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Die
Erfindung betrifft Verfahren und Gerät für die Fragmentierung von großen Molekülen, vorzugsweise
Biomolekülen,
durch Elektroneneinfang in Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallenmassenspektrometern
nach Wolfgang Paul.
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Die
Erfindung besteht darin, den Strahl niederenergetischer Elektronen
durch ein magnetisches Führungsfeld
genau in die Ionenwolke im Zentrum der Ionenfalle zu lenken.
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Ionenfallen
nach Paul bestehen aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden,
wobei in der Regel die Ringelektrode mit der Speicherhochfrequenzspannung
versorgt wird, es sind jedoch auch andere Betriebsarten möglich. Im
Inneren der Ionenfalle können
Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld gespeichert werden. Die
Ionenfallen können
als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten
Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen
werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt
geworden, auf die hier nicht näher
eingegangen werden soll.
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Die
Hochfrequenzspannung an der Ringelektrode ist sehr hoch, sie beträgt bei handelsüblichen
Ionenfallenmassenspektrometern zwischen 15 und 30 Kilovolt (Spitze-Spitze).
Die Frequenz beträgt etwa
ein Megahertz. Im Inneren wird ein hauptsächlich quadrupolares Feld aufgespannt,
das mit der Hochfrequenzspannung schwingt und die Ionen oberhalb
einer Schwellenmasse zum Zentrum treibt, wodurch diese Ionen so
genannte sekulare Oszillationen in diesem Feld ausführen. Die
rücktreibenden Kräfte in der
Ionenfalle werden manchmal durch ein so genanntes Pseudopotential
beschrieben, das über
eine zeitliche Mittelung der Kräfte
des realen Potentials bestimmt wird. Im Zentrum befindet sich ein
Sattelpunkt des oszillierenden realen Potentials, dieses fällt, je
nach Phase der Hochfrequenzspannung, vom Sattelpunkt zur Ringelektrode
hin quadratisch ab und steigt vom Sattelpunkt aus zu den Endkappenelektroden
hin quadratisch an (oder umgekehrt).
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Ionenfallenmassenspektrometer
haben Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen
interessant macht. So können
insbesondere ausgewählte
Ionensorten (sogenannte „Elternionen") in der Ionenfalle
isoliert und fragmentiert werden. Die Spektren dieser Fragmentionen
werden "Fragmentionenspektren" oder auch "Tochterionenspektren" der betreffenden
Elternionen genannt. Es können
auch „Enkelionenspektren" als Fragmentionenspektren
ausgewählter
Tochterionen gemessen werden. Die Ionen werden bislang vorwiegend
durch eine Vielzahl von Stößen mit
einem Stoßgas
fragmentiert, wobei die Oszillationen der zu fragmentierenden Ionen
durch ein Dipolwechselfeld so angeregt werden, dass die Ionen in
den Stößen Energie
aufsammeln können,
was schließlich
zum Zerfall der Ionen führt.
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Die
Ionen können
im Inneren der Ionenfalle erzeugt, aber auch von außen eingeführt werden.
Ein Stoßgas
in der Ionenfalle sorgt dafür,
dass die ursprünglich
vorhandenen Bewegungsschwingungen (Oszillationen) der Ionen im quadrupolaren
Hochfrequenzfeld abgebremst werden; die Ionen versammeln sich dann
als kleine Wolke im Zentrum der Ionenfalle. Der Durchmesser der
Wolke beträgt
in üblichen
Ionenfallen etwa ein Millimeter; er bestimmt sich durch ein Gleichgewicht
zwischen der zentripetalen Pseudokraft des Hochfrequenzfeldes (der
rücktreibenden
Kraft des Pseudopotentials) und den abstoßenden Coulombschen Kräften zwischen
den Ionen. Die inneren Abmessungen der Ionenfallen sind meist durch
einen Abstand von etwa 14 Millimeter der Endkappen voneinander charakterisiert,
der Ringdurchmesser beträgt
etwa 14 bis 20 Millimeter.
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Eine
gängige
Art der Ionisierung großer
Biomoleküle
ist die Elektrosprüh-Methode
(ESI = electro spray ionization), die Ionen bei Atmosphärendruck außerhalb
des Massenspektrometers ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlaßsysteme
bekannter Art in das Vakuum des Massenspektrometers und von dort
in die Ionenfalle eingebracht.
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Diese
Ionisierung erzeugt praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind
im wesentlichen die des Moleküls.
Wohl aber treten bei Elektrosprühen gehäuft vielfach
geladene Ionen der Moleküle
auf. Durch das Fehlen fast jeder Fragmention während des Ionisierungsprozesses
beschränkt
sich die Information aus dem Massenspektrum auf das Molekulargewicht;
es fehlen Informationen über
interne Molekularstrukturen, die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden
Substanz benutzt werden können.
