DE19803309C1

DE19803309C1 - Massenspektrometrisches Verfahren zur genauen Massenbestimmung unbekannter Ionen

Info

Publication number: DE19803309C1
Application number: DE19803309A
Authority: DE
Inventors: Claus Koester
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 1998-01-29
Filing date: 1998-01-29
Publication date: 1999-10-07
Anticipated expiration: 2018-01-30
Also published as: GB9901914D0; GB2333893A; US6188064B1; GB2333893B

Abstract

Die Erfindung betrifft eine genaue Bestimmung der Lagerkoordinate (Orts-, Frequenz- oder Zeitkoordinate) eines Ionenpeaks in einem Massenspektrum als Grundlage für die genaue Massenbestimmung von Inonen unbekannter Masse. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, für die Bestimmung der Lagerkoordinate nicht nur isoliert einen Massenpeak, sondern alle Peaks eines Peakmusters dieser Ionen, beispielsweise eines Isotopenmusters, heranzuziehen, und eine Einpassung einer geeignet zusammengesetzten Funktionskurve über alle Peaks des gemessenen Musters gleichzeitig vorzunehmen. Dabei müssen allerdings die wahren Massenabstände der einzelnen Peaks des Peakmusters voneinander bekannt sein. Die Abstände der Peaks eines Isotopenmusters können beispielsweise in guter Näherung aus mittleren Zusammensetzungen der Substanzen einer chemischen Klasse aus den Elementen abgeleitet werden. Während der Anpassung durch eine mathematische Optimierung werden im einfachsten Fall nur die Lagerkoordinate und die Breite der Peakkurven variiert. Wird als Muster ein Isotopenmuster verwendet, so wird dabei automatisch eine präzise Lagebestimmung der monoisotopischen Ionen der Isotopengruppe erhalten, selbst wenn diese Ionen im Spektrum gar nicht sichtbar sind; man braucht daher die Isotopengruppe nicht zusätzlich zu untersuchen. Im einfachsten Fall wird für organische Substanzen nur das Muster der Kohlenstoffisotope in dieser chemischen Klasse für die Anpassung herangezogen, wobei die Anzahl der Kohlenstoffatome ...

Description

Die Erfindung betrifft die genaue Bestimmung der Lagekoordinate (Orts-, Frequenz- oder Zeitkoordinate) eines Ionenpeaks in einem Massenspektrum als Grundlage für die genaue Mas senbestimmung von Ionen unbekannter Masse.

Die Erfindung besteht darin, für die Bestimmung der Lagekoordinate nicht nur isoliert einen Massenpeak, sondern alle Peaks eines Peakmusters dieser Ionen, beispielsweise eines Iso topenmusters, heranzuziehen, und eine Einpassung einer geeignet zusammengesetzten Funkti onskurve über alle Peaks des gemessenen Musters gleichzeitig vorzunehmen. Dabei müssen allerdings die wahren Massenabstände der einzelnen Peaks des Peakmusters voneinander und das Verhältnis ihrer Breiten bekannt sein. Die Abstände der Peaks eines Isotopenmusters kön nen beispielsweise in guter Näherung aus mittleren Zusammensetzungen der Substanzen einer chemischen Klasse aus den Elementen abgeleitet werden. Während der Anpassung durch eine mathematische Optimierung werden im einfachsten Fall nur die Lagekoordinate und die Breite der Peakkurven variiert. Wird als Muster ein Isotopenmuster verwendet, so wird dabei auto matisch eine präzise Lagebestimmung der monoisotopischen Ionen der Isotopengruppe erhal ten, selbst wenn diese Ionen im Spektrum gar nicht sichtbar sind; man braucht daher die Iso topengruppe nicht zusätzlich zu untersuchen. Im einfachsten Fall wird für organische Substan zen nur das Muster der Kohlenstoffisotope in dieser chemischen Klasse für die Anpassung her angezogen, wobei die Anzahl der Kohlenstoffatome aus Mittelwerten für die chemische Klasse gewonnen wird.

Stand der Technik

Für die genaue Massenbestimmung von Ionen einer unbekannten Substanz mit einem Massen spektrometer ist das Massenspektrometer stets zunächst mit einer bekannten Eichsubstanz möglichst an mehreren Punkten des Massenspektrums zu kalibrieren. Durch diese Kalibrierung gewinnt man einen "Kalibrierkurve" genannten Zusammenhang zwischen der Lage eines Io nenpeaks im Massenspektrum und der Masse der Ionen dieses Ionenpeaks. Dann kann ein Spektrum einer unbekannten Substanz gemessen und die Masse eines unbekannten Ions über die Kalibrierkurve berechnet werden. Für genauere Messungen fügt man der unbekannten Substanz eine bekannte Referenzsubstanz zu und korrigiert die Massen der unbekannten Sub stanz anhand der Massendifferenz, die man für die Referenzsubstanz zwischen berechneter und wahrer Masse gefunden hat (Verfahren mit "interner Referenz").

Grundlage aller dieser Kalibrier- und Meßverfahren ist dabei stets die Berechnung einer Orts-, Frequenz- oder Zeitkoordinate für einen einzelnen Massenpeak im Massenspektrum, das aus einer Vielzahl einzelner digitaler Meßwerte besteht. Ortskoordinaten bestimmt man in Spektren statisch arbeitender Massenspektrometer mit Ortsauflösung über Photoplatten oder Diodenar rays, Frequenzwerte in Fourier-Transform-Massenspektrometern, Zeitwerte in zeitlich scan nenden Massenspektrometern und in Flugzeitmassenspektrometern. Den genauen Orts-, Fre quenz- oder Zeitwert muß man dabei aus einem gemessenem (örtlichen oder zeitlichen) Profil der Meßwerte über einen Massenpeak hinweg ableiten. Im einfachsten Fall wird dabei eine Schwerpunktsbildung aus den einzelnen Meßwerten benutzt. Bei etwas aufwendigeren, aber auch etwas genaueren Verfahren wird in das Meßprofil eines Massenpeaks eine (meist theore tisch abgeleitete) Kurve eingepaßt, aus deren optimaler Lage der Orts-, Frequenz- oder Zeit wert abgeleitet wird.

Im Folgenden wird statt der Orts-, Frequenz- oder Zeitkoordinaten nur noch von den "Lage koordinaten" oder einfach von der "Lage" eines Massenpeaks im Massenspektrum gesprochen.

Diese Bestimmung der Lage des Signalprofils einer Ionensorte im Spektrum bildet aber die Hauptquelle für Ungenauigkeiten der Massenbestimmung. Da diese Lagebestimmung sowohl bei der Kalibrierung, wie auch bei der Messung der unbekannten Substanz angewandt wird, vergrößert sich der Fehler entsprechend.

Die Genauigkeit der Massenbestimmung wird daher oft dadurch zu erhöhen gesucht, daß wäh rend der Kalibrierung sehr viele Massenpeaks längs des Spektrums aufgenommen und ausge wertet werden, durch deren Lagekoordinaten hindurch dann eine glatte Kurve ausgleichend angepaßt wird. Da sich ein gleiches Verfahren für die Messung der unbekannten Masse oft wegen Mangel an Probe verbietet, bleibt der Gewinn an Genauigkeit bescheiden.

Für komplizierter zusammengesetzte Ionen (beispielsweise schwere organische Ionen) ist der Peak einer Ionensorte stets von mehreren Peaks derselben Elementzusammensetzung, aber verschiedener Isotopenzusammensetzung begleitet. Wir sprechen hier von einer Isotopengrup pe von Ionenpeaks. Man kann in diesem Fall die Masse aller dieser Ionen einzeln bestimmen, und daraus einen verbesserten Mittelwert für einen Peak des Musters berechnen. Wenn die atomare Zusammensetzung des Ions bekannt ist, kann man die zu dieser Mittelwertbildung notwendigen richtigen Massenabstände der Ionenpeaks voneinander sehr genau berechnen.

Die bisher erreichten Genauigkeiten der Massenbestimmung sind allerdings noch nicht zufrie denstellend. Eine verbesserte Genauigkeit der Massenberechnung ist besonders für die sichere Identifizierung von Proteinen von Bedeutung. Hier läßt man ein Protein durch ein Enzym (beispielsweise Trypsin) verdauen, wobei das Protein jeweils benachbart zu einer enzymspezi fisch vorgegebenen Aminosäure zerschnitten wird. Auf diese Weise erhält man Verdauungs produkte, die im statistischen Mittel etwa 20 Aminosäuren lang sind, deren Länge aber natür lich stark streut und von etwa 10 bis 40 Aminosäuren reicht. Diese überstreichen daher den Massenbereich von 1000 bis 5000 atomaren Masseneinheiten. Für diesen Massenbereich wird dringend eine verbesserte Genauigkeit der Massenbestimmung gesucht, um mit den Ergebnis sen der verbesserten Massenbestimmung über Proteindatenbanken das Protein eindeutiger identifizieren zu können. In diesem Massenbereich können gute Massenspektrometer eine Auflösung von einem Ionenpeak zum nächsten mit einer Masseneinheit Unterschied noch gut auftrennen, die Ionenpeaks einer Isotopengruppe werden also noch einigermaßen gut getrennt (dieses Auflösungsvermögen wird üblicherweise "Einheitsmassenauflösung" genannt).

Eine Verbesserung wird allerdings auch für den anschließenden Bereich von etwa 5000 bis 10000 atomaren Masseneinheiten gesucht Gute Flugzeitmassenspektrometer können beispiels weise auch in diesem Bereich eine Einheitsmassenauflösung liefern.

Für Ionen im Massenbereich von etwa 5000 bis 10000 atomaren Masseneinheiten ergibt sich dabei eine weitere Schwierigkeit für die Massenkalibrierung: der Massenpeak der sogenannten "monoisotopischen" Masse, die sich aus Atomen der jeweils häufigsten Isotope zusammen setzt, ist nicht mehr leicht zu identifizieren, sogar meist gar nicht mehr im Spektrum sichtbar. Beispielsweise sieht man bei Rinder-Insulin (die Masse des monoisotopischen Peaks beträgt 5731,616 atomare Masseneinheiten) den protonierten, monoisotopischen Molekülpeak der Zusammensetzung ¹²C₂₅₄ ¹H₃₇₉ ¹⁴N₆₅ ¹⁶O₇₅ ³²S₆ häufig gar nicht, zumindest dann nicht, wenn es sich nicht gerade um ein Prachtspektrum mit sehr gutem Signal-zu-Rausch-Verhältnis handelt. Man sieht von den vielen hundert Peaks der Häufigkeitsverteilung des Isotopenmusters, die sich bis zum ¹³C₂₅₄ ²H₃₇₉ ¹⁵N₆₅ ¹⁸O₇₅ ³⁶S₆ über insgesamt 872 Masseneinheiten erstrecken, über haupt nur etwa zehn Peaks aus dem Verteilungsmaximum. Es ist daher selbst bei bekannten Substanzen gar nicht so einfach, die einzelnen Peaks wirklich den richtigen Isotopenzusammen setzungen und damit den wahren Massen zuzuordnen. Kalibrierfehler können so leicht vor kommen. Noch schwieriger ist die Bestimmung der monoisotopischen Masse für unbekannte Ionen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren für die präzise Lagebestimmung von Ionen massensignalen zu finden, das den Methoden der Schwerpunktbestimmung oder Kurvenanpas sungen einzelner oder auch mehrerer einzelner Massensignale überlegen ist und als Grundlage für präzise Kalibrier- und Meßverfahren benutzt werden kann. Es ist eine Nebenaufgabe der Erfindung, für schwere Ionen eine automatische Erkennung der Lage des monoisotopischen Peaks zu erreichen.

Beschreibung der Erfindung

Es ist die Grundidee der Erfindung, nicht wie bisher eine einzige glockenförmigen Funktions kurve in ein gemessenes Signalprofil eines einzelnen Ionenpeaks mathematisch einzupassen, sondern gleichzeitig in einem einzigen Optimierungsvorgang eine ganze Schar von Glocken kurven bekannter Massenabstände und bekannter Breitenverhältnisse in ein gemessenes Si gnalmuster aus mehreren Ionenpeaks. Es ist für das Verfahren nach dieser Erfindung erforder lich, die wahren Massenabstände (und damit die Lageabstände) der einzelnen Ionenpeaks in zumindest sehr guter Näherung zu kennen, um feste Lageabstände der Glockenkurven vonein ander vorgeben zu können. Auch die Breitenverhältnisse der Glockenkurven müssen vorher bekannt sein, oft können die Breiten als praktisch gleich angesehen werden. Es ist dabei nicht erforderlich, die wahren Höhen der Glockenkurven zu kennen, diese können notfalls den Mes sungen entnommen werden.

Dabei ist die mathematisch einzupassende Funktion durch einfache Addition aus mehreren Glockenkurven zusammenzusetzen, die im einfachsten Fall alle gleiche Breite haben, deren Abstände die wahren Massenabstände und deren Höhen - wiederum im einfachsten Fall - die gemessenen Peakhöhen repräsentieren. Der Prozeß der mathematischen Anpassung besteht - wiederum im einfachsten Fall - aus einer Minimierung der Summe der quadrierten Abweich nungen zwischen Funktionskurve (additiv zusammengesetzter Glockenkurve) und gemessenem Ionenstromprofil, wobei nur die Lagekoordinate (Orts-, Frequenz- oder Zeitkoordinate der mathematischen Funktion) und ein Breitenfaktor für die Glockenkurven variiert werden (im Falle gleich breiter Glockenkurven die Breite selbst).

Als Glockenkurve kann beispielsweise sehr einfach eine Verteilungsfunktion nach Gauß be nutzt werden. Die Optimierung kann auf Profilwerte oberhalb einer Schwelle beschränkt wer den, um das Rauschen des Untergrundes zwischen den Peaks nicht in die Optimierung einzu beziehen.

Die optimal angepaßte Schar aus Glockenkurven ergibt dabei mit hoher Präzision die Lageko ordinate für einen ausgewählten Peak aus dem Muster (und damit auch die Lagekoordinaten aller anderen Peaks des Musters). Die Präzision ist weit höher als die bisher