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Umfeld der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Fragmentierung
von mehrfach negativ geladenen Ionen in Elektronen-Ionen Reaktionen
in multipolaren Radiofrequenzfeldern, wie etwa den Feldern in Quadrupol-Ionenfallen
und in Ionenleitsystemen, und Vorrichtungen, mit denen diese Verfahren
zur Fragmentierung von Ionen durchgeführt werden. Die Verfahren lassen
sich in der Tandem Massenspektrometrie verwenden.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Massenspektrometrie ist eine Analysentechnik, in der Probenmoleküle ionisiert
werden und bezüglich
ihres Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z-Verhältnis) analysiert
werden. Die Ionen werden durch eine Vielzahl von Ionisationsverfahren
erzeugt, wie etwa durch Elektronenionisation (EI = Electron Ionization),
durch Beschuss mit schnellen Atomen (FAB = Fast Atom Bombardement),
durch Elektrosprühen
(ESI = Electron Spray Ionization) und durch matrixunterstützte Laserdesorption
und Ionisation (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization).
Das Masse-zu-Ladungsverhältnis
wird in Masseanalysatoren gemessen, in denen die Ionen entweder
für eine
Zeitdauer in einer Falle gespeichert werden oder die von den Ionen
in Richtung eines Ionendetektors durchlaufen werden. In den Masseanalysatoren
mit Ionenfallen, zu denen die Quadrupol-Ionenfalle (Paulfalle) und
das Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer
(ICR oder Penningfalle) gehören,
werden die Ionen durch eine Kombination aus magnetischen, elektrostatischen
und zeitlich veränderlichen
elektromagnetischen Feldern für
0.1 bis 10 Sekunden räumlich
eingeschlossen. Die Aufenthaltszeit in den von Ionen durchlaufenden
Masseanalysatoren ist im Vergleich dazu kürzer und beträgt zwischen
1 und 100 Mikrosekunden. Zu dieser Art zählen etwa Magnetfeldanalysatoren,
Quadrupolfilter und Flugzeitanalysatoren.
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Die
Tandem Massenspektrometrie bezeichnet allgemein ein Verfahren, bei
dem innerhalb des Massenspektrometers Probenionen mit einem gewünschten
m/z-Verhältnis
ausgewählt
und dissoziiert werden. Die erhaltenen Fragmente werden ihrem m/z-Verhältnis entsprechend
weiter analysiert. Die Dissoziation der selektierten Probenionen
kann in einer speziellen Zelle zwischen zwei Masseanalysatoren erfolgen.
Diese Zellen beruhen für
gewöhnlich auf
einem Ionenleitsystem mit Multipolfeldern (Quadrupolfeldern, Hexapolfeldern
usw.). In Massenspektrometern mit Ionenfallen erfolgt die Dissoziation
in der Ionenfalle selber. Die Tandem Massenspektrometrie kann sehr
viel mehr Informationen über
die Struktur der Probenmoleküle
liefern.
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Um
Ionen in einem Massenspektrometer zu fragmentieren wird am häufigsten
die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID = Collision Induced Dissoziation)
eingesetzt. Im vorherrschenden Verfahren werden dabei Ionen mit
einem bestimmten m/z-Verhältnis
vorselektiert und mit Gasatomen, wie beispielsweise Helium, Argon
oder Stickstoff, zur Kollision gebracht, wobei die Kollisionsenergie
nachfolgende in innere Ionenenergie umgewandelt wird. Alternativ
können
die Ionen auch mit infrarotem Licht bestrahlt werden (IRMPD = Infrared
Multiphoton Dissociation), was ebenfalls zu einer Erhöhung der
inneren Energie führt.
Weisen Ionen eine hinreichen große innere Energie auf, durchlaufen
sie anschließend
eine Dissoziation, die zu einfach oder mehrfach geladenen Fragmenten
führt.
Aus der Masse und der Häufigkeit
der jeweiligen Fragmente ergeben sich Informationen, die für die Charakterisierung
der Struktur der Probenmolekülen
verwendet werden kann.
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Beide
Dissoziationsverfahren (CID und MPIRD) haben schwerwiegende Nachteile.
Erstens dominieren hier die Prozesskanäle mit niedrigen Dissoziationsenergien,
was die Vielfalt der Bindungsbrüche
und damit die ableitbare Information reduziert. Selbst bei relativ
geringen Kollisionsenergien werden schwach gebundene funktionelle
Gruppen abgelöst und
so der Informationsgewinn über
die Struktur begrenzt. Die Anwesenheit von schwach gebundenen Gruppen
führt zu
einem Informationsverlust bezüglich
ihrer Position im Molekül.
Schließlich
sind beide Dissoziationsverfahren (CID und MPIRD) bei großen Molekülmassen
nicht mehr effektiv.
