DE10325579B4

DE10325579B4 - Ionenfragmentierung durch Elektroneneinfang in linearen Ionenfallen

Info

Publication number: DE10325579B4
Application number: DE10325579A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2023-06-06
Also published as: US20050017167A1; GB2403340A; GB2403340B; US6995366B2; DE10325579A1; GB0412405D0

Abstract

Verfahren für die Fragmentierung von Ionen in einer linearen Hochfrequenz-Ionenfalle, wobei die Ionenfalle mindestens vier Polstäbe umfasst, dadurch gekennzeichnet,
a) dass mehrfach geladene Ionen in der Ionenfalle gespeichert werden,
b) dass niederenergetische Elektronen aus einer Elektronenquelle durch den Spalt zwischen zwei benachbarten Polstäben eingeschossen werden, wobei die niederenergetischen Elektronen eine Energie aufweisen, die in der Nähe der thermischen Energie liegt, und
c) dass die mehrfach geladenen Ionen durch den Einfang der niederenergetischer Elektronen (ECD) fragmentiert werden.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Gerät für die Fragmentierung von großen Molekülen in linearen Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometern nach Wolfgang Paul.
Die Erfindung besteht darin, die Ionen durch den Einfang niederenergetischer Elektronen zu fragmentieren (ECD), wobei die niederenergetischen Elektronen durch den Spalt zwischen den Polstäben eingeschossen werden.
Stand der Technik
Normalerweise bestehen Ionenfallen nach Paul aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, wobei in der Regel die Ringelektrode mit der Speicherhochfrequenzspannung versorgt wird. Es können aber auch Vierstab-Quadrupolfilter nach Paul als Ionenfallen verwendet werden, wenn beide Enden des Stabsystems durch Blenden mit ionenabstoßenden Potentialen beaufschlagt werden. Diese so genannten „linearen Quadrupolionenfallen" oder kurz „linearen Ionenfallen" können leichter mit Ionen befüllt werden und mit mehr Ionen als die „dreidimensionalen Ionenfallen". Im Inneren der Ionenfalle können Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld gespeichert werden.
Aus diesen linearen Quadrupolionenfallen können die Ionen sowohl radial durch Schlitze in einer der langgestreckten Elektroden ( US 5,420,425 A , M. E. Bier und J. E. Syka, entsprechend EP 0 684 628 A1 ), wie auch axial durch Kopplungsvorgänge im inhomogenen Endfeld des Stabsystems („A new linear ion trap mass spectrometer", J. W. Hager, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 512-526) massenselektiv herausgeworfen werden. In beiden Fällen erhält man ein Massenspektrometer, wenn die massenselektiv herausgeworfenen Ionen durch eine Detektionseinheit, beispielsweise einen Sekundärelektronenvervielfacher, gemessen und dann zu einem Massenspektrum verarbeutet werden.
Normalerweise wird die lineare Ionenfalle mit einer zweiphasigen Hochfrequenzspannung betrieben, wobei die zwei Phasen reihum abwechselnd an die vier Polstäbe gelegt wird. Im Inneren entsteht ein quadrupolares Hochfrequenzfeld. In der Achse des Stabsystems herrscht dann gegenüber dem Massepotential des Massenspektrometers kein Hochfrequenzpotential.
Die Hochfrequenzspannung an den Stäben des Stabsystems ist sehr hoch, sie beträgt bei handelsüblichen Quadrupol-Massenspektrometern zwischen 15 und 30 Kilovolt (Spitze-Spitze). Die Frequenz beträgt etwa ein Megahertz. Im Inneren wird ein hauptsächlich quadrupolares Feld aufgespannt, das mit der Hochfrequenzspannung schwingt und die Ionen oberhalb einer Schwellenmasse zur zentralen Achse treibt, wodurch diese Ionen so genannte sekulare Oszillationen in diesem Feld ausführen. Die rücktreibenden Kräfte in der Ionenfalle werden manchmal durch ein so genanntes Pseudopotential beschrieben, das über eine zeitliche Mittelung der Kräfte des realen Potentials bestimmt wird. In der zentralen Achse befindet sich ein Sattelpunkt des oszillierenden realen Potentials, dieses fällt, je nach Phase der Hochfrequenzspannung, vom Sattelpunkt zu zwei gegenüberliegenden Stabelektroden hin quadratisch ab und zu den beiden anderen Stabelektroden hin quadratisch an. Der Sattelpunkt selbst befindet sich normalerweise, wie schon beschrieben, auf einem Gleichspannungspotential gegenüber dem Massepotential.
Ionenfallenmassenspektrometer haben Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen interessant macht. So können insbesondere ausgewählte Ionensorten (sogenannte „Elternionen") in der Ionenfalle isoliert und fragmentiert werden. Die Spektren dieser Fragmentionen werden "Fragmentionenspektren" oder auch "Tochterionenspektren" der betreffenden Elternionen genannt. Es können auch „Enkelionenspektren" als Fragmentionenspektren ausgewählter Tochterionen gemessen werden. Die Ionen werden bislang vorwiegend durch eine Vielzahl von Stößen mit einem Stoßgas fragmentiert, wobei die Oszillationen der zu fragmentierenden Ionen durch ein zugemischtes Dipolwechselfeld so angeregt werden, dass die Ionen in den Stößen Energie aufsammeln können, die schließlich zum Zerfall der Ionen führt.
