DE102006050021B4

DE102006050021B4 - Top-Down-Proteinanalyse in Massenspektrometern mit Ionenfallen II

Info

Publication number: DE102006050021B4
Application number: DE102006050021A
Authority: DE
Inventors: Ralf Hartmer; Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2009-11-26
Anticipated expiration: 2026-10-25
Also published as: DE102006050021A1

Abstract

Verfahren zur Erzeugung gut auswertbarer Fragmentionenspektren aus vielfach positiv geladenen Proteinionen in einem Massenspektrometer mit einer Ionenfalle, dadurch gekennzeichnet, dass in der Ionenfalle vor einer Fragmentierung der Proteinionen eine teilweise Deprotonierung der Proteinionen so weit durchgeführt wird, dass eine Mischung aus einfach bis n-fach positiv geladenen Fragmentionen entsteht, mit 3 ≤ n ≤ 8, und dass das Massenspektrum der Mischung aus Fragmentionen aufgenommen wird.

Description

Die Erfindung betrifft die Strukturanalyse von Proteinen im Molekülmassenbereich von etwa 5·10³ bis 100·10³ u, ohne vorherigen enzymatischen Verdau zu kleinen Peptiden, in Massenspektrometern, die mit Ionenfallen arbeiten, wobei eine möglichst hohe Sequenzabdeckung erreicht werden soll.
Da die Ionisierung größerer Proteine durch Elektrosprühen oder ähnliche Verfahren stets hoch geladene Analytionen erzeugt, verbindet die Erfindung eine Fragmentierung der Analytionen in der Ionenfalle mit einer teilweisen Deprotonierung, die vor der Fragmentierung angewendet wird. Dabei wird eine Erzeugung eines möglichst gleichmäßig verteilten Gemisches solcher Fragmentionen angestrebt, die einfach bis n-fach geladen sind, wobei n eine Zahl von drei bis etwa acht ist. Aus diesem Gemisch an Fragmentionen lässt sich ein Massenspektrum aufnehmen, das eine Sequenzabdeckung zeigt, die weit über den Massenbereich des Massenanalysators für einfach geladene Ionen hinausgeht. Es können dabei ergodische Fragmentierungen wie auch elektroneninduzierte Fragmentierungen vorgenommen werden.
Stand der Technik
Proteine wie auch Peptide bestehen aus Ketten von Aminosäuren, wobei der Unterschied zwischen Peptiden und Proteinen nur in der Länge der Ketten besteht, ohne dass es jedoch eine scharf abgrenzende Definition gäbe. Proteine bestehen aus weit mehr als 20 aneinander geketteten Aminosäuren, Peptide im Allgemeinen aus weniger. Wenn hier von Proteinen die Rede ist, so sind Ketten mit etwa 40 und mehr Aminosäuren gemeint, mit Molekülmassen größer als etwa 5·10³ u. Die meisten Proteine haben Molekülmassen unterhalb von 10⁵ u; diese „mittelgroßen Proteine” von 5·10³ bis 100·10³ u stehen hier im Mittelpunkt des Interesses, obwohl einige interessante Proteine, wie beispielsweise Antikörper, auch Molekülmassen zwischen 10⁵ und 10⁶ u haben. Es gibt sogar einige Proteine mit mehr als 10⁶ u. Die sehr großen Proteine sind bisher einer massenspektrometrischen Top-Down-Analyse ohne enzymatischen Verdau kaum zugänglich. Es gibt aber Enzyme, deren Spaltungen nur an selten vorkommenden Sequenzmustern angreifen und große Verdauproteine jenseits einer Molekülmasse von 5·10³ u erzeugen. Diese großen Verdauproteine sollen hier ebenfalls als „mittelgroßen Proteine” betrachtet werden. Solche Enzyme erlauben auch stückweise Top-Down-Analysen sehr großer Proteine.
Die massenspektrometrische Strukturanalyse von schwereren Proteinen, die im Wesentlichen eine Analyse der Sequenz von Aminosäuren, aber auch die Bestimmung von deren Modifikationen umfasst, beginnt in klassischer Technik mit einem enzymatischen Verdau der Proteine zu relativ leichten Verdaupeptiden, um zu massenspektrometrisch gut messbaren Molekülgrößen zu gelangen. Der meist angewendete tryptische Verdau beispielsweise liefert Verdaupeptide mit durchschnittlich zehn Aminosäuren Länge, da Trypsin ausschließlich die C-termina len Peptidbindungen der Aminosäuren von Arginin und Lysin spaltet. Andere Enzyme, die die Peptidbindung nur spezifisch an einer Aminosäure spalten, liefern Verdaupeptide von durchschnittlich zwanzig Aminosäuren Länge. Die Verdaupeptide werden nun als ungetrenntes Gemisch oder chromatographisch getrennt einem Tandem-Massenspektrometer zugeführt. Die Messung der Fragmentionenspektren der einzelnen Verdaupeptide liefert nun Teilstücke der Sequenz. Diese sind meist ausreichend, um über Proteinsequenzdatenbanken mit geeigneten Suchmaschinen eine Identifizierung vornehmen zu können und auch einen Teil der Modifikationen zu bestimmen.
Leider hat dieses Verfahren auch Nachteile. So können meist überhaupt nur 50 bis 70 Prozent der Verdaupeptide im Massenspektrometer wiedergefunden und gemessen werden. Über die Modifikationen der verlorenen Verdaupeptide kann nichts ausgesagt werden. Die Molekülmasse des unverdauten Proteins kann nicht bestimmt werden. Die Information über die Reihenfolge der Verdaupeptide im ursprünglichen Protein ist verloren. Lagen dem Verdau zwei oder mehr Proteine zugrunde, die nicht getrennt werden konnten, so kann keine Zuordnung der Verdaupeptide zu den Proteinen vorgenommen werden. – Es wird daher seit einiger Zeit nach Verfahren gesucht, die das Protein als ganzes ohne vorherigen enzymatischen Verdau massenspektrometrisch zu analysieren und aus den originären Proteinmolekülen möglichst lange Teilstücke der Sequenz zu bestimmen gestatten. Solche Verfahren wurden bisher nur für sehr teure Ionenzyklotron-Resonanz-Massenspektrometer (ICR-MS) entwickelt. Sie sind als „Top-Down-Analysen” bekannt geworden. Die Top-Down-Analysen verlagern die Auftrennung der Proteine in kleine Einheiten ins Massenspektrometer; sie setzen die Existenz geeigneter Ionisierungs- und Fragmentierungsverfahren für die mittelgroßen Proteine voraus, und, wie unten gezeigt werden wird, weitere Maßnahmen zur Entzerrung der entstehenden, sehr komplexen Fragmentionenspektren.
Für die Ionisierung von Proteinen und anderen Biomolekülen werden heute ganz vorwiegend entweder die matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI) oder das Elektrosprühen (ESI) eingesetzt. Dabei liefert MALDI praktisch nur einfach geladene Ionen, die für eine Fragmentierung sehr ungünstig sind, weil sie schwierig zu fragmentieren sind und ihre Fragmentionen nur kleine Stücke der Aminosäure-Sequenz mit großen Lücken liefert. Der komplizierte Prozess namens MALDI liefert allerdings in sich sowohl eine nicht-ergodische Spontanfragmentierung im Laserplasma (ISD = „in-source decay”) wie auch eine ergodische Fragmentierung durch metastabilen Zerfall angeregter Analytionen (LID = „laser induced decomposition”, auch PSD = „post source decay” genannt), die aber beide nur in hoch spezialisierten MALDI-Flugzeitmassenspektrometern zur Messung kommen können und hier nicht weiter verfolgt werden sollen.
Sollen für eine massenspektrometrische Analyse von Biomolekülen, insbesondere für eine Analyse unter Einschluss einer Fragmentierung, mehrfach geladene Analytionen erzeugt werden, so ist die gängige Art der Erzeugung von Molekülionen die Elektrosprüh-Ionisierung (ESI = „electro spray ionization”), die Ionen bei Atmosphärendruck außerhalb des Massenspektrometers ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlasssysteme bekannter Art in das Vakuumsystem des Massenspektrometers und weiter in eine Ionenfalle geleitet. Dort sind die Molekülionen weiteren Manipulationen zugänglich, beispielsweise einer Fragmentierung.
Die Ionisierung durch Elektrosprühen erzeugt praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind im wesentlichen die des protonierten Moleküls; wegen ihrer mehrfachen Protonierung sind sie um entsprechend viele u schwerer als die Neutralmoleküle und werden daher häufig als „Pseudomolekülionen” bezeichnet. Beim Elektrosprühen treten in der Regel durch mehrfache Protonierung mehrfach geladene Ionen der Moleküle auf: doppelt und dreifach geladene Ionen für kleinere Moleküle wie etwa Peptide, bis zu zehn- oder sogar hundertfach geladene Ionen und mehr für mittelgroße Proteine im Bereich der Molekülmassen von 5·10³ bis 100·10³ u. Wenn möglich, geht man für die Fragmentierung von doppelt bis vierfach geladenen Proteinionen aus, da diese eine sehr hohe Ausbeute an Fragmentionen haben und sehr einfach auszuwertende Fragmentionenspektren liefern. Bei mittelgroßen Proteinen haben die doppelt bis vierfach geladenen Molekülionen aber nur verschwindend kleine Intensitäten, sie können daher für eine Fragmentierung nicht herangezogen werden.
Die Spektren der Fragmentionen werden auch ”Tochterionenspektren” der betreffenden ausgewählten Elternionen genannt. Es können auch „Enkelionenspektren” als Fragmentionenspektren ausgewählter Tochterionen gemessen werden. Aus diesen Tochterionenspektren (und Enkelionenspektren) lassen sich Strukturen der fragmentierten Ionen ablesen; so ist es beispielsweise möglich (wenn auch für manche Fragmentierungsverfahren schwierig), aus diesen Spektren zumindest Teile der Sequenz der Aminosäuren eines Peptids oder Proteins zu bestimmen.
Es gibt heute zwei verschiedene Arten von Ionenfallen, die häufig als „Penning-Ionenfallen” und „Paul-Ionenfallen” bezeichnet werden. Die Penning-Ionenfallen halten die Ionen radial in einem starken Magnetfeld und in Achsenrichtung in einem elektrischen Trapping-Potential. Sie werden in Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (ICR-MS) eingesetzt. Heutige ICR-MS verwenden überwiegend sehr teuere supraleitende Magnetspulen, gekühlt in flüssigem Helium, zur Erzeugung sehr hoher Magnetfelder von etwa 7 bis 15 Tesla Magnetfeldstärke. Ihre Verbreitung beschränkt sich auf weniger als tausend Instrumente. Sie sind heute überwiegend zusätzlich mit Hochfrequenz-Ionenfallen ausgestattet, um die Ionen in ihnen stoßfragmentieren oder sonst manipulieren zu können.
Die Paul-Ionenfallen verwenden inhomogene Hochfrequenzfelder zum Halten der Ionen. Dadurch entstehen so genannte Pseudopotentiale, die einen Speichertopf bilden, in dem positive wie auch negative Ionen eingesperrt werden können. In dreidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfallen steigt das Pseudopotential in allen drei Raumrichtungen an, in zweidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfallen nur in zwei Raumrichtungen, in der dritten Raumrichtung müssen die Ionen durch andere Mittel, in der Regel durch Gleichspannungspotentiale, festgehalten werden. In den Potentialtöpfen der Hochfrequenz-Ionenfallen können die Ionen so genannte sekulare Schwingungen ausführen, wobei die Schwingungsfrequenz streng umgekehrt proportional zu ihrer ladungsbezogenen Masse m/z ist. Durch Beladen mit Stoßgas werden die sekularen Schwingungen gedampft, die Ionen finden sich dann als Wolke im Minimum des Potentialtopfes ein. Die Hochfrequenz-Ionenfallen sind für ihre Leistungen sehr preiswert, sie sind daher in Stückzahlen von vielen Tausend Instrumenten außerordentlich weit verbreitet. Wie unten näher erläutert werden wird, können Paul-Ionenfallen als so genannte 2D-Ionenfallen oder 3D-Ionenfallen konstruiert sein.
Massenspektrometer mit Hochfrequenz-Ionenfallen haben Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen interessant machen. So können insbesondere ausgewählte Ionensorten (die Elternionen) in der Ionenfalle isoliert und dann mit verschiedenartigen Verfahren fragmentiert werden. Unter der Isolierung einer Ionensorten versteht man, dass alle nicht interessierenden Ionensorten durch starke resonante Anregungen ihrer sekularen Schwingungen oder andere Maßnahmen aus der Ionenfalle entfernt werden, so dass nur die Elternionen übrig bleiben. Diese können dann fragmentiert werden und liefern Fragmentionenspektren, die nicht mit Fragmentionen anderer Substanzen verunreinigt sind.