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Um
zumindest einige dieser Probleme zu überwinden, wurden in jüngster Zeit
eine Reihe von Elektronen-Ionen Reaktionen zur Dissoziation von Ionen
vorgeschlagen (Überblick
in Zubarev, R. A., Mass Spectrom. Rev. 22 (2003), S. 57–77). Eine
dieser Reaktionen ist die Dissoziation durch Elektroneneinfang (ECD
= Electron Capture Dissociation) (Zubarev, R. A., Kelleher und McLafferty,
J. Am. Chem. Soc. 120 (1998), S. 3265–3266).
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Das
ECD Verfahren ist der älteren
Dissoziation durch Kollisionen mit energiereichen Elektronen (EID
= Electron Impact Dissociation) bezüglich der technischen Realisierung ähnlich,
hat aber einen anderen physikalischen Wirkmechanismus. Im Patent
US 4 731 533 A wird
die Verwendung von hochenergetischen Elektronen mit einer Energie
von etwa 600 Elektronenvolt beschrieben, die radial auf einen Ionenstrahl
gerichtet werde und zur Fragmentierung von Ionen führen. In ähnlicher
Weise wird im Patent
US
4 988 869 A der Gebrauch eines Strahls aus hochenergetischen
Elektronen (100–500
eV) offen gelegt, der schräg
auf einen Ionenstrahl trifft und die Fragmentierung der Ionen herbeiführt. Das
EID Verfahren leidet an einer geringen Fragmentierungseffizienz,
die sich auf ungefähr
fünf Prozent
der Elternionen beläuft.
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Im
Gegensatz zur EID zerfallen die mehrfach positiv geladenen Ionen
beim ECD Verfahren in einer Ionen-Zyklotron-Resonanzzelle durch
den Einfang eines niederenergetischen Elektrons (< 1eV). Die niederenergetische
Elektronen werden durch einen beheizten Draht oder eine Spenderkathode
erzeugt (Zubarev, R. A., et. al., Anal. Chem. 73 (2001), S. 998–3005).
Der Elektroneneinfang kann im Vergleich zum CID- oder MPIRD-Verfahren
mehr strukturrelevante Bindungsbrüche hervorrufen. Bei Polypeptiden,
die weithin mit massenspektrometrischen Techniken analysiert werden,
bricht bei einem Elektroneneinfang bevorzugt eine N-Ca Bindung
der Rückgratstruktur
(C- oder Z-Fragmente), während
die Anregung durch Kollisionen (CID) oder Infrarotabsorption (MPIRD)
zu einer Spaltung der Amidbindung der Rückgratstruktur führt (Peptidbindung,
B- oder Z-Brüche).
Werden diese beiden Arten der Fragmentierung kombiniert, ergeben
sich zusätzliche
Informationen über
die Sequenz des Polypetids (Horn, D. A., Zubarev and McLafferty,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (2000), S. 0313–10317). Zudem werden bei einem Elektroneneinfang
auch Disulfidbindungen gespalten, die bei einer Anregung durch Kollisionen
oder Infrarotabsorption für
gewöhnlich
intakt bleiben. Schließlich
blieben beim Elektroneneinfang schwach gebundene Gruppen an den
jeweiligen Fragmenten gebunden, wodurch ihre Position bestimmt werden kann.
Dieses Merkmal ist speziell für
die Analyse von posttranslatorischen Modifikationen von Proteinen und
Peptiden wichtig, wie etwa bei der Phosphorylierung, Glykolysierung,
g-Caboxylierung etc..
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Andere
Elektronen-Ionen Reaktionen zur Fragmentierung von Ionen liefern
weitere analytische Vorteile. Wird die Energie der Elektronen auf
3 bis 13 Elektronenvolt erhöht,
so führt
der Einfang dieser „heißen” Elektronen
zu einer Dissoziation (HECD = Hot Electron Capture Dissociation),
in der dem Elektroneneinfang eine Elektronenanregung vorausgeht. Die
so erzeugten Fragmente durchlaufen sekundäre Fragmentationsprozesse,
mit denen isomere Leucin- und Iso-Leucin Reste unterschieden werden
können (Kjeldsen,
F., Budnik, Haselmann Jensen, Zubarev, Chem. Phys. Lett. 356 (2002),
S. 201–206).
In der Dissoziation durch Elektronenabstreifung (EDD = Electron
Detachment Dissociation) ionisieren Elektronen mit Energie von 20
Elektronenvolt dianionische Peptide. Die EDD ist bezüglich der
Wirkung mit der ECD vergleichbar und hat Vorteile bei sauren Peptiden
und Peptiden mit säureartigen
Modifikation, wie etwa einer Sulfation.
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Der
Nachteil der bestehenden Fragmentierungsverfahren durch Elektronen-Ionen
Reaktionen liegt hauptsächlich
darin, dass diese nur in Penningfallen effizient sind. Diese Ionenfallen
sind aber wegen ihrer technischen Komplexität und Kosten nicht weit verbreitet.