In anderen Massenspektrometern mit linearer Ionenfalle, die als so genannte Dreifach-Quadrupolmassenspektrometer („triple quads") ausgeführt sind, werden die Tochterionen durch Selektion der Elternionen in einem erstem Quadrupolmassenfilter und durch Fragmentierung der Elternionen zu Tochterionen durch Einschuss in zweites, stoßgasbefülltes Quadrupolfilter erzeugt und erst dann in die lineare Ionenfalle eingebracht.
Die letztendlich für ein Massenspektrum verwendeten Ionen können also im Inneren erzeugt, wie auch auch von außen eingeführt werden. Ein Stoßgas in der linearen Ionenfalle sorgt dafür, dass die ursprünglich vorhandenen Bewegungsschwingungen (Oszillationen) der Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld abgebremst werden; die Ionen versammeln sich dann als kleine Wolke in der zentralen Achse der Ionenfalle. Der Durchmesser der fadenförmigen Ionenwolke beträgt in üblichen linearen Ionenfallen etwa einen halben Millimeter; er bestimmt sich durch ein Gleichgewicht zwischen der zentrierenden Wirkung des Hochfrequenzfeldes (der rücktreibenden Kraft des Pseudopotentials) und den abstoßenden Coulombschen Kräften zwischen den Ionen. Die inneren Abmessungen der Ionenfallen sind meist durch einen Abstand gegenüberliegender Stäbe von etwa acht bis zwölf Millimeter charakterisiert.
Eine gängige Art der Ionisierung großer Biomoleküle ist die Elektrosprüh-Methode (ESI = electro spray ionization), die Ionen bei Atmosphärendruck außerhalb des Massenspektrometers ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlasssysteme bekannter Art in das Vakuum des Massenspektrometers und von dort in die Ionenfalle eingebracht.
Diese Ionisierung erzeugt praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind im wesentlichen die des Moleküls. Wohl aber treten bei Elektrosprühen gehäuft vielfach geladene Ionen der Moleküle auf. Durch das Fehlen fast jeder Fragmention während des Ionisierungsprozesses beschränkt sich die Information aus dem Massenspektrum auf das Molekulargewicht; es fehlen Informationen über interne Molekülstrukturen, die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt werden können. Diese Informationen können erst über die Aufnahme von Fragmentionenspektren (Tochterionenspektren) erhalten werden.
Aus der Ionencyclotronresonanz- oder Fourier-Transform-Massenspektrometrie ist in jüngster Zeit ein Verfahren zur Fragmentierung von Biomolekülen, hauptsächlich von Peptiden und Proteinen bekannt geworden. Es besteht darin, Elektronen von den Ionen einfangen zu lassen, wobei die dabei freiwerdende Ionisierungsenergie zum Bruch der in der Regel kettenförmigen Moleküle führt. Das Verfahren wird ECD genannt (electron capture dissociation). Waren die Moleküle doppelt geladen, so bleibt eines der beiden entstehenden Fragmente als Ion zurück. Die Fragmentierung folgt dabei sehr einfachen Regeln (für Fachleute: es gibt im Wesentlichen nur C-Brüche und wenige Z-Brüche zwischen den Aminosäuren eines Peptids), so dass aus dem Fragmentierungsmuster sehr einfach auf den Aufbau des Moleküls geschlossen werden kann. Insbesondere wird die Sequenz von Peptiden oder Proteinen in einfacher Weise aus dem Fragmentierungsspektrum sichtbar. Die Interpretation dieser ECD-Fragmentspektren ist einfacher als die Interpretation von stoßerzeugten Fragmentspektren.
Es ist auch möglich, dreifach oder mehrfach geladene Ionen in dieser Weise zu fragmentieren, doch zeigt die Methode ihren Glanz besonders an den zweifach geladenen Ionen. Wird eine Elektrosprüh-Ionisierung auf Peptide angewandt, so sind die zweifach geladenen Ionen in der Regel auch die häufigsten Ionen. Elektrosprüh-Ionisierung ist eine Methode der Ionisierung, die für Biomoleküle zum Zwecke der massenspektrometrischen Untersuchung in Ionenfallen besonders häufig verwendet wird.
Für eine Fragmentierung durch Elektroneneinfang muss die kinetische Energie der Elektronen sehr gering sein, da sonst kein Einfang stattfinden kann. In der Praxis bietet man Elektronen mit einer Energie an, die nur wenig über der thermischen Energie der Elektronen liegt. Das geht in den sehr starken Magnetfeldern der Fourier-Transfom-Massenspektrometer sehr gut, da die Elektronen einfach längs der magnetischen Feldlinien driften, bis sie die Wolke der Ionen erreichen.