Hochfrequenz-Ionenfallen haben eine Besonderheit, die sich manchmal nachteilig auswirkt. Sie besitzen eine „untere Massenschwelle” für die Speicherung der Ionen. Ionen mit einer niedrigeren ladungsbezogenen Masse m/z als diese Massenschwelle können nicht in der Ionenfalle gespeichert werden. Diese leichten Ionen können bereits in einer einzigen Halbwelle der Hochfrequenzspannung so beschleunigt werden, dass sie an die Elektroden stoßen und damit vernichtet werden. Die untere Massenschwelle erhöht sich proportional, wenn die Hochfrequenzspannung erhöht wird.
In Ionenfallen der verschiedenen Arten stehen heute zwei grundsätzlich verschiedene Arten der Fragmentierung zur Verfügung: die „ergodische” Fragmentierung und die „elektroneninduzierte” Fragmentierung.
Unter einer „ergodischen” Fragmentierung von Analytionen wird hier eine Fragmentierung verstanden, bei der ein genügend großer Überschuss an innerer Energie in den Analytionen zu einer Fragmentierung führt. Der Überschuss an Energie kann beispielsweise durch eine Vielzahl von Stößen der Analytionen mit einem Stoßgas, aber auch durch Absorption vieler Photonen einer Infrarot-Strahlung erzeugt werden.
Nach dem ursprünglich von Boltzmann als Hypothese formulierten Ergodensatz wird in einem abgeschlossenem System, beispielsweise in einem komplexen molekularen Analytion, bei Vorhandensein einer bestimmten Energie jeder Zustand, der mit dieser Energie verwirklicht werden kann, im Laufe der Zeit tatsächlich verwirklicht werden. Dieser Ergodensatz ist inzwischen mathematisch bewiesen, also keine Hypothese mehr. Da die Fragmentierung einen möglichen Zustand erzeugt, nämlich die Entstehung zweier Teilchen aus dem Analytion, wird die Fragmentierung auch irgendwann eintreten. Durch die Energieaufnahme entstehen zwischenzeitlich „metastabil” genannte Analytionen, die dann irgendwann zerfallen. Der Zerfall wird an sich durch eine „Halbwertszeit” charakterisiert, die aber vom Betrag der Überschussenergie abhängt und heute noch nicht eindeutig bestimmbar ist.
Die Wahrscheinlichkeit der ergodischen Spaltung einer bestimmten Bindung hängt von ihrer Bindungsenergie ab. Mit hoher Wahrscheinlichkeit werden nur die schwächsten Bindungen des Analytions gespalten. In Proteinen sind die schwächsten Bindungen die so genannten peptidischen Bindungen zwischen den Aminosäuren, die zu Fragmenten der b- und der y-Reihe führen, die teils geladen als Fragmentionen, teils als Neutralteilchen entstehen. Da die peptidischen Bindungen zwischen verschiedenen Aminosäuren etwas unterschiedliche Bindungsenergien aufweisen, werden einige peptidische Bindungen des Analytions mit höherer Wahrscheinlichkeit, andere mit geringerer Wahrscheinlichkeit gespalten. Das führt dazu, dass im Fragmentionenspektrum nicht alle Fragmentionen aus Peptidbindungen gleiche Intensität haben. Nicht-peptidische Bindungen werden so selten gespalten, dass ihre Bruchstücke nicht in messbaren Mengen vorkommen.
Die klassische Art der Fragmentierung der Analytionen in Hochfrequenz-Ionenfallen ist die ergodische Fragmentierung durch Stöße, wobei also der Überschuss an innerer Energie der Analytionen durch Stöße mit einem Stoßgas in der Ionenfalle eingesammelt wird. Damit die Stöße überhaupt Energie in das Analytion pumpen können, müssen sie mit einer minimalen Stoßenergie erfolgen. Die Stoßenergie wird in klassischer Weise durch eine schwache resonante Anregung der sekularen Ionenoszillationen der Elternionen mit einer dipolaren Wechselspannung erzeugt. Diese führt zu vielen Stößen mit dem Stoßgas, ohne die Ionen aus der Ionenfalle zu entfernen. Die Ionen können in den Stößen Energie aufsammeln, die schließlich zum ergodischen Zerfall der Ionen und zur Entstehung der Bruchstück-Ionen führt. Bis vor wenigen Jahren war diese Stoßfragmentierung (CID = „collision induced dissociation”) die einzig bekannte Art der Fragmentierung in Ionenfallen.
Die Stoßfragmentierung in Hochfrequenz-Ionenfallen hat aber auch Nachteile. So ist es notwendig, bei größeren Analytionen für die Herstellung genügend harter Stoßbedingungen die Hochfrequenzspannung zum Speichern der Ionen sehr hoch zu wählen. Dadurch ergibt sich eine sehr hoch liegende untere Massenschwelle für die Ionenfalle. Ionen unterhalb der Massenschwelle können nicht mehr gespeichert werden; sie gehen verloren. Es beginnt daher das Fragmentionenspektrum erst bei einer Masse, die etwa bei einem Drittel der Masse m/z des Analytions liegt; über die leichten Fragmentionen kann das Fragmentionenspektrum keine Auskunft mehr geben, da diese Ionen verloren sind. Vielfach geladene schwere Analytionen haben wegen der hohen Anzahl an Protonen regelmäßig eine geringe ladungsbezogene Masse m/z bei nur ungefähr 500 bis 1000 u diese lassen sich überhaupt nicht fragmentieren, da die Hochfrequenzspannung nicht hoch genug eingestellt werden kann, um genügend energetische Stöße zu erzeugen.
Für die Speicherung auch sehr kleiner Fragmentionen (besonders der so genannten Immonium-Ionen, die durch innere Fragmentierung von Fragmentionen entstehen) durch Stoßfragmentierung sind jüngst besondere Verfahren bekannt geworden, die vom langsamen, metastabilen Zerfall der Ionen durch den ergodischen Fragmentierungsprozess Gebrauch machen. Die Patentanmeldungsschriften sind aber noch nicht veröffentlicht.
Die Durchführung von Stoßfragmentierungen ist in Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (ICR-MS) sehr unhandlich, weil diese Spektrometer nur bei bestem Ultrahochvakuum unter 10^–9 Hektopascal gut arbeiten. Trotzdem gibt es für die Ionenfallen dieser Geräte auch Einrichtungen zur Stoßfragmentierung. Es ist aber hier sehr früh die andere Art von ergodischer Fragmentierung eingeführt worden: die Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation (IRMPD). Es wird hier die innere Energie der Analytionen durch die Absorption einer größeren Anzahl von Infrarot-Photonen erhöht. Es werden dazu in der Regel Kohlendioxid-Laser zur Erzeugung genügend starker Infrarot-Strahlung eingesetzt. IRMPD-Einrichtungen für ICR-MS werden kommerziell hergestellt und vertrieben.
Durch die Schrift WO 02/101 787 A1 (S. A. Hofstadler and J. J. Drader) ist bekannt geworden, dass man die Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation (IRMPD) auch in Hochfrequenz-Ionenfallen anwenden kann. Die Infrarot-Strahlung wird dabei einer dreidimensionalen Hochfrequenz-Ionenfalle in einfacher Weise durch eine evakuierte, innen verspiegelte Hohlfiber zugeführt. Damit steht in Hochfrequenz-Ionenfallen ein weiteres Verfahren zur ergodischen Fragmentierung zur Verfügung. Diese Art der Fragmentierung ist sehr vorteilhaft, da sie bei kleinen Hochfrequenzspannungen durchgeführt werden kann; es werden dann auch die kleinen Fragmentionen gespeichert. Es gibt aber noch keine kommerziell vertriebenen Ionenfallen-Massenspektrometer mit dieser Fragmentierungs-Variante.
Nun zu den elektroneninduzierten Fragmentierungsverfahren: Vor etwa zehn Jahren wurde eine völlig neue Art der Fragmentierung von Proteinionen entdeckt: eine nicht-ergodische Fragmentierung, die durch den Einfang nieder-energetischer Elektronen induziert wurde (ECD = „electron capture dissociation”). Durch die direkte Neutralisierung eines assoziierten Protons, das dann als radikales Wasserstoffatom verloren geht, wird das Potentialgleichgewicht des Proteinions so gestört, dass durch entsprechende Umlagerungen ein Bruch der Kette aus Aminosäuren induziert wird. Der Bruch betrifft dabei nicht die peptidischen Bindungen, sondern dazu benachbarte Bindungen, die zu so genannten c- und z-Fragmentionen führen.
Diese Art der Fragmentierung ist besonders einfach in ICR-Massenspektrometern durchzuführen, da die nieder-energetischen Elektronen von einer Glühkathode aus leicht entlang der Magnetkraftlinien der gespeicherten Wolke aus Analytionen zugeführt werden können. Die ECD-Fragmentierung ist nur mit einigen Schwierigkeiten auf Hochfrequenz-Ionenfallen zu übertragen, da die starken Hochfrequenzfelder die Elektronen nicht gut nieder-energetisch an die Wolke der Analytionen heranlassen. Es gibt trotzdem verschiedenartige Ansätze für eine ECD-Fragmentierung in Hochfrequenz-Ionenfallen, die jedoch jeweils einen höheren apparativen Aufwand erfordern.
Es ist nun jüngst ein Verfahren zur Fragmentierung von Ionen in Hochfrequenz-Ionenfallen bekannt geworden, das zur Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD) gleichartige Fragmentierungen durch andersartige Reaktionen liefert: die „Elektronentransfer-Dissoziation” (ETD). Diese kann leicht in den Ionenfallen durchgeführt werden, indem geeignete negative Ionen zu den gespeicherten Analytionen hinzu eingeführt werden. Verfahren dieser Art sind in den Offenlegungsschriften DE 10 2005 004 324 A1 (R. Hartmer und A. Brekenfeld) und US 2005/0199804 A1 (D. F. Hunt et al.) beschrieben worden. Die Bruchstückionen gehören dabei (wie bei ECD) den so genannten c- und z-Reihen an, und sind somit sehr verschieden von den Bruchstückionen der b- und y-Reihen, die durch ergodische Fragmentierungen gewonnen werden. Die Bruchstücke der c- und z-Reihen haben deutliche Vorteile für die Bestimmung der Aminosäuresequenz aus den massenspektrometrischen Daten, nicht zuletzt dadurch, dass die ETD-Fragmentionenspektren zu kleineren Massen hinunterreichen können als die Stoßfragmentionenspektren. Aus der Offenlegungsschrift von Hunt et al. ist zudem bekannt, dass Peptide im negativen Modus einer Elektrospray-Ionenquelle ionisiert werden und die dabei erzeugten mehrfach deprotonierten Peptidanionen mit positiv geladenen Kationen zur Reaktion gebracht werden, um die Peptidanionen zu fragmentieren.
Die Fragmentierung von Proteinkationen durch Elektronentransfer (ETD) in einer Hochfrequenz-Ionenfalle wird in sehr einfacher Weise durch Reaktionen zwischen mehrfach geladenen positiven Proteinionen und geeigneten negativen Ionen erzeugt. Geeignete negative Ionen sind regelmäßig radikale Anionen, beispielsweise solche von Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder anderen polyaromatischen Verbindungen. Bei radikalen Anionen sind die chemischen Valenzen nicht abgesättigt, was sie zur leichten Abgabe von Elektronen befähigt, um zu einer energetisch begünstigten nichtradikalen Form zu gelangen. Sie werden in NCI-Ionenquellen (NCI = „negative chemical ionization”) erzeugt, höchstwahrscheinlich durch einfachen Elektroneneinfang oder durch Elektronenübertragung. NCI-Ionenquellen sind im Prinzip wie Ionenquellen für chemische Ionisierung (CI-Ionenquellen) aufgebaut, werden aber anders betrieben, um zu großen Mengen niederenergetischer Elektronen zu kommen. Die NCI-Ionenquellen werden auch als Elektronenanlagerungs-Ionenquellen bezeichnet.
Inzwischen wurde bekannt, dass auch ein Elektronenübertrag von hoch angeregten Neutralteilchen, beispielsweise durch hoch angeregte Helium-Atome aus einer „Fast-Atom-Bombardment”-Teilchenquelle (FAB-Teilchenquelle), stattfinden kann ( DE 10 2005 005 743 A1 , R. Zubarev et al.). Diese Art der Fragmentierung wird als MAID abgekürzt („metastable atom induced dissociation”). Auch hier gibt es ECD-artige Fragmentionenspektren. Es scheint für den nicht-ergodischen Fragmentierungsprozess durch Neutralisierung eines Protons durch ein Elektron keine Rolle zu spielen, woher das Elektron stammt. Die Fragmentierungsarten ECD, ETD und MAID können daher gemeinsam als „elektroneninduzierte” Fragmentierungsarten bezeichnet werden.