Diese Informationen können
erst über
die Aufnahme von Fragmentionenspektren erhalten werden.
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Aus
der Ionencyclotronresonanz- oder Fourier-Transform-Massenspektrometrie
ist in jüngster Zeit
ein besonders günstiges
Verfahren zur Fragmentierung von Biomolekülen, hauptsächlich von Peptiden und Proteinen
bekannt geworden. Es besteht darin, Elektronen von mehrfach positiv
geladenen Ionen einfangen zu lassen, wobei die dabei freiwerdende
Ionisierungsenergie (genauer: die Protonenanlagerungsenergie) zum
Bruch der in der Regel kettenförmigen
Moleküle
führt.
Das Verfahren wird ECD genannt (electron capture dissociation).
Waren die Moleküle
doppelt geladen, so bleibt eines der beiden entstehenden Fragmente
als Ion zurück.
Die Fragmentierung folgt dabei sehr einfachen Regeln (für Fachleute:
es gibt im Wesentlichen nur C-Brüche und
wenige Z-Brüche
zwischen den Aminosäuren
eines Peptids), so dass aus dem Fragmentierungsmuster sehr einfach
auf den Aufbau des Moleküls
geschlossen werden kann. Insbesondere wird die Sequenz von Peptiden
oder Proteinen in einfacher Weise aus dem Fragmentierungsspektrum
sichtbar. Die Interpretation dieser ECD-Fragmentspektren ist einfacher als die
Interpretation von stoßerzeugten Fragmentspektren.
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Es
ist auch möglich,
dreifach oder mehrfach geladene Ionen in dieser Weise zu fragmentieren, doch
zeigt die Methode ihren Glanz besonders an den zweifach geladenen
Ionen. Wird eine Elektrosprüh-Ionisierung
auf Peptide angewandt, so sind die zweifach geladenen Ionen in der
Regel auch die häufigsten
Ionen. Elektrosprüh-Ionisierung
ist eine Methode der Ionisierung, die für Biomoleküle zum Zwecke der massenspektrometrischen
Untersuchung in Ionenfallen besonders häufig verwendet wird.
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Für eine Fragmentierung
durch Elektroneneinfang muss die kinetische Energie der Elektronen sehr
gering sein, da sonst kein Einfang stattfinden kann. In der Praxis
bietet man Elektronen mit einer Energie an, die nur wenig über der
thermischen Energie der Elektronen liegt. Das geht in den sehr starken
Magnetfeldern der Fourier-Transfom-Massenspektrometer sehr gut,
da die Elektronen einfach längs
der magnetischen Feldlinien driften, bis sie die Wolke der Ionen
erreichen.
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In
elektrischen Hochfrequenz-Ionenfallen nach Paul ist ein solcher
Elektroneneinfang schwierig herzustellen. Ionenfallen besitzen in
der Regel Perforationen in den Endkappen, durch die die Ionen eintreten
und austreten können.
Im Falle interner Ionisierung wird auch die ionisierende Strahlung
durch diese Endkappenperforation eingeführt. In der Regel verwendet
man dazu einen Elektronenstrahl. Das stark schwingende Hochfrequenzfeld
im Inneren der Ionenfalle beschleunigt entweder die Elektronen so, dass
sie durch das Fallenvolumen mit erheblicher Energie hindurchsausen,
oder es werden die Elektronen bereits am Eingangsloch zurückgewiesen.
Für den
Elektroneneinfang sind diese Elektronen wenig geeignet. Nur für eine außerordentlich
kurze Zeit, für nur
Bruchteile von Nanosekunden im Nulldurchgang der Hochspannung, herrscht
kein Feld und niederenergetische Elektronen können niederenergetisch die Ionenwolke
erreichen. Diesen wenigen niederenergetischen Elektronen stehen
jedoch außerordentlich viel
mehr Elektronen gegenüber,
die auf erhebliche Energien beschleunigt sind; die Fragmentierung durch
hochenergetischen Elektronenstoß überlagert die
Fragmentierung durch Elektroneneinfang um ein Vielfaches und macht
so die Fragmentionenspektren unbrauchbar.