Aus DE 100 58 706 C1 ist ein Verfahren für die Fragmentierung von Ionen durch Elektroneneinfang in dreidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfallen nach Paul bekannt. In elektrischen Hochfrequenz-Ionenfallen nach Paul, sowohl in dreidimensionalen wie auch in linearen Ionenfallen, ist bisher eine Fragmentierung der Ionen durch Elektroneneinfang noch nicht gelungen. Aus DE 1 698 216 A1 und EP 0 736 894 B1 sind weiterhin dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen nach Paul bekannt, bei denen Elektronen zur Ionisierung von Analyten durch Elektronenstöße in eine dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen einge führt werden. Die Elektronen werden hier sowohl durch einen Spalt zwischen der Ringelektrode und einer Endkappenelektrode als auch durch Löcher in einer der Endkappenelektroden eingeschossen. Allerdings ist die Energie der Elektronen für die Fragmentierung von Ionen durch Elektroneneinfang zu groß.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Fragmentierungsverfahren in einer linearen Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle und ein zugehöriges Massenspektrometer bereitzustellen, wobei die Fragmentierung Ionen erzeugen soll, deren Spektrum die Sequenz von Biopolymerionen erkennen lässt.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung schlägt vor, eine Fragmentierung ausgesuchter, mehrfach geladener Ionen durch Elektroneneinfang in einer linearen Ionenfalle durchzuführen. Die niederenergetischen Elektronen können dabei auf zwei verschiedene Weisen in die lineare Ionenfalle eingebracht werden.
Das erste Verfahren zum Einschuss der niederenergetischen Elektronen wird in einer symmetrische mit den beiden Phasen der Antriebshochfrequenzspannung betriebenen Ionenfalle angewandt und besteht darin, dass die Elektronen durch den Spalt zwischen zwei benachbarten Polstäben in die Ionenfalle eingeschossen werden. Die Elektronen werden dabei in der ganz überwiegenden Zeit der Hochfrequenzperiode sofort auf einen der Polstäbe gelenkt und steht damit für eine Fragmentierung nicht zur Verfügung. Aber in der winzigen Zeit des Nulldurchgangs der Hochfrequenzspannung können einige Elektronen, die ja auch niederenergetisch noch sehr schnell sind, die Ionenwolke in der Achse des Stabsystems erreichen; diese Elektronen werden dann in der Wolke eingefangen.
Das zweite Verfahren des Einschusses niederenergetischer Elektronen entspricht einem Verfahren, das bereits zur Fragmentierung von Ionen durch Elektroneneinfang in dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen nach Paul verwendet wird ( DE 100 58 706 C1 ) und damit zum Stand der Technik gehört. Dieses Verfahren verwendet eine geänderte Zuführung der Hochfrequenzspannung zu nur zwei gegenüberliegenden Polstäben, sodann werden Elektronen durch eine Öffnung in einem der Hochfrequenz führenden Polstäbe in die Ionenfalle eingeschossen, wobei sich die Elektronenquelle auf einem so hohen positiven Potential befindet, dass dieses Potential vom oszillierenden Potential der zentrale Achse der Ionenfalle nur kurz erreicht oder überschritten wird. Die beiden anderen Polstäbe befinden sich dabei bevorzugt auf einem Gleichspannungpotential, entweder auf Massepotential oder auf einem Potential, das nur geringfügig vom Massepotential abweicht.
Die Elektronen können die zentrale Achse, in der die fadenförmige Ionenwolke siedelt, jeweils nur für wenige Nanosekunden erreichen: im ersten Einschussverfahren nur im Nulldurchgang., im zweiten aus dem Stand der Technik bekannten Einschussverfahren im Maximum der Hochfrequenzspannung, aber auf sehr geringe Reste ihrer kinetischen Energie abgebremst, also ideal für den Elektroneneinfang. Zu allen anderen Zeiten können die Elektronen die zentrale Achse der Ionenfalle überhaupt nicht erreichen, weil das Potential der zentralen Achse negativer ist als das Potential der Elektronenquelle und daher die immer negativ geladenen Elektronen zurückweist.
Die beiden Verfahren sind dabei recht unterschiedlich: das erste Einschussverfahren im Nulldurchgang bringt nur sehr wenige Elektronen in die Ionenwolke. Dieses Verfahren ist umso günstiger, je höher die kinetische Energie der Elektronen gewählt werden kann. Das zweite aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren ist besonders für Elektronen geeignet, die kinetische Energien in der Nähe der thermischen Energie in der Ionenwolke haben sollen. Dieses zweite Verfahren ist daher wesentlich günstiger. Im Folgenden werde nur auf das zweite Verfahren im Detail eingegangen.
Das Abbremsen der Ionen findet bei diesem zweiten aus den Stand der Technik bekannten Verfahren auf dem Weg von der Öffnung im Polstab bis zur zentralen Achse statt, wobei die Elektronen das sattelförmige Potentialgebirge erklimmen müssen (siehe 2 und 3). Die fadenförmige Ionenwolke befindet sich Sattelpunkt des Potentials. Das Sattelpotential fokussiert dabei die Elektronen auf die Ionenwolke, seitliche abweichende Elektronen werden wieder auf den richtigen Pfad in der Sattelrinne zurückgetrieben.
In der Achsenrichtung des Stabsystems (allgemein z-Richtung genannt) findet dabei weder Fokussierung noch Defokussierung des Elektronenstrahls statt. Da die Ionenwolke aber längs der Achse weit ausgedehnt ist, ist hier keine Fokussierung nötig.
Die Öffnung in dem Hochfrequenz führenden Polstab kann dabei schlitzförmig, aber auch rund sein, da sich die Elektronen in der fadenförmigen Ionenwolke sehr schnell verteilen. Handelt es sich um ein Massenspektrometer mit radialem Auswurf der Ionen durch einen langen Schlitz, so kann sich die Öffnung in einem Abschnitt des Stabsystems befinden, dass außerhalb des Schlitzbereiches liegt, um den Auswurf nicht durch eine Feldverzerrung durch die Elektroneneinschussöffnung zu stören.