Die Auswertung der Fragmentionenspektren ist sehr einfach, wenn sie aus zwei- bis etwa vierfach geladenen Elternionen produziert wurden, da sich doppelt bis vierfach geladene Fragmentionen an den Massenabständen ihres Isotopenmusters erkennen lassen, und da die Fragmentionenspektren nicht allzu komplex sind. Das ist anders, wenn hoch geladene Elternionen, beispielsweise zehn- bis dreißigfach geladene Elternionen dieser Fragmentierungsprozedur unterworfen werden. Die Anzahlen verschiedenartiger Fragmentionen sind außerordentlich hoch und die weitaus meisten der Fragmentionen drängeln sich im Bereich ladungsbezogener Massen m/z von etwa 600 bis 1200 u. Das Fragmentionenspektrum ist dermaßen komplex, dass eine Auswertung kaum mehr möglich ist, zumal sich die Isotopenmuster in Ionenfallen als Massenanalysatoren nicht mehr nach Massen auflösen lassen und daher die Ladungsstufe nicht mehr feststellbar ist.
Größere Moleküle, vor allem Proteine, liefern in Elektrosprüh-Ionenquellen vielfach geladene Ionen, wobei als grobe Faustregel angenommen werden kann, dass bei jeweils 1500 u Erhöhung der Masse im Mittel die Ladung um etwa ein Proton zunimmt. Ein Protein der Masse 10 000 u hat damit im Maximum der Ladungsverteilung etwa 15 Protonen aufgenommen, aber es herrscht meist eine breite Verteilung der Ionen mit verschiedenen Anzahlen von Ladungen, die sich größtenteils im Bereich ladungsbezogener Massen von m/z = 600 bis 1200 u wiederfinden. Zweifach oder dreifach geladene Ionen haben dabei verschwindend geringe Häufigkeiten und können daher praktisch nicht zur Erzeugung der Fragmentionen verwendet werden; die Fragmentierung stößt aus diesen Gründen bei Proteinmolekülen des Molekülmassenbereichs zwischen 5·10³ und 100·10³ u auf größere Schwierigkeiten, obwohl sich die hochgeladenen Analytionen beispielsweise durch Elektronentransfer hervorragend dissoziieren lassen. Die so entstehenden Fragmentionen, vor allem die schweren Fragmentionen, sind überwiegend wieder selbst hoch geladen und zeigen das oben beschriebene komplexe Fragmentionenspektrum.
Es ist nun seit längerem bekannt, dass man vielfach geladene Ionen durch fortgesetzte Deprotonierung („charge stripping”) in einfach oder niedrig geladene Ionen wandeln kann. Das geschieht recht einfach durch fortgesetzten Protonentransfer von den vielfach positiv geladenen Ionen auf besondere Arten von negativ geladenen Ionen, und zwar insbesondere auf nichtradikale Anionen, die dadurch neutralisiert werden. Der Wirkungsquerschnitt für eine solche Protonentransferreaktion ist proportional zum Quadrat der Anzahl der Protonenladungen an dem positiv geladenen Ion; die Deprotonierungen verlaufen daher für hoch geladene Ionen sehr schnell und bremsen bei Erreichen niedrig geladener Ionen stark ab. Stoppt man beispielsweise die Zufuhr von negativen Reaktantionen für die Deprotonierung beim Erreichen einfach geladener Ionen ab, so erhält man durch Messung im Massenanalysator sehr einfach auswertbare Massenspektren, da diese praktisch nur noch die Signale einfach geladener Ionen enthalten.
Für die Elektronentransfer-Dissoziation von mittelgroßen Proteinen in Ionenfallen ist bereits bekannt, dass man diesen Effekt auch auf die dabei entstehenden Fragmentionen anwenden kann: Nach der Speicherung von hochgeladenen Ionen der großen Proteinmoleküle wendet man eine ETD-Fragmentierung durch Einspeisen von geeigneten Radikal-Anionen an; danach speist man nichtradikale Anionen zur Deprotonierung ein, bis eine praktisch vollständige Reduzierung der Ladungszustände zu einfach geladenen Ionen eingetreten ist. Dadurch erhält man einfach auszuwertende Massenspektren der ETD-Fragmentionen. Über dieses Verfahren wurde auf der „17th International Mass Spectrometry Conference”, August 27 – September 1, 2006, Prag, von Donald F. Hunt (Abstract L2) berichtet. Der Offenlegungsschrift WO 2006/042187 A2 (Hunt et al.) ist zudem zu entnehmen, dass eine Fragmentierung von Proteinionen und danach der Fragmentionen derart durchgeführt wird, dass die Fragmentionen zwischen einer und vier Ladungen aufweisen.
Es ist im Bereich der Deprotonierungen von hoch geladenen Pseudomolekülionen jüngst ein weiteres interessantes Verfahren bekannt geworden. Die hoch geladenen Pseudomolekülionen einer Substanz, die in verschiedenen Ladungsstufen vorliegen, können in einer HochfrequenzIonenfalle gleichzeitig deprotoniert werden und dieser Prozess der Deprotonierung kann bei einer bestimmten Ladungsstufe angehalten werden, so dass sich bei dieser Ladungsstufe alle Pseudomolekülionen höherer Ladungsstufen teildeprotoniert sammeln. Dazu ist es erforderlich, bei dem ladungsbezogenen Massenwert m/z dieser Ladungsstufe der Pseudomolekülionen eine leichte resonante Anregung der sekularen Schwingungen durch eine Dipolwechselspannung zu setzen. Die dann angeregt schwingenden Ionen dieser Ladungsstufe sind zu weiteren Reaktionen mit deprotonierenden Reaktant-Anionen nicht mehr fähig, da zur Deprotonierung eine niedrige Relativgeschwindigkeit der beteiligten Partner notwendig ist. Dieses Verfahren ist im Patent US 7 064 317 B2 (S. M. McLucky et al.) beschrieben.
Eine solche Umwandlung von hoch geladenen Pseudomolekülionen verschiedener Ladungsstufen in eine vorbestimmte Ladungsstufe sorgt gleichzeitig auch für eine hohe Empfindlichkeit, da sich die Analytionen aller höheren Ladungsstufen während der Deprotonierung mit relativ hoher Ausbeute bei der ausgewählten Ladungsstufe sammeln. Man kann Ausbeuten von über 50 Prozent erzielen. Außerdem ist es so möglich, bei Vorhandensein der hoch geladenen Ionen mehrerer Substanzen die Analytionen auszuwählen, da die Ionen der fremden Substanzen nicht gesammelt, sondern bei genügend langer Reaktionszeit bis zum bitteren Ende, bis zu ihrer Neutralisierung, deprotoniert werden.
Es wurde oben schon erwähnt, dass sich aus mittelschweren, hoch geladenen Proteinionen außerordentlich viele Fragmente bilden, die auch noch viele verschiedene Anzahlen von Ladungen tragen. Die meisten Fragmentionen erscheinen im Bereich ladungsbezogener Massen von m/z = 600 bis 1200 u. Daraus ergibt sich ein Massenspektrum, das selbst bei höchster Massenauflösung meist nicht mehr zu entwirren ist. Es überlagern sich so viele Fragmentionen mit ihren jeweiligen Isotopenmustern, dass auch beste Entfaltungsalgorithmen nicht mehr in der Lage sind, mit diesem Signalgemisch fertig zu werden. Werden die Ionenfallen der eingesetzten Massenspektrometer auch als Massenanalysatoren benutzt, so ist die Lage hoffnungslos, da diese nicht imstande sind, die Isotopenmuster der hoch geladenen Fragmentionen nach Einzelmassen aufzulösen.
Werden allerdings, wie nach dem Stand der Technik bekannt, die Fragmentionen in der Ionenfalle bis zur Ladungsstufe eins (oder allenfalls zwei) deprotoniert, so wird es möglich, ein Massenspektrum der Fragmentionen zu messen, und zwar sowohl mit Ionenfallen, die auch als Massenanalysatoren eingesetzt werden, wie auch mit Massenanalysatoren anderer Art. Nachteilig ist es aber dann, dass das Massenspektrum auf den Massenbereich des Massenanalysators für einfach (oder allenfalls zweifach) geladene Ionen beschränkt ist. Das gibt für mittelschwere Proteine keine hohe Sequenzabdeckung.
Die Messung eines Massenspektrums der Fragmentionen kann mit der Ionenfalle selbst geschehen. Dafür ist eine Reihe von Scanverfahren bekannt, die praktisch alle auf einem schnell aufeinander folgenden massenselektiven Auswurf der Ionen beruhen. Die ausgeworfenen Ionen werden in einem Ionendetektor gemessen. – Die Fragmentionen können aber auch in angeschlossenen Massenanalysatoren anderer Art gemessen werden. So sind Kopplungen von Hochfrequenz-Ionenfallen mit Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern, mit Kingdon-Zellen, oder mit Flugzeitmassenspektrometern kommerziell erhältlich.
Dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen (3D-Ionenfallen) nach Wolfgang Paul bestehen aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, wobei in der Regel die Ringelektrode mit der Hochfrequenzspannung versorgt wird, es sind jedoch auch andere Betriebsarten möglich. Im Inneren der Ionenfalle können für massenspektrometrische Analysen sowohl positive wie auch negative Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld gespeichert werden. Die Ionenfallen können als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll. Gute kommerzielle Ionenfallen-Massenspektrometer haben einen Massenbereich bis zu einer ladungsbezogenen Masse von m/z = 3000 u, wobei besondere Scanverfahren bei jeder Masse auch noch die Isotopenmuster von vierfach geladenen Ionen auflösen können. Ionenfallen-Massenspektrometer gehören zu den preiswertesten Massenspektrometern; sie sind weit verbreitet.
Lineare Hochfrequenz-Ionenfallen (auch 2D-Ionenfallen genannt, weil sich die elektrischen Felder im Inneren nur in zwei Dimensionsrichtungen ändern) bestehen aus zwei oder mehr Poistabpaaren unter Hochfrequenzspannung mit Endelektroden, deren inhomogene Hochfrequenz-Potentiale positive wie negative Ionen zurückweisen können. Für die Möglichkeit, gleichzeitig positive und negative Ionen speichern zu können, muss man für deren Speiche rung in axialer Richtung besondere Maßnahmen ergreifen, beispielsweise kann man an den Enden durch Hochfrequenzspannungen Pseudopotentiale erzeugen, die Ionen beider Polaritäten zurückhalten. Zweidimensionale Ionenfallen mit vier Polstäben formen im Inneren ein Quadrupolfeld und können wie 3D-Ionenfallen als Massenanalysatoren verwendet werden, wobei es auch hier verschiedene Scanverfahren gibt, beispielsweise solche des massenselektiven Auswurfs der Ionen durch Schlitze in den Polstäben oder durch Blenden am Ende der Stabsysteme. Kommerzielle Geräte dieser Art haben gegenwärtig einen ladungsbezogenen Massenbereich bis zu m/z = 2000 u.
Es ist eine Besonderheit aller Ionenfallen-Massenspektrometer, dass bei ihnen das absolute Massenauflösungsvermögen R_a = 1/Δm konstant ist und nicht das relative Massenauflösungsvermögen R_r = m/Δm, wie bei anderen Arten von Massenspektrometern. Das bedeutet, dass in Ionenfallen-Massenspektrometern die Breite der Ionensignale über den gesamten Massenbereich hinweg konstant ist (gemessen in Einheiten der ladungsbezogenen Masse m/z), während für praktisch alle anderen Arten von Massenspektrometern die Breite der Ionensignale mit der ladungsbezogenen Masse m/z proportional anwächst. Für Ionenfallen-Massenspektrometer wachst daher das Auflösungsvermögen für ein Isotopenmuster bei einer Deprotonierung an; für alle anderen Arten von Massenspektrometern bleibt das Auflösungsvermögen für das Isotopenmuster bei einer Deprotonierung in etwa konstant.
Im Inneren quadrupolarer Ionenfallen wird ein hauptsächlich quadrupolares elektrisches Hochfrequenzfeld aufgespannt, das die Ionen oberhalb der unteren Massenschwelle zum Zentrum treibt, wodurch diese Ionen in diesem Feld so genannten sekularen Oszillationen unterliegen. Die rücktreibenden Kräfte in der Ionenfalle können durch ein so genanntes Pseudopotential beschrieben werden, das über eine zeitliche Mittelung der Kräfte auf ein erzwungen schwingendes Ion im realen Potentials bestimmt wird. Das Pseudopotential steigt quadratisch in zwei oder drei Raumrichtungen gleichmäßig an. In diesem „Topf” des Pseudopotentials oszillieren die Ionen, und zwar positive wie auch negative Ionen.
Ein Stoßgas in der Ionenfalle sorgt dafür, dass die ursprünglich vorhandenen Bewegungsschwingungen (die sekularen Oszillationen) der Ionen im Topf des Pseudopotentials abgebremst werden; die Ionen versammeln sich dann als kleine Wolke im Zentrum der Ionenfalle. Der Durchmesser der Wolke beträgt in üblichen Ionenfallen bei üblichen Ionenfüllungen mit einigen Zehntausend Ionen etwa ein Millimeter. Die Wolke hat in 3D-Ionenfallen eine elliptische Form, in 2D-Ionenfallen eine Form eines länglichen Fadens. Der Durchmesser bestimmt sich durch ein Gleichgewicht zwischen der rücktreibenden Kraft des Pseudopotentials und den abstoßenden Coulombschen Kräften zwischen den Ionen. Thermische Restenergien vergrößern die Ionenwolke um ein kleines bisschen.
Es sind Ionenfallen-Massenspektrometer kommerziell erhältlich, die mit besonderen Ionenquellen für die Herstellung von negativ geladenen Reaktantionen ausgestattet sind. Es können darin sowohl Radikalanionen für die Fragmentierung durch Elektronentransfer hergestellt werden, wie auch nichtradikale Anionen für die Verminderung der Protonenzahl von Analytionen durch Protonentransfer von der Analytionen zu den negativen Reaktantionen. Negative Ionen für eine Deprotonierung können aber auch in den Elektrosprüh-Ionenquellen hergestellt werden, mit denn die überwiegende Anzahl von Ionenfallen-Massenspektrometer ausgerüstet sind.
Es ist besonders für eine de-novo-Sequenzierung, aber auch für andere Zielsetzungen für eine Spektrenauswertung günstig, sowohl ergodisch gewonnene Fragmentionenspektren wie auch elektroneninduziert gewonnene Fragmentionenspektren nebeneinander aufzunehmen. Eine denovo-Sequenzierung ist immer dann erwünscht, wenn die Suche einer Suchmaschine in einer Proteinsequenzdatenbank keine vernünftigen Ergebnisse liefert, beispielsweise, weil ein Protein dieser Art noch nicht in der Datenbank vorhanden ist. Durch den Vergleich ergodischer und elektroneninduzierter Fragmentionenspektren kann sofort die Zuordnung der Ionensignale zu den c/b-Reihen oder z/y-Reihen entnommen werden, weil zwischen c-Ionen und b-Ionen wie auch zwischen z-Ionen und y-Ionen feste Massendifferenzen herrschen, durch die die Zugehörigkeit leicht abzulesen ist. Dadurch können sehr leicht Teilsequenzen für beide Reihen von Fragmentionen ausgelesen werden. Aber auch die leichte Erkennung von Modifikationen ist dadurch gegeben, da Seitenketten wie Phosphorylierungen oder Glykosilierungen bei elektroneninduzierter Fragmentierung erhalten bleiben und bei ergodischer Fragmentierung verloren gehen. Die Differenzen lassen die Modifikationen sichtbar werden.
Die leichte Erzeugung von ETD-Fragmentionenspektren macht also die Erzeugung von ergodischen Fragmentionenspektren nicht überflüssig, da erst beide Arten von Fragmentionenspektren nebeneinander viele wertvolle Aussagen ermöglichen.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, mit Massenspektrometern, die Ionenfallen enthalten, Fragmentionen-Massenspektren von mittelgroßen Proteinen zu erstellen, die eine möglichst hohe Sequenzabdeckung bieten, nach Möglichkeit weit über den Massenbereich hinaus, die deren Massenanalysatoren für einfach oder doppelt geladene Ionen bieten. Es sollen Massenspektren sowohl ergodischer wie auch elektroneninduzierter Fragmente gemessen werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung auswertbarer Fragmentionenspektren hoch geladener Proteinionen in Massenspektrometern mit Ionenfallen bereit, das dadurch charakterisiert werden kann, dass vor einer Fragmentierung eine teilweise Deprotonierung der Proteinionen mit Reaktant-Anionen so durchgeführt wird, dass eine Mischung aus einfach bis n-fach geladenen Fragmentionen entsteht, wobei 3 ≤ n ≤ 8 gilt. Die günstigste Maximalzahl n der Ladungen an den Fragmentionen hängt vom Massenauflösungsvermögen des Massenanalysators ab; dieser muss dabei isotopenaufgelöste Massenspektren liefern. Je kleiner die Ma ximalzahl n der Ladungen, umso entzerrter ist das Fragmentionenspektrum; je höher die Maximalzahl n der Ladungen, umso höher ist die Sequenzüberdeckung.
Besonders vorteilhaft ist es, die Deprotonierung bei einer ausgewählten Ladungsstufe durch resonante Anregung der sekularen Schwingungen anzuhalten. Die Ladungsstufe, bis zu der die Proteinionen deprotoniert wird, wird dabei so ausgewählt, dass sie sowohl für die nachfolgende Fragmentierung wie auch für die entstehende Mischung der Fragmentionen günstig ist. Eine Fragmentierung der Proteinionen einer Ladungsstufe mit k Protonen liefert bei einer ergodischen Fragmentierung eine Mischung von Fragmentionen der Ladungsstufen 1 bis k, bei einer elektroneninduzierten Fragmentierung eine Mischung der Ladungsstufen 1 bis (k – 1). Das Besondere daran ist, dass die Fragmentionen aller dabei entstehenden Ladungsstufen etwa gleiche Intensität haben, ganz im Gegensatz zu den Verhältnissen bei einer Deprotonierung der Fragmentionen nach einer Fragmentierung.
Die Ladungsstufe, bei der fragmentiert wird, kann auch in zwei oder mehr Schritten erreicht werden. Dafür sind schwere Reaktant-Anionen erforderlich. Die ladungsbezogene Masse m/z der Proteinionen der ausgewählten Ladungsstufe k kann auch außerhalb des Scanbereichs der Hochfrequenz-Ionenfalle liegen.
Die teilweise Deprotonierung der Proteinionen vor der Fragmentierung ist mit vielen Vorteilen verbunden. So werden zunächst die Proteinionen der verschiedenen, im Ionisierungsprozess erzeugten Ladungsstufen in einer einzigen Ladungsstufe gesammelt und ergeben eine höhere Ausnutzung der Proteinionen. Die Sammlung erspart eine Isolierung der ausgewählten Elternionen. Die Sammlung vernichtet gleichzeitig störende Ionen anderer Substanzen. Die Mischung der daraus erzeugten Fragmentionen enthält gleichmäßig intensiv alle verschiedenen Ladungsstufen. Für Stoßfragmentierungen wird so die Fragmentierung überhaupt erst möglich, da nur Elternionen relativ hoher ladungsbezogener Masse fragmentiert werden können. Bei elektroneninduzierter Fragmentierung wird die Bildung innerer Fragmente reduziert.
Bei richtiger Wahl der maximalen Ladungsstufe n für das Gemisch der Fragmentionen kann selbst in Ionenfallen, die als Massenanalysator verwendet werden, ein gut isotopenaufgelöstes Spektrum dieser Ionen gemessen werden. Aus den isotopenaufgelösten Signalen dieser ladungsverminderten Fragmentionen kann man beispielsweise ein „virtuelles Massenspektrum” berechnen, das nur noch aus den mono-isotopischen Signalen einfach geladener Ionen besteht. Es handelt sich hierbei um eine weitere „rechnerische Deprotonierung”, verbunden mit einer nichttrivialen rechnerischen Bestimmung der Masse des mono-isotopischen Signals des Isotopenmusters eines Fragmentions, wobei für hochmolekulare Ionen dieses Signal nicht mehr selbst messbar ist und nur aus dem Isotopenmuster gewonnen werden kann.
Im Falle einer elektroneninduzierten Fragmentierung bilden sich manchmal stabile Radikal-Kationen, die nicht sofort zerfallen. Da hier die Radikal-Kationen aus einer einzigen Ionensorte entstehen, können sie durch eine schwache resonante Anregung ihrer sekularen Schwin gungen weiter durch Stöße fragmentiert werden, wobei sie zerfallen und die für elektroneninduzierte Fragmentierungen typischen Fragmentionen ergeben. Die Frequenz für diese Anregungswechselspannung kann aus der bekannten Masse dieser Radikal-Kationen und ihrer bekannten Ladung berechnet werden. Diese Anregungsspannung bewirkt, dass die Ausbeute der gewünschten Fragmentionensorte erhöht wird.
Auch eine Deprotonierung nach der Fragmentierung kann das gewünschte Gemisch aus Fragmentionen der Ladungsstufen eins bis n erzeugen.
Es ist das Besondere an dieser Erfindung, dass durch die Kombination aus Deprotonierung und Fragmentierung ein Ionengemisch aus ein- bis n-fach geladenen Fragmentionen erzeugt wird. Dadurch werden die Fragmentionensignale in ihrer absoluten Anzahl stark vermindert und über einen wesentlich größeren Massenbereich verteilt, so dass die Anzahl der Überlappungen von Isotopenmustern deutlich verringert wird. Für den Fall n ≤ 4 wird erreicht, dass die Fragmentionen in Ionenfallen, die auch als Massenanalysatoren verwendet werden, isotopenaufgelöst gemessen werden können. Für n = 4 kann in einer Ionenfalle, die einen Scanbereich von M = 3000 u für einfach geladene Ionen besitzt, eine Sequenzabdeckung von je 12 000 u erreicht werden, und zwar jeweils über beide Enden der Sequenz hinweg. Für den Fall 5 ≤ n ≤ 8 muss ein Massenanalysator mit entsprechend hohem Auflösungsvermögen zur Messung herangezogen werden. Aus den so gemessenen isotopenaufgelösten Massenspektren der ladungsverminderten Fragmentionen lässt sich dann mit bekannten Verfahren ein virtuelles Massenspektrum berechnen, das nur noch aus den mono-isotopischen Signalen einfach geladener Fragmentionen besteht.
Sowohl die Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation wie auch die negativen Reaktantanionen für die Deprotonierung können in einer Ionenquelle zur chemischen Erzeugung von negativen Ionen (NCI-Ionenquelle) erzeugt und in die Ionenfalle eingespeist werden. Eine oder beide Arten der Reaktantionen können aber auch in gewöhnlichen Elektrosprüh-Ionenquellen oder anderen Ionenquellen, die an Atmosphärendruck arbeiten (APCI = atmospheric pressure chemical ionzation; APPI = atmospheric pressure photo ionization), hergestellt werden.
Beschreibung der Abbildungen
1 stellt ein Schema eines Ionenfallenmassenspektrometers für die Durchführung eines Verfahrens nach dieser Erfindung dar, hier mit zwei parallel zu betreibenden Elektrosprüh-Ionenquellen (1a, 2a und 1b, 2b), einem Ionentrichter (4), einer Elektronenanlagerungs-Ionenquelle (8) für die Erzeugung negativer Ionen und einer 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (11, 13) und Ringelektrode (12). Das Ionenleitsystem (9), hier als Oktopol-Stabsystem ausgeführt, kann sowohl positive wie auch negative Ionen zur Ionenfalle leiten. Eine der beiden Elektrosprüh-Ionenquellen kann beispielsweise für die Herstellung schwerer negativer Reaktantionen für die Deprotonierung verwendet werden.
2 zeigt eine Elektronenanlagerungs-Ionenquelle, in der ein von der Glühkathode (24) ausgehender Elektronenstrahl von zwei Magneten (21) und (37) geführt in der Kammer (27) das durch die Zuführung (28) eintretende gasförmige Fluoranthen in Anwesenheit von Methan ionisiert. Die entstehenden Anionen werden mit Hilfe der Extraktionsblende (30) aus der Öffnung (29) herausgezogen und in das Hexapol-Ionenleitsystem (31) eingeführt. Mit geringer Extraktionsspannung werden praktisch nur Radikalanionen extrahiert, bei höherer Extraktionsspannung ganz überwiegend nur nichtradikale Anionen.
In 3 sind die Analytionen aus dem Versprühen von Ubiquitin (Molekülmasse 8560 u gezeigt. Die Ionen haben Ladungsstufen von 7 bis 14, wobei die 12-fach geladenen Analytionen am häufigsten vorkommen.
Die 4 zeigt ein Massenspektrum der isolierten 12-fach geladenen Ionen des Ubiquitin, die als Elternionen ausgesucht wurden.
5 zeigt das Fragmentionenspektrum, das aus den 12-fach geladenen Analytionen des Ubiquitin durch Elektronentransfer-Dissoziation gewonnen wurde. Die Fragmentionen häufen sich im Gebiet von 600 u bis 1200 u.
6 gibt das Massenspektrum der ladungsverminderten Fragmentionen des Ubiquitin aus 5 wieder. Das Massenspektrum ist weitgehend entzerrt.
7 zeigt das virtuelle Massenspektrum von Ubiquitin, berechnet aus dem ladungsverminderten Massenspektrum der 6. Die Annotation wurde von einem automatisch arbeitenden Rechenprogramm durchgeführt. Die Lücken der Annotation in der oberen Zeile c der ersten Spektrenhälfte sind auf das Vorkommen von Prolin zurückzuführen, dessen amidseitige Bindung durch Elektronentransfer-Dissoziation nicht gespaltet werden kann. Einem solchen Rechenprogramm kann aber auch beigebracht werden, solche Prolinlücken zu durch eindeutige Zuordnung schließen. Dann wäre mit dem Verfahren der Erfindung eine 96-prozentige Sequenzabdeckung gegeben.
Günstige Ausführungsformen
Die Erfindung stellt für Massenspektrometer mit Ionenfallen ein Verfahren zur Verfügung, mit dem Massenspektren der Fragmentionen geliefert werden, die weit über den originären Massenbereich der Massenanalysatoren hinausgehen und die eine Basis für ein Top-Down-Analyseverfahren für mittelschwere Proteine bilden. Die Erfindung geht von der Erzeugung hoch geladener Proteinionen aus, wie sie beispielsweise durch Elektrosprühen von mittelschweren Proteinmolekülen, aber auch durch andere Ionisierungsverfahren, erzeugt werden. Es können dafür alle Arten von Ionenfallen verwendet werden, wobei aber die Verfahrensablaufe für die verschiedenen Ionenfallen verschieden sind.
In Hochfrequenz-Ionenfallen gehen besonders günstige Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens von einer teilweisen Deprotonierung der hoch geladenen Proteinionen vor einer Fragmentierung aus, wobei die Deprotonierung bei einer bestimmten, im Voraus gewählten Ladungsstufe angehalten wird. Die verschiedenen Ausführungsformen auf dieser Basis unterscheiden sich dann in der Art der Fragmentierung, wobei durchaus sowohl ergodische wie auch nicht-ergodische, insbesondere elektroneninduzierte Fragmentierungen zum Einsatz kommen können.
Die Deprotonierung wird durch Reaktionen der hoch geladenen Proteinionen mit geeigneten Reaktant-Anionen vorgenommen. Die Reaktant-Anionen sind in der Regel nicht-radikale Anionen, wobei sehr viele verschiedene Substanzklassen für eine Bildung dieser Reaktant-Anionen infrage kommen. Eine Deprotonierungs-Reaktion besteht in einem Protonentransfer von einem hoch geladenen Proteinion zu einem Reaktant-Anion, wobei letzteres neutralisiert wird, ohne dabei ein Radikal zu bilden. Die Deprotonierungs-Reaktionen haben Wirkungsquerschnitte, die dem Quadrat der Ladungsstufe der hoch geladenen Proteinionen proportional sind; die Reaktionen laufen für hoch geladene Proteinionen außerordentlich schnell ab.
Das Anhalten der Deprotonierung bei einer vorgewählten Ladungsstufe besteht in einer Hochfrequenz-Ionenfalle darin, die Proteinionen, die durch fortgesetzte Deprotonierung bei dieser Ladungsstufe angekommen sind, durch eine Dipolwechselspannung resonant schwach anzuregen. Die Anregung darf nicht so stark sein, dass die Proteinionen aus der Ionenfalle ausgeworfen werden. Es ist ein Gleichgewicht zwischen der Anregung durch die Dipolwechselspannung und der Dämpfung durch das Stoßgas herzustellen. Diese Art der schwachen Anregung ist für Ionenfallen bekannt (beispielsweise für Stoßfragmentierungen) und kann durch die Software-Steuerung jeder kommerziell vertriebenen Ionenfalle durchgeführt werden. Durch die Bewegung der Proteinionen bei ihrer sekularen Schwingung entziehen sie sich weiteren Deprotonierungs-Reaktionen, da diese nur bei niedrigen Relativgeschwindigkeiten stattfinden.
Da durch die schwache resonante Anregung die Proteinionen nicht sofort schwingen, sondern eine Anschwing-Phase geringer Geschwindigkeit durchlaufen, dürfen die Deprotonierungs-Reaktionen nicht mit hoher Geschwindigkeit ablaufen. Sonst werden die Proteinionen weiter deprotoniert, bevor sie die Phase voller Schwingungen erreicht haben. Die Geschwindigkeit der Deprotonierungs-Reaktionen kann durch die Zufuhr an Reaktant-Anionen gesteuert werden.
Die Anschwing-Phase dauert umso länger, je langsamer die sekulare Schwingung ist. Die Frequenz der sekularen Schwingungen ist bei gegebener Hochfrequenzspannung umgekehrt proportional zur ladungsbezogenen Masse m/z; für eine niedrige Anzahl von Ladungen z ist also die Schwingungsfrequenz ungünstig niedrig. Andererseits nimmt die Schwingungsfrequenz mit der Hochfrequenzspannung der Ionenfalle zu; es ist also günstig, diese so hoch wie eben möglich zu wählen.
Es sei dies an einem Beispiel erläutert: Proteinmoleküle von 15·10³ u erhalten bei einer Ionisierung durch Elektrosprühen etwa 15 bis 30 Protonen, die ladungsbezogenen Massen der hoch geladenen Proteinionen erstrecken sich also von 500 bis 1000 u. Um alle diese hoch geladenen Proteinionen zu deprotonieren, sollte die Hochfreqenzspannung so hoch gewählt werden, dass die untere Massenschwelle bei etwa 500 u liegt. Damit gehen keine hoch geladenen Proteinionen verloren. Wird jetzt für das Anhalten der Deprotonierung eine Ladungsstufe k = 5 gewählt, so haben die Proteinionen dieser Ladungsstufe eine ladungsbezogene Masse m/z = 3000 u. Diese Proteinionen schwingen trotz der mäßig hohen Hochfrequenzspannung extrem langsam, was ungünstig ist.
Man kann diese Situation durch eine zweistufige Deprotonierung verbessern. Für die erste Phase der Deprotonierung wählt man beispielsweise k = 14, und damit eine Sammlung bei der ladungsbezogenen Masse von m/z = 1071 u. Für diese Ionen ist die Frequenz der sekularen Schwingung rund dreimal höher, der Prozess der Deprotonierung darf also etwa dreimal schneller ablaufen. Die Gesamtdauer dieser ersten Phase der Deprotonierung ist insgesamt sehr kurz. Danach kann man die Hochfrequenzspannung verdoppeln, so dass die untere Massenschwelle jetzt bei 1000 u liegt. Für das Anhalten bei der Ladungsstufe k = 5 kann jetzt gegenüber der einstufigen Deprotonierung die Reaktionsgeschwindigkeit verdoppelt werden. Da auch die zweite Phase der zweiphasigen Deprotonierung bedeutend kürzer ist als die Gesamtdauer der einstufigen Deprotonierung, erhält man einen Zeitgewinn bei doppelstufiger Deprotonierung.
Diese Art der Deprotonierung bedarf allerdings einer hohen Molekülmasse für die Reaktant-Anionen, da diese jeweils über der Massenschwelle der Ionenfalle liegen muss. Reaktant-Anionen so hoher Molekülmasse von über 1000 u kann man zwar in Elektronenanlagerungs-Ionenquellen nach 2 herstellen, man ist dann allerdings auf verdampfbare Substanzen dieser Molekülmasse angewiesen, beispielsweise auf hoch bromierte oder iodierte Polyaromaten oder Polyether. Es stehen aber viele verschiedenartige Substanzen zur Verfügung, wenn man eine Elektrosprüh-Ionenquelle zur Herstellung dieser Reaktant-Anionen verwendet. Die Elektrosprüh-Ionenquelle muss nicht mit der Ionenquelle für die Erzeugung der Proteinionen identisch sein, sie kann vielmehr dazu parallel angeordnet sein, wie das schematisch in 1 angedeutet ist. Die Elektrosprüh-Ionenquelle für die Reaktant-Anionen kann auch besondere Hilfsmittel, wie beispielsweise einer Nadel für Corona-Entladungen zur Unterstützung des negativen Elektrosprühens durch chemische Ionisierung enthalten.
Die bei einer ausgewählten Ladungsstufe k angehaltene Deprotonierung liefert nun Proteinionen, die sich günstig sowohl durch ergodische Prozesse wie auch elektroneninduziert fragmentieren lassen.
Eine Fragmentierung durch Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation (IRMPD) liefert jetzt Fragmentionen der Ladungsstufen 1 bis n = k, wobei der Vorteil hier darin liegt, dass alle Ladungsstufen im Gemisch der Fragmentionen gleichermaßen stark vertreten sind, im Gegensatz zu einer Deprotonierung der Fragmentionen nach einer Fragmentierung der hoch geladenen Proteinionen.
Für die Stoßfragmentierung ist eine Deprotonierung vor der Fragmentierung zwingend notwendig, weil sich die hoch geladenen Proteinionen im Bereich der ladungsbezogenen Massen von m/z = 500 bis 1000 u überhaupt nicht fragmentieren lassen. Es kann für diese hoch geladenen Proteinionen die Hochfrequenzspannung nicht so hoch eingestellt werden, dass die Stöße so energiereich werden, dass bei den Stößen Energie in die Ionen hineingepumpt werden kann. Es müssen in den Stößen die Energieschwellen für die Anregung bestimmter Schwingungszustände überschritten werden, sonst laufen die Stöße vollelastisch unter einfacher Reflektion des Stoßgas-Moleküls ab. Das gilt besonders dann, wenn als Stoßgas Helium verwendet wird. Helium wird in kommerziell hergestellten Hochfrequenz-Ionenfallen besonders häufig verwendet, da es die Scanverfahren zur Spektrenaufnahme wenig stört.
Durch die Sammlung von Proteinionen einer hohen ladungsbezogenen Masse m/z im oben geschilderten Deprotonierungsprozess bei einer genügend niedrigen Ladungsstufe k werden jetzt die Voraussetzungen für eine Stoßfragmentierung geschaffen. Durch Hochsetzen der Hochfrequenzspannung können jetzt harte Stoßbedingungen geschaffen werden. Die Hochfrequenzspannung wird dazu so hoch gesetzt, dass die untere Massenschwelle bei mindestens der Hälfte, besser noch bei zwei Dritteln bis zu drei Viertel der ladungsbezogenen Massen m/k der Proteinionen liegt. Es genügt dann eine eher kurze resonante Anregung von nur einigen Millisekunden, möglicherweise sogar weniger, um genügend Energie für eine Fragmentierung durch Stöße in die Proteinionen zu pumpen. Die Fragmentierung erfolgt hier nicht sofort, sondern verzögert mit der Halbwertszeit der ergodischen Fragmentierung. Die Halbwertszeit ist umso länger, je weniger die innere Überschussenergie über der Bindungsenergie liegt. Andererseits wird die innere Energie durch zarte, Energie abgebende Stöße mit dem Stoßgas auch wieder vermindert, so dass ein Kompromiss experimentell zu suchen ist.
Wird bei einer hohen Hochfrequenzspannung eine resonante Anregung vorgenommen, so wird nicht nur eine sekulare Schwingung erzeugt, sondern es wird der sekularen Schwingung auch eine erzwungene Schwingung im Takt der Hochfrequenz aufgeprägt. Die erzwungene Schwingung ist in ihrer Amplitude umso größer, je weniger die ladungsbezogene Masse der resonant angeregten Ionen über der unteren Massenschwelle der Ionenfalle liegt. Da die Frequenz der erzwungenen Schwingung um einen Faktor zwei (direkt oberhalb der Massenschwelle) bis vier (bei der doppelten Massenschwelle) über der sekularen Schwingung liegt, trägt sie erheblich zur Energie der Stöße bei. Die erzwungene Schwingung kann auch alleine ausgenutzt werden, indem man über die beiden Endkappen eine Gleichspannung legt, die die Ionen aus dem Zentrum bewegt, so dass sie außerhalb des Zentrums die erzwungene Schwingung des Hochfrequenzfeldes erfahren. Die Gleichspannung wirkt dann auf alle Ionen in der Ionenfalle, da es keine resonante Anregung einer einzigen Ionensorte mehr ist. Die Gleich spannung wirkt auf schwere Ionen mehr als auf leichte Ionen, da die rücktreibenden Kräfte des Pseudopotentials für schwere Ionen geringer sind.
Die Energie der Stöße kann auch durch ein schwereres Stoßgas vergrößert werden. Es kommt dafür beispielsweise Stickstoff oder Argon in Frage. Kommerzielle Ionenfallen-Massenspektrometer vermeiden den Zusatz oder die alleinige Verwendung schwerer Stoßgase, da sie zur Erzielung hoch auflösender Scanverfahren nicht schnell genug abgepumpt werden können.
Die hohe Hochfrequenzspannung verhindert die Speicherung kleiner Fragmentionen. Diese sind aber für das auswertbare Fragmentionenspektrum entscheidend wichtig. Es muss daher sofort nach der Stoßphase die Hochfrequenzspannung wieder herabgesetzt werden. Das muss gesteuert so geschehen, dass die Dämpfung aller weit schwingenden Proteinionen schneller erfolgt als die Ausweitung der Schwingungen im schwacher werdenden Hochfrequenzfeld und dadurch niedriger werdenden Pseudopotentialtopf, weil sonst mindestens einige der Ionen durch Schwingungen über den Rand des Pseudopotentialtopfes hinaus verloren gehen. Die Stoßphase darf nur kurz sein, meist genügen aber auch nur einige Millisekunden.
Ist eine niedrige untere Stabilitätsgrenze von beispielsweise m/z = 150 u erreicht, so werden die meisten Fragmentionen aller jetzt verzögert stattfindenden Zerfälle auch in der Ionenfalle gehalten. Sind die Fragmentionen jetzt immer noch zu hoch geladen, so können sie durch eine weitere Deprotonierung in ihrer Ladungsstufe weiter herabgesetzt werden.
Für die elektroneninduzierten Fragmentierungen ist die Sammlung der Proteinionen bei einer vorgewählten Ladungsstufe k ebenfalls ideal. Es werden dann Fragmentionen der Ladungsstufen 1 bis n = (k – 1) gebildet. Auch hier liegt der Vorteil darin, dass neben einer Entzerrung der Fragmentionenspektren eine Mischung aus Fragmentionen entsteht, bei denen die Fragmentionen der Ladungsstufen 1 bis (k – 1) etwa gleiche Intensität haben. Das wäre nicht der Fall, wenn die Deprotonierung nach der elektroneninduzierten Fragmentierung vorgenommen würde.
In Hochfrequenz-Ionenfallen ist die elektroneninduzierte Fragmentierung durch Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) relativ einfach durchzuführen, insbesondere dann, wenn eine Quelle für Radikal-Anionen vorhanden ist. Dazu werden in an sich bekannter Weise geeignete Radikal-Anionen eingeführt, deren mangelnde Absättigung der chemischen Valenzen dazu führen, ein Elektron an die mehrfach positiv geladenen Proteinionen abzugeben. Die Reaktionen können bei sehr niedriger Hochfrequenzspannung ablaufen, daher werden auch kleine Fragmentionen eingefangen.
Für die Erzeugung der Radikal-Anionen kann eine übliche Elektronenanlagerungs-Ionenquelle verwendet werden, wie sie in 2 wiedergegeben ist. Geeignete Radikalanionen M^.- für die Elektronentransfer-Dissoziation werden durch Elektronenanlagerung an geeignete Reaktantsubstanzen hergestellt, wobei bekanntermaßen verschiedenartige Reaktantsubstanzen verwendet werden können, wie beispielsweise Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder andere polyaromatische Verbindungen. Im Prinzip kann auch eine Mischung von Reaktantsubstanzen verwendet werden um eine Mischung aus Radikalanionen zu erzeugen. Für die Fragmentierung des Ubiquitins, dessen Fragmentionenspektrum in 5 gezeigt wird, wurde das Radikalanion des Fluoranthens verwendet.
Sind die Proteinionen sehr gut thermalisiert, so bilden sich bei der Elektronentransfer-Dissoziation manchmal metastabile Radikal-Kationen, die nicht sofort zerfallen. Da hier die Radikal-Kationen aus einer einzigen Ionensorte, den Proteinionen der Ladungsstufe k, entstehen, können die Radikal-Kationen durch eine schwache resonante Anregung ihrer sekularen Schwingungen durch Stöße nachhelfend fragmentiert werden, wobei sie zerfallen und die für elektroneninduzierte Fragmentierungen typischen Fragmentionen ergeben. Die Frequenz für diese Anregungswechselspannung kann aus der bekannten Masse dieser Radikal-Kationen und ihrer bekannten Ladung berechnet werden. Diese Anregungsspannung bewirkt, dass die Ausbeute der gewünschten Fragmentionensorte erhöht wird. Diese Radikal-Kationen mögen sich manchmal außerhalb des Massenbereichs der Ionenfalle für eine Spektrenaufnahme befinden, beispielsweise bei m/z = 4000 u einer Ionenfalle, deren Massenbereich für die Spektrenaufnahme nur bis m/z = 3000 u reicht; trotzdem kann man die Frequenz ihrer sekularen Schwingung berechnen und sie resonant anregen.
In besonders ausgebildeten Ionenfallen, beispielsweise in solchen Ionenfallen, die mit einer rechteckförmigen Hochfrequenzspannung betrieben werden, ist es aber auch möglich. eine Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD) zu betreiben.
Ist im Ionenfallen-Massenspektrometer eine Quelle für hoch angeregte Neutralteilchen vorhanden, so kann auch recht einfach eine Dissoziation durch metastabile Atome (MAID) durchgeführt werden. Auch hier ist es vorteilhaft, dass gleichmäßige Gemische der Fragmentionen aller Ladungsstufen erhalten werden.
In Penning-Ionenfallen, die in ICR-Massenspektrometern eingesetzt werden, lassen sich ebenfalls Deprotonierungen durch Reaktionen mit nicht-radikalen Anionen durchführen. Hier kommen insbesondere sehr leichte Anionen zur Anwendung, beispielsweise Anionen der Benzoesäure. Auch hier ist es möglich, die Deprotonierung bei einer bestimmten Ladungsstufe anzuhalten, indem die Zyklotron- oder Magnetronschwingung der Proteinionen dieser Ladungsstufe angeregt wird. Die Anregung darf allerdings nicht von Dauer sein; es ist aber bekannt, dass man durch Anwendung von häufigen Phasensprüngen zu einer Bewegung der Ionen kommen kann, die nicht in einer immer größer werdenden Spirale endet. Außerdem ist es auch hier möglich, durch ein resonantes Quadrupolwechselfeld zu einer dipolaren Schwingung endlicher Amplitude zu gelangen.
Trotz der Betonung der Vorteile für eine Deprotonierung vor einer Fragmentierung kann eine Deprotonierung nach der Fragmentierung immer noch nützlich sein, um (a) eine Isotopenauf- Lösung bei der Spektrenaufnahme, (b) eine Reduzierung der Anzahl der Sorten von Fragmentionen und (c) eine Entzerrung des Fragmentionenspektrums zu erzeugen.
Als Beispiel werde hier die Deprotonierung der Fragmentionen des Ubiquitin nach ihrer Entstehung in einer Hochfrequenz-Ionenfalle gebracht, wobei hier die Ionenfalle auch als Massenanalysator verwendet wird. Ubiquitin diene hier als Beispiel für ein mittelschweres Protein; es hat eine Molekülmasse von 8560 u für das mono-isotopische Molekül.
Eine günstige Ausführungsform des Ionenfallenmassenspektrometers ist in 1 schematisch wiedergegeben. Es wird hier eine der beiden Elektrosprüh-Ionenquellen (1a, b) mit einer Sprühkapillare (2a, b) außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung der hochmolekularen Proteine verwendet. Das hochmolekulare Protein, befindet sich dazu in einer wässerigen Lösung, der zur Erleichterung des Sprühens organische Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril beigemischt sind. Die durch das Elektrosprühen erzeugten hoch geladenen Analytionen werden in üblicher Weise durch eine Einlasskapillare (3a, b) und einen Hochfrequenz-Ionentrichter (4) in das Ionenleitsystem (5) geführt, wobei das mitgeführte Umgebungsgas weitgehend abgesaugt wird. Mit Hilfe der Ionenleitsysteme (5) und (9) werden die hoch geladenen Analytionen durch die Druckstufen (15), (16), (17) zur 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (11 und 13) und Ringelektrode (12) geführt und dort in üblicher Weise eingefangen. Die Ionenleitsysteme (5) und (9) bestehen aus parallelen Stabpaaren, an denen alternierend die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen. Sie sind üblicherweise als Hexapol- oder als Oktopol-Stabsystem ausgeführt.
Ein erstes Massenspektrum, das durch resonante Anregung der Ionen mit massenselektivem Auswurf mit Messung im Ionendetektor (14) gewonnen wird, gibt eine Übersicht über die verschiedenen Ladungsstufen, in denen die Analytionen vorliegen. Ein solches Massenspektrum von Ubiquitin mit einer breiten Verteilung der Ladungsstufen von 7 bis 14 ist in 3 gezeigt. Nach einer Wiederholung der Füllung der Ionenfalle kann jetzt die Ionensorte einer ausgewählten Ladungsstufe mit üblichen Mitteln isoliert werden; diese Ionen bilden dann die Elternionen für die Fragmentierung. Dazu überfüllt man zunächst die Ionenfalle, damit später genügend Ionen für eine gute Spektrenaufnahme übrig bleiben, und wirft dann alle Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht den ausgewählten Elternionen entsprechen. In 4 ist das Massenspektrum des Ubiquitins nach Isolation der Ionen mit Ladungsstufe 12 wiedergegeben. In einem starken Zoom des Massenspektrums wäre zu erkennen, dass keine Isotopenauflösung vorliegt.
Diese hoch geladenen Analytionen werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas in das Zentrum der Falle hinein abgebremst. Sie bilden dort eine kleine Wolke von etwa einem Millimeter Durchmesser.
Sodann werden die hoch geladenen Elternionen, also hier die 12-fach geladenen Ubiquitin-Ionen, fragmentiert. Es werde hier eine Elektronentransfer-Dissoziation vorgenommen, es können aber auch andere Arten von Fragmentierungen angewendet werden. Für die Elektronentransfer-Dissoziation werden besondere negativ geladenen Ionen, insbesondere Radikalanionen geeigneter Substanzen wie Anthracen oder Fluoranthen, hinzugefügt.
Diese Radikalanionen werden hier in einer gesonderten Ionenquelle (8) für negative chemische Ionisierung erzeugt und über ein kleines Ionenleitsystem (7) zu einer Ionenweiche geführt, wo sie in das Ionenleitsystem (9) zur Ionenfalle (11, 12, 13) eingefädelt werden. Die Ionenweiche besteht in der hier gezeigten Ausführung einfach aus einer Lochblende (6) und aus einer Verkürzung zweier Stäbe des stabförmigen Ionenleitsystems (9). Besonders günstig für diese sehr einfache Art einer Ionenweiche ist es, wenn das Ionenleitsystem als Oktopolsystem ausgeführt ist. Diese Ionenweiche kann die Ionen der Elektrosprüh-Ionenquelle (1a, 2a) bei geeigneten Spannungen an der Lochblende sowie bei geeigneten Gleichspannungen in den Achsen der Oktopol-Stabsysteme (5) und (9) ungehindert durchlassen, mit anderen Spannungen werden die negativen Ionen aus der Ionenquelle (8) in das Ionenleitsystem (9) hinein reflektiert. Über dieses Ionenleitsystem (9) gelangen sie zur Ionenfalle und werden dort in üblicher Weise durch eine Einschussoptik (10) eingespeichert.
Eine günstige Elektronenanlagerungs-Ionenquelle ist in 2 gezeigt. Ein von der Glühkathode (24) an Haltepfosten (23) ausgehender Elektronenstrahl von etwa 70 Elektronenvolt Energie wird von zwei Magneten (21) und (37) durch die Kammer (27) geführt. In der Kammer (27) wird das durch die Zuführung (28) eintretende gasförmige Fluoranthen in Anwesenheit von Methan, das ebenfalls durch die Zuführung (28) eintritt, ionisiert. Die entstehenden Anionen werden mit Hilfe der Extraktionsblende (30) aus der Öffnung (29) der Kammer (27) herausgezogen und in ein Hexapol-Ionenleitsystem (31) eingeführt. Mit dieser Elektronenanlagerungs-Ionenquelle ist es übrigens auch möglich, nichtradikale Anionen für die Deprotonierung zu erzeugen. Mit geringer Extraktionsspannung werden praktisch nur Radikalanionen extrahiert, bei höherer Extraktionsspannung ganz überwiegend nur nichtradikale Anionen. Elektronenanlagerungs-Ionenquelle und Hexapol-Ionenleitsystem (31) entsprechen der Ionenquelle (8) und dem Ionenleitsystem (7) der 1.
Die Radikalanionen reagieren dabei sofort (innerhalb weniger Millisekunden) mit den positiven Analytionen, wobei diese in bekannter Weise fragmentieren und Fragmentionen der c- und der z-Reihe bilden. Aus hochmolekularen Proteinionen werden dabei sehr viele Fragmentionen gebildet, wobei die schweren Fragmentionen in der Regel auch wieder hoch geladen sind, während die leichten Fragmentionen wesentlich geringer geladen sind. 5 zeigt die so gewonnenen Fragmentionen von Ubiquitin, die sich im relativ schmalen Bereich von m/z = 600 bis 1200 u drängeln.
Gewöhnlich füllt man eine feststehende Menge der Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation der Analytionen ein, und bricht nach einer vorgewählten Zeit diesen Prozess dadurch ab, dass man restliche Radikalanionen schnell entfernt, um nicht eine weitere Fragmentierung der gerade erzeugten Fragmentionen zu bewirken. Eine solche weitere Fragmen tierung kann so genannte „innere Fragmente” erzeugen, die eine Auswertung des letztendlich angestrebten Massenspektrums erschweren. Die Beseitigung der restlichen Radikalanionen kann vorzugsweise über eine resonante Anregung der Sekularschwingungen dieser Ionen erfolgen; es gibt aber auch andere Verfahren. Diese Art der Fragmentierung durch Elektronentransfer nimmt einschließlich des Auswurfs der restlichen Radikalanionen nur etwa 5 bis 30 Millisekunden in Anspruch.
Nach einer kurzen Beruhigungsphase von wenigen Millisekunden können jetzt die negativen Ionen zur Deprotonierung zugefügt werden. Das Deprotonierung geschieht recht einfach durch Protonentransfer von den vielfach positiv geladenen Ionen auf besondere Arten von negativ geladenen Ionen, und zwar insbesondere auf nicht-radikale Anionen. Die Wirkungsquerschnitte für diese Protonentransferreaktionen sind proportional zum Quadrat der Anzahl der Protonenladungen an einem Ion; die Deprotonierungen verlaufen daher für hoch geladene Ionen extrem schnell und bremsen bei Erreichen niedriger geladener Ionen stark ab. Zehnfach geladene Ionen werden also etwa hundertmal schneller deprotoniert als einfach geladene Ionen, und immer noch sechsmal schneller als vierfach geladene Ionen.
Die nicht-radikalen Anionen für die Deprotonierung können in der gleichen Ionenquelle (8) erzeugt werden, in der auch schon die Radikal-Anionen erzeugt wurden. Sie können aber auch in einer der beiden Elektrosprüh-Ionenquellen (1a, 2a) oder (1b, 2b) erzeugt werden, meist unter Verwendung einer zweiten Sprühkapillare (2a) oder (2b). Ebenso können die nicht-radikalischen Anionen durch eine Corona-Entladung in Eingangsbereich einer der beiden Einlasskapillaren (3a) oder (3b) erzeugt werden.
Stoppt man die Zufuhr der nicht-radikalen Anionen für die Deprotonierung beim Erreichen einer vorgewählten niedrigeren Ladungsstufe ab, beispielsweise bei Erreichen einer Mischung aus Fragmentionen mit je ein bis vier Ladungen, so kann man unter Verwendung der Ionenfalle (11, 12, 13) als Massenanalysator ein isotopenaufgelöstes Massenspektrum der Fragmentionen messen. Die zeitliche Dauer der Deprotonierung hängt von der Erzeugungsrate der nichtradikalen Anionen ab, sie beträgt zwischen 20 und 200 Millisekunden. In 6 ist gut zu sehen, wie das Fragmentionenspektrum des Ubiquitins, das nunmehr nur noch Ionen bis zur Ladungsstufe vier enthält, nunmehr stark entzerrt ist und sich relativ gleichmäßig über den hier ingestellten Massenbereich des Ionenfallen-Massenanalysators von m/z = 150 bis 3000 u erstreckt.
Aus diesem entzerrten, isotopenaufgelösten Massenspektrum der Ubiquitin-Fragmentionen in 6 kann man ein virtuelles Massenspektrum der einfach geladenen, mono-isotopischen Ubiquitin-Fragmentionen berechnen.
Ein solches virtuelles Massenspektrum der Fragmentionen umfasst jetzt einen Massenbereich, der mehrfach höher ist als der originäre Massenbereich des Massenanalysators für einfach geladene Ionen. Das ergibt eine höhere Sequenzabdeckung als für den Fall einer Deprotonie rung bis zur Ladungsstufe eins. Das virtuelle Massenspektrum der Fragmentionen kann für Identifizierungen oder Modifikationsbestimmungen in Suchmaschinen verwendet werden, steht aber auch sonst für vielfältige Untersuchungen oder Darstellungen zur Verfügung, beispielsweise zur Darstellung von Massenspektren, die mit den Aminosäuren annotiert sind. Das Wort „Massenspektrum” ist hier nicht nur als ein graphisches Diagramm zu verstehen, das Massenspektrum kann genau so gut eine Liste mit den Massen der mono-isotopischen Signale und deren Intensitäten sein.
Bei Verwendung der Ionenfallen auch als Massenanalysatoren macht die Erfindung davon Gebrauch, dass es möglich ist, die Isotopenmuster von bis zu vierfach geladenen Ionen noch aufzulösen. Für höher geladene Ionen ist das nicht mehr möglich. Für Spektren mit aufgelösten Isotopenmustern kann aus dem Abstand der Signale in den Isotopenmustern sehr einfach die Ladungsstufe der Ionen dieses Isotopenmusters bestimmt werden. Für zweifach geladene Ionen beträgt dieser Abstand stets 1/2 u, für dreifach geladene 1/3 u, für vierfach geladene Ionen 1/4 u Daraus lässt sich sofort die Masse der einfach geladenen Ionen (A+H)⁺ berechnen, sie beträgt das zwei-, drei- oder vierfache der Masse m/z der Ionen (A+2H)² ⁺, (A+3H)³⁺ oder (A+4H)⁴⁺ minus der Masse für die Anzahl der Protonen H⁺, die bei den einfach geladenen Ionen fehlen.
Da aber das virtuelle Massenspektrum nur die Massen der mono-isotopischen Signale enthalten soll, setzt das Verfahren voraus, dass es mathematische Methoden zur Massenbestimmung für das mono-isotopische Signal eine Isotopengruppe gibt. Diese Aufgabe ist für größere Proteine im Bereich von 5·10³ bis 100·10³ u nicht mehr trivial, wird aber im Patent DE 198 03 309 C1 (C. Köster; GB 2 333 893 B ; US 6,188,064 B1 ) beschrieben. Das monoisotopische Signal gehört zu demjenigen Ion eines Isotopenmusters, das nur aus den Hauptisotopen ¹H, ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ³¹P und ³²S besteht. Dieses mono-isotopische Signal ist für sehr große Proteine von verschwindender Intensität und kann nur aus den anderen Signalen der Isotopengruppe erschlossen werden. Ein Protein der Masse von 5000 u hat noch ein monoisotopisches Signal, das etwa fünf Prozent der Summe der Signale aller Isotopen ausmacht, bei einem Protein der Masse 8000 u macht das mono-isotopische Signal nur noch ein Prozent aus. Bei noch schwereren Proteinen ist das mono-isotopische Signal kaum noch zu erkennen: bereits bei einem Protein von 10000 u Masse macht das mono-isotopische Signal nur noch 0,2 Prozent aus. Mit dieser mathematischen Methode ist es auch möglich, auch noch einigermaßen komplexe Überlagerungen von Isotopenmustern zu erkennen und zu trennen.
Für die Bestimmung des mono-isotopischen Ions wird zunächst aus dem Isotopenmuster die Masse des betreffenden Fragmentions abgeschätzt. Aus den Kenntnissen über Proteine kann die durchschnittliche Zusammensetzusammensetzung aus den Elementen H, C, O, N, P und S bestimmt werden. Aus dieser durchschnittlichen Zusammensetzung kann mit bekannten Verfahren ein Isotopenmuster für ein Fragmention dieser Masse berechnet werden. Dieses be rechnete Isotopenmuster wird nun in das gemessene Isotopenmuster parametrisierend eingepasst; daraus ergibt sich auch die ladungsbezogene Masse m/z des mono-isotopischen Fragmentions, das aber noch mehrfach geladen ist. Das Verfahren wird für alle Isotopenmuster wiederholt, wobei die Resultate in eine Tabelle eingetragen werden, in der die ladungsbezogenen Massen, die Ladungsstufen und die Intensitäten aller gemessenen Fragmentionen stehen. Als Intensitäten werden zweckmäßigerweise die Summen aller Intensitäten der Fragmentionen eines Isotopenmusters eingetragen.
Diese Tabelle wird dann durch Umrechnung auf einfach geladene Fragmentionen in das virtuelle Massenspektrum der Fragmentionen gewandelt werden. Ist m* die ladungsbezogene Masse m/z des n-fach durch Protonen H⁺ geladenen Fragmentions (F + n × H)ⁿ⁺, so kann die Masse m der einfach geladenen Fragmentionen (F+H)⁺ wie folgt berechnet werden: m[(F + H)⁺] = n × m*[(F + n × H)ⁿ⁺] – (n – 1) × m[H]. Dieses tabellarisch vorliegende virtuelle Massenspektrum der Fragmentionen hat eine Form, die für weiterverarbeitende Rechenprogramme aller Art geeignet ist, beispielsweise für die bereits genannten Suchmaschinen, oder für Programme zur Bestimmung von Modifikationen der Aminosäuren wie Phosphorylierungen oder Glykosylierungen.
Dieses virtuelle Massenspektrum hat den Vorteil eines sehr viel höheren Massenbereichs. Man kann damit in einer Ionenfalle, die einen Massenbereich bis zu m/z = 3000 u besitzt und vierfach geladene Ionen auflösen kann, im virtuellen Massenspektrum einen Massenbereich bis zu m = 12000 u abdecken. Während man also nach bisheriger Technik, in der man zu einfach geladenen Fragmentionen deprotoniert, nur den originären Massenbereich für die Sequenzierung der Aminosäuren zur Verfügung hat, reicht mit dieser Erfindung der Massenbereich wesentlich weiter. Dabei werden die Sequenzen beider Enden der Kette aus Aminosäuren abgedeckt, also die Sequenzen sowohl des C-terminalen wie auch des N-terminalen Endes.
In 7 ist das virtuelle Massenspektrum der Fragmentionen des Ubiquitin wiedergegeben, das mit den Abkürzungen der Aminosäuren annotiert ist. Das zur Annotation verwendete Programm war hier nicht darauf eingestellt, Kombinationen von beliebigen Aminosäuren mit Prolin zu erkennen. Die Bindung zwischen Prolin und der amidseitig gebundenen Aminosäure kann durch Elektronentransfer-Dissoziation nicht gespalten werden, daher gibt es diese Lücken in der c-Reihe der ersten Hälfte des Massenspektrums. Wären diese Lücken annotieret, so würde das Spektrum eine Sequenzabdeckung über 73 der 76 Aminosäuren zeigen. Die Aminosäuren GGR vom C-terminalen Ende der Sequenz fehlen am Anfang der (z + 1)-Reihe, da die Ionenfalle während der Fragmentierung auf eine untere Massengrenze von 150 u eingestellt war, und selbst zwei Glycine (G) mit nur je 57 u leichter sind als 150 u. Zum Vergleich: Die Sequenz des Ubiquitins ist MQIFVKTLTG KTITLEVEPS DTIENVKAKI QDKEGIPPDQ QRLIFAGKQL EDGRTLSDYN IQKESTLHLV LRLRGG.
Bei Verwendung der Ionenfallen auch als Massenanalysatoren macht somit die Erfindung davon Gebrauch, dass es möglich ist, die Isotopenmuster von bis zu vierfach geladenen Ionen noch aufzulösen. Für höher geladene Ionen ist das nicht mehr möglich. Für Spektren mit aufgelösten Isotopenmustern kann dann, wie beschrieben, aus dem Abstand der Signale in den Isotopenmustern sehr einfach die Ladungsstufe der Ionen dieses Isotopenmusters bestimmt werden.
Bei Massenspektrometern, die nicht die Ionenfalle selbst auch als Massenanalysator benutzen, sondern mit andersartigen Massenanalysatoren ausgestattet sind, hilft die Deprotonierung nicht, um zu einer höheren Isotopenauflösung zu kommen, weil deren relatives Auflösungsvermögen R_r konstant ist und alle Isotopenmuster, gleich welcher Ladungsstufe, in gleicher Weise auflöst werden. Die Isotopenauflösung für schwere Ionen muss hier durch ein hohes Massenauflösungsvermögen des Massenanalysators gegeben sein, wie es beispielsweise bei Ionenzyklotronresonanz-Massenanalysatoren der Fall ist. Der Vorteil der Erfindung liegt hier vielmehr darin, dass das Verfahren der Erfindung die große Anzahl der Fragmentionen, je mit einem teils komplizierten Isotopenmuster, in ihrer absoluten Anzahl stark vermindert, und dass die starke Häufung aller Fragmentionen im Bereich von 500 bis 1200 u entzerrt wird, weil sich die Fragmentionen verminderter Ladungsstufen jetzt über einen weiten Massenbereich verteilen und dadurch die Anzahl von Überlappungen der Isotopenmuster vermindert ist.
Für Massenspektrometer mit diesen andersartigen Massenanalysatoren kann es zweckmäßig sein, nicht bis zu niedrig geladenen Fragmentionen der Ladungsstufen eins bis vier zu deprotonieren, sondern durchaus auch Ionen mäßig hoher Ladungsstufen zuzulassen, beispielsweise Ionen bis zur Ladungsstufe sechs oder acht.
Bei einer Fragmentierung vor der Deprotonierung können die hoch geladenen Analytionen als Mischung von Ionen mehrerer Ladungsstufen gemeinsam fragmentiert werden, es können aber die Analytionen einer geeigneten Ladungsstufe zunächst isoliert werden. Dabei muss das Isotopenmuster vollständig erhalten bleiben, um bei den Fragmentionen aus dem Muster die Ladungsstufe ablesen zu können.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren für die Erstellung guter Fragmentionenspektren schwerer Proteine in Massenspektrometern mit Ionenfallen bereit, das zunächst hoch geladene Ionen der Proteine erzeugt und in der Ionenfalle speichert, diese Analytionen deprotoniert und fragmentiert und eine Mischung ladungsverminderten Fragmentionen der Ladungsstufen eins bis n herstellt, die gut isotopenaufgelöste Spektren ergibt, eine geringere Zahl von Fragmentionen enthält und das Fragmentionenspektrum über einen größeren Bereich der ladungsbezogenen Massen verteilt. Aus diesen Fragmentionenspektren lässt sich das „virtuelles Massenspektrum” aus nur einfach geladenen, mono-isotopischen Ionen berechnen.
Für die Berechnung der Zeiten einer optimalen Befüllung einer Hochfrequenz-Ionenfalle, die auch als Massenanalysator verwendet werden soll, mit hoch geladenen Analytionen gibt es verschiedene bekannte Verfahren, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll. Die Füllzeiten bewirken eine optimale Füllung, bei der letztendlich die Spektrenaufnahme, die durch die massenselektive Ejektion der Ionen erfolgt, gerade noch nicht durch die Raumladung gestört wird. Dabei kann die Ionenfalle zwischenzeitlich für alle ablaufenden Prozesse der Isolation, Fragmentierung und Deprotonierung stark überfüllt sein, es kommt nur darauf an, dass während der Spektrenaufnahme keine Überfüllung mehr herrscht.
Für die Befüllung mit negativen Ionen – sowohl der Radikalanionen für die Fragmentierung wie auch der nicht-radikalen Anionen für die Deprotonierung – ist im Allgemeinen nur ein einziges Mal eine optimale Befüllungsmenge oder Befüllungszeit zu ermitteln, da immer etwa die gleiche Menge an negativen Ionen gebraucht wird, um mit der feststehenden Anzahl von positiven Ionen optimal zu reagieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erstellung von Fragmentionenspektren von Proteinen und großen Proteinfragmenten, die eine weite Sequenzabdeckung zeigen, in Massenspektrometern, die mit Ionenfallen ausgestattetet sind, kann in folgende Schritte aufgelöst werden: a) Erzeugung hoch geladener Analytionen der Proteine und Speicherung einer Menge solcher Analytionen in der Ionenfalle des Massenspektrometers, b) Einbringen solcher Mengen von nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung und nachfolgend solcher Mengen an Radikalanionen für die Elektronentransfer-Dissoziation, dass ein Gemisch aus Fragmentionen entsteht, das aus Ionen der Ladungsstufen eins bis n besteht, mit einer wählbaren maximalen Ladungsstufe n im Bereich 3 ≤ n ≤ 8, und c) Messung eines isotopenaufgelösten Massenspektrums dieser ladungsverminderten Fragmentionen.
Die Erzeugung der Ionen in Schritt a) geschieht bevorzugt durch Elektrosprühen, da dadurch mehrfach geladene Ionen erzeugt werden, wie sie für die Elektronentransfer-Dissoziation gebraucht werden. Dabei entstehen aber aus hochmolekularen Substanzen unvermeidlich vielfach geladene Analytionen, die wiederum vielfach geladene Fragmentionen ergeben. Es können für die Ionisierung statt des Elektrosprühens auch andere Ionisierungsarten Verwendung finden, wenn diese mehrfach geladene Ionen erzeugen, wie beispielsweise die Ionisierung von oberflächengebundenen Analytproben durch den Beschuss mit hoch geladenen Molekülclustern. Auch hier werden von großen Biomolekülen vielfach geladene Ionen erzeugt.
Für die Fragmentierung in Schritt b) müssen nicht alle Analytionen der verschiedenen Ladungsstufen eingespeichert bleiben, es können auch in bekannter Weise Analytionen einer einzigen Ladungsstufe isoliert oder die Analytionen bis zu einer vorgewählten Ladungsstufe deprotoniert werden. Es können auch Analytionen in einer Mischung aus mehreren Ladungs stufen gemeinsam fragmentiert werden. In jedem Fall aber muss bei einer Isolierung von Elternionen das Isotopenmuster der ausgewählten Analytionen vollständig erhalten bleiben, um bei den Fragmentionen aus dem Isotopenmuster die Ladungsstufe ablesen und auch die mono-isostopische Form berechnen zu können.
Die Fragmentierung in Schritt b) kann durch Elektronentransfer (ETD), durch Bestrahlung mit Infrarot-Photonen (IRMPD) oder durch Reaktionen mit hoch angeregten, metastabilen Neutralteilchen (MAID = „metastable atom induced decomposition”) bewirkt werden. Eine Fragmentierung durch Stöße (CID) nach resonanter Anregung der sekularen Schwingungen der Analytionen bedarf besonderer Maßnahmen, um zu energiereichen Stößen zu kommen.
Wird die Fragmentierung in Schritt b) mit Hilfe der Elektronentransfer-Dissoziation durch Elektronenanlagerung an geeignete Reaktantsubstanzen durchgeführt, so können verschiedenartige Reaktantsubstanzen zur Herstellung der benötigten Radikal-Anionen verwendet werden, wie beispielsweise Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder andere polyaromatische Verbindungen. Im Prinzip kann auch eine Mischung von Reaktantsubstanzen verwendet werden.
Die Überführung einer vorgewählten Menge an Radikalanionen in die Ionenfalle kann dann auch mit einer Selektion bestimmter Ionen verbunden werden, wenn diese beispielsweise aus einem Gemisch von Substanzen erzeugt wurden, und nur eine Ionensorte des entstehenden Ionengemischs für die Elektronentransfer-Dissoziation verwendet werden soll. Auch beigemischte nichtradikale Anionen können dabei ausgefiltert werden. Diese Filterung kann beispielsweise durch ein Quadrupolfilter geschehen, das zwischen der Elektronenanlagerungs-Ionenquelle und der Ionenfalle eingebaut ist. Unerwünschte Ionen können aber auch bei der Einspeicherung entfernt werden, beispielsweise indem die unerwünschten Ionen durch eine resonante Anregung ihrer sekularen Schwingungsfrequenz an der Einspeicherung gehindert werden.
Zur Beschleunigung der Elektronentransfer-Dissoziation kann willentlich ein Überschuss an Radikalanionen in die Ionenfalle eingeführt werden. In diesem Fall können die überschüssigen Radikalanionen nach Ablauf einer vorgewählten Reaktionszeit wieder aus der Ionenfalle entfernt werden, um zu verhindern, dass auch in hohem Maße Elektronentransfer-Dissoziationen von mehrfach geladenen Fragmentionen eintreten können, wenn erst einmal hohe Anzahlen an Fragmentionen gebildet wurden. Es würden sonst Ionen so genannter „inneren Fragmente” entstehen, die die Interpretation der Fragmentionenspektren erschweren. Es ist daher notwendig, die Reaktionen zur Elektronentransfer-Dissoziation nach einer vorgewählten Reaktionszeit durch Entfernen der Radikalanionen abzubrechen. Die Reaktionszeit ist dabei so zu wählen, dass ein bestimmter Prozentsatz an fragmentierten Elternionen nicht überschritten wird, beispielsweise 30 bis 70 Prozent.
Die Radikalanionen können auf verschiedene, bekannte Weisen aus der Ionenfalle entfernt werden, beispielsweise durch einen resonanten Auswurf, der hier bevorzugt verwendet wird. Es ist aber auch möglich, die Radikalanionen durch Änderung der Hochfrequenzspannung an der Ionenfalle zu entfernen, womit Bedingungen instabiler Speicherung der Radikalanionen erreicht werden und diese die Ionenfalle verlassen. Letzteres ist aber nur möglich, wenn sich keine interessierenden Fragmentionen in der Ionenfalle befinden, die leichter als die Radikalanionen sind.
Zur Erzeugung der negativen Ionen für die Deprotonierung kann die gleiche Ionenquelle verwendet werden, die auch zur Erzeugung der Radikalanionen benutzt wurde. Die nichtradikalen Anionen zur Deprotonierung können aber in eigenständigen Ionenquellen hergestellt werden oder sogar in einer Elektrosprühionenquelle ähnlich der, die die Analytionen liefert. Hier kann beispielsweise eine zweite Sprühkapillare (2b) verwendet werden. Auf jeden Fall sind hier die Spannungen zum Sprühen umzukehren, um negative Ionen zu erzeugen und zur Einlasskapillare in das Vakuumsystem des Massenspektrometers zu führen. Es ist auch möglich, hier durch Corona-Entladungen oder andere Maßnahmen eine negative chemische Ionisierung einzurichten.
Auch für die nichtradikalen Anionen zur Deprotonierung wird zweckmäßigerweise eine vorgewählte Menge in die Ionenfalle eingespeichert, um die Deprotonierungsprozesse ablaufen zu lassen. Sind praktisch nur noch die gewünschten niedrig geladenen Analyt- oder Fragmentionen in der Ionenfalle und wurden dabei nicht alle nichtradikalen Anionen verbraucht, so müssen (in der Regel nach Ablauf einer vorgewählten Reaktionszeit) die restlichen nichtradikalen Anionen entfernt werden. Auch hier werden die Anionen bevorzugt durch resonante Anregung ihrer sekularen Schwindungen aus der Ionenfalle ausgeworfen.
Es kann nach Schritt b) auch vorteilhaft sein, einen Teil der restlichen Elternionen, die jetzt ebenfalls reduziert geladen vorliegen und immer noch einen überragenden Bestandteil des Inhalts der Ionenfalle bilden, zu entfernen. Dadurch wird der dynamische Messbereich der Ionenfalle erhöht und das Spektrum der Fragmentionen tritt stärker hervor. Der Verlust an Ionen in der Ionenfalle kann auch hier durch anfängliches Überfüllen der Ionenfalle mit Analytionen ausgeglichen werden.
Es lassen sich durch den Fachmann in Kenntnis dieser Erfindung auch veränderte Verfahren oder Verbesserungen des vorgestellten Verfahrens erstellen. Alle diese Lösungen sollen vom Erfindungsgedanken mit umfasst sein.

Claims

Verfahren zur Erzeugung gut auswertbarer Fragmentionenspektren aus vielfach positiv geladenen Proteinionen in einem Massenspektrometer mit einer Ionenfalle, dadurch gekennzeichnet, dass in der Ionenfalle vor einer Fragmentierung der Proteinionen eine teilweise Deprotonierung der Proteinionen so weit durchgeführt wird, dass eine Mischung aus einfach bis n-fach positiv geladenen Fragmentionen entsteht, mit 3 ≤ n ≤ 8, und dass das Massenspektrum der Mischung aus Fragmentionen aufgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Deprotonierung vor der Fragmentierung bei einer Ladungsstufe k durch eine resonante Anregung der Proteinionen dieser Ladungsstufe angehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Deprotonierung in einer ersten Stufe bis zu einer ersten Ladungsstufe und in einer zweiten Stufe bis zu einer zweiten Ladungsstufe vorgenommen wird, die niedriger als die erste Ladungsstufe ist, indem zwei verschiedene Resonanzfrequenzen für die resonanten Anregungen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Ionenfalle eine Hochfrequenz-Ionenfalle verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Hochfrequenz-Ionenfalle eine 2D- oder eine 3D-Ionenfalle verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stoßfragmentierung der Proteinionen der Ladungsstufe k durch eine Anregung ihrer sekularen und/oder erzwungenen Schwingungen vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Stoßfragmentierung die Hochfrequenzspannung der Ionenfalle hoch eingestellt wird, um energiereiche Stöße zu erhalten, und dass nach einer Phase der Anregung die Hochfrequenzspannung herabgesetzt wird, um auch leichte Fragmentionen speichern zu können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fragmentierung durch Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fragmentierung durch Elektronentransfer-Dissoziation, durch Elektroneneinfang-Dissoziation oder durch Elektronentransfer von neutralen, hoch angeregten Atomen oder Molekülen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Radikal-Anionen für die Elektronentransfer-Dissoziation in einer Elektronenanlagerungsionenquelle hergestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-radikale Anionen für die Deprotonierung in einer Elektronenanlagerungsionenquelle erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-radikale Anionen für die Deprotonierung in einer Elektrosprüh-Ionenquelle erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die nichtradikalen Anionen für die Deprotonierung durch eine Corona-Entladung in der Elektrosprüh-Ionenquelle erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die vielfach positiv geladenen Proteinionen durch Elektrosprühen erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Fragmentionenspektrum ein virtuelles Massenspektrum der Fragmentionen berechnet wird, das nur noch die Daten der einfach geladenen, mono-isotopischen Signale enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme der Massenspektren des Gemischs aus Fragmentionen durch die Ionenfalle erfolgt, die als Massenanalysator dient.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahme der Massenspektren des Gemischs aus Fragmentionen durch einen Massenanalysator erfolgt, der mit der Ionenfalle gekoppelt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der restlichen Elternionen, die nach einer nur teilweisen Fragmentierung übrig bleiben, durch eine resonante Anregung entfernt wird.