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Es
ist nun für
Ionenfallenmassenspektrometer nach Paul in Patentschrift
DE 100 58 706 C1 ein Verfahren
bekannt geworden, bei dem in einer einfachsten Ausführungsform
die Elektronen durch eine zusätzlich
angebrachte Öffnung
in der Ringelektrode in die Ionenfalle eingeschossen werden, wobei
sich die Elektronenquelle auf einem so hohen positiven Potential
befindet, dass es vom oszillierenden Potential des Zentrums der
Ionenfalle nur kurz, nur für
wenige Nanosekunden im Maximum der Hochfrequenzspannung, erreicht
oder überschritten
wird. Nur in diesen wenigen Nanosekunden können die Elektronen die Ionenwolke
erreichen, aber auf sehr geringe Reste ihrer kinetischen Energie
abgebremst, also ideal für
den Elektroneneinfang. Zu allen anderen Zeiten können die Elektronen das Zentrum
der Ionenfalle überhaupt
nicht erreichen, weil das Potential des Zentrums negativer ist als
das Potential der Elektronenquelle und die immer negativ geladenen
Elektronen zurückweist
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Das
Abbremsen der Ionen findet dabei auf dem Weg von der Ringelektrode
zum Zentrum statt, wobei die Elektronen das sattelförmige Potentialgebirge
zwischen den beiden Endkappen erklimmen müssen (siehe 3 und 4).
Die Ionenwolke befindet sich Sattelpunkt. Das Sattelpotential fokussiert dabei
in der Ebene, die aus der Strahlachse des Elektronenstrahls und
und der z-Achse, die durch die beiden Endkappen geht, gebildet wird
(die „Endkappenebene"), die Elektronen
auf die Ionenwolke, seitliche abweichende Elektronen werden wieder
auf den richtigen Pfad in der Sattelrinne zurückgetrieben.
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Leider
findet aber in der anderen Ebene, der Mittelebene des Rings („Ringebene"), keine Fokussierung
des Elektronenstrahls statt, sondern eine Defokussierung, da die
Elektronen hier nicht in einem Sattel das Potential des Zenrtrums
erklimmen, sondern auf dem Außenmantel
eines Rotations-Paraboloids. Nur Elektronen, die sich exakt auf
der Ideallinie einfinden, haben eine Chance, den Berg zu erklimmen,
aber auch sie befinden sich dabei stets im labilen Gleichgewicht,
das bei jeder kleinsten Störung
zu einem sofortigen Verlassen der Ideallinie führt. Diese Defokussierung hat
es bisher verhindert, dass Elektronen bis zur Wolke vordringen konnten.
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Die
Stoßfragmentierung
in der Ionenfalle findet gewöhnlich
bei einer Hochfrequenzspannung statt, die zwischen einem Fünftel und
einem Drittel der für
die Spektrenaufnahme gebrauchten maximalen Spannung beträgt. Diese
relativ hohe Spannung ist notwendig, um zu genügender Energieübertragung
bei den Stößen zu kommen.
Diese Spannung hat aber den Nachteil, dass Fragmentionen geringer Masse
nicht mehr in der Falle gehalten werden können. Es ist damit nicht möglich, die
vollständige
Sequenz eines Peptids aufzuklären,
weil die kleinen Bruchstücke
mit einem, zwei oder drei Aminosäuren verloren
gehen.
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Diesen
Nachteil hat der Elektroneneinfang in der Ionenfalle nicht, wenn
er denn hergestellt werden kann. Diese Art der Fragmentierung kann
auch bei geringeren Hochfrequenzspannungen erfolgen, so dass auch
die Fragmentionen geringer Masse, also solche mit einer, zwei oder
drei Aminosäuren
in der Falle gehalten und nachgewiesen werden können.
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Für eine Fragmentierung
durch Elektroneneinfang wird beispielsweise nach Isolierung von zweifach
geladenen Ionen in der Ionenfalle eine Hochfrequenzspannung von
beispielsweise etwa 3 Kilovolt (Spitze zu Spitze) eingestellt, die
am Ring im Potentialbereich von -1,5 bis +1,5 Kilovolt gegen Masse
sinusförmig
schwingt. Die Endkappenelektroden werden auf Massepotential gehalten.
Das Zentrum der Ionenfalle folgt der Ringspannung mit etwa der halben
Ringelektrodenspannung, wenn der innere Radius der Ringelektroden
das 1,4-fache des Abstandes zwischen den Endkappenelektroden beträgt, also
von etwa -750 bis +750 Volt. Befindet sich nun die Elektronenquelle
auf einem Gleichspannungspotential von +750 Volt, so können die
Elektronen das Zentrum nur dann erreichen, wenn sich die Ringspannung
im Spannungsmaximum bei + 1,5 Kilovolt und das Zentrum demgemäß auf +750
Volt befindet. Die Elektronen werden dabei außerhalb der Ionenfalle vom
Potential der Elektronenquelle (+750 V) auf das Potential der Ringelektrode
beschleunigt (+1,5 kV), erhalten also eine Energie von 750 Elektronenvolt.
Im Inneren der Ionenfalle wird die kinetische Energie von 750 Elektronenvolt
wieder auf praktisch null Elektronenvolt abgebremst, da sich das
Zentrum mit der Ionenwolke auf dem Potential von +750 Volt befindet.
Zu allen anderen Zeiten befindet das Zentrum auf einem negativerem
Potential, die negativen Elektronen werden zurückgewiesen.
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Leider
ließ sich
bisher die Elektroneneinfangfragmentierung in einer Quadrupol-Ionenfalle noch nicht
experimentell herstellen, weil die Elektronen durch Defokussierung
längs des
instabiles Potentialanstiegs in der Ringebene nicht den Sattelpunkt
erreichen konnten.
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, Elektronen in eine Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle gegen die
defokussierende Wirkung in der Ringebene so einzuführen, dass
sie in genügender
Anzahl eine im Zentrum der Ionenfalle gespeicherte Wolke von Ionen
mit sehr niedriger kinetischer Energie erreichen, ohne dass höherenergetische
Elektronen die Ionenwolke erreichen können.
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung für
ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 wird durch durch
die Maßnahme
des kennzeichnenden Teils des Anspruchs 1 dargestellt. Die Erfindung
für ein
Massenspektrometer nach Anspruch 5 wird durch den kennzeichnenden
Teil des Anspruchs 5 beschrieben. Die abhängigen Ansprüche 2 bis
4 und 6 bis 7 beschreiben weitere günstige Ausführungsformen.
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Es
ist die Grundidee der Erfindung, die Elektronen durch den hochfrequenzbeaufschlagten
Ring in den Fallenraum einzuschießen und durch ein magnetisches
Feld so zu führen,
dass keine Defokussierung in der Ringebene stattfinden kann. Dazu
reicht bereits ein sehr schwaches Magnetfeld, zumal die defokussierenden
Kräfte
auf der vorgesehenen, instabilen Idealbahn sehr schwach sind und
erst bei Verlassen dieser Bahn stärker werden.
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Das
magnetische Feld kann ein schwaches Permanentfeld sein, da sich
mittelschwere bis schwere Ionen kaum durch ein solches Feld ablenken
lassen und so das magnetische Feld den Betrieb der Ionenfalle kaum
stört.
Das Permanentfeld lässt sich
durch ein oder mehrere Permanentmagneten mit außen herum schließenden Joch
herstellen.
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Das
magnetische Feld kann aber auch durch einen Elektromagneten mit
Joch hergestellt werden. Das hat den Vorteil, das Magnetfeld ein-
und ausschalten zu können.
Es braucht dann nur während der
Fragmentierung eingeschaltet werden.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Ionenfallenmassenspektrometer für die Durchführung des
Verfahrens, mit mindestens einer Öffnung in der Ringelektrode,
mit einer Elektronenquel le vor der Öffnung in der Ringelektrode
und mit einem führenden
Magnetfeld für
die Elektronen.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 stellt eine Ionenfalle
für die
Elektroneneinfangfragmentierung mit dem zusätzlichen, erfindungsgemäßen Magnetfeld
dar.
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2 zeigt den symbolischen
Potentialverlauf (1, 2, 3, 4)
vom Ort der Elektronenquelle (1) in der Ringebene (r-Richtung)
bis zum Ort der Ionenwolke (4) zur Zeit des Spannungsmaximums
der Hochfrequenzperiode.
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3 zeigt den Potentialsattel über der r-z-Ebene,
den die Elektronen (9) zum Erreichen der Ionenwolke (10)
relativ einfach erklimmen können. Die
Elektronen werden in dieser Ebene durch die Sattelform automatisch
geführt.
Im Punkte (11) werden die Elektronen (9) eingeschossen.
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4 zeigt den Potentialberg über der
Ringebene, den die Elektronen (9) zum Erreichen der Ionenwolke
(10) erklimmen müssen.
Hier werden die Elektronen defokussiert, sie weichen bei der geringsten
Störung
seitlich aus. Sie können
nur durch das erfindungsgemäße Magnetfeld
geführt
werden.
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5 gibt das Zeitdiagramm
für die
Abnahme der doppelt geladenen Ionen (punktiert), die Zunahme der
Neutralteilchen nach doppelter Entladung (strichpunktiert) und den
Verlauf der einfach geladenen Ionen (gestrichelt) wieder.
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Beschreibung
günstiger
Ausführungsformen
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Eine
günstige
Ausführungsform
der Erfindung ist in 1 wiedergegeben
und zeigt das erfindungsgemäße magnetische
Führungsfeld
mit den beiden Magnetpolen (39, 31) für die Elektronen.
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Es
wird eine Elektrosprüh-Ionenquelle
außerhalb
des Massenspektrometers zur Ionisierung von Biomolekülen verwendet.
Es werde hier angenommen, dass eine Mischung von Verdaupeptiden eines
größeren Proteins
untersucht werden soll. Die Ionen werden in üblicher Weise durch eine Kapillare und
anschließende
Druckstufen mit Ionenleitvorrichtungen in die Ionenfalle geführt und
dort eingefangen. Ein erstes Massenspektrum gibt eine Übersicht über die
Verdaupeptide. Sollen jetzt ein oder mehrere Peptide auf ihre Sequenz
aus Aminosäuren
hin untersucht werden, so isoliert man mit üblichen Mitteln die doppelt
geladenen Ionen dieses Peptids; das heißt, man wirft nach gezielter Überfüllung alle
Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht doppelt geladene Ionen dieses
Peptids sind. Die Überfüllung wird
so gewählt,
dass nach der Isolierung die richtige Anzahl von Ionen für Fragmenteirung
und Messung übrigbleiben.
Die doppelte Ladung erkennt man am Abstand der Isotopenlinien voneinander,
die für
doppelt geladene Ionen genau ½ atomare
Masseneinheit beträgt.
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Diese
doppelt geladenen Ionen werden durch eine kurze Wartezeit von einigen
Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas in das Zentrum der Falle
hinein abgebremst. Sie bilden dort eine kleine Wolke (25)
von etwa einem Millimeter Durchmesser.
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Die
Ringelektrode (20) der Ionenfalle ist mit einem Loch (26)
von etwa einem halben Millimeter Durchmesser in einer etwas weiteren
Schachtbohrung (29) versehen. Vor dem Schachtloch (29)
ist ein Elektronenemitter (27) mit Elektroden (28)
für den Elektronenabzug
und die Elektronenstrahlfokussierung angebracht. Dieser Elektronenemitter
(27) befindet sich auf dem Potential, den die Ionenwolke
(25) im Sattelpunkt des Fallenpotentials zum Zeitpunkt seines
positiven Maximums annimmt.
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Zu
beiden Seiten der Ringelektrode (20) befinden sich in der
Ebene des Elektronenemitters (27) die beiden Pole (30, 31)
des Magneten mit Joch (32). Das Magnetfeld ist parallel
zu der gewünschten
Bahn der Elektronen ausgerichtet. Es kann sich dabei um schwache
Permanentmagnete, aber auch um einen Elektromagneten handeln. Im
Falle des Elektromagneten befindet wird das Joch von einer Magnetspule (nicht
gezeichnet) umfasst. Der Elektromagnet hat den Vorteil, dass sich
das Magnetfeld in den übrigen Phasen
des Betriebes der Ionenfalle ausschalten lässt. Das Joch erstreckt sich
vorteilhaft in der Ebene der Ringelektrode (20); es ist
in 1 aus Gründen besserer
Sichtbarkeit um die Endkappe (22) herumgeführt.
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Wird
der Elektronenabzug durch die Elektroden (28) eingeschaltet,
so wird ein feiner Elektronenstrahl gebildet, der durch die elektrische
Fokussierung der Schaltlinse (28), besonders aber durch
das Magnetfeld zwischen den Magnetpolen (30) und (31),
auf die Eingangsöffnung
(29) der Schachtbohrung in der Ringelektrode gerichtet
ist. Dieser Elektronenstrahl wird von der Ringelektrode so lange
zurückgetrieben,
wie das Hochfrequenzpotential der Ringelektrode negativer ist als
das Potential des Elektronenemitters. Wird das Potential der Ringelektrode
im Verlaufe der Hochfrequenzperiode positiver, so werden die Elektronen
zunehmend auf die Ringelektrode (20) zu beschleunigt. Sie
treten dann durch die Schachtbohrung (29) und die winzige Öffnung (26)
in die Ionenfalle ein und sehen hier einen entgegenstehenden, abbremsenden
Potentialverlauf, den sie nicht voll ersteigen können. Sie werden also wieder
reflektiert. Erst im Maximum des Potentials der Hochfrequenzperiode
können
die Elektronen bis zum Sattelpunkt (siehe (10) in 3), in dem sich die Ionenwolke
(25) befindet, vordringen. Bei der Ankunft in der Ionenwolke
(25) sind sie praktisch auf die kinetische Energie null
abgebremst. Sie jetzt praktisch ohne Einfangverluste zunächst vom
Raumladungspotential der Ionenwolke, und in dieser dann von einzelnen
Ionen eingefangen.
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Es
ist günstig,
die Fokussierung der Elektronen durch das Blendenbündel (28)
und die Schachtöffnung
(29) so einzustellen, dass nur in der richtigen Zeitphase
eine Fokussierung des Elektronenstroms auf die kleine Öffnung (26)
stattfindet.
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2 zeigt den symbolischen
Potentialverlauf (1, 2, 3, 4)
vom Ort der Elektronenquelle (1) über der Ringebene (r-Richtung)
bis zum Ort der Ionenwolke (4) zur Zeit des Spannungsmaximums
der Hochfrequenzperiode. Der Potentialverlauf zeigt für negative
Potentiale nach oben, so dass Elektronen schematisch die Potentiale
in der richtig gefühlten Weise „herunterrollen" können.
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Die
Positionen (5) und (6) zeigen symbolisch den Ort
der Ringelektrode an, im Bereich (7) ist die kleine Ionenwolke
auf dem Potentialsattel (4) angesiedelt. Die Elektronen
(9) rollen zunächst
den Potentialabhang (2) zwischen Elektronenquellenpotential (1)
und der Ringelektrode (5) hinab, und werden dann an der
aufsteigenden Potentialpiste (3) zum Potential (4)
der Ionenwolke hin abgebremst. Dieser Potentialverlauf herrscht
nur in den wenigen Nanosekunden des maximalen Potentials der Hochspannungsperiode.
Der Potentialverlauf (8) zeigt einen Verlauf in einer anderen
Phase der Hochfrequenzperiode. Die Richtung zu positiven Potentialen
zeigt nach unten, zu negativen Potentialen nach oben, um das Abrollen
der Elektronen (9) deutlicher zu machen.
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Die
beiden 3 und 4 zeigen den Potentialverlauf,
den der Elektronenstrahl im Inneren der Ionenfalle erlebt, einmal
in der Ringebene (4)
und einmal in der Ebene quer zur Ringebene (3).
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3 zeigt dabei den sehr günstigen
Potentialsattel über
der r-z-Ebene, den die Elektronen (9) längs des Weges (3)
zum Erreichen der Ionenwolke (10) recht einfach erklimmen
können,
da sie in dieser Ebene durch die Sattelform automatisch geführt werden.
Im Punkte (11) werden die Elektronen (9) eingeschossen.
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4 zeigt den Potentialberg,
den die Elektronen (9) längs des Weges (3)
zum Erreichen der Ionenwolke (10) erklimmen müssen, über der
Ringebene. Dieser Weg ist ein Weg dauernder Instabilität für die Elektronen.
Bei der geringsten Störung,
oder bei geringster Abweichung des Einschusses von der Ideallinie
(3) weichen die Elektronen sofort seitlich aus. Hier greift
die vorliegende Erfindung: Nur durch das erfindungsgemäße Magnetfeld
können
die Elektronen sicher zur Ionenwolke (10) geführt werden.
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In
der Ionenwolke werden die niederenergetischen Elektronen durch das
Coulombfeld um die einzelnen Ionen herum durch vielfältige, statistische Ablenkungen
ihrer Flugrichtung eingefangen, wobei sie in der Regel jeweils ein
wenig kinetische Energie verlieren. Aus energetischen Gründen können sie diese
Ionenwolke nicht mehr verlassen. Sie werden schließlich von
einem Ion zur Rekombination einer Ionenladung eingefangen, wenn
Richtung des Elektronenflugs und kinetische Energie genau stimmen.
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Beim
Einfangen der Elektronen durch ein Ion wird die Ladungsstufe des
Ions herabgestuft. Eine Ionisierungsstelle des Ions wird neutralisiert.
Aus dem zweifach geladenen Ion wird ein einfach geladenes Ion. Dabei
wird die Ionisierungsenergie frei. (Genauer: bei den Ionen handelt
es sich ganz überwiegend um
protonierte Biomoleküle.
Es wird also die Anla gerungsenergie des Protons, die so genannte
Protonenaffinitätsenergie,
frei). Die freiwerdende Energie wird im Ion absorbiert und führt zu einem
sehr genau definierten Bruch zwischen zwei Aminosäuren, in
der Regel zu einem so genannten C-Bruch. Andere Ionen der gleichen
Art erleben einen Bruch zwischen jeweils zwei anderen Aminosäuren. Statistisch
gesehen entsteht ein Gemisch aus Fragmentionen, die in ihrer Länge die
ganze Kette der Aminosäuren
widerspiegeln, oder zumindest einen Teil dieser Kette.
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Der
Elektronenstrahl wird abgestellt, sobald eine genügende Fragmentierung
eingetreten ist. In 5 ist
dargestellt, wie die doppelt geladenen Ionen zeitlich abnehmen und
die einfach geladenen Ionen (Fragmentionen) zunehmen. Man darf dabei
diesen Vorgang nicht zu lange fortsetzen, da sonst die einfach geladenen
Fragmentionen zu Neutralpartikeln rekombinieren. Die einfach geladenen
Fragmentionen werden nach Abschalten des Elektronenstrahls und nach
einer kurzen Beruhigungspause in üblicher Weise als Massenspektrum
aufgenommen. Die Interpretation dieses Massenspektrums ergibt die
Sequenz oder zumindest eine Teilsequenz der Aminosäuren in
diesem Peptid.
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Dieses
Verfahren kann dann für
andere Peptide aus dem Gemisch wiederholt werden. Es ergibt sich
so eine sehr sichere Identifizierung des Eiweißes. Es können sogar Unterschiede des
untersuchten Eiweißes
zu solchen aus Proteinsequenzdatenbanken festgestellt werden.
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Die
durch die Erfindung ermöglichte
Fragmentierung durch Elektroneneinfang hat eine Reihe von Vorteilen,
die nicht auf den ersten Blick ersichtlich sind:
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Vorteil
a: Da die Speicherung der Ausgangsionen und ihre Fragmentierung
nunmehr bei sehr kleinem q im Mathieu-Diagramm möglich ist, ist die Sekularbewegung
der Ionen sehr langsam. Das ist wiederum günstig für den Elektroneneinfang.
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Vorteil
b: Durch die Fragmenteirung bei kleinem q (niedriger Hochfrequenzspannung)
können alle
Tochterionen bis zu kleinen Massen herunter gespeichert werden,
weil die Schwellenmasse jetzt sehr niedrig liegt. Das war bisher
nicht möglich,
da für Stoßfragmentierung
mit einem q von etwa 0,3 gearbeitet werden musste, weil sonst die
Stoßenergie
zu klein wurde und eine Fragmentierung oft nicht möglich war.
Erst durch sehr kleine q-Werte kann das ganze Aminosäuren-Fragmentspektrum
der C-Brüche
ab einer einzigen Aminosäure
aufgenommen werden. Beispiel: Ein großes, doppelt geladenes Peptid
mit 20 Aminosäuren
hat ein Molekulargewicht von etwa 2400 atomaren Masseneinheiten
und eine spezifische Masse von m/z = 1200 Masseneinheiten pro Elementarladung.
Normalerweise können
Tochterionen durch Stoßfragmentation
nur etwa ab Schwellenmasse von 400 Masseneinheiten pro Elementarladung
(entspricht etwa drei bis vier Aminosäuren) gespeichert werden, jetzt
ist aber mit ECD durch Wahl eines sehr kleinen q eine Speicherung
ab 80 Masseneinheiten pro Elementarladung möglich, so dass auch die kleinste,
endständige,
einfach geladene Aminosäure
noch erfasst werden kann.
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Vorteil
c: Die Erzeugung der einfach geladenen Ionen aus doppelt geladenen
und der zugehörige Verlust
von einfach geladenen Ionen verhält
sich gutmütig,
wie aus 5 zu ersehen
ist (falls die Wirkungsquerschnitte für den Elektroneneinfang sich wirklich
wie 4 1 verhalten, was noch unsicher ist). Beträgt die Ausbeute der einfach
geladenen Ionen etwa 50 % der ursprünglichen Anzahl an doppelt
geladenen Ionen, so sind die doppelt geladenen Ionen auf etwa 2 – 3 % gesunken;
stören
also nicht mehr. Etwa 47 % der einfach geladenen Ionen sind durch
Löschung
verloren gegangen; das ist gut erträglich.
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Vorteil
d: Die Fragmentierung ist sehr schnell, sie dauert nur wenige Millisekunden.
Es werden dabei etwa 40 – 50
Millisekunden Fragmentierungs- und Dämpfungszeit eingespart. Dadurch
können
mehr Tochterionenspektren pro Zeiteinheit aufgenommen werden, effektiv
wird dadurch die Empfindlichkeit erhöht.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
erfordert natürlich
zuerst eine Einjustierung der günstigsten Potentiale
des Ionenemitters für
jede Einstellung der Hochfrequenzspannung. Es wird hierfür experimentell
eine Kalibrierkurve erstellt. Auch für die Elektronenstromstärke und
für die
Zeitdauer der Einwirkung des Elektronenstrahls werden die optimalen
Daten experimentell ermittelt.
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Das
der Eintrittsöffnung
für die
Elektronen gegenüberliegende
Loch in 1 hat den Sinn, während der
Potentialeinstellung des Elektronenemitters über den Potentialsattel hinausschießende Elektronen
aus der Ionenfalle hinauszuführen,
um keine Einbrennstellen zu bekommen.
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Natürlich werden
in der Ionenfalle während des
Eindringens der Elektronen durch Elektronenstoß auch Ionen des Stoßgases erzeugt.
Meist wird Helium als Stoßgas
benutzt, es können
aber auch andere, leichte Gase verwendet werden. Die Masse der Ionen
dieser Gase liegen regelmäßig unterhalb der
Speicherschwelle der Ionenfalle, die Ionen verlassen die Ionenfalle
innerhalb sehr weniger Hochfrequenzperioden, meist innerhalb einer
einzigen Periode.
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Das
Verfahren benötigt
ein Ionenfallenmassenspektrometer mit mindestens einer Öffnung in
der Ringelektrode, mit einem Elektronenemitter, dessen Elektronenemissionsstrom
nach Dauer und Stärke einstellbar
ist, mit einem Magnetsystem für
die Elektronenführung
und und mit einer einstellbaren Spannungsversorgung für das Emitterpotential.
Als Emitter kann eine einfache Glühkathode, vorzugsweise eine
so genannte Haarnadelkathode, dienen. Stromstärke und Strahldauer kann über ein
Potential an einer Blende oder einem einfachen Wehnelt-Zylinder eingestellt
werden. Der einzustellende Elektronenstrom ist, wie unten gezeigt
wird, sehr klein. Da die Hochfrequenzspannung für eine handelsübliche Ionenfalle
im Bereich von 10 bis 30 Kilovolt liegt, sollte das Emitterpotential
etwa im Bereich von 100 bis 1000 Volt einstellbar sein.
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In
der Ionenwolke dürfen
sich schlussendlich für
ein gutes Spektrum nur etwa 104 Ionen befinden, da
es sonst zu einer Verschlechterung des Massenauflösungsvermögens durch
die Einwirkung der Raumladung kommt. Geht man von etwa 2·104 doppelt geladener Ionen aus, so werden
für die
Elektroneneinfangfragmentierung in der Wolke nur etwa 3·104 Elektronen benötigt. Die Bedingungen für den Zugang
niederenergetischer Elektronen zur Ionenwolke herrschen nur für die kurze
Zeit des Maximums der Hochfrequenzspannung. Die Zeit beträgt nur etwa
1 % der Schwingungsperiode, also etwa zehn Nanosekunden. Es wird
also nur etwa ein Prozent der Elektronen des Elektronenstrahles
eingefangen. Daraus resultiert, dass etwa 3·106 Elektronen
in den Ionenfallenraum eintreten müssen. Rechnet man von der Glühkathode
bis zum Eintritt in den Ionenfallenraum mit einem Verlust von 99
Prozent der Ionen, so müssen
etwa 3·108 Elektronen von der Glühkathode geliefert werden.
Möchte
man den Vorgang in einer Millisekunde abschließen, so benötigt man einen Elektronenstrom
von etwa 3·1011 Elektronen pro Sekunde. Das ist ein Elektronenstrom
von etwa 30 Nanoampère,
also extrem wenig, da sich selbst mit einer sehr einfachen Elektronenquelle
leiht Elektronenströme
von etwa 100 Mikroampère
erreichen lassen. Selbst bei Elektronenverlusten, die um eine Faktor 100
höher liegen,
ließe
sich der benötigte
Elektronenstrom leicht herstellen.
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Bei
der Fragmentierung durch Elektroneneinfang an doppelt geladenen
Ionen lässt
es sich nicht vermeiden, dass auch eine Anzahl von bereits gebildeten,
einfach geladenen Fragmentionen durch einen weiteren Elektroneneinfang
vernichtet werden. In 5 sind
geschätzte
Kurven für
die Rekombination (mit Fragmentierung) wiedergegen. Die Berechnung
der Kurven in 5 erfolgte
unter der Voraussetzung, dass der Wirkungsquerschnitt für die Rekombination
doppelt geladener Ionen um eine Faktor vier größer ist als der Wirkungsquerschnitt
für die
Rekombination von einfach geladenen Ionen. Es lässt sich damit ein guter Kompromiss
finden zwischen restlichen doppelt geladenen Elternionen, einfach geladenen
Fragmentionen und durch vollständige Entladung
vernichteten Ionen. Es ist aber notwendig, mit einer höheren Anzahl
von Ionen zu beginnen, als für
das schlussendlich aufgenommene Fragmentionenspektrum gebraucht
werden. Diese Betrachtung muss bei der Einspeicherung der Ionen
und bei ihrer Isolierung berücksichtigt
werden.
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Der
Elektroneneinschuss kann auch durch die Endkappenelektroden erfolgen.
Dann muss aber die Ringelektrode geerdet sein; die Speicherhochfrequenzspannung
muss dann gleichphasig an den beiden Endkappen anliegen. Das Potential
des Fallenzentrums folgt dann dem Endkappenpotential in etwa mit
einem Abschwächungsfaktor
von 3/5. Auch hier ist die Anwendung eines äußeren Magnetffeldes zur Führung der
Elektronen notwendig.
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Es
lassen sich durch den Fachmann auch noch kompliziertere Potentialversorgungen
ausdenken, die den gleichen Effekt haben, die Ionenwolke im Zentrum
nur mit nullenergetischen Elektronen zu versorgen, beispielsweise
dadurch, dass das Potential des Elektronenemitters auch auf einer
Hochfrequenzspannung liegt. Alle diese Lösungen sind jedoch auf wendiger
als die oben vorgeschlagene Lösung
des Problems, obwohl diese komplizierteren Lösungen vom Erfindungsgedanken
mit umfasst sein sollen.