Die Erfindung umfasst auch Ionenfallenmassenspektrometer für die Durchführung des Verfahrens. Das Ionenfallenmassenspektrometer aus Polstäben umfasst dabei eine Elektronenquelle, die sich vor dem Spalt zwischen zwei Polstäben befindet.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt eine lineare Ionenfalle für einen radialen Auswurf massenselektierter Ionen durch einen Schlitz (6) in Polstab (1), allerdings ohne die stirnseitig abschließenden Blenden, aber versehen mit einer Einschussvorrichtung (9, 10) für Elektronen durch eine feine Öffnung (8) im Hochfrequenz führenden Polstab (2), wie es dem Stand der Technik für dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen entspricht.
2 gibt eine lineare Ionenfalle wieder, die einen Elektronenemitter (10) mit Fokussierungs- und Steuerblenden (9) für den Einschuss niederenergetischer durch den Spalt zwischen den Polstäben (1) und (4) besitzt.
3 zeigt den symbolischen aus DE 100 58 706 C1 für dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfalle bekannten Potentialverlauf (11, 12, 13, 14) vom Ort der Elektronenquelle (11) bis zum Ort der fadenförmigen Ionenwolke (14) zur Zeit des Spannungsmaximums der Hochfrequenzperiode, beim Durchschuss durch eine Öffnung in einem Polstab. Die Linien (15) und (16) zeigen die Positionen der gegenüberstehenden, Hochfrequenzspannung führenden Polstäbe an.
4 zeigt den Potentialsattel zwischen den vier Polstäben (x- und y-Richtung) in einer linearen Ionenfalle in einer festen Phase der Hochfrequenz. Ein derartiger Potentialsattel ist aus DE 100 58 706 C1 für dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfalle bekannt. Im Punkte (21) werden die Elektronen durch eine Öffnung in einem Polstab eingeschossen. Der Potentialanstiegspfad (22) in der Potentialrinne führt die Elektronen (19) zur Ionenwolke, die genau im Sattelpunkt (20) gespeichert ist und sich in z-Richtung fadenförmig ausdehnt.
5 gibt das Zeitdiagramm für die Abnahme der doppelt geladenen Ionen (punktiert), die Zunahme der Neutralteilchen nach doppelter Entladung (strichpunktiert) und den Verlauf der einfach geladenen Ionen (gestrichelt) wieder.
Beschreibung günstiger Ausführungsformen
Eine günstige Ausführungsform, die für dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen aus dem Stand der Technik bekannt ist, ist in 1 wiedergegeben und zeigt eine lineare Ionenfalle für einen radialen Auswurf massenselektierter Ionen durch einen Schlitz (6) in Polstab (1), allerdings ohne die stirnseitig abschließenden Blenden., aber versehen mit einer Einschussvorrichtung für Elektronen mit einer Glühkathode (10) und einem Blendenbündel (9). Der Einschuss der Elektronen erfolgt hier durch eine feine Öffnung (8) im Hochfrequenz führenden Polstab (2). Die Einschussöffnung befindet sich hier an einer Stelle der linearen Ionenfalle, die nicht vom Ausschussschlitz (6) überdeckt wird, um keine Störung des Ausschusses durch die feine Elektroneneinschussöffnung (8) zu bewirken. Das Blenden bündel (9) dient dazu, den Elektronenstrahl ein- und auszuschalten und auf die feine Öffnung (8) zu fokussieren.
Die Erfindung kann aber auch für Ionenfallenmassenspektrometer mit axialem Auswurf der Ionen verwendet werden.
2 gibt eine etwas weniger günstige, aber immer noch erfolgreiche Ausführungsform einer linearen Ionenfalle für eine Fragmentierung durch Elektroneneinfang wieder. Dabei befindet sich ein Elektronenemitter (10) mit Fokussierungs- und Steuerblenden (9) für den Einschuss niederenergetischer Elektronen vor dem Spalt zwischen den Polstäben (1) und (4). Die niederenergetischen Elektronen werden durch den Spalt zwischen zwei benachbarten Polstäben eingeschossen, wobei die lineare Ionenfalle symmetrisch mit den beiden Phasen der Antriebshochfrequenzspannung betriebenen wird. Die Elektronen werden dabei in der ganz überwiegenden Zeit der Hochfrequenzperiode sofort auf einen der Polstäbe gelenkt und stehen damit für eine Fragmentierung nicht zur Verfügung. Aber in der winzigen Zeit des Nulldurchgangs der Hochfrequenzspannung können einige Elektronen, die ja auch niederenergetisch noch sehr schnell sind, die Ionenwolke in der Achse des Stabsystems erreichen. Diese Elektronen werden dann in der Ionenwolke eingefangen
Für die Beschreibung des Betriebs der linearen Ionenfalle werde angenommen, dass eine Elektrosprüh-Ionenquelle außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung von Biomolekülen verwendet wird. Es werde weiter angenommen, dass eine Mischung von Verdaupeptiden eines größeren Proteins untersucht werden soll. Die Ionen werden in üblicher Weise durch eine Kapillare und anschließende Druckstufen mit Ionenleitvorrichtungen in die Ionenfalle geführt und dort eingefangen. Ein erstes Massenspektrum gibt eine Übersicht über die Verdaupeptide. Sollen jetzt ein oder mehrere Peptide auf ihre Sequenz aus Aminosäuren hin untersucht werden, so isoliert man mit üblichen Mitteln die doppelt geladenen Ionen dieses Peptids; das heißt, man wirft mit bekannten Verfahren alle Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht doppelt geladene Ionen dieses Peptids sind. Die doppelte Ladung erkennt man am Abstand der Isotopenlinien voneinander, die für doppelt geladene Ionen genau ½ atomare Masseneinheit beträgt.