In den weiter verbreiteten Paulfallen, Kollisionszellen mit Multipolfeldern
und Ionenleitsystemen werden Elektronen durch die elektrische Radiofrequenzfelder
(RF-Feld), die typischerweise eine Frequenz von einem Megahertz
und eine Amplitude von 500 Volt aufweisen, abgelenkt oder erhalten
Energien über
20 Elektronenvolt. Unter einer Elektronenenergie von 20 Elektronenvolt
sind die Elektronen-Ionen Reaktionen am effizientesten. Eine andere
Schwierigkeit besteht in der parasitären Ionisation der Moleküle im Restgas,
die zu einer große
Anzahl von ungewollten negativen und bevorzugt positiven Ionen führt. Diese
Ionen werden direkt detektiert und durch weitere Ionen-Molekül Reaktionen
indirekt detektiert, was in beiden Fällen zu einem starken Hintergrundsignal
und parasitären
Signalspitzen führt und
dadurch die Sensitivität
begrenzt. Für
Helium, das in den meisten Fällen
als Puffergas verwendet wird, tritt die parasitäre Ionisation ab einer Elektronenenergie
von 24 Elektronenvolt ein.
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In
den Offenlegungsschriften
DE
103 25 582 A1 (Franzen) und
WO 2003/102545 A2 (Whitehouse et
al.) werden allerdings Ionenfallen und Ionenleitsysteme mit RF-Feldern
zur Fragmentierung von Ionen durch Elektronen-Ionen Reaktionen verwendet,
wobei niederenergetische Elektronen durch Magnetfelder zu den Ionen
in den Ionenfallen bzw. Ionenleisytemen geführt werden. In der erst genannten
Offenlegungsschrift von Franzen werden dazu dreidimensionale Paulfallen
für das
ECD Verfahren verwendet. Die Offenlegungsschrift von Whitehouse
et al. zeigt, dass neben positiv geladenen Ionen auch negativ geladene
Ionen in Reaktionen mit niederenergetischen Positronen (PCD) fragmentiert
werden können,
wobei die ECD- und PCD-Reaktionen
in linearen Ionenfallen und Ionenleitsystemen ausgeführt werden
und magnetische Führungsfelder
für die
Elektronen und Positronen vorgesehen sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, mit denen mehrfach
negativ geladene Ionen in multipolaren Radiofrequenzfeldern durch
Elektronen-Ionen Reaktionen effektiv fragmentiert werden, wobei
die multipolaren Radiofrequenzfelder zur Speicherung und zum Transport
der Ionen eingesetzt werden. Im Zentrum des Feldes wird eine Elektronenwolke
mit Elektronenenergie unter 20 Elektronenvolt bereitgestellt und
radial zur Achse der Vorrichtung eingeschlossen, und zwar durch
ein Magnetfeld, das entlang dieser Achse verläuft.
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In
dreidimensionalen Paulfallen mit Ring- und Endkappenelektroden werden
die Elektronen in radialer Richtung durch das Magnetfeld und in
axialer Richtung während
einer Halbperiode der Radiofrequenzspannung durch das elektrische
Potential eingeschlossen. Es werden Mittel bereitgestellt, um die Elektronen
entlang der Achse der Vorrichtung gefangen zu halten, wenn die Radiofrequenzspannung
positiv ist. Die Elektronenwolke im Zentrum kann in jeder Periode
der Radiofrequenz wenigstens einmal bereitgestellt werden, so dass
sich für
die Elektronen-Ionen
Reaktionen ein Arbeitszyklus mit einer Auslastung von 50 Prozent
oder mehr ergeben kann.
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In
zweidimensionalen Vorrichtungen mit Multipolfeldern, wie etwa lineare
Fallen oder Ionenleitsystemen, braucht der radiale Einschluss der
Elektronen durch das Magnetfeld nicht durch einen axialen Einschluss
unterstützt
werden. Die niederenergetischen Elektronen können sich entlang der Achse der
Vorrichtung frei bewegen oder werden durch ein geeignete Kraftfeld
axial begrenzt, wie zum Beispiel in einer magnetischen Flasche.
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Da
in beiden Arten von Vorrichtungen die radiale Beschleunigung der
Elektronen im Radiofrequenzfeld durch das axiale Magnetfeld verhindert wird,
bleibt die anfängliche
kinetische Energie der Elektronen über einen weiten Teil der Speicherdauer im
Wesentlichen erhalten und die Elektronen reagieren wirkungsvoll
mit den Ionen.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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Die 1 zeigt
eine Paulfalle mit einem einzelnen Permanentmagneten (5),
der die Form einer Unterlegscheibe hat und in die Ringelektrode
(3) eingelassen ist und die Elektronen vom ringförmigen Emitter
(6) in die Falle führt.
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Die 2 zeigt
eine Paulfalle mit zwei Magneten in Form von Unterlegscheiben (10, 11),
durch die die Elektronen auf dem gekennzeichneten Weg (14)
in die Falle geführt
werden. Die Elektronen werden dabei mit Hilfe eines ultravioletten
gepulsten Nanosekunden Lasers (12) erzeugt.
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Die 3 zeigt
ein lineares Ionenleitsystem mit einem Quadrupol-Radiofrequenzfeld,
das von einem Elektromagneten (23) umgeben ist, um die
Elektronen vom ringförmigen
Emitter (6) auf einen Weg nahe der Achse zu führen.
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Die 4 zeigt
ein Massenspektrum, das in einer Paulfalle durch die Dissoziation
von doppelt negativ geladenen Ionen des FAP Peptids unter Elektronenabstreifung
(EDD) erzielt wird.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
und bevorzugte Ausführungsformen
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Das
erfindungsgemäße Verfahren,
mit dem effiziente Elektronen-Ionen Reaktionen in der Massenspektrometrie
erzielt werden, beinhaltet folgende Schritte:
- – Bereitstellung
eines multipolaren elektrischen Radiofrequenzfeldes (zumindest Quadrupolfeldes),
das die Speicherung oder Führung
von Ionen zeitweise ermöglicht;
- – Bereitstellung
von mehrfach negativ geladenen Ionen in einem räumlich begrenzen Gebiet innerhalb
des multipolaren elektrischen Radiofrequenzfeldes;
- – Bereitstellung
einer Elektronenwolke innerhalb des räumlich begrenzten Gebietes,
die Elektronen einer Energie kleiner als etwa 20 Elektronenvolt aufweist
und die Elektronen-Ionen-Reaktionen gestattet;
und
- – Bereitstellung
eines Magnetfeldes innerhalb des räumlich begrenzten Gebietes,
das hinreichend stark ist, um die Elektronen senkrecht zum Magnetfeld
einzuschließen.
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Das
räumlich
begrenzte Gebiet liegt typischerweise in einem Massenspektrometer
oder in einem angrenzenden Bereich, beispielsweise in einer Reaktionskammer
oder in einer Ionisationsquelle. Die negativ geladenen Probenionen
werden in dem räumlich
begrenzten Gebiet gespeichert oder durch dieses geleitet, so dass
sie zeitweise in dem räumlich begrenzten
Gebiet mit einem Elektronenstrahl wechselwirken.
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Es
gibt mindestens zwei Arten von Vorrichtungen mit Radiofrequenzfeldern,
die es ermöglichen,
Ionen zu speichern oder zu leiten: Lineare Stabsysteme, an deren
Stäben
Radiofrequenzspannungen anliegen und die die Ionen entlang der Achse des
Stabsystems speichern oder leiten, und rotationssymmetrische Systeme,
an deren Ring- und Endkappenelektroden Radiofrequenzspannungen anliegen
und die die Ionen im Zentrum des rotationssymmetrischen Systems
speichern. Häufig
werden lineare Stabsysteme mit vier Stäben verwendet, die im Inneren
des linearen Stabsystems ein zweidimensionales Quadrupolfeld erzeugen,
und Paulfallen mit einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, die
ein nahezu dreidimensionales Quadrupolfeld erzeugen. Beide Arten
von Vorrichtungen bieten räumliche
und/oder zeitliche Fenster, in denen niederenergetische Elektronen
ins Zentrum des Feldes eingespeist werden können, in dem die Ionen eingeschlossen
sind. In diesen Zusammenhang steht der Begriff „Zentrum” für die zentrale Achse der zweidimensionalen
Multipolfelder und für
das punktförmige
Zentrum der dreidimensionalen Multipolfelder.
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In
linearen Stabsystemen können
die niederenergetischen Elektronen als feiner Elektronenstrahls
genau in die Achse des Stabsystems eingespeist werden. Nur genau
auf der Achse ist die Feldstärke
zu allen Zeiten gleich Null. Das Potential ist wie ein Sattel geformt.
Dieser Potentialsattel schwankt bezüglich der Stärke und
der räumlichen Ausrichtung
mit der Frequenz der Radiofrequenzspannung. Die Elektronen in der
Achse befinden sich in einem Zustand eines ständigen instabilen Gleichgewichts.
In der Praxis lassen sich die Elektronen nicht im Gleichgewicht
halten, ohne der vorliegenden Erfindung entsprechend ein hinreichend
starkes Magnetfeld parallel zur Achse bereitzustellen, das die Elektronen
nahe der Achse einschließt.
Für ein
Reaktion mit den Ionen können
sich die Elektronen entweder entlang der Achse unbegrenzt bewegen
oder sie werden durch Kraftfelder an den Enden des Stabsystems eingeschlossen,
wie zum Beispiel in einer so genannten magnetischen Flasche mit
höheren
Magnetfeldstärken
an den Enden des Stabsystems.
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In
eine Paulfalle können
niederenergetische Elektronen im Nulldurchgang oder kurz vor dem
Nulldurchgang des Feldes durch die Endkappen in das System eingespeist
werden. Kurze Zeit später
befinden sich die Elektronen mit fortschreitender Phase der Radiofrequenz
im Quadrupolfeld in sehr instabilen Zuständen. Allerdings können die
Elektronen hier durch ein axial ausgerichtetes Magnetfeld ausreichender
Feldstärke
im Inneren der Falle gehalten werden. Wenn niederenergetische Elektronen
zu dem genauen Zeitpunkt ins Zentrum der Falle eingespeist werden,
an dem die Spannung an der Ringelektrode in Bezug auf die Endkappenelektroden
das Vorzeichen von Minus nach Plus wechselt, so befinden sich die
Elektronen sofort auf einem runden Potentialhügel und bewegen sich auf einer
instabilen Bahn in Richtung der umgebenden Ringelektrode. Durch
das Magnetfeld werden die Elektronen allerdings im Inneren gehalten,
ohne auf die umgebende Ringelektrode abgezogen zu werden. In Richtung
der beiden Endkappen wird das elektrische Feld zunehmend abstoßend, so
dass die Elektronen zumindest für
eine halbe Periode der Radiofrequenzspannung in der Paulfalle gespeichert
bleiben.
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Es
können
Mittel bereitgestellt werden, um Elektronen innerhalb oder außerhalb
des räumlich begrenzten
Gebietes zu erzeugen, zum Beispiel durch Thermoemission von einer
heißen
Oberfläche, durch
Feldemission, durch Emission von Sekundärelektronen oder durch Photonemission
von einer Oberfläche
oder von Molekülen
der Gasphase. Die Erzeugung kann kontinuierlich oder gepulst erfolgen.
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Ein
geeignetes Kraftfeld kann dabei unterstützen, dass die außerhalb
des räumlich
begrenzten Gebietes erzeugten Elektronen in dieses Gebiet geleitet
werden. Ein solches Kraftfeld kann ein Magnetfeld, ein elektrisches
Feld, ein elektromagnetisches Feld oder eine Kombination aus diesen
Feldern sein.
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Es
können
Mittel bereitgestellt werden, um den Elektronenstrahl zeitweise
zu schalten und mit der Phase der Radiofrequenzspannung zu synchronisieren
und an diese zu koppeln.
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Es
können
Mittel bereitgestellt werden, um die Bewegung der Elektronen und
der Ionen (Vorgänger-
und Fragmentionen) innerhalb des begrenzten Gebietes zu dämpfen, zum
Beispiel mit einem Puffergas. Das Puffergas kann kontinuierlich
oder durch Gaspulse zugeführt
werden.
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Das
Magnetfeld kann sowohl durch einen Permanentmagneten als auch durch
einen Elektromagneten aus supraleitendem Material oder Widerstandsmaterial
erzeugt werden. Das Magnetfeld kann dabei räumlich homogen oder inhomogen
gestaltet sein und auch die Form einer magnetischen Flasche aufweisen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
für die Elektronen-Ionen
Reaktionen führt
in zweckdienlichen Ausführungsformen
dazu, dass negativ geladene Probenionen zerfallen und Fragmentionen
erzeugen. In der Dissoziation durch Elektronenabstreifung (EDD)
wird die folgende Elektronen-Ionen
Reaktion ausgenutzt: [M – nH]n– +
e– → [M – nH](n-1)– +
2e– → Fragmentierung wobei die vielfach
deprotonierte Moleküle
[M – nH]n– (n ≥ 2) am besten
durch Elektrosprühen
gebildet werden. (Die Elternionen benötigen eine Ladungszahl von
zwei oder mehr, damit nach dem Entfernen von einem Elektron zumindest
ein geladenes Fragment erhalten werden kann, wenn die Ladungszahl
der Fragmente wird tun eine negative Ladungseinheit reduziert.)
Der Wechselwirkungsquerschnitt für
die Elektronenabstreifung erreicht nennenswerte Werte bei Elektronenenergien
zwischen 10 und 20 Elektronenvolt. Für eine effektive Reaktion sollte
daher zumindest ein wesentlicher Anteil der Elektronen eine Elektronenenergie
zwischen 10 und 20 Elektronenvolt und bevorzugt zwischen 17 und
20 Elektronenvolt haben.
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In
der Dissoziation durch Elektroneneinfang (ECD) wird die folgende
Elektronen-Ionen Reaktion ausgenutzt: [M
+ nH]n+ + e– → [M + nH](n-1)+ → Fragmentierung wobei die vielfach
deprotonierte Moleküle
[M – nH]n– (n ≥ 2) am besten
durch Elektrosprühen
gebildet werden. (Die Elternionen benötigen eine Ladungszahl von
zwei oder mehr, damit nach dem Entfernen von einem Elektron zumindest
ein geladenes Fragment erhalten werden kann, wenn die Ladungszahl
der Fragmente wird um eine negative Ladungseinheit reduziert.) Der
Wechselwirkungsquerschnitt für
den Elektroneneinfang nimmt mit zunehmender Elektronenenergie stark
ab. Für
eine effektive Reaktion sollte daher zumindest ein wesentlicher
Anteil der Elektronen eine Energie unter einem Elektronenvolt, bevorzugt
unter 0.5 Elektronenvolt und am meisten bevorzugt unter 0.2 Elektronenvolt
aufweisen. Der Wechselwirkungsquerschnitt hat eine quadratische Abhängigkeit
von der Ladungszahl der Ionen, d. h., dass der Einfang bei doppelt
geladenen Ionen viermal effizienter als bei einfach geladenen Ionen
ist. Im Vergleich mit den Elternionen erfolgt der Elektroneneinfang
bei Fragmentionen, die durch Elektroneneinfang aus den Elternionen
entstanden sind und eine geringere Ladungszahl aufweisen, mit einer
viel geringeren Rate.
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In
der Dissoziation durch den Einfang „heißer” Elektronen (HECD) sollte
die Elektronenenergie zwischen 3 und 13 Elektronenvolt und bevorzugt
um elf Elektronenvolt liegen. Diese „heißen” Elektronen werden direkt
eingefangen und erzeugen sofort angeregte elektronische Zustände. Der
Energieüberschuss
der HECD fließt
typischerweise in sekundäre Fragmentierungsreaktionen,
wie etwa der Verlust eines Wasserstoffradikals oder einer größeren Radikalgruppe
nahe der primären
Bruchstelle.
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Ionen,
die für
eine Analyse mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, stammen
aus vielen unterschiedlichen Klassen von chemischer Spezies, die alle
als mehrfach geladene Ionen erzeugt werden können, wie zum Beispiel Polymere,
Kohlenhydrate und Biopolymere. Die Biopolymere umfassen im Besonderen
Proteine und Peptide und deren Modifikationen.
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Im
Gegensatz zum bisherigen Stand der Technik wird in der vorliegenden
Erfindung davon ausgegangen, dass eine Elektronenwolke mit hinreichend
kleiner Energie während
der positiven Phase der Radiofrequenzspannung im Inneren einer Vorrichtung
mit Radiofrequenzfeldern (auch Paulfallen) bereitgestellt werden
kann. Während
dieser positiven Phase der Radiofrequenzspannung werden die Elektronen
durch das elektrische Feld in der einen Richtung und durch das Magnetfeld
in den beiden anderen Richtungen gefangen gehalten. Die Elektronenwolke
bleibt für
eine Zeitdauer der positiven Phase des Radiofrequenzfeldes im Inneren
der Vorrichtung gespeichert. Die Elektronenenergie bleibt dabei
für einen
wesentlichen Teil der Speicherdauer hinreichend klein.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform,
in der eine konventionelle Paulfalle verwendet wird, ist in der 1 dargestellt.
Die zwei Endkappenelektroden (1) und (2) und die
Ringelektrode (3) werden durch einen elektrisch isolierenden
Abstandsring (4) gehalten. Die Ringelektrode (3)
hält einen
Permanentmagneten (5), der die Form einer Unterlegscheibe
hat und in zwei Hälfen
geteilt in eine Nut der Ringelektrode eingeklebt ist. Der scheibenförmige Permanentmagnet
(5) hat wegen des zentralen Lochs ein kompliziertes Magnetfeld,
dessen Feldlinien in der 1 skizziert sind. Das axiale
Magnetfeld im Zentrum der Ionenfalle öffnet sich leicht außerhalb der
Endkappen (1) und (2) und ermöglicht es, dass achsennahe
Elektronen aus einer ringförmigen
und die Achse umschließenden
Emitterkatode (6) in die Ionenfalle eingespeist werden.
Der Weg der Elektronen ist durch den Pfad (7) skizziert.
Die Öffnung
der ringförmigen
Kathode (6) erlaubt es, dass negativ geladene Ionen aus
Richtung (8) kommend durch die ringförmige Kathode (6)
in die Ionenfalle eingespeist werden können. Die negativ geladenen
Ionen werden dort durch die üblichen
Mittel gehalten. Wenn eine Spannung zwischen der Kathode (6)
und der Endkappenelektrode (1) gepulst angelegt wird und die
Elektronen ausschließlich
kurz vor dem Nulldurchgang des Feldes in die Ionenfalle gelangen, kann
die Elektronenwolke genau zum Zeitpunkt des Nulldurchgangs im Zentrum
der Ionenfalle zum Halten gebracht werden. Falls das Potential im
Zentrum positiv ist und ansteigt, wird die Elektronenwolke in diesem
Potential für
die nächste
halbe Periode der Radiofrequenz eingeschlossen und nimmt in dieser Zeit
keine Energie auf. Die niederenergetischen Elektronen können dann
mit gespeicherten Ionen reagieren. Die aus den Reaktionen hervorgegangenen Ionen
können
durch einen herkömmlichen
massenselektiven Auswurf in Richtung (9) zum Ionendetektor analysiert
werden.
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Eine
andere bevorzugte Ausführungsform verwendet
zwei Permanentmagnete (10) und (11), die die Form
von Unterlegscheiben haben und in der 2 skizziert
sind. Die negativ geladenen Ionen können aus Richtung (8)
kommend durch die Magneten in die Ionenfalle eingespeist werden.
Die Elektronen können
hier wie in 1 auch durch eine ringförmige Emitterkathode
erzeugt und achsennah in die Ionenfalle eingespeist werden. In 2 ist
allerdings eine andere Erzeugung der Elektronen dargestellt: Ein
ultravioletter gepulster Nanosekunden Laser (12) erzeugt
einen gepulsten Lichtstrahl, der durch die Linse (13) auf
eine sorgfältig
abgestimmte Stelle auf der leitenden Oberfläche eines Magneten fokussiert
wird. Eine Wolke bestehend aus bis zu einigen tausend Elektronen
wird erzeugt und durch die magnetischen Feldlinien (14)
und ein geringes elektrisches Potential, das am Magneten anliegt,
in die Ionenfalle geleitet. Der Laserpuls ist zeitlich so abgestimmt,
dass die Elektronen beim Eintritt in die Ionenfalle gegen ein geringes
(negatives) Potential anlaufen müssen
und dadurch Energie verlieren. Eine richtige zeitliche Abstimmung
ergibt Elektronen mit verschwindender kinetischer Energie, die auf
dem Potentialhügel
unter den dort gespeicherten Ionen zur Ruhe kommen. Der Potentialhügel wird
mit zunehmender Phase der Radiofrequenz rasch kleiner, verschwindet
nach einigen Nanosekunden und verwandelt sich in eine Potentialmulde,
in der die Elektronen für
eine halbe Periode der Radiofrequenzspannung gespeichert werden
und mit den Ionen in der Ionenwolke reagieren.
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Eine
andere bevorzugte Ausführungsform verwendet
Elektromagneten, zum Beispiel eine Spule um die Ringelektrode oder
zwei Spulen im Außenraum
an den beiden Endkappenelektroden.
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Eine
Verwendung einer elektromagnetischen Spulen (23) ist in
der 3 dargestellt, und zwar für ein Quadrupol-Ionenleitsystem
aus vier Stäben,
von denen nur die zwei gegenüber
liegende Stäbe
(21) und (23) in 3 zu sehen
sind. Die negativ geladenen Ionen werden entlang Richtung (8)
durch die ringförmige
Emitterkathode, die den langsamen Ionen niederenergetische Elektronen
hinzufügt,
in die Achse des Systems geleitet. Die Elektronen können mit
den negativ geladenen Ionen während
der Flugzeit im Inneren des Ionenleitsystems reagieren, bevor die
Ionen in Richtung (9) herausgezogen werden.
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Die
Magnete (Permanent- oder Elektromagnete) können durch Joche unterstützt werden.
Das Magnetfeld kann abgeschirmt werden, damit es nicht bis zum Ionendetektor
reicht. Einige Typen von Ionendetektoren reagieren manchmal ungünstig auf die
Anwesenheit von Magnetfeldern. Elektromagnete und Permanentmagnete
können
kombiniert werden, um das Magnetfeld vorteilhaft zu gestalten. Rechnergestützte Simulationen
haben gezeigt, dass schwache Magnetfelder in der Größenordnung
von 100 Gauss ausreichen um Elektronen im Zentrum eines multipolaren
Radiofrequenzfeldes einzuschließen.
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Elektronen
können
durch heiße
Kathoden erzeugt werden, die Metallemitter oder Spenderkathoden
sein können.
Die Katoden können
ringförmig
geformt sein oder nur aus einem oder zwei Drähten bestehen, die gerade oder
V-förmig
geformt sind. Feldemitter können
ebenfalls verwendet werden, um Elektronen zu liefern. Auch Photoelektronen
können von
geeigneten Oberflächen
freigesetzt werden, wenn diese von Lichtpulsen ausreichender Energie getroffen
werden. Zwischen dem Emitter und den Endkappenelektroden können teilchenoptische
Komponenten angeordnet werden, wie etwa Elektronenlinsen zur Beschleunigung,
zur Führung
und zum Schalten des Elektronenstrahls.
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Obwohl
die Fragmentierung von negativ geladenen Ionen durch Elektronen-Ionen
Reaktionen wie diskutiert an sich nicht neu ist, so versagt der Stand
der Technik bisher bei der Übertragung
des Konzeptes auf andere Massenspektrometer als die Ionen-Zyklotron-Resonanz
Massenspektrometer.
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Die
vorliegende Erfindung erreicht dieses Ziel und nutzt dabei, dass
die kinetische Energieverteilung von kompakten Elektronen- und Ionenwolken im
Wesentlichen erhalten bleibt, wenn sich ein elektrisches Potential
im Bereich der Wolke verändert. Dies
gilt unter der Voraussetzung, dass der räumliche Gradient des elektrischen
Potentials klein ist im Vergleich zur Bewe gung der geladenen Teilchen.
Im Zentrum eines Massenspektrometers, wie etwa einer Paulfalle,
einer Lineare Quadrupolfalle oder einem Multipol-Ionenleitsystem,
verschwindet der Gradient des elektrischen Potentials. Im von den
Ionen in Anspruch genommenen Gebiet nahe dem Zentrum ändert sich
der Gradient periodisch mit der Radiofrequenz. Während einer halben Periode
der Radiofrequenz mit positivem Potential werden die Elektronen, die
sich nahe dem verschwindenden Gradient befinden, in einer Richtung
gespeichert. Die Spannung ändert
sich im Vergleich zur Bewegung der Elektronen sehr langsam, wenn
die Elektronenenergie über etwa
0.1 Elektronenvolt liegt. Tatsächlich übersteigt die
Geschwindigkeit dieser Elektronen 20 Zentimeter pro Mikrosekunde,
was bedeutet, dass eine Radiofrequenzperiode bei einem Megahertz
mindestens zehn gespeicherten Bewegungsperioden in einem ein Zentimeter
langen Gebiet entlang der einen Speicherrichtung entspricht. Die
gespeicherten Elektronen passen sich der Radiofrequenzspannung an, ohne
wesentlich kinetische Energie zu gewinnen. In den senkrechten Richtungen
werden die Elektronen durch das Magnetfeld eingeschlossen und können deshalb
auch in diesen Richtungen keine Energie aufnehmen. Im Wesentlichen
bleibt die mittlere kinetische Elektronenenergie konstant, solange
die Speicherbedingungen erhalten bleiben. Da die Elektronen während der
halben Periode der Radiofrequenz gespeichert werden, kann. der Arbeitszyklus bis
zu 50% ausgelastet sein, was im Vergleich zur Bestrahlung mit einem
konstanten Elektronenstrahl als Stand der Technik viel höher ist.
Des Weiteren übersteigt
die kinetische Elektronenenergie den gewünschten Wert nicht, was die
parasitäre
Ionisation des Hintergrundgases und das Hintergrundrauschen im Massenspektrum
verhindert. Die erfindungsgemäße Kombination
des räumlichen
Einschluss durch ein paralleles magnetisches und elektrisches Feld
ist bisher weder verwendet noch vorgeschlagen worden, um Elektronen
zusammen mit negativ geladenen Ionen in einem Massenspektrometers
mit Radiofrequenzfeldern zu speichern und miteinander reagieren
zu lassen.
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Die
erfindungsgemäße Elektronenwolke kann
sowohl durch einen kontinuierlichen Elektronenstrahl, zum Beispiel
durch einen beheizten Draht oder durch eine Spenderkathode, oder
durch einen gepulsten Elektronenstrahl, zum Beispiel durch die Photoemission
unter ultravioletter Bestrahlung, erzeugt werden. Die Art der Elektronenquelle
hängt von der
Art des verwendeten Massenspektrometers ab. Wenn ein kontinuierlicher
Elektronenstrahl außerhalb der
speichernden Vorrichtung erzeugt wird, werden Hilfsmittel verwendet,
um die Elektronen bei einer günstigen
Phase der Radiofrequenzspannung so in die Vorrichtung einzuspeisen,
dass die Elektronenenergie am Ort der gespeicherten Ionen den gewünschten
Wert aufweist. Zusätzlich können Linsen oder
Gitter oder andere Komponenten die Elektronen zum Zentrum der Vorrichtung
führen.
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Alternativ
können
die Elektronen auch innerhalb der Vorrichtung erzeugt werden. Ultraviolettes Licht
kann von außerhalb
der Vorrichtung auf eine innere Oberfläche gelenkt werden, um dort
während
einer geeigneten Phase der Radiofrequenzspannung Sekundärelektronen
zu erzeugen. Die freigesetzten Sekundärelektronen können mit
Hilfe von elektrischen und magnetischen Feldern zu den negativ geladenen
Ionen geführt
werden. Niederenergetischen Sekundärelektronen können im
Inneren der Vorrichtung auch durch die Ionisation von Gasmolekülen erzeugt
werden, und zwar durch ultraviolettes Licht oder durch gepulste
energiereiche Elektronen.
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Obwohl
wie oben besprochen die gemeinsame Speicherung von Elektronen und
negativ geladenen Ionen im gleichen Gebiet oft nützliche Fragmentierungen von
Ionen durch Elektronen-Ionen
Reaktionen liefert, werden in anderen vorteilhaften Ausführungsformen
zusätzliche
Fragmentierungstechniken angewendet, um die Ionen nach der Reaktion
mit Elektronen weiter zu dissozieren. Diese Ionen zeigen dann typischerweise
Fragmentmuster, die sich von den reinen EDD Fragmentmustern unterscheiden. Diese
Massenspektren ergeben mehr Informationen als mit einer Fragmentierungstechnik
allein. Die zusätzlichen
Fragmentierungstechniken sind zum Beispiel die kollisionsaktivierte
Dissoziation oder die elektromagnetische Bestrahlung, wie etwa mit
einem infraroten Laser oder mit einem ultravioletten Laser oder
mit einem Schwarzkörperstrahler.