden die Analytmoleküle so schnell gekühlt, dass sie sich ganz überwiegend nicht zersetzen können. Die Analytmoleküle befinden sich also nach der Desorption ungebunden und stabil in der Gasphase.
Die Erfindung ionisiert nun die freigesetzten Analytmoleküle vorzugsweise durch Protonenübertragung in Reaktionen mit Reaktant-Ionen, wie von chemischer Ionisierung her bekannt. Die Reaktant-Ionen befinden sich bei gepulster Desorption bereits in einer dichten Ansammlung vor der Probe, oder sie werden, insbesondere bei kontinuierlicher Desorption, der desorbierenden Wolke mit Analytmolekülen zusammen mit etwas Umgebungsgas kontinuierlich oder getaktet zugeblasen. Im genannten Druckbereich mischen sich die Desorptionswolke und das zugeführte Umgebungsgas mit den Reaktant-Ionen wegen der freien Weglängen von einigen Hundertsteln bis zu einigen Zehnteln Millimeter zu großen Teilen praktisch sofort. Die beiden aufeinander treffenden Gasströmungen haben eine sehr breite Zone sofortiger Mischung, ganz anders, als das bei Atmosphärendruck zu finden ist.
Die Reaktant-Ionen werden in einer eigenen Reaktant-Ionenquelle vorzugsweise bei etwa dem gleichen Druck erzeugt, bei dem auch desorbiert wird, und durch Ionenleitsysteme vor oder während der Desorption in großen Mengen an die Stelle vor der Probe geleitet. Die Reaktant-Ionen können besonders vorteilhaft in einer Ionenquelle hergestellt werden, wie sie für chemische Ionisierungen verwendet wird. In einer klassischen CI-Ionenquelle werden aber die intern gebildeten Reaktant-Ionen noch in der Ionenquelle selbst mit Analytmolekülen zusammen gebracht, mit denen sie unter Ionisierung reagieren, während die Reaktant-Ionen hier aus der Ionenquelle extrahiert werden. Eine solche Reaktant-Ionenquelle arbeitet besonders gut bei einem Druck von etwa 100 bis 200 Pascal.
Wird die Desorption gepulst vorgenommen, so ist die sich adiabatisch ausdehnende Desorptionswolke mit den Analytmolekülen in etwa 10 bis 50 Mikrosekunden etwa 10 bis 20 Millimeter weit in das Umgebungsgas mit den Reaktant-Ionen penetriert; die Ionisierung der Analytmoleküle ist jetzt weitgehend abgeschlossen. Es kann jetzt die Wolke der Analyt-Ionen durch eine Schaltung von elektrischen Gleich- und Hochfrequenzfeldern in einen Ionentrichter getrieben werden, der die Analyt-Ionen über weitere Zwischenstationen zu einem Massenanalysator oder zu einem anderen Spektrometer führt. Der Ionentrichter kann an seinem Ende einen Blendenstapel enthalten, der durch besondere Formgebung ein Quadrupolfeld aufbaut, wodurch eine gute Fokussierung der Analyt-Ionen für die Extraktion durch einen als Linse ausgebildeten Lochblendenstapel erreicht wird. In dieser Phase der Weiterleitung der Analyt-Ionen kann auch die Hochfrequenzspannung an den Blenden des Ionentrichters so hoch gesetzt werden, dass die restlichen Reaktant-Ionen, die in der Regel ein relativ niedriges Molekulargewicht haben, aus dem System ausscheiden. Durch die Zeitdauern der benötigten Schritte für Ausdehnung der Desorptionswolke mit Reaktion der Analytmoleküle, Austreiben der Analytmoleküle aus dem Reaktionsraum und neues Befüllen des Reaktionsraumes mit Reaktant-Ionen ist die Pulsfrequenz auf etwa fünf bis maximal zehn Kilohertz beschränkt.
Bei kontinuierlicher Desorption, beispielsweise durch kontinuierliche Zersetzung einer Dünnschicht aus Sprengstoff im Fokus einer Laserdiode, werden auch die Reaktant-Ionen kontinuierlich oder auch schnell getaktet zugeführt. Die schnelle Taktung ist förderlich für eine schnelle Vermischung. Die entstehenden Analyt-Ionen können auch hier durch einen Ionentrichter aufgenommen und weitergeleitet werden. Es ist hier kein schnelles Schalten von Spannungen für den Abtransport der Analyt-Ionen notwendig. Für die kontinuierliche Desorption ist es günstig, eine hohe Wanderungsgeschwindigkeit des Lichtfokus auf dem Probenträger zu erzeugen. Eine Desorption, die durch eine hochfrequent modulierte Laserdiode mit einer Frequenz größer als 20 Kilohertz erzeugt wird, soll hier ebenfalls unter den Begriff „kontinuierliche Desorption" fallen, da in diesem Fall die einzelnen Desorptionswolken praktisch kontinuierlich ineinander laufen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die 1 bis 3 zeigen schematisch drei Phasen der Ionisierung von Analytmolekülen in einer Einrichtung nach dieser Erfindung, die mit gepulstem Laserlicht arbeitet.
Die bewegliche Probenträgerplatte (1) trägt eine Vielzahl von Proben (2), von den sich eine Probe (3) gerade im Fokus des Laserstrahls (9) befindet. Der Laserstrahl (9) aus dem Laser (8) wird über den Spiegel (7) auf die Probe (3) gelenkt. Die Probe (3) befindet sich an der Eingangsöffnung einer Reaktionskammer (15), die aus einer Vielzahl von Ringblenden (4) und (5) gebildet wird, wobei an abwechselnd aufeinander folgenden Ringblenden die beiden Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen. Es bildet sich dadurch ein so genanntes Pseudopotential, das Ionen abstößt und so in der Reaktionskammer (15) einsperren kann.
1 gibt diese Reaktionskammer (15) zur Zeit der Laserschusses wieder. Die Reaktionskammer (15) ist mit Reaktant-Ionen gefüllt, die aus einer Reaktant-Ionenquelle (10) mit Gaszuführung (11) stammen und über ein kleines Ionenleitsystem (14) in die Reaktionskammer (15) geleitet wurden.
2 zeigt den Zustand etwa 50 Mikrosekunden nach dem Laserschuss. Die Wolke (16) mit verdampftem Probenmaterial hat sich ausgedehnt; in der Wolke befanden sich auch die Analytmoleküle. Diese wurden durch die Reaktant-Ionen durch Protonenübertragung zu großen Anteilen ionisiert.
3 gibt wieder, wie jetzt die Analyt-Ionen durch ein leichtes Gleichspannungsgefälle an den Ringblendensystemen (4) und (5), das den Hochfrequenzspannungen überlagert ist, in den trichterförmigen Teil (5) der Reaktionskammer und von dort in den quadrupolaren Blendenstapel (6) getrieben werden. In diesem quadrupolaren Blendenstapel (6) herrscht vorzugsweise neben einem leichten Gleichspannungsabfall ein quadrupolares Hochfrequenzfeld, das die im Umgebungsgas in ihrer Bewegung gedämpften Analyt-Ionen in die Achse des Blendenstapels (6) bringt, woraus sie durch die Lochblendenlinse (12) besonders günstig in ein Hochfrequenz-Ionenleitsystem (13) weitergeleitet werden können. Dieses Ionenleitsystem (13) besteht hier aus Polstäben, die mit Hochfrequenzspannung versorgt sind, und kann die Analyt-Ionen beispielsweise in den Analysatorteil eines Massenspektrometers (hier nicht gezeigt) bringen, wo sie nach Massen und Intensitäten analysiert werden können.
4 zeigt eine Reaktionskammer vor der Probe (3), deren größter Teil nicht aus einer Vielzahl von Lochblenden aufgebaut ist, sondern einfach aus Ringblenden (16), die ein Gleichspannungspotential tragen, das die Reaktant-Ionen abstößt. Die Reaktant-Ionen werden durch das Achsenpotential des Ionentrichters (5) in diesen Teil der Reaktionskammer innerhalb der Ringblenden (16) hineingedrückt und können hier mit den Analytmolekülen reagieren. Durch Schalten eines Gleichspannungsabfalls an den Ringblenden (16) können die gebildeten Analyt-Ionen später in den Ionentrichter (5) hineingedrückt werden.
5 stellt einen Abschnitt eines quadrupolaren Blendenstapels dar. Dieser Blendenstapel bildet den Abschnitt (6) in den 1 bis 4.
6 gibt eine Apparatur zur kontinuierlichen Desorption wieder. Eine Laserdiode (17) mit integrierter Fokussierung und integriertem Ablenkspiegel überstreicht die Probe (3) oszillierend mit einem desorbierenden Lichtstrahl, wobei sich auch die Probenträgerplatte (1) entsprechend bewegt, um eine kontinuierliche Desorption der Analytmoleküle zu erhalten. Aus der Reaktant-Ionenquelle (10) wird durch das rohrförmige Ionenleitsystem (14) kontinuierlich ein Strom aus Umgebungsgas mit Reaktant-Ionen zur Probe (3) geblasen.
7 stellt ein rohrförmiges Ionenleitsystem dar, das durch die Ummantelung (31) der Hexapolstäbe (32) für die Zuleitung der Reaktant-Ionen zusammen mit Umgebungsgas verwendet werden kann.
Bevorzugte Ausführungsformen
Einige Ausführungsformen von Verfahren, Ionenquellen zur Erzeugung von Analyt-Ionen aus desorbierten Analytmolekülen und zugehörigen Spektrometern werden in den Ansprüchen 1 bis 19 dargelegt.
Eine erste günstige Ausführungsform von Verfahren und Gerät, die mit gepulstem Laserlicht arbeitet, wird hier an Hand der 1 bis 3 dargestellt. Diese Abbildungen geben drei aufeinander folgende Phasen in einem Pulszyklus des Verfahrens wieder.
Eine Probenträgerplatte (1) trägt eine Vielzahl von Proben (2). Die Probenträgerplatte kann aus einem beliebigen Material bestehen; es ist allerdings günstig, wenn ein metallischer Kern, eine metallische Hinterlegung oder eine metallische Oberfläche ein elektrisches Potential annehmen kann, das zur späteren Beschleunigung der Ionen dienen kann. Die Probenträgerplatte (1) muss außerdem so beschaffen sein, dass die Proben (2) festgehalten werden und später ohne Absprengen größerer Probenbrocken desorbiert werden können. Da für die hier beschriebene günstige Ausführungsform eine Desorption durch Laserlicht vorgenommen wird, muss die Oberfläche der Probenträgerplatte einigermaßen resistent gegen eine Abtragung durch den Laserlichtpuls sein. Die Probenträgerplatte (1) ist parallel zur Oberfläche, die die Proben (2) aufnimmt, in zwei Richtungen verschiebbar, so dass alle Proben (2) nacheinander in den Fokus des Laserlichtstrahls (9) gebracht werden können. In 1 befindet sich die besonders gekennzeichnete Probe (3) im Fokus des Laserlichtstrahls (9).
MALDI-Proben bestehen bei normalem UHV-MALDI aus einer Matrixsubstanz mit einem geringen Anteil von nur etwa einem Hundertstel Prozent an Analytmolekülen. Die Verdünnung bewirkt, dass die Analytmoleküle nicht in Form von Dimeren oder Trimeren desorbiert werden; denn einmal gebildete Dimere und Trimere werden sich in der Gasphase nicht mehr trennen. Die Proben (2, 3) können in dieser Ausführungsform genau so beschaffen sein wie für UHV-MALDI. Die bei der Laserdesorption solcher Präparationen entstehenden geringen Anteile an Analyt-Ionen machen aber nur einen sehr kleinen Anteil an den nachfolgend gebildeten Analyt-Ionen aus. Daher braucht die in dieser Erfindung verwendete Matrixsubstanz die Ionisierung im Grunde überhaupt nicht zu übernehmen; es können also ganz andere, insbesondere auch nicht-ionisierende Matrixsubstanzen verwendet werden. Die Aufgaben der Matrixsubstanz bestehen also nur noch darin, die Analytmoleküle in fein verteilter Form auf der Probenträgerplatte (1) festzuhalten, Laserlicht aus dem Lichtpuls (9) zu absorbieren und das Probenmaterial so zu desorbieren, dass die Analytmoleküle weitgehend unbeschädigt und Probenmaterial so zu desorbieren, dass die Analytmoleküle weitgehend unbeschädigt und einzeln in die Gasform überführt werden. Eine besondere Form der Matrixsubstanzen, die sich unter der Wirkung des Laserlichts in kleine Moleküle zersetzt, wird weiter unten besprochen. Die Proben brauchen aber letztendlich nicht unbedingt eine Matrixsubstanz enthalten, es können adsorbierte Analytmoleküle auch nackt von der Oberfläche der Probenträgerplatte desorbiert werden, wie dies von der früher vielfach angewandten Laserdesorption (LD) bekannt ist.
Ein kleiner Teil der Probe (3) wird nun im Fokus des Laserstrahls (9) desorbiert, wobei der Laserstrahl (9) aus dem Laser (8) über den Spiegel (7) auf die Probe (3) gelenkt wird. Die zur Fokussierung notwendigen Linsen sind in 1 nicht wiedergegeben. Der Laser (8) ist in dieser Ausführungsform ein Pulslaser; die Desorption ist eine gepulste Desorption, die eine eigenständige Desorptionswolke erzeugt. Für die Matrixsubstanzen des klassischen UHV-MALDI wird ein UV-Laser im Wellenlängenbereich von etwa 320 bis 360 Nanometer verwendet, der bei ähnlicher Probenpräparation hier ebenfalls verwendet werden kann. Es kann hier aber auch, abhängig von den Absorptionseigenschaften der verwendeten Matrixsubstanz, Licht eines anderen Wellenlängenbereichs verwendet werden, beispielsweise Licht aus einem IR-Laser. Die Pulslänge des Lasers spielt hier eine untergeordnete Rolle, es können Laser mit Pulslängen von etwa einigen Hundert Femtosekunden bis zu mehreren Mikrosekunden verwendet werden. Preiswerte UV-Laser bieten Pulslängen von 2 bis 10 Nanosekunden.
Die Probe (3) und der Fokus des Laserlichtstrahls (9) befinden sich an der Eingangsöffnung einer Reaktionskammer (15), die aus einer Vielzahl von umschließenden Ringblenden (4) und (5) gebildet wird, deren Innenöffnungen eine virtuelle Wand für Ionen in der Reaktionskammer bilden. Die Ringblenden werden mit einer Hochfrequenzspannung versorgt, wobei die beiden Phasen der Hochfrequenzspannung jeweils an abwechselnd aufeinander folgenden Ringblenden liegen. Es bildet sich dadurch vor der virtuellen Wand der Reaktionskammer ein so genanntes Pseudopotential, das Ionen beider Polaritäten abstößt und so in der Reaktionskammer (15) einsperren kann. Die Ringblenden können durch offene Zwischenräume getrennt sein, es ist dann möglich, dass die Desorptionswolke schließlich durch diese Öffnungen entweicht. Die Reaktionskammer kann aber auch eine undurchdringliche Wand besitzen, so dass die Desorptionswolke lange festgehalten wird, beispielsweise für sehr effiziente Reaktionen mit den Reaktant-Ionen. Die Ringblenden können dann beispielsweise auf die Wand der Reaktionskammer mit einer leitfähigen Farbe aufgedruckt sein.
Diese Reaktionskammer und ihre Umgebung sind mit einem Umgebungsgas, vorzugsweise Reinststickstoff, gefüllt. Dieses Umgebungsgas kann auf einen günstigen Druck im Bereich von etwa 30 bis 300 Pascal eingestellt werden, wobei sich der optimale Druck durch eine optimale Ionisierung der Analytmoleküle auszeichnet und so auch eingestellt werden kann. Unter Umständen kann sich dieser optimale Druck auch etwas außerhalb dieses angegebenen Druckbereichs liegen und sich im Bereich zwischen etwa 10 bis 1000 Pascal befinden.
1 gibt diese Reaktionskammer (15) zur Zeit des Laserschusses wieder, also zu der Zeit, zu der der Laserlichtstrahl (9) auf die Probe (3) fällt. Die Reaktionskammer (15) ist zu dieser Zeit außer mit Umgebungsgas insbesondere auch mit Reaktant-Ionen gefüllt, die aus der Reaktant-Ionenquelle (10) stammen. Die Reaktant-Ionen, die im Inneren der Reaktant-Ionenquelle (10) erzeugt werden, können über ein kleines Ionenleitsystem (14) in die Reaktionskammer (15) geleitet werden. Das Ionenleitsystem mündet in das Lochblendensystem des Ionentrichters (5), der einen Teil der Reaktionskammer (15) bildet. Das Ionenleitsystem kann beispielsweise als Quadrupol-Stabsystem oder als Hexapol-Stabsystem ausgelegt sein. Das Einmünden von solchen Ionenleitsystemen in Ringblendensysteme wird in der nachveröffentlichten Offenlegungsschrift DE 10 2004 028 419 A1 beschrieben. Die Lochblendensysteme (4, 5) der Reaktionskammer (15), die ebenfalls ein Ionenleitsystem bilden, führen die Reaktant-Ionen weiter in Richtung Desorptionsstelle vor der Probe (3).
Abhängig von der Größe der Reaktionskammer (15) können etwa 10⁶ bis 10⁸ Reaktant-Ionen eingelagert werden. Eine Reaktionskammer mit etwa 30 Millimeter innerem Durchmesser und etwa 80 Millimeter Länge kann durchaus 10⁷ Reaktant-Ionen aufnehmen, die Reaktant-Ionen befinden sich dann allerdings, durch ihre eigene Raumladung voneinander abgestoßen, vorwiegend an der virtuellen Wand der Reaktionskammer und bilden dort eine Schicht. Es kann unter Umständen besser sein, nur mit einer Füllung von nur etwa 10⁵ Reaktant-Ionen zu arbeiten, die von einer guten Reaktant-Ionenquelle in einigen Zehn Mikrosekunden bereitgestellt werden können. Eine gute Reaktant-Ionenquelle kann einen Ionenstrom von etwa einem Nano-Ampere liefern, also etwa 10¹⁰ Ionen pro Sekunde.
In der Reaktant-Ionenquelle (10) werden Moleküle eines günstigen Gasgemisches, beispielsweise Propan, Butan oder Pentan in leicht feuchtem Reinststickstoff, durch eine Reaktionskette zu Reaktant-Ionen umgewandelt. Das Gasgemisch wird durch die Gaszuführung (11) in die Reaktant-Ionenquelle eingeleitet. Die Ionenquelle enthält Glühkathoden und Beschleunigungsblenden zur Erzeugung eines Elektronenstrahls, der durch das Magnetfeld zweier Permanentmagneten geführt wird. Die Reaktionskette beginnt mit einer Ionisierung des überwiegend vorhandenen Reinststickstoffs durch Elektronenstoß, dann werden sehr schnell Wasserkomplex-Ionen gebildet und die Reaktionskette endet schließlich mit der Bildung der Reaktant-Ionen. Beispielsweise werden mit Butan (C₄H₁₀) als Hauptgemischbestandteil überwiegend Reaktant-Ionen der Form C₄H₁₁ ⁺ (protoniertes Butan) und C₄H₉ ⁺ (protoniertes Buten) gebildet. Diese eignen sich vorzüglich zur Protonierung von Analytmolekülen höherer Molekulargewichte über etwa 80 atomaren Masseneinheiten. So werden mit diesen Reaktant-Ionen insbesondere tryptische Verdaupeptide sehr gut protoniert, eine besonders häufige Analysenaufgabe. Die Reaktant-Ionen werden durch besondere Einrichtungen innerhalb dieser Ionenquelle (10), beispielsweise durch einen Mini-Ionentrichter, in das Ionenleitsystem (14) überführt, das die Reaktant-Ionen zur Desorptionsstelle leitet.
Es sind jedoch auch ganz andere Arten von Reaktant-Ionen herstellbar, beispielsweise solche, die Molekulargewichte von einigen Hundert atomaren Masseneinheiten besitzen und trotzdem Peptide und Proteine gut ionisieren. Dazu eignen sich beispielsweise teilfluorierte Alkane; es gibt jedoch viele Substanzgruppen, die hier eingesetzt werden können. Die unverbrauchten Reaktant-Ionen dieser schweren Art können nach der Ionisierung der Analyt-Ionen mit diesen zusammen weitergeleitet werden, beispielsweise für eine spätere Nachionisierung der Analyt-Ionen mit einem oder mehreren weiteren Protonen.
2 zeigt den Zustand etwa 50 Mikrosekunden nach dem Laserschuss. Es hat sich eine Verdampfungswolke (16) gebildet, die sich wegen ihres ursprünglich sehr hohen Drucks adiabatisch in das Umgebungsgas hinein ausgedehnt hat. Die Wolke (16) mit verdampftem Probenmaterial vermischt sich wegen des niedrigen Umgebungsdrucks und der relativ großen freien Weglänge zwischen den Stößen zumindest teilweise sofort mit dem Umgebungsgas und den darin enthaltnen Reaktant-Ionen. Es werden dabei die Analytmoleküle in Stößen mit den Reaktant-Ionen mit hoher Reaktionswahrscheinlichkeit zu Analyt-Ionen protoniert.
Trotz relativ schneller Vermischung wird das Umgebungsgas zum Teil einschließlich der Reaktant-Ionen von der Verdampfungswolke (16) vor sich her geschoben. Die Reaktionskammer ist in den 1 bis 3 mit einem offenen Ringblendensystem dargestellt. Die Moleküle der Verdampfungswolke können schließlich die Reaktionskammer durch die Zwischenräume zwischen den Ringblenden verlassen, nicht aber die Ionen. Zunächst werden die Reaktant-Ionen des zurückweichenden Teils des Umgebungsgases am Pseudopotential der virtuellen Wand aufgehalten; sie formen eine relativ dichte Schicht. Durch diese Schicht wird ein großer Teil der restlichen Analytmoleküle protoniert. Auch die Analyt-Ionen werden durch die virtuelle Wand des Pseudopotentials eingesperrt gehalten.
Bei einer geschlossenen Reaktionskammer verlaufen die Prozesse im Wesentlichen ähnlich. Zwar kann hier die Desorptionswolke nicht durch die Zwischenräume der Ringblenden entweichen, die nicht ionisierten Analytmoleküle können aber, wenn sie bis zu den Wänden diffundieren, an den Wänden der Reaktionskammer kondensieren, wodurch ebenfalls ein Entzug der Analytmoleküle erzeugt wird.
Die Ausbeute an Analyt-Ionen kann bei guter Formung der Reaktionskammer und bei optimalem Druck des Umgebungsgases durchaus 10 Prozent der freien Analytmoleküle und mehr betragen. Bei Verwendung einer Matrixsubstanz, die keine geschmolzenen Spritzer oder Absprengsel bildet, kann so eine sehr hohe Ausbeute an Analyt-Ionen erhalten werden. Geschmolzene Spritzer oder auch feste, abgesprengte Explosionsbrocken können beträchtliche Mengen an Analytmolekülen einsperren und aus der Probe entfernen, so dass diese Analytmoleküle einer Ionisierung entzogen werden.
3 stellt dar, wie jetzt die Analyt-Ionen als Wolke (17) durch ein leichtes Gleichspannungsgefälle von wenigen Volt an den Ringblendensystemen (4) und (5), das den Hoch frequenzspannungen überlagert ist, in den trichterförmigen Teil (5) der Reaktionskammer und von dort in den quadrupolaren Blendenstapel (6) getrieben werden. Während dieses Vorgangs kann auch die Hochfrequenzspannung an den Ringblendensystemen (4), (5) und (6) erhöht werden, wodurch die leichten Reaktant-Ionen, die dann unterhalb der Massenschwelle für das stabile Halten der Ionen in der Reaktionskammer liegen, aus der Reaktionskammer durch die Zwischenräume zwischen den Lochblenden oder durch Anstoßen an die Ringlochblenden ausgetrieben werden.
Dieses Ausfiltern der leichten Reaktant-Ionen kann besonders erfolgreich im quadrupolaren Teil (6) des Blendenstapels erfolgen. In diesem quadrupolaren Blendenstapel (6) herrscht neben einem leichten Gleichspannungsabfall ein quadrupolares Hochfrequenzfeld, das die im Umgebungsgas in ihrer Bewegung gedämpften Analyt-Ionen in die Achse des Blendenstapels (6) bringt, woraus sie durch die Lochblendenlinse (12) sehr effektiv in ein Hochfrequenz-Ionenleitsystem (13) weitergeleitet werden. Die Überführung der Analyt-Ionen aus der Reaktionskammer in das nachfolgende Ionenleitsystem (13) gelingt in gut ausgebildeten Reaktionskammern in etwa 50 Mikrosekunden. Das quadrupolare Hochfrequenzfeld hat eine recht scharf definierte untere Stabilitätsgrenze für die Masse der Ionen, sondert also leichte Ionen aus.
Ein solcher quadrupolarer Blendenstapel ist in 5 gezeigt. Er besteht aus Blenden (21, 22) einer einzigen Form, die jeweils um 90° gedreht hintereinander angeordnet sind, und über die Platinen (23-26) sowohl einzeln mit Gleichspannungspotentialen wie auch gemeinsam mit Hochfrequenzspannung versorgt werden können. Es lässt sich somit der quadrupolaren Hochfrequenzspannung ein Gleichspannungsgefälle längs der Achse überlagern.
Aus den Zeitdauern für die einzelnen Phasen innerhalb eines Pulszyklus ergibt sich auch die maximale Pulsfrequenz für diesen gepulsten Desorptionsbetrieb. Da die Ausdehnung der Desorptionswolke mit der Reaktion der Analytmoleküle mit den Reaktant-Ionen etwa 50 Mikrosekunden dauert, und das Austreiben der gebildeten Analyt-Ionen ebenfalls etwa 50 Mikrosekunden in Anspruch nimmt, beträgt die maximale Pulsfrequenz etwa 10 Kilohertz. Hier wurde noch nicht berücksichtigt, dass die Reaktionskammer wieder mit Reaktant-Ionen befüllt werden muss. Dieser Befüllungsvorgang kann bei sehr guter Reaktant-Ionenquelle und geringer Befüllung sehr kurz sein. Für eine gute Ausbeute an Analyt-Ionen ist es jedoch günstiger, sehr viele Reaktant-Ionen einzufüllen, was dann eher 100 Mikrosekunden und mehr in Anspruch nehmen wird. Die maximale Pulsfrequenz beträgt dann etwa 5 Kilohertz. Für UHV-MALDI werden Frequenzen zwischen 20 Hertz und etwa 2 Kilohertz angewandt.
Das Ionenleitsystem (13), das hier zur Aufnahme der Analyt-Ionen aus der erfindungsgemäßen Ionenquelle dient, ist hier nur als ein Beispiel für ein System dargestellt, das die Analyt-Ionen aufnehmen, gegebenenfalls weiterleiten oder auch für einige Zeit zwischenspeichern kann. Das Ionenleitsystem kann, wie in 3 gezeigt, aus Polstäben bestehen, die mit Hochfrequenzspannung versorgt sind. Es kann, muss aber nicht, die Analyt-Ionen in den Analysatorteil des Massenspektrometers weiterleiten, wo sie nach Massen und Intensitäten analysiert werden. Statt eines Massenspektrometers kann auch jede andere geeignete Art von Spektrometer für die Analyse der Analyt-Ionen zum Einsatz kommen, beispielsweise ein Ionenmobilitätsspektrometer, oder ein optisches Spektrometer.
Eine andere günstige Ausführungsform, die aber ebenfalls mit gepulstem Laserlicht arbeitet, besitzt eine Reaktionskammer, die nicht allseits von einem Pseudopotential umgeben ist, wie in 4 gezeigt. Es kann ein Teil der Reaktionskammer durchaus von einem realen Potential umgeben sein, beispielsweise in Form von Ringen (16), die auf einem Gleichspannungspotential liegen. Zusammen mit dem gleichem Potential an der Probenträgerplatte (1) bilden sie einen Potentialtopf, in den die Reaktant-Ionen von einem geeigneten Mittenpotential am Ionentrichter (5) hineingedrückt werden können, wie es in 4 dargestellt ist. Nachdem die Analyt-Ionen erzeugt wurden, kann an den Gleichspannungsringen ein Spannungsabfall von der Probenträgerplatte bis zum Ionentrichter eingeschaltet werden, der die Analyt-Ionen in den Ionentrichter treibt. Es sind somit mehrere Ausführungsformen möglich, die aber alle dem gleichen Erfindungsgedanken folgen.
Für die Präparation der Proben (2) können, wie oben schon angemerkt, die klassischen Matrixsubstanzen und Aufbereitungsverfahren genutzt werden. Beispielsweise können die Proben in gelöster Form mit Pipettierrobotern auf die Probenträgerplatte aufgebracht und dort getrocknet werden. Besondere hydrophile Bereiche auf der Probenträgerplatte in hydrophober Umgebung können die Probenkristallisation auf diese hydrophilen Bereiche beschränken. Es ist eine Vielzahl von Matrixsubstanzen bekannt, die jeweils auf bestimmte Gruppen von Analytsubstanzen abgestimmt sind und diese besonders gut ionisieren.
Da es in dieser Erfindung kaum eine Rolle spielt, ob die Laserdesorption bereits Analyt-Ionen liefert oder nicht, können hier für die Laserdesorption auch Matrixsubstanzen verwendet werden, die nicht protonieren. Besonders günstig können solche Matrixsubstanzen sein, die sich bei der Desorption zersetzen und gasförmige Moleküle der Art CO₂, H₂O und N₂ bilden, wie das bereits in DE 196 08 963 A1 für MALDI an Atmosphärendruck dargelegt wurde. Diese Zersetzung ist für viele Sprengstoffe gegeben, aber auch andere Substanzgruppen können so instabil sein, dass sie sich bei der kurzzeitigen Erhitzung im Laserschuss zersetzen. Eine für diese Zwecke besonders günstige Matrixsubstanz ist beispielsweise Cellulosedinitrat (häufig als Dinitrocellulose bezeichnet). Diese Substanz kann besonders gut Peptide und Proteine an ihrer Oberfläche binden. Als offenporiger Schaum auf Probenträgerplatten aufgetragen, hat sie eine sehr große absorbierende Oberfläche; die Lösungen mit Analytsubstanzen können dann direkt auf diese Schaumflecken aufgetragen werden. Unter Laserbeschuss zersetzen sich nur die Stellen, die im direkten Laserlichtfokus liegen; es explodiert nicht etwa der ganze Probenauftrag.
Eine zweite günstige Ausführungsform des Verfahrens und Geräts geht nicht von einer gepulsten Desorption der Analytmoleküle aus, sondern von einer kontinuierlichen, wie in 6 dargestellt. Dazu sind beispielsweise moderne Laserdioden geeignet, wie sie in CD- oder DVD-Playern verwendet werden. Die Laserdiode kann mit Fokussierungslinse und deflektierendem Mikrospiegel zu einer sehr kleinen Einheit (17) integriert werden, die nahe an den zu desorbierenden Proben, hier vor der Probe (3), angeordnet werden kann. Diese Laserdioden, die es für verschiedene Wellenlängen vom infraroten, sichtbarem bis ins ultraviolette Licht gibt, zeichnen durch die Möglichkeit der Erzeugung eines sehr feinen Fokus aus. Der Fokusdurchmesser ist in etwa der Wellenlänge proportional und liegt bei Bruchteilen eines Mikrometers. Im Fokus herrscht eine Energiedichte, die Material selbst bei hohen Scangeschwindigkeiten verändern, beispielsweise aufschmelzen kann, wie von CD-Platten her bekannt.
Diese Dioden sind geeignet, in ihrem Fokus, der dabei vorzugsweise sehr schnell über den Probenträger (1) zu bewegen ist, adsorbierte Analytmoleküle kontinuierlich zu desorbieren. Die hohe Geschwindigkeit des Fokus auf der Probenträgerplatte (1) sorgt dafür, dass keine lokale Überhitzung des Probenträgers (1) und der zu desorbierenden Probe (3) stattfindet. Für einen sehr kleinen Fokus ist die Fokuslänge sehr klein zu halten, es können aber noch genügend kleine Fokusdurchmesser für die Desorption mit Abständen von einigen Millimeter erreicht werden. Eine hohe Geschwindigkeit des Fokus auf dem Probenträger in der Größenordnung von 0,1 bis 10 Meter pro Sekunde lässt sich durch eine kombinierte Bewegung des Laserstrahls aus der Laserdiode durch einen integrierten, oszillierenden Mikrospiegel einerseits und eine mäßig schnelle Bewegung des Probenträgers (1) andererseits erzeugen, wobei es günstig ist, beide Bewegungen rechtwinklig zueinander ablaufen zu lassen. Geschwindigkeiten im Bereich von 0,01 bis 1 Meter pro Sekunde können auch durch Bewegungen des Probenträgers allein erzeugt werden.
Da es nicht unbedingt auf die Wellenlänge des desorbierenden Lichtes ankommt, kann auch eine Licht emittierende Diode (LED) verwendet werden. Diese können Licht verschiedener einzelner Wellenlängen, aber auch gemischter Wellenlängen aussenden. Das Licht kann mit Linsen kurzer Brennweiten ebenfalls gut gebündelt werden.
Unter kontinuierlicher Desorption soll hier auch verstanden werden, wenn eine Laserdiode moduliert mit sehr hoher Modulationsfrequenz eingesetzt wird. Die Modulation kann sinusförmig, aber beispielsweise auch rechteckförmig mit einstellbarem Verhältnis der Emissionsintervalle zu den Ruheintervallen sein. Eine Modulationsfrequenz von 20 Kilohertz erzeugt deshalb einen kontinuierlichen Strom an desorbierten Analytmolekülen, weil die einzelnen Verdampfungswolken kontinuierlich ineinander laufen. Außerdem weiß man von Untersuchungen an UHV-MALDI, dass nach dem Laserschuss eine Zeit lang (durchaus viele Mikrosekunden lang) noch eine Verdampfung stattfindet, allerdings dann praktisch ohne Ionen bildung. Besonders günstig sind hier Modulationsfrequenzen der Laserdioden von hundert Kilohertz bis zehn Megahertz, zumal wenn eine zersetzliche Matrix verwendet wird.
Die Desorption der Analytmoleküle durch diesen rasch wandernden Laserdiodenfokus gelingt besonders gut, wenn die Analytmoleküle nackt auf einem geeigneten Probenträger adsorbiert sind. Sie brauchen daher nicht unbedingt einen Einschluss in eine Matrixsubstanz.
Eine mit Matrixsubstanz besonders günstige Aufbereitung der Proben für diese kontinuierliche Desorption besteht darin, die Analytmoleküle auf einer sehr dünnen Schicht von Sprengstoff oder anders zersetzlichem Material zu adsorbieren. Sehr geeignet ist beispielsweise eine nur einen Mikrometer dünne Schicht aus Cellulosedinitrat, die auf den Probe-Orten für die spätere Aufnahme der Analytmoleküle als dünner Lackfilm aufgebracht wird. Cellulosedinitrat bildet in Azeton gelöst einen sehr gut verarbeitbaren Lack. Ein solcher Lack mit relativ niedrig nitrierter Cellulose ist als „Bootslack" im Handel, allerdings nicht in hoher Reinheit. Diese Dünnschicht kann sehr gut mit Peptiden oder Proteinen beladen werden, da die Lackschicht diesen Substanzen gegenüber außerordentlich affin ist. Ein Quadratmillimeter Lack kann etwa ein Femtomol an Analytsubstanzen aufnehmen. Die für die Proben vorgesehenen Lackflecken können etwa ein Quadratmillimeter, aber durchaus auch 10 oder 50 Quadratmillimeter groß sein. Bei 7 × 7 Millimeter großen Flecken lassen sich durchaus 96 Proben auf einer Probenträgerplatte in der Größe einer Mikrotiterplatte unterbringen; bei 3 × 3 Millimeter großen Flecken können 384 Proben untergebracht werden.
Die Dünnschicht aus Sprengstoff zersetzt sich kontinuierlich im Fokus der Laserdiode, wobei auch die adsorbierten Analytmoleküle in das Umgebungsgas geblasen werden. Hier werden sie durch die kontinuierlich oder getaktet zugeführten Reaktant-Ionen protoniert. Der Sprengstoffzersetzt sich zu Wasser, Kohlendioxid und Stickstoff, bildet also keine mittelschwere Moleküle, wie das herkömmliche Matrixmaterialien tun. Es bilden sich daher keine störenden Untergrund-Ionen, einer der Nachteile von UHV-MALDI. Die Analyt-Ionen werden dann vorzugsweise kontinuierlich durch elektrische Gleichspannungspotentiale in den Ionentrichter (5) gesaugt, von dort über den quadrupolaren Blendenstapel (6) und durch die Linsenanordnung (12) in das Ionenleitsystem (13) weitergeleitet. Besonders günstig ist für diese Zersetzung von Sprengstoff-Dünnschichten ein modulierte Laserdiode mit etwa 100 Kilohertz bis zehn Megahertz Modulationsfrequenz.
Statt einer Dünnschicht aus Sprengstoff kann auch hier wieder eine dünne Schicht aus offenporigen Sprengstoff-Schaum verwendet werden, um eine größere Oberfläche für die Adsorption der Analytmoleküle zu erhalten. Der offenporige Schaum kann beispielsweise durch rasches Vakuum-Trocknen von wässrig aufgequollenen Lackflecken erhalten werden.
Für dieses Verfahren der kontinuierlichen Desorption können die Reaktant-Ionen aus der Reaktant-Ionenquelle durch ein schlankes Ionenleitsystem (14) direkt zur Desorptionsstelle geblasen werden. Dazu ist es besonders günstig, wenn das Ionenleitsystem gasdicht umhüllt ist, um die Reaktant-Ionen direkt in einem Strom von Umgebungsgas zur Desorptionsstelle blasen zu können. Ein solches rohrförmiges Ionenleitsystem mit einem eingeschlossenem Hexapol-Stabsystem ist in 7 im Querschnitt gezeigt. Das Ionenleitsystem (14) kann mit einem Außendurchmesser von nur etwa zwei bis drei Millimeter hergestellt werden. Durch das zugeblasene Umgebungsgas werden auch die desorbierten Analytmoleküle und andere Desorptionsdämpfe von der Desorptionsstelle weggeblasen. Das ist nicht nur für effiziente Reaktionen zwischen Analytmolekülen und Reaktant-Ionen günstig, sondern auch für eine Sauberhaltung der Fokussierlinsen oder Mikrospiegel der Laserdiodensysteme (17).
Es wurde bei dieser Schilderung des erfindungsgemäßen Verfahren manchmal von einer Protonierung der Analytmoleküle angesprochen, die naturgemäß zu positiven Analyt-Ionen führt. In ähnlicher Weise können die Analytmoleküle aber auch durch Reaktionen mit entsprechenden negativen Reaktant-Ionen zu negativ geladenen Analyt-Ionen verwandelt werden. Dazu sind Deprotonierungs-Reaktionen oder auch Elektronenübertragungs-Reaktionen notwendig. Es soll also keinesfalls die Reaktion zu negativ geladenen Analyt-Ionen ausgeschlossen werden; sie sollen vielmehr bei der Erfindung ausdrücklich eingeschlossen sein.
Die Erfindung findet ihre Anwendung für Ionenquellen in Massenspektrometern verschiedener Art, aber auch für andere Arten von Spektrometern, beispielsweise Ionenmobilitätsspektrometer. Besonders interessant ist beispielsweise eine Anwendung als höchstempfindliche Ionenquelle in einem Tandem-Massenspektrometer, das als Analysator einen Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF) enthält. Diese Art von Massenanalysator hat höchste Empfindlichkeit, großen dynamischen Messbereich, und eine hervorragende Massengenauigkeit. Als Fragmentierungs-Einheit kann sowohl eine Stoßzelle wie auch eine beliebige andere Fragmentierungsstufe verwendet werden. Da aber die Fragmentierung von Biopolymeren am besten arbeitet, wenn man von doppelt geladenen Ionen ausgeht, kann eine Einrichtung zur Protonierung der hier erzeugten einfach geladenen Ionen zwischengeschaltet werden.
Dieses Beispiel ist aber nur eines von vielen. Es ließen sich hier weitere spektrometrische Verwendungen aufzählen. Dem Fachmann ist es mit Kenntnis dieser Erfindung möglich, weitere nahe liegende Ausführungsformen und Anwendungen zu schaffen, die aber immer dem prinzipiellen Erfindungsgedanken und damit dem Schutzumfang unterliegen sollen.

Claims

Verfahren für die Erzeugung von Analyt-Ionen aus Analytmolekülen für eine Analyse in einem Spektrometer, wobei sich die Analytmoleküle in Proben auf einem festen Probenträger befinden, dadurch gekennzeichnet, – dass die Analytmoleküle in einem Umgebungsgas bei einem Druck zwischen 10 und 1000 Pascal desorbiert werden, – dass in einer Reaktant-Ionenquelle Reaktant-Ionen erzeugt werden, – dass die Reaktant-Ionen durch ein Ionenleitsystem der Desorptionsstelle zugeführt werden, und – dass die desorbierten Analytmoleküle durch die Reaktant-Ionen ionisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption der Analytmoleküle kontinuierlich erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kontinuierliche Desorption der Analytmoleküle durch einen kontinuierlichen Lichtstrahl aus einem Laser, einer Laserdiode oder aus einer Licht emittierenden Diode erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kontinuierliche Desorption der Analytmoleküle durch einen hochfrequent modulierten Lichtstrahl aus einem Laser, einer Laserdiode oder aus einer Licht emittierenden Diode mit einer Modulationsfrequenz größer als 20 Kilohertz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption der Analytmoleküle gepulst mit einer Pulsfrequenz kleiner als zehn Kilohertz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption durch Laserlichtpulse aus einem Pulslaser erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Analytmoleküle auf dem Probenträger adsorbiert befinden, ohne dass Zusätze dabei sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Analytmoleküle auf dem Probenträger in einer Umgebung von Matrixmolekülen befinden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Analytmoleküle auf dem Probenträger in einer Umgebung von Matrixmolekülen befindet, die sich bei der Desorption zersetzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionen der Reaktant-Ionen mit den Analytmolekülen außerhalb der Reaktant-Ionenquelle erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktant-Ionenquelle bei dem gleichen Druck arbeitet, bei dem auch die Desorption erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyt-Ionen von einem Ionentrichter vor dem Probenträger aufgenommen und weitergeleitet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption der Analytmoleküle bei einem Druck des Umgebungsgases zwischen 30 und 300 Pascal erfolgt.
Ionenquelle für die Ionisierung von Analytmolekülen, die sich in Proben auf einem Probenträger befinden, bestehend aus (a) einer Vakuumkammer mit einem Umgebungsgas eines Druckes zwischen 10 und 1000 Pascal zur Aufnahme des Probenträgers, (b) einer Einrichtung für die kontinuierliche Desorption der Analytmoleküle einer Probe auf dem Probenträger, (c) einer Reaktant-Ionenquelle für die Erzeugung von Reaktant-Ionen, und (d) einem Ionenleitsystem für die Leitung der Reaktant-Ionen von der Reaktant-Ionenquelle zur Desorptionsstelle.
Ionenquelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ionentrichter die Analyt-Ionen aufnimmt und weiterleitet.
Ionenquelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorptionseinrichtung einen Laser, eine Laserdiode oder eine Licht emittierende Diode enthält.
Spektrometer, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Ionenquelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16 enthält.
Spektrometer nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Massenspektrometer handelt.