Diese doppelt geladenen Ionen werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas in die zentrale Achse der Falle hinein abgebremst. Sie bilden dort eine langgestreckte fadenförmige Wolke von etwa einem halben Millimeter Durchmesser.
Bei der aus dem Stand der Technik bekannten und in 1 dargestellten Ausführungsform ist der Hochspannung führende Polstab (2) der Ionenfalle mit einem feinen Loch (8) von etwa einem halben Millimeter Durchmesser in einer Aushöhlung (7) versehen. Vor Aushöhlung (7) ist ein Elektronenemitter (10) mit blendenförmigen Elektroden (9) für den Elektronenabzug und die Elektronenstrahlfokussierung angebracht. Dieser Elektronenemitter (10) befindet sich auf dem Potential, den der Sattelpunkt des Fallenpotentials in der zentralen Achse zum Zeitpunkt seines positiven Maximums und damit die fadenförmige Ionenwolke zu dieser Zeit annimmt.
Wird der Elektronenabzug durch das Blendenbündel (9) eingeschaltet, so wird ein feiner Elektronenstrahl gebildet, der durch die elektrische Fokussierung des Blendenbündels (9) nur im Augenblick des Elektroneneinfangs voll auf die Eingangsöffnung (8) des Polstabs (2) gerichtet ist. Der Elektronenstrahl wird vom Polstab (2) so lange zurückgetrieben, wie das Hochfrequenzpotential des Polstabs (2) negativer ist als das Potential des Elektronenemitters (10). Wird das Potential des Polstabs (2) im Verlaufe der Hochfrequenzperiode positiver, so werden die Elektronen zunehmend auf den Polstab (2) zu beschleunigt, aber in der meisten Zeit noch stark defokussiert, bewirkt durch das Zusammenspiel der Potentiale an Blendenbündel (9) und Aushöhlung (7). Die wenigen Elektronen, die die Öffnung treffen, treten dann durch die winzige Öffnung (8) in die Ionenfalle ein und sehen hier einen entgegenstehenden, abbremsenden Potentialverlauf, den sie nicht voll ersteigen können. Sie werden also wieder reflektiert. Erst im Maximum des Potentials der Hochfrequenzperiode können die Elektronen bis zum Sattelpunkt in der zentralen Achse, in dem sich die fadenförmige Ionenwolke befindet, vordringen. In diesem Augenblick herrscht auch die beste Fokussierung des Elektronenstrahls auf die kleine Eingangöffnung (8), so dass erst jetzt nennenswerte Mengen an Elektronen in die Ionenfalle eindringen. Diese optimale Fokussierung wird durch die Potentiale am Blendenbündel (9) eingestellt.
Bei der Ankunft der Elektronen in der Ionenwolke nach dem Erklimmen des Potentialsattels sind die Elektronen praktisch auf die kinetische Energie null abgebremst. Sie werden jetzt praktisch ohne Einfangverluste zunächst vom Raumladungspotential der Ionenwolke, und in dieser dann von einzelnen Ionen eingefangen.
Beispiel: Findet die Fragmentierung in der Ionenfalle bei einer Hochfrequenzspannung statt, die 3 Kilovolt Spitze-Spitze beträgt, so folgt das Potential in der zentralen Achse mit genau dem halben Betrag. Schwingt das an den beiden Polstäben anliegende Potential im Potentialbereich von –1,5 bis +1,5 Kilovolt gegen Masse, so folgt das Potential des zentralen Zentrums mit einer Schwingungsweite von –750 bis +750 Volt. Die beiden übrigen Stäbe werden auf Massepotential gehalten. Befindet sich nun die Elektronenquelle auf einem Gleichspannungspotential von +750 Volt, so können die Elektronen die zentrale Achse nur dann erreichen, wenn sich die Polstabspannung im Spannungsmaximum bei +1,5 Kilovolt und das Potential in der zentralen Achse demgemäß auf +750 Volt befindet. Die Elektronen werden dabei außerhalb der Ionenfalle vom Potential der Elektronenquelle (+750 V) auf das stark positivere Potential des Polstabs beschleunigt (+1,5 kV), erhalten also eine Energie von 750 Elektronenvolt. Im Inneren der Ionenfalle wird die kinetische Energie von 750 Elektronenvolt wieder auf praktisch null Elektronenvolt abgebremst, da sich die zentrale Achse auf dem Potential von +750 Volt befindet. Zu allen anderen Zeiten befindet die zentrale Achse auf einem negativerem Potential, die negativen Elektronen werden zurückgewiesen.
3 zeigt den symbolischen für dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen bekannten Potentialverlauf (11, 12, 13, 14) vom Ort der Elektronenquelle (11) über die Position (15) des Polstabs bis zum Ort der Ionenwolke (14) zur Zeit des Spannungsmaximums der Hochfrequenzperiode. Negative Potentiale sind in 3 nach oben gerichtet, so dass Elektronen schematisch die Potentiale in der richtig gefühlten Weise „herunterrollen" können.
Die Positionen (15) und (16) zeigen symbolisch den Ort der beiden gegenüberliegenden, Hochspannung führenden Polstäbe. Zwischen den beiden Bereichsgrenzen (17) ist die Ionenwolke (14) angesiedelt. Die Elektronen (19) rollen zunächst den Potentialabhang (12) zwischen Elektronenquellenpotential (11) und Polstabpotential (15) hinab, und werden dann an der aufsteigenden Potentialpiste (13) zum Potential (14) der Ionenwolke hin abgebremst. Dieser Potentialverlauf herrscht nur in den wenigen Nanosekunden des maximalen Potentials der Hochspannungsperiode. Der Potentialverlauf (18) zeigt einen Verlauf in einer anderen Phase der Hochfrequenzperiode. In dieser Phase können die Elektronen den zu hoch liegenden (zu negativen) Sattelpunkt nicht erklimmen.
Die 4 zeigt den für dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfalle bekannten Potentialverlauf, den der Elektronenstrahl im Inneren der Ionenfalle erlebt, über der x-y-Ebene quer zum Stabsystem. Der Potentialverlauf bildet einen sehr günstigen Potentialsattel, den die Elektronen (19) längs des Weges (22) zum Erreichen der Ionenwolke (20) recht einfach erklimmen können, da sie in dieser Ebene durch die Sattelform automatisch geführt werden. Im Punkte (21) werden die Elektronen (19) eingeschossen. In der z-Richtung, also der Längsrichtung des Stabsystems, findet keine Fokussierung statt, aber auch keine Defokussierung, so dass die Ionen auf jeden Fall die Ionenwolke erreichen..
In der Ionenwolke werden die dann niederenergetischen Elektronen durch das Coulombfeld um die einzelnen Ionen herum durch vielfältige, statistische Ablenkungen ihrer Flugrichtung eingefangen, wobei sie in der Regel jeweils ein wenig kinetische Energie verlieren. Aus energetischen Gründen können sie diese Ionenwolke nicht mehr verlassen, aber sie können in der fadenförmigen Wolke leicht in Längsrichtung durch die Wolke diffundieren. Sie werden schließlich von einem Ion zur Rekombination einer Ionenladung eingefangen.
Ist die fadenförmige Ionenwolke zu stark gekühlt, so liegen die Ionen ortsfest in der Achse des Stabsystems aufgereiht, und es ist den Elektronen nicht mehr möglich, in Längsrichtung zu diffundieren. Es muss dann entweder die Einfädelung der Elektronen durch einen langen Schlitz oder durch mehrere Öffnungen vorgenommen werden, oder aber es muss, im Fall eines Elektroneneinschusses durch ein einziges feines Loch, den Elektronen die Diffusion ermöglicht werden. Das kann beispielsweise durch eine leichte, dipolare Anregung der Ionen durch eine schwache dipolare Wechselspannung mit einem Frequenzgemisch („weißes Rauschen") oder einer schwachen Anregungsfrequenz für die doppelt geladenen Ionen zwischen den beiden Polstäben geschehen, die sich nach obiger Beschreibung auf Gleichpotential befinden sollen.
Beim Einfangen der Elektronen durch ein Ion wird die Ladungsstufe des Ions herabgestuft. Eine Ionisierungsstelle des Ions wird neutralisiert. Aus dem zweifach geladenen Ion wird ein einfach geladenes Ion. Dabei wird die Ionisierungsenergie frei. (Genauer: bei den Ionen handelt es sich ganz überwiegend um protonierte Biomoleküle. Es wird also die Anlagerungsenergie des Protons, die so genannte Protonenaffinitätsenergie, frei). Die freiwerdende Energie wird im Ion absorbiert und führt zu einem sehr genau definierten spontanen Bruch zwischen zwei Aminosäuren, in der Regel zu einem so genannten C-Bruch. Andere Ionen der gleichen Art erleben einen Bruch zwischen jeweils zwei anderen Aminosäuren. Statistisch gesehen entsteht ein Gemisch aus Fragmentionen, die in ihrer Länge die ganze Kette der Aminosäuren widerspiegeln, oder zumindest einen Teil dieser Kette. Es ist einer der Vorteile der Fragmentierung durch Elektroneneinfang, dass alle C-Bruchstücke mit etwa gleicher Häufigkeit gebildet werden, also ein Massenspektrum mit einer guten Lesbarkeit der Sequenz der Aminosäuren liefert.
Der Elektronenstrahl wird abgestellt, sobald eine genügende Fragmentierung eingetreten ist. In 3 ist dargestellt, wie die doppelt geladenen Ionen zeitlich abnehmen und die einfach geladenen Ionen (Fragmentionen) zunehmen. Man darf dabei diesen Vorgang nicht zu lange fortsetzen, da sonst die einfach geladenen Fragmentionen zu Neutralpartikeln rekombinieren. Die einfach geladenen Fragmentionen werden nach Abschalten des Elektronenstrahls und nach einer kurzen Beruhigungspause in üblicher Weise als Massenspektrum aufgenommen. Die Interpretation dieses Massenspektrums ergibt die Sequenz oder zumindest eine Teilsequenz der Aminosäuren in diesem Peptid.
Dieses Verfahren kann dann für andere Peptide aus dem Gemisch wiederholt werden. Es ergibt sich so eine sehr sichere Identifizierung des Eiweißes. Es können sogar Unterschiede des untersuchten Eiweißes zu solchen aus Proteinsequenzdatenbanken festgestellt werden.
Die durch die Erfindung ermöglichte Fragmentierung durch Elektroneneinfang hat eine Reihe von Vorteilen, die nicht auf den ersten Blick ersichtlich sind:
Vorteil a: Da die Speicherung der Ausgangsionen und ihre Fragmentierung nunmehr bei sehr kleinem q im Mathieu-Diagramm möglich ist, ist die Sekularbewegung der Ionen sehr langsam. Das ist wiederum günstig für den Elektroneneinfang.
Vorteil b: Durch die Fragmentierung mit niedriger Hochfrequenzspannung können alle Tochterionen bis zu kleinen Massen herunter gespeichert werden, weil die Schwellenmasse jetzt sehr niedrig liegt. Das war bisher nicht möglich, da für Stoßfragmentierung mit einer Mindesthochfrequenzspannung gearbeitet werden musste, weil sonst die Stoßenergie zu klein wurde und eine Fragmentierung oft nicht möglich war. Erst durch sehr kleine Hochfrequenzspannungen kann das ganze Aminosäuren-Fragmentspektrum der C-Brüche ab der ersten Aminosäure aufgenommen werden. Beispiel: Ein großes, doppelt geladenes Peptid mit 20 Aminosäuren hat ein Molekulargewicht von etwa 2400 atomaren Masseneinheiten und eine spezifische Masse von m/z = 1200 Masseneinheiten pro Elementarladung. Normalerweise können Tochterionen durch Stoßfragmentation nur etwa ab einer Schwellenmasse von 400 Masseneinheiten pro Elementarladung (entspricht etwa drei bis vier Aminosäuren) gespeichert werden, jetzt ist aber mit ECD durch Wahl einer sehr kleinen Hochfrequenzspannung eine Speicherung ab 80 Masseneinheiten pro Elementarladung möglich, so dass auch die kleinste, endständige Aminosäure noch erfasst werden kann.
Vorteil c: Die Erzeugung der einfach geladenen Ionen aus doppelt geladenen und der zugehörige Verlust von einfach geladenen Ionen verhält sich gutmütig, wie aus 3 zu ersehen ist (falls die Wirkungsquerschnitte für den Elektroneneinfang sich wirklich wie 4 : 1 verhalten, was nicht für alle Ionensorten gelten mag). Beträgt die Ausbeute der einfach geladenen Ionen etwa 50 % der ursprünglichen Anzahl an doppelt geladenen Ionen, so sind die doppelt geladenen Ionen auf etwa 2-3 % gesunken; stören also nicht mehr. Etwa 47 % der einfach geladenen Ionen sind durch Löschung verloren gegangen; das ist gut erträglich. Andere Fragmentierungsarten haben geringere Ausbeuten.
Vorteil d: Die Fragmentierung ist sehr schnell, sie dauert nur wenige Millisekunden. Es werden dabei etwa 40 bis 50 Millisekunden Fragmentierungs- und Dämpfungszeit eingespart. Im Resultat können mehr Spektren pro Zeiteinheit aufgenommen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert natürlich zuerst eine Einjustierung der günstigsten Potentiale des Elektronenemitters für jede Einstellung der Hochfrequenzspannung. Es wird hierfür experimentell eine Kalibrierkurve erstellt. Auch für die Elektronenstromstärke und für die Zeitdauer der Einwirkung des Elektronenstrahls werden die optimalen Daten experimentell ermittelt.
Natürlich werden in der Ionenfalle während des Eindringens der Elektronen durch Elektronenstoß auch Ionen des Stoßgases erzeugt. Meist wird Helium als Stoßgas benutzt, es können aber auch andere, leichte Gase verwendet werden. Die Masse der Ionen dieser Gase liegen regelmäßig unterhalb der Speicherschwelle der Ionenfalle, die Ionen verlassen die Ionenfalle innerhalb sehr weniger Hochfrequenzperioden, meist innerhalb einer einzigen Periode.
Das lineare Ionenfallenmassenspektrometer in 1 für den Einschuss von Elektronen durch eine Öffnung in einem der Polstäbe zur Fragmentierung von Ionen durch Elektroneneinfang benötigt einen Elektronenemitter (eine Elektronenquelle) für die Erzeugung des Elektronenstrahls vor mindestens einer dieser Öffnungen und einen Hochfrequenzgenerator, der auch ein Polstabpaar allein versorgen kann. Günstig ist eine einstellbare Spannungsversorgung für das Emitterpotential und eine Versorgung für das Blendenbündel, das den Elektronenstrahl nach Dauer und Stärke einzustellen gestattet. Das Ionenfallenmassenspektrometer kann dabei durch radialen oder axialen massenselektiven Ionenauswurf betrieben werden. Als Emitter kann eine einfache Glühkathode, vorzugsweise eine so genannte Haarnadelkathode, dienen. Stromstärke und Strahldauer können über ein Potential an einem einfachen Wehnelt-Zylinder oder einer einfachen Lochblende eingestellt werden. Der einzu stellende Elektronenstrom ist, wie unten gezeigt wird, sehr klein. Da die Hochfrequenzspannung für eine handelsübliche Ionenfalle im Bereich von 10 bis 30 Kilovolt liegt, sollte das Emitterpotential etwa im Bereich von 100 bis 1000 Volt einstellbar sein.
In der Ionenwolke dürfen sich für ein gutes Spektrum nur maximal 10⁵ Ionen befinden, da es sonst zu einer Verschlechterung des Massenauflösungsvermögens durch die Einwirkung der Raumladung kommt. Dazu müssen sich zu Beginn der Fragmentierung etwa 2·10⁵ doppelt geladene Ionen in der Falle befinden. Es werden also für die Elektroneneinfangfragmentierung in der Wolke etwa 3·10⁵ Elektronen benötigt. Die Bedingungen für den Zugang niederenergetischer Elektronen zur Ionenwolke herrschen nur für die kurze Zeit des Maximums der Hochfrequenzspannung. Die Zeit beträgt nur etwa 1 % der Schwingungsperiode, also etwa zehn Nanosekunden. Es wird also nur etwa ein Prozent der Elektronen des Elektronenstrahles eingefangen. Daraus resultiert, dass etwa 3·10⁷ Elektronen in den Ionenfallenraum eintreten müssen. Rechnet man von der Glühkathode bis zum Eintritt in den Ionenfallenraum mit einem Verlust von 99 Prozent der Ionen, so müssen etwa 3·10⁹ Elektronen von der Glühkathode geliefert werden. Möchte man den Vorgang in einer Millisekunde abschließen, so benötigt man einen Elektronenstrom von etwa 3·10¹² Elektronen pro Sekunde. Das ist ein Elektronenstrom von etwa 150 Nanoampère, also extrem wenig, da sich selbst mit einer sehr einfachen Elektronenquelle leicht Elektronenströme von etwa 100 Mikroampère erreichen lassen. Selbst bei Elektronenverlusten, die um eine Faktor 100 höher liegen, ließe sich der benötigte Elektronenstrom leicht herstellen.
Bei der Fragmentierung durch Elektroneneinfang an doppelt geladenen Ionen lässt es sich nicht vermeiden, dass auch eine Anzahl von bereits gebildeten, einfach geladenen Fragmentionen durch einen weiteren Elektroneneinfang vernichtet werden. In 3 sind geschätzte Kurven für die Rekombination (mit Fragmentierung) wiedergegen. Die Berechnung der Kurven in 3 erfolgte unter der erfahrungsgestützten Voraussetzung, dass der Wirkungsquerschnitt für die Rekombination doppelt geladener Ionen um eine Faktor vier größer ist als der Wirkungsquerschnitt für die Rekombination von einfach geladenen Ionen. Es lässt sich damit ein guter Kompromiss finden zwischen restlichen doppelt geladenen Elternionen, einfach geladenen Fragmentionen und durch vollständige Entladung vernichteten Ionen. Es ist aber notwendig, mit einer wesentlich höheren Anzahl von Ionen zu beginnen, als für das schlussendlich aufgenommene Fragmentionenspektrum gebraucht werden. Diese Betrachtung muss bei der Einspeicherung der Ionen und bei ihrer Isolierung berücksichtigt werden.
Es lassen sich durch den Fachmann auch noch kompliziertere Potentialversorgungen ausdenken, die den gleichen Effekt haben, die Ionenwolke im Zentrum nur mit nullenergetischen Elektronen zu versorgen, beispielsweise dadurch, dass das Potential des Elektronenemitters auch auf einer Hochfrequenzspannung liegt. Alle diese Lösungen sind jedoch auf wendiger als die oben vorgeschlagene Lösung des Problems, obwohl diese komplizierteren Lösungen vom Erfindungsgedanken mit umfasst sein sollen.

Claims

Verfahren für die Fragmentierung von Ionen in einer linearen Hochfrequenz-Ionenfalle, wobei die Ionenfalle mindestens vier Polstäbe umfasst, dadurch gekennzeichnet, a) dass mehrfach geladene Ionen in der Ionenfalle gespeichert werden, b) dass niederenergetische Elektronen aus einer Elektronenquelle durch den Spalt zwischen zwei benachbarten Polstäben eingeschossen werden, wobei die niederenergetischen Elektronen eine Energie aufweisen, die in der Nähe der thermischen Energie liegt, und c) dass die mehrfach geladenen Ionen durch den Einfang der niederenergetischer Elektronen (ECD) fragmentiert werden.
Verfahren für die Fragmentierung von Ionen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Ionenfalle mehrfach geladene Ionen einer zu untersuchenden Ionensorte vor dem Einschuss der Elektronen ausgewählt und isoliert werden.
Verfahren für die Fragmentierung von Ionen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die fragmentierten Ionen in der Ionenfalle massenspektrometrisch analysiert werden.
Lineare Hochfrequenz-Ionenfalle mit mindestens vier Polstäben, dadurch gekennzeichnet, dass sich außerhalb der linearen Hochfrequenz-Ionenfalle vor der Spaltöffnung zwischen zwei benachbarten Polstäben eine Elektronenquelle befindet, wobei die Elektronenquelle derart eingerichtet ist, dass sie Elektronen erzeugt, die eine Energie aufweisen, die in der Nähe der thermischen Energie liegt und somit für die Fragmentierung von mehrfach geladenen Ionen durch Elektroneneinfang (ECD) geeignet ist.
Lineare Hochfrequenz-Ionenfalle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektronenquelle eine Einrichtung zur Einstellung des Potentials umfasst.
Lineare Hochfrequenz-Ionenfalle nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung vorgesehen ist, mit der die Elektronenstromstärke der Elektronenquelle und die Zeitdauer der Elektronenlieferung einstellbar ist.