DE102004039643A1

DE102004039643A1 - Fragmentierung von Ionen durch Elektronen-Ionen-Reaktionen in multipolaren Hochfrequenzfeldern

Info

Publication number: DE102004039643A1
Application number: DE102004039643A
Authority: DE
Inventors: Roman Zubarev; Frank Kjeldsen; Igor Ivonin; Oleg Silivra
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2003-08-20
Filing date: 2004-08-16
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2024-08-17
Also published as: GB2405526A; GB2405526B; US6800851B1; DE102004039643B4; GB0418538D0

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Fragmentierung von Ionen durch Elektronen-Ionen-Reaktionen in multipolaren Hochfrequenzfeldern, wie etwa den Feldern in Quadrupol-Ionenfallen und in Ionenleitsystemen, und Vorrichtungen, mit denen diese Verfahren zur Fragmentierung von Ionen durchgeführt werden. Die Verfahren lassen sich in der Tandem-Massenspektrometrie einsetzen. Die Erfindung umfasst die Anwendung eines Magnetfeldes, das im Wesentlichen parallel zur Achse des Hochfrequenzfeldes ausgerichtet ist und die Elektronen senkrecht zu dieser Achse einschließt.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Fragmentierung von Ionen in Elektronen-Ionen-Reaktionen in multipolaren Hochfrequenzfeldern, wie etwa den Feldern in Quadrupol-Ionenfallen und in Ionenleitsystemen, und Vorrichtungen, mit denen diese Verfahren zur Fragmentierung von Ionen durchgeführt werden. Die Verfahren lassen sich in der Tandem-Massenspektrometrie verwenden.
Hintergrund der Erfindung
Die Massenspektrometrie ist eine Analysentechnik, in der Probenmoleküle ionisiert werden und bezüglich ihres Masse-zu-Ladungsverhältnisses (m/z-Verhältnis) analysiert werden. Die Ionen werden durch eine Vielzahl von Ionisationsverfahren erzeugt, wie etwa durch Elektronen-Stoßionisation (EI = Electron Impact), durch Beschuss mit schnellen Atomen (FAB = Fast Atom Bombardment), durch Elektrosprühen (ESI = Electrospray Ionization) und durch matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisation (MALDI = Matrix-Assisted Laser Desorption and Ionization). Das Masse-zu-Ladungsverhältnis wird in Masseanalysatoren gemessen, in denen die Ionen entweder für eine Zeitdauer in einer Falle gespeichert werden oder die von den Ionen in Richtung eines Ionendetektors durchlaufen werden. In den Masseanalysatoren mit Ionenfallen, zu denen die Quadrupol-Ionenfalle (Paulfalle) und das Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer (ICR oder Penningfalle) gehören, werden die Ionen durch eine Kombination aus magnetischen, elektrostatischen und zeitlich veränderlichen elektromagnetischen Feldern für 0,1 bis 10 Sekunden räumlich eingeschlossen. Die Aufenthaltszeit in den von Ionen durchlaufenen Masseanalysatoren ist im Vergleich dazu kürzer und beträgt zwischen 1 und 100 Mikrosekunden. Zu dieser Art zählen etwa Magnetfeldanalysatoren, Quadrupolfilter und Flugzeitanalysatoren.
Die Tandem-Massenspektrometrie bezeichnet allgemein ein Verfahren, bei dem innerhalb des Massenspektrometers Probeionen mit einem gewünschten m/z-Verhältnis ausgewählt und dissoziiert werden. Die erhaltenen Fragmente werden ihrem m/z-Verhältnis entsprechend weiter analysiert. Die Dissoziation der selektierten Probeionen kann in einer speziellen Zelle zwischen zwei Masseanalysatoren erfolgen. Diese Zellen beruhen für gewöhnlich auf einem Ionenleitsystem mit Multipolfeldern (Quadrupolfeldern, Hexapolfeldern usw.). In Massenspektrometern mit Ionenfallen erfolgt die Dissoziation in der Ionenfalle selber. Die Tandem-Massenspektrometrie kann sehr viel mehr Informationen über die Struktur der Probenmoleküle liefern.
Um Ionen in einem Massenspektrometer zu fragmentieren, wird am häufigsten die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID = Collision Induced Dissociation) eingesetzt. Im vorherrschenden Verfahren werden dabei Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhältnis vorselektiert und mit Gasatomen oder -molekülen, wie beispielsweise Helium, Argon oder Stickstoff zur Kollision gebracht, wobei die Kollisionsenergie nachfolgend in innere Ionenenergie umgewandelt wird. Alternativ können die Ionen auch mit infrarotem Licht bestrahlt werden (IRMPD = Infrared Multiphoton Dissociation), was ebenfalls zu einer Erhöhung der inneren Energie führt. Weisen Ionen eine hinreichend große innere Energie auf, durchlaufen sie anschließend eine Dissoziation, die zu einfach oder mehrfach geladenen Fragmenten führt. Aus der Masse und der Häufigkeit der jeweiligen Fragmente ergeben sich Informationen, die für die Charakterisierung der Struktur der Probenmoleküle verwendet werden können.
Beide Dissoziationsverfahren (CID und IRMPD) haben schwerwiegende Nachteile. Erstens dominieren hier die Prozesskanäle mit niedrigen Dissoziationsenergien, was die Vielfalt der Bindungsbrüche und damit die ableitbaren Information reduziert. Selbst bei relativ geringen Kollisionsenergien werden schwach gebundene funktionelle Gruppen abgelöst und so der Informationsgewinn über die Struktur begrenzt. Die Anwesenheit von schwach gebundenen Gruppen führt zu einem Informationsverlust bezüglich ihrer Position im Molekül. Schließlich sind beide Dissoziationsverfahren (CID und IRMPD) bei großen Molekülmassen nicht mehr effektiv.

Um zumindest einige dieser Probleme zu überwinden, wurden in jüngster Zeit eine Reihe von Elektronen-Ionen-Reaktionen zur Dissoziation von Ionen vorgeschlagen (Überblick in Zubarev, Mass Spectrom. Rev. 22 (2003) 57–77). Eine dieser Reaktionen ist die Dissoziation durch Elektroneneinfang (ECD = Electron Capture Dissociation) (Zubarev, Kelleher and McLafferty, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 3265–3266).

Das ECD-Verfahren ist der älteren Dissoziation durch Kollisionen mit energiereichen Elektronen (EID = Electron Impact Dissociation) bezüglich der technischen Realisierung ähnlich, hat aber einen anderen physikalischen Wirkmechanismus. Im Patent US 4,731,533 wird die Verwendung von hochenergetischen Elektronen mit einer Energie von etwa 600 Elektronenvolt beschrieben, die radial auf einen Ionenstrahl gerichtet werden und zur Fragmentierung von Ionen führen. In ähnlicher Weise wird im Patent US 4,988,869 der Gebrauch eines Strahls aus hochenergetischen Elektronen (100–500 eV) offen gelegt, der quer auf einen Ionenstrahl trifft und die Fragmentierung der Ionen herbeiführt. Das EID-Verfahren leidet an einer geringen Fragmentierungseffizienz, die sich höchstens auf ungefähr 5 Prozent der Elternionen beläuft.

Im Gegensatz zur EID zerfallen die mehrfach positiv geladenen Ionen beim ECD-Verfahren in einer Ionen-Zyklotron-Resonanzzelle durch den Einfang eines niederenergetischen Elektrons (< 1 eV). Die niederenergetischen Elektronen werden durch einen beheizten Draht oder eine Spenderkathode erzeugt (Zubarev et al., Anal. Chem. 73 (2001) 2998–3005). Der Elektroneneinfang kann im Vergleich zum CID- oder IRMPD-Verfahren mehr strukturrelevante Bindungsbrüche hervorrufen. Bei Polypeptiden, die weithin mit massenspektrometrischen Techniken analysiert werden, bricht bei einem Elektroneneinfang bevorzugt eine N-C_a-Bindung der Rückgratstruktur (C- oder Z-Fragmente), während die Anregung durch Kollisionen (CID) oder Infrarotabsorption (IRMPD) zu einer Spaltung der Amidbindung der Rückgratstruktur führt (Peptidbindung, B- oder Y-Brüche). Werden diese beiden Arten der Fragmentierung kombiniert, ergeben sich zusätzliche Informationen über die Sequenz des Polypeptids (Hom, Zubarev and McLafferty, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (2000) 10313–10317). Zudem werden bei einem Elektroneneinfang auch Disulfidbindungen gespalten, die bei einer Anregung durch Kollisionen oder Infrarotabsorption für gewöhnlich intakt bleiben. Schließlich bleiben beim Elektroneneinfang einige schwach gebundene Gruppen an den jeweiligen Fragmenten gebunden, wodurch ihre Position bestimmt werden kann. Dieses Merkmal ist speziell für die Analyse von posttranslationalen Modifikationen von Proteinen und Peptiden wichtig, wie etwa bei der Phosphorylierung, Glykosylierung, γ-Carboxylierung etc.

Andere Elektronen-Ionen-Reaktionen zur Fragmentierung von Ionen liefern weitere analytische Vorteile. Wird die Energie der Elektronen auf 3 bis 13 Elektronenvolt erhöht, so führt der Einfang dieser „heißen" Elektronen zu einer Dissoziation (HECD = Hot-Electron Capture Dissociation), in der dem Elektroneneinfang eine Elektronenanregung vorausgeht. Die so erzeugten Fragmente durchlaufen sekundäre Fragmentationsprozesse, mit denen isomere Leucin- und Isoleucin-Reste unterschieden werden können (Kjeldsen, Budnik, Haselmann, Jensen, Zubarev, Chem. Phys. Lett. 356 (2002) 201–206). In der Dissoziation durch Elektronenablösung (EDD = Electron Detachment Dissociation) (Budnik, Haselmann and Zubarev, Chem. Phys. Lett. 342 (2001) 299–302) ionisieren Elektronen mit Energie von 20 Elektronenvolt dianionische Peptide. Die EDD ist bezüglich der Wirkung mit der ECD vergleichbar und hat Vorteile bei sauren Peptiden und Peptiden mit säureartigen Modifikationen, wie etwa einer Sulfation.

Der Nachteil der bestehenden Fragmentierungsverfahren durch Elektronen-Ionen-Reaktionen liegt hauptsächlich darin, dass diese nur in Penningfallen effizient sind. Diese Ionenfallen sind aber wegen ihrer technischen Komplexität und Kosten nicht weit verbreitet. In den weiter verbreiteten Paulfallen, Kollisionszellen mit Multipolfeldern und Ionenleitsystemen werden Elektronen durch elektrische Hochfrequenzfelder (HF-Felder), die typischerweise eine Frequenz von 1 Megahertz und eine Amplitude von 500 Volt aufwei sen, abgelenkt oder wird ihre Energie auf über 20 Elektronenvolt erhöht. Unter einer Elektronenenergie von 20 Elektronenvolt sind die Elektronen-Ionen-Reaktionen am effizientesten. Eine andere Schwierigkeit besteht in der parasitären Ionisation der Moleküle im Restgas, die zu einer großen Anzahl von unerwünschten negativen und positiven Ionen, bevorzugt positiven, führt. Diese Ionen werden direkt detektiert und durch Ionen-Molekül-Reaktionen indirekt detektiert, was in beiden Fällen zu einem starken Hintergrundsignal und parasitären Signalspitzen führt und dadurch die Sensitivität begrenzt. Für Helium, das in den meisten Fällen als Puffergas verwendet wird, tritt die parasitäre Ionisation ab einer Elektronenenergie von 24 Elektronenvolt ein. Wegen der geringen Effizienz und dem großen Hintergrundsignal werden Elektronen-Ionen-Reaktionen in den meisten analytischen Massenspektrometern nicht eingesetzt.

Aus diesen Gründen wäre es wünschenswert, die Effizienz von Elektronen-Ionen-Reaktionen in massenspektroskopischen Vorrichtungen, in denen Hochfrequenzfelder verwendet werden, zu verbessern.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren bereit, in bzw. mit denen positive und negative Ionen in multipolaren Hochfrequenzfeldern durch Elektronen-Ionen-Reaktionen effektiv fragmentiert werden, wobei die multipolaren Hochfrequenzfelder zur Speicherung und zum Transport der Ionen eingesetzt werden. Im Zentrum des Feldes wird eine Elektronenwolke mit einer kinetischen Elektronenenergie unter 20 Elektronenvolt bereitgestellt und radial zur Achse der Vorrichtung eingeschlossen, und zwar durch ein Magnetfeld, das entlang dieser Achse verläuft.

In dreidimensionalen Paulfallen mit Ring- und Endkappenelektroden werden die Elektronen in radialer Richtung durch das Magnetfeld und in axialer Richtung während einer Halbperiode der Hochfrequenzspannung durch das elektrische Potential eingeschlossen. Es werden Mittel bereitgestellt, um die Elektronen entlang der Achse der Vorrichtung gefangen zu halten, wenn die Hochfrequenzspannung positiv ist. Die Elektronenwolke im Zentrum kann in jeder Periode der Hochfrequenz wenigstens einmal bereitgestellt werden, so dass sich für die Elektronen-Ionen-Reaktionen ein Nutzgrad von 50 Prozent oder mehr ergeben kann.

In zweidimensionalen Vorrichtungen mit Multipolfeldern, wie etwa linearen Fallen oder Ionenleitsystemen, braucht der radiale Einschluss der Elektronen durch das Magnetfeld nicht durch einen axialen Einschluss unterstützt zu werden. Die niederenergetischen Elektronen können sich entlang der Achse der Vorrichtung frei bewegen oder werden durch ein geeignetes Kraftfeld axial begrenzt, wie zum Beispiel in einer magnetischen Flasche.

Da in beiden Arten von Vorrichtungen mit Hochfrequenzfeldern die durch die Hochfrequenzspannung bewirkte radiale Beschleunigung der Elektronen durch das axiale Magnetfeld verhindert wird, bleibt die anfängliche kinetische Energie der Elektronen über einen weiten Teil der Speicherdauer im Wesentlichen erhalten und die Elektronen reagieren wirkungsvoll mit den Ionen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

1 zeigt eine Paulfalle mit einem einzelnen Permanentmagneten (5), der die Form einer Unterlegscheibe hat und in die Ringelektrode (3) eingelassen ist und die Elektronen vom ringförmigen Emitter (6) in die Ionenfalle führt.

2 zeigt eine Paulfalle mit zwei Magneten in Form von Unterlegscheiben (10, 11), durch die die Elektronen auf dem gekennzeichneten Weg (14) in die Ionenfalle geführt werden. Die Elektronen werden dabei mit Hilfe eines ultravioletten gepulsten Nanosekunden-Lasers (12) erzeugt.

3 zeigt ein lineares Ionenleitsystem mit einem Quadrupol-Hochfrequenzfeld, das von einem Elektromagneten (23) umgeben ist, um die Elektronen vom ringförmigen Emitter (6) auf einen Weg nahe der Achse zu führen.

4 zeigt ein Massenspektrum, das in einer Paulfalle durch die Dissoziation von doppelt negativ geladenen Ionen des FAP-Peptids unter Elektronenablösung (EDD) erzielt wird.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen

Das erfindungsgemäße Verfahren, mit dem effiziente Elektronen-Ionen-Reaktionen in der Massenspektrometrie erzielt werden, beinhaltet folgende Schritte:

– Bereitstellung eines multipolaren elektrischen Hochfrequenzfeldes (zumindest Quadrupolfeldes), das die Speicherung oder Führung von Ionen zeitweise ermöglicht;
– Bereitstellung von positiv oder negativ geladenen Ionen in einem räumlich begrenzten Gebiet innerhalb des multipolaren elektrischen Hochfrequenzfeldes;
– Bereitstellung einer Elektronenwolke innerhalb des räumlich begrenzten Gebietes, die Elektronen einer Energie kleiner als etwa 20 Elektronenvolt aufweist und die Elektronen-Ionen-Reaktionen gestattet; und
– Bereitstellung eines Magnetfeldes innerhalb des räumlich begrenzten Gebietes, das hinreichend stark ist, um die Elektronenwolke senkrecht zum Magnetfeld einzuschließen.

Das räumlich begrenzte Gebiet liegt typischerweise in einem Massenspektrometer oder in einem angrenzenden Bereich, beispielsweise in einer Reaktionskammer oder im Bereich einer Ionisationsquelle. Die Probeionen werden in dem räumlich begrenzten Gebiet gespeichert oder durch dieses geleitet, so dass sie zeitweise in dem räumlich begrenzten Gebiet mit einem Elektronenstrahl interagieren.

Es gibt mindestens zwei Arten von Vorrichtungen mit Hochfrequenzfeldern, die es ermöglichen, Ionen zu speichern oder zu leiten: lineare Stabsysteme, an deren Stäben Hochfrequenzspannungen anliegen und die die Ionen entlang der Achse des Stabsystems speichern oder leiten, und rotationssymmetrische Ring- und Endkappen-Systeme, an deren Ring- und Endkappenelektroden Hochfrequenzspannungen anliegen und die die Ionen im Zentrum des Systems speichern. Häufig werden Stabsysteme mit vier Stäben verwendet, die im Inneren des Systems ein zweidimensionales Quadrupolfeld erzeugen, und Paulfallen mit einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, die ein nahezu dreidimensionales Quadrupolfeld erzeugen. Beide Arten von Vorrichtungen bieten zeitliche und/oder räumliche Fenster, in denen niederenergetische Elektronen ins Zentrum des Feldes eingespeist werden können, in dem die Ionen eingeschlossen sind. In diesem Zusammenhang steht der Begriff „Zentrum" für die zentrale Achse der zweidimensionalen Multipolfelder und für das punktförmige Zentrum der dreidimensionalen Multipolfelder.

In linearen Hochfrequenz-Stabsystemen können die niederenergetischen Elektronen als sehr feiner Elektronenstrahl genau in die Achse des Systems eingespeist werden. Nur genau auf der Achse ist die Feldstärke zu allen Zeiten gleich Null. Das Potential ist wie ein Sattel geformt. Dieser Potentialsattel schwankt bezüglich der Stärke und der räumlichen Ausrichtung mit der Frequenz der Hochfrequenzspannung. Die Elektronen in der Achse befinden sich in einem Zustand eines ständigen instabilen Gleichgewichts. In der Praxis lassen sich die Elektronen nicht im Gleichgewicht halten, ohne der vorliegenden Erfindung entsprechend ein hinreichend starkes Magnetfeld parallel zur Achse bereitzustellen, das die Elektronen nahe der Achse einschließt. Für eine Reaktion mit den Ionen können sich die Elektronen entweder entlang der Achse frei bewegen oder sie werden durch Kraftfelder eingeschlossen, wie zum Beispiel in einer so genannten magnetischen Flasche mit höheren Magnetfeldstärken an den Enden des Stabsystems.

In einer Paulfalle können niederenergetische Elektronen im Nulldurchgang oder kurz vor dem Nulldurchgang des Feldes durch eine der Endkappen in das System eingespeist werden. Kurze Zeit später befinden sich die Elektronen mit fortschreitender Phase der Hochfrequenz im Quadrupolfeld in sehr instabilen Zuständen. Auch hier können die Elektronen durch ein axial ausgerichtetes Magnetfeld ausreichender Feldstärke im Inneren der Falle gehalten werden. Wenn niederenergetische Elektronen zu dem genauen Zeitpunkt ins Zentrum der Falle eingespeist werden, an dem die Spannung an der Ringelektrode in Bezug auf die Spannung an den Endkappenelektroden das Vorzeichen von Minus nach Plus wechselt, so befinden sich die Elektronen sofort auf einem runden Potentialhügel und bewegen sich auf einer instabilen Bahn in Richtung der umgebenden Ringelektrode. Durch das Magnetfeld werden die Elektronen allerdings im Inneren gehalten, ohne auf die umgebende Ringelektrode abgezogen zu werden. In Richtung der beiden Endkappen wird das elektrische Feld zunehmend abstoßend, so dass die Elektronen zumindest für eine halbe Periode der Hochfrequenzspannung in der Paulfalle gespeichert bleiben.

Es können Mittel bereitgestellt werden, um Elektronen außerhalb oder innerhalb des räumlich begrenzten Gebietes zu erzeugen, zum Beispiel durch Thermoemission von einer heißen Oberfläche, durch Feldemission, durch Emission von Sekundärelektronen oder durch Photoemission von einer Oberfläche oder von Molekülen der Gasphase. Die Erzeugung kann kontinuierlich oder gepulst erfolgen.

Ein geeignetes Kraftfeld kann dabei unterstützen, dass die außerhalb des räumlich begenzten Gebietes erzeugten Elektronen in dieses Gebiet geleitet werden. Ein solches Kraftfeld kann ein Magnetfeld, ein elektrisches Feld, ein elektromagnetisches Feld oder eine Kombination aus diesen Feldern sein.

Es können Mittel bereitgestellt werden, um den Elektronenstrahl zeitweise mit einem Shutter zu schalten sowie mit der Phase der Hochfrequenzspannung zu synchronisieren und an diese zu koppeln.

Es können Mittel bereitgestellt werden, um die Bewegung der Elektronen und der Ionen (Vorgänger- und Fragmentionen) innerhalb des räumlich begrenzten Gebietes zu dämpfen, zum Beispiel mit einem Puffergas. Das Puffergas kann kontinuierlich oder durch Gaspulse zugeführt werden.

Das Magnetfeld kann sowohl durch einen Permanentmagneten als auch durch einen Elektromagneten aus supraleitendem Material oder Widerstandsmaterial erzeugt werden. Das Magnetfeld kann dabei räumlich homogen oder inhomogen gestaltet sein und auch die Form einer magnetischen Flasche aufweisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren für die Elektronen-Ionen-Reaktionen führt in zweckdienlichen Ausführungsformen dazu, dass Probeionen zerfallen und Fragmentionen erzeugen. In der Dissoziation durch Elektronenablösung (EDD) wird die folgende Elektronen-Ionen-Reaktion ausgenutzt: [M – nH]^n– + e– → [M – nH]^(n–1)–· + 2e– → Fragmentierung wobei die vielfach deprotonierten Moleküle [M – nH]^n– (n ≥ 2) am besten durch Elektrosprühen gebildet werden. (Die Elternionen benötigen eine Ladungszahl von 2 oder mehr, damit nach dem Auswurf von einem Elektron zumindest ein geladenes Fragment erhalten werden kann, wobei die Ladungszahl der Fragmente um eine negative Ladungseinheit reduziert wird.) Der Wechselwirkungsquerschnitt für die Elektronenablösung erreicht nennenswerte Werte bei Elektronenenergien über 10 Elektronenvolt und maximale Werte bei ca. 20 Elektronenvolt. Für eine effektive Reaktion sollte daher zumindest ein wesentlicher Anteil der Elektronen eine kinetische Energie zwischen 10 und 20 Elektronenvolt und bevorzugt zwischen 17 und 20 Elektronenvolt haben.

In der Dissoziation durch Elektroneneinfang (ECD) wird die folgende Elektronen-Ionen-Reaktion ausgenutzt: [M + nH]ⁿ⁺ + e– → [M + nH]^(n–1)+· → Fragmentiening wobei die vielfach deprotonierten Moleküle [M ± nH]^n– (n ≥ 2) am besten durch Elektrosprühen gebildet werden. (Die Elternionen benötigen eine Ladungszahl von 2 oder mehr, damit nach dem Einfang von einem Elektron zumindest ein geladenes Fragment erhalten werden kann, wobei die Ladungszahl der Fragmente um eine positive Ladungseinheit reduziert wird.) Der Wechselwirkungsquerschnitt für den Elektroneneinfang nimmt mit zunehmender Elektronenenergie stark ab. Für eine effektive Reaktion sollte daher zumindest ein wesentlicher Anteil der Elektronen eine kinetische Energie unter ca. 1 Elektronenvolt, bevorzugt unter ca. 0,5 Elektronenvolt und am meisten bevorzugt unter ca. 0,2 Elektronenvolt aufweisen. Der Wechselwirkungsquerschnitt für den Elektroneneinfang hat eine quadratische Abhängigkeit von der Ladungszahl der Ionen, d.h., dass der Einfang bei doppelt geladenen Ionen viermal effizienter als bei einfach geladenen Ionen ist. Im Vergleich mit den Elternionen erfolgt der Elektroneneinfang bei Fragmentionen, die durch Elektroneneinfang aus den Elternionen entstanden sind und eine geringere Ladungszahl aufweisen, mit einer viel geringeren Rate.

In der Dissoziation durch den Einfang „heißer" Elektronen (HECD) sollte die Elektronenenergie zwischen 3 und 13 Elektronenvolt und bevorzugt um 11 Elektronenvolt liegen. Diese „heißen" Elektronen werden direkt eingefangen und erzeugen sofort angeregte elektronische Zustände. Der Energieüberschuss der HECD fließt typischerweise in sekundäre Fragmentierungsreaktionen, wie etwa der Verlust eines Wasserstoffradikals oder einer größeren Radikalgruppe nahe der primären Bruchstelle.

Ionen, die für eine Analyse mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, stammen aus vielen unterschiedlichen Klassen von chemischer Spezies, die alle als mehrfach geladene Ionen erzeugt werden können, wie zum Beispiel Polymere, Kohlenhydrate und Biopolymere. Die Biopolymere umfassen im Besonderen Proteine und Peptide und deren Modifikationen.

Im Gegensatz zum bisherigen Stand der Technik wird in der vorliegenden Erfindung davon ausgegangen, dass eine Elektronenwolke mit hinreichend kleiner Energie während der positiven Phase der Hochfrequenzspannung im Inneren einer Vorrichtung mit Hochfrequenzfeldern (auch Paulfallen) bereitgestellt werden kann. Während dieser positiven Phase der Hochfrequenzspannung werden die Elektronen durch das elektrische Feld in der einen Richtung und durch das Magnetfeld in den beiden anderen Richtungen gefangen gehalten. Die Elektronenwolke bleibt für eine Zeitdauer der positiven Phase der Hochfrequenzspannung im Inneren der Vorrichtung gespeichert. Die kinetische Energie der Elektronen bleibt dabei für einen wesentlichen Teil der Speicherdauer hinreichend klein.

Eine bevorzugte Ausführungsform, in der eine konventionelle Paulfalle verwendet wird, ist in 1 dargestellt. Die beiden Endkappenelektroden (1) und (2) und die Ringelektrode (3) werden durch elektrisch isolierende Abstandsringe (4) in einem genauen Abstand gehalten. Die Ringelektrode (3) hält einen Permanentmagneten (5), der die Form einer großen Unterlegscheibe hat und in zwei Hälfen geteilt in eine Nut der Ringelektrode (3) eingeklebt ist. Der scheibenförmige Magnet (5) hat wegen des zentralen Lochs ein kompliziertes Magnetfeld, dessen Feldlinien in der Skizzenzeichnung skizziert sind. Das axiale Magnetfeld im Zentrum der Ionenfalle öffnet sich leicht außerhalb der Endkappenelektroden (1) und (2) und ermöglicht es, dass achsennahe Elektronen aus einer ringförmigen und die Achse umschließenden Emitterkathode (6) in die Ionenfalle eingespeist werden. Der Weg der Elektronen ist durch Pfade (7) skizziert. Die Öffnung der ringförmigen Kathode (6) erlaubt es, dass Ionen in Richtung (8) durch die ringförmige Kathode in die Ionenfalle eingespeist werden können. Die Ionen werden dort durch die üblichen Mittel gehalten. Wenn eine Spannung zwischen der Kathode (6) und der Endkappenelektrode (1) gepulst so angelegt wird, dass Elektronen ausschließlich kurz vor dem Nulldurchgang des Feldes in die Ionenfalle gelangen, kann die Elektronenwolke genau zum Zeitpunkt des Nulldurchgangs im Zentrum der Ionenfalle zum Halten gebracht werden. Falls das Potential im Zentrum positiv ist und ansteigt, wird die Elektronenwolke in diesem Potential für die nächste halbe Periode der Hochfrequenz eingeschlossen und nimmt in dieser Zeit keine Energie auf. Die niederenergetischen Elektronen können dann mit den hier gespeicherten Ionen reagieren. Die aus den Reaktionen hervorgegangenen Ionen können durch einen herkömmlichen massenselektiven Auswurf in Richtung (9) zum Ionendetektor analysiert werden.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform verwendet zwei Permanentmagnete (10) und (11), die die Form von Unterlegscheiben haben und in 2 skizziert sind. Die Ionen können in Richtung (8) durch diese Magneten in die Ionenfalle eingespeist werden. Die Elektronen können hier wie in 1 auch durch eine ringförmige Emitterkathode erzeugt und achsennah in die Ionenfalle eingespeist werden. In 2 ist aller dings eine andere Erzeugung der Elektronen dargestellt: Ein ultravioletter gepulster Nanosekunden-Laser (12) erzeugt einen gepulsten ultravioletten Lichtstrahl, der durch die Linse (13) auf eine sorgfältig abgestimmte Stelle auf der leitenden Oberfläche eines Magneten fokussiert wird. Eine Wolke, bestehend aus bis zu einigen tausend Elektronen, wird hier erzeugt und durch die magnetischen Feldlinien (14) und ein geringes elektrisches Potential, das am Magneten anliegt, in die Ionenfalle geleitet. Der Laserpuls ist zeitlich so abgestimmt, dass die Elektronen beim Eintritt in die Ionenfalle gegen ein geringes (negatives) Potential anlaufen müssen und dadurch Energie verlieren. Eine richtige zeitliche Abstimmung ergibt Elektronen mit der kinetischen Energie Null, die auf dem Potentialhügel unter den dort gespeicherten Ionen zur Ruhe kommen. Der Potentialhügel wird mit zunehmender Phase der Hochfrequenz rasch kleiner, verschwindet nach einigen Nanosekunden und verwandelt sich in eine Potentialmulde, in der die Elektronen für eine halbe Periode der Hochfrequenzspannung gespeichert werden und mit den Ionen in der Ionenwolke reagieren.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform verwendet Elektromagneten, zum Beispiel eine Spule um die Ringelektrode oder zwei Spulen im Außenraum an den beiden Endkappenelektroden.

Eine Verwendung einer elektromagnetischen Spule (23) ist in 3 dargestellt, und zwar für ein Quadrupol-Ionenleitsystem aus vier Stäben, von denen nur die zwei gegenüber liegenden Stäbe (21) und (22) in 3 zu sehen sind. Die Ionen werden entlang Richtung (8) durch eine ringförmige Emitterkathode, die den langsamen Ionen niederenergetische Elektronen hinzufügt, in die Achse des Systems geleitet. Die Elektronen können mit den Ionen während der Flugzeit im Inneren des Ionenleitsystems reagieren, bevor die Ionen in Richtung (9) herausgezogen werden.

Die Magnete (Permanent- oder Elektromagnete) können durch Joche unterstützt werden. Das Magnetfeld kann abgeschirmt werden, damit es nicht bis zum Ionendetektor reicht. Einige Typen von Ionendetektoren reagieren manchmal ungünstig auf die Anwesenheit von Magnetfeldern. Elektromagnete und Permanentmagnete können kombiniert werden, um das Magnetfeld vorteilhaft zu gestalten. Rechnergestützte Simulationen haben gezeigt, dass schwache Magnetfelder in der Größenordnung von 100 Gauss ausreichen, um Elektronen im Zentrum eines multipolaren Hochfrequenzfeldes einzuschließen.

Elektronen können durch heiße Kathoden erzeugt werden, die Metallemitter oder Spenderkathoden sein können. Die Kathoden können ringförmig sein oder nur aus einem oder zwei Drähten bestehen, die gerade geformt oder V-förmig sind. Feldemitter können ebenfalls verwendet werden, um Elektronen zu liefern. Auch Photoelektronen können von geeigneten Emitter-Oberflächen freigesetzt werden, wenn diese von Lichtpulsen ausreichender Energie getroffen werden. Zwischen dem Emitter und den Endkappenelektroden können teilchenoptische Komponenten angeordnet werden, wie etwa Elektronenlinsen zur Beschleunigung, zur Führung und zum Schalten des Elektronenstrahls.

Obwohl die Fragmentierung von Ionen durch Elektronen-Ionen-Reaktionen wie diskutiert an sich nicht neu ist, so versagt der Stand der Technik bisher bei der Übertragung des Konzeptes auf andere Geräte als die Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer.

Die vorliegende Erfindung erreicht dieses Ziel und nutzt dabei die Tatsache, dass die kinetische Energieverteilung von kompakten Elektronen- und Ionenwolken im Wesentlichen erhalten bleibt, wenn sich ein elektrisches Potential im Bereich der Wolke verändert. Dies gilt unter der Voraussetzung, dass der Gradient des elektrischen Potentials klein ist im Vergleich zur Bewegung der geladenen Teilchen. Im Zentrum eines Massenspektrometers, wie etwa einer Paulfalle, einer linearen Quadrupolfalle oder einem Multipol-Ionenleitsystem, ist der Gradient des elektrischen Potentials gleich Null. Im von den Ionen in Anspruch genommenen Gebiet nahe dem Zentrum ändert sich der Gradient, der ungleich Null ist, periodisch mit der Hochfrequenz. Während einer halben Periode der Hochfrequenz mit positivem Potential werden die Elektronen, die sich nahe dem Punkt, an dem der Gradient gleich Null ist, befinden, in einer Richtung gespeichert. Die Spannung ändert sich im Vergleich zur Bewegung der Elektronen wesentlich langsamer, wenn die Elektronenenergie über etwa 0,1 Elektronenvolt liegt. Tatsächlich übersteigt die Geschwindigkeit dieser Elektronen 20 Zentimeter pro Mikrosekunde, was bedeutet, dass eine Hochfrequenzperiode bei 1 MHz mindestens zehn gespeicherten Bewegungsperioden in einem 1 cm langen Gebiet entlang der einen Speicherrichtung entspricht. Die gespeicherten Elektronen passen sich der Hochfrequenzspannung an, ohne daraus wesentlich kinetische Energie zu gewinnen. In den senkrechten Richtungen werden die Elektronen durch das Magnetfeld eingeschlossen und können deshalb auch in diesen Richtungen keine Energie aufnehmen. Im Wesentlichen bleibt die mittlere kinetische Elektronenenergie konstant, solange die Speicherbedingungen erhalten bleiben. Da die Elektronen während der halben Periode der Hochfrequenz gespeichert werden, kann der Nutzgrad der Elektronen-Ionen-Reaktionen bis zu 50 % betragen, was im Vergleich zur Bestrahlung mit einem konstanten Elektronenstrahl als Stand der Technik viel höher ist. Des Weiteren übersteigt die kinetische Elektronenenergie den gewünschten Wert niemals, was die parasitäre Ionisation des Hintergrundgases und das Hintergrundrauschen im Massenspektrum erfindungsgemäß verhindert. Die erfindungsgemäße Kombination des räumlichen Einschlusses durch ein paralleles magnetisches und elektrisches Feld ist nach dem Stand der Technik bisher weder verwendet noch vorgeschlagen worden, um Elektronen zusammen mit Ionen in einem Massenspektrometer mit Hochfrequenzfeldern zu speichern und miteinander reagieren zu lassen.

Die erfindungsgemäße Elektronenwolke kann sowohl durch einen kontinuierlichen Elektronenstrahl, zum Beispiel durch einen beheizten Draht oder durch eine Spenderkathode, als auch durch einen gepulsten Elektronenstrahl, zum Beispiel durch die Photoemission unter ultravioletter Bestrahlung, erzeugt werden. Die Art der Elektronenquelle hängt von der Art des verwendeten Geräts ab. Wenn ein kontinuierlicher Elektronenstrahl außerhalb der speichernden Vorrichtung erzeugt wird, werden Hilfsmittel verwendet, um die Elektronen während günstiger Phasen der Hochfrequenzspannung so in die Vorrichtung einzuspeisen, dass die Elektronenenergie am Ort der gespeicherten Ionen den gewünschten Wert aufweist. Zusätzlich können Linsen oder Gitter oder andere Komponenten die Elektronen zum Zentrum der Vorrichtung führen.

Alternativ kann die Elektronenwolke auch innerhalb der Vorrichtung erzeugt werden. Ultraviolettes Licht kann von außerhalb der Vorrichtung auf eine innere Oberfläche gelenkt werden, um dort während einer geeigneten Phase der Hochfrequenzspannung Sekundärelektronen zu erzeugen. Die desorbierten Sekundärelektronen können mit Hilfe von elektrischen und magnetischen Feldern zum Ort der gespeicherten Ionen geführt werden. Niederenergetische Sekundärelektronen können im Inneren der speichernden Vorrichtung auch durch die Ionisation von Molekülen der Gasphase erzeugt werden, und zwar durch ultraviolettes Licht oder durch gepulste energiereiche Elektronen während der geeigneten Hochfrequenzphase.

Obwohl wie oben besprochen die gemeinsame Speicherung von Elektronen und Ionen im gleichen Gebiet oft nützliche Fragmentierungen von Ionen durch Elektronen-Ionen-Reaktionen liefert, werden in anderen vorteilhaften Ausführungsformen zusätzliche Fragmentierungstechniken angewendet, um die Ionen nach der Reaktion mit Elektronen weiter zu dissoziieren. Diese Ionensorten zeigen dann typischerweise Fragmentmuster, die sich von den „Vor-ECD"-Fragmentmustern unterscheiden. Diese Massenspektren ergeben mehr Informationen als mit der ECD allein oder der zusätzlichen Fragmentierung allein. Die zusätzlichen Fragmentierungstechniken sind zum Beispiel die kollisionsaktivierte Dissoziation oder die elektromagnetische Bestrahlung, wie etwa mit einem infraroten Laser oder mit einem ultravioletten Laser oder mit einem Schwarzkörperstrahler.

Claims

Eine Vorrichtung zur Fragmentierung von Ionen in Elektronen-Ionen-Reaktionen, bestehend aus (a) einer Struktur aus Multielektroden, (b) einem Generator, der die Struktur aus Multielektroden mit einer Hochfrequenzspannung versorgt und ein multipolares elektrisches Hochfrequenzfeld erzeugt, (c) einer Ionenquelle und einem Mittel zur Ionenbeschleunigung, das Ionen in das Hochfrequenzfeld bringt, wo die Ionen durch das Hochfrequenzfeld in einem räumlich begrenzten Gebiet zeitweise eingeschlossen werden, (d) einem Mittel, das das elektrische Hochfrequenzfeld mit einem Magnetfeld überlagert, und (e) einem Mittel, das Elektronen mit Energien unter etwa 20 Elektronenvolt in dem räumlich begrenzten Gebiet bereitstellt.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur aus Multielektroden aus geraden Stäben besteht.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur aus Multielektroden aus vier parallelen geraden Stäben besteht.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur aus Multielektroden aus Ringelektroden und Endkappenelektroden besteht.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur aus Multielektroden aus einer hyperbolisch geformten Ringelektrode und zwei hyperbolisch geformten Endkappenelektroden besteht.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenquelle vielfach geladene Ionen liefert.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenquelle eine Ionenquelle mit Elektrosprühen ist.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Ionenzuführung die Ionen nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis selektiert.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein zusätzlicher Generator die Struktur aus Multielektroden mit Wechselspannungen oder Gleichspannungen versorgt, um Ionen eines vorausgewählten Masse-zu-Ladungsverhältnisses auszuwerfen.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Mittel einschließt, mit dem der Struktur aus Multielektroden ein Dämpfungsgas zugeführt wird, um die Bewegung der Ionen zu dämpfen und eine Ionenwolke im Zentrum der Struktur aus Multielektroden zu formen.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Bereitstellung der Elektronen einen Elektronenemitter einschließt.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenemitter so in dem Magnetfeld positioniert ist, dass die Elektronen in die Nähe des Zentrums der Struktur aus Multielektroden gelangen, indem die Elektronen den Magnetfeldlinien folgen.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Bereitstellung der Elektronen einen Spannungsgenerator einschließt, der den Elektronen eine Beschleunigungsspannung liefert.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Spannungsgenerator die Elektronen pulst, wobei die Zeit für die Pulse an die Phase der Hochfrequenzspannung gekoppelt sein kann.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Bereitstellung der Elektronen einen gepulsten Laser zur Erzeugung kurzer Elektronenpulse einschließt.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld durch einen Permanentmagneten oder durch mehrere Permanentmagnete erzeugt wird.
Eine Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld durch einen elektrischen Strom in einer Spule oder in mehreren Spulen erzeugt wird.
Ein Verfahren zum Erreichen von effektiven Elektronen-Ionen-Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass (a) ein multipolares elektrisches Hochfrequenzfeld zur Speicherung oder zum Führen von Ionen bereitgestellt wird, (b) positiv oder negativ geladene Ionen in einem räumlich begenzten Gebiet innerhalb des Hochfrequenzfeldes bereitgestellt werden und dort zeitweise eingeschlossen werden, (c) Elektronen in dem räumlich begrenzten Gebiet bereitgestellt werden, deren kinetische Energie unter etwa 20 Elektronenvolt liegt und Elektronen-Ionen-Reaktionen ermöglicht, und (d) ein Magnetfeld in dem räumlich begrenzten Gebiet bereitgestellt wird, wobei das Magnetfeld hinreichend stark ist, um die Elektronen senkrecht zum Magnetfeld einzuschließen.
Ein Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein unterstützendes Kraftfeld die Elektronen, die außerhalb des räumlich begrenzten Gebietes erzeugt werden, in das räumlich begrenzte Gebiet lenkt und führt, wobei das unterstützende Kraftfeld ein Magnetfeld, ein elektrisches Feld, ein elektromagnetisches Feld oder eine Kombination aus diesen Feldern sein kann.
Eine Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektronen für eine kurze Zeitdauer von wenigen Nanosekunden bereitgestellt werden und der Zeitpunkt für die Bereitstellung an die Phase der Hochfrequenzspannung gekoppelt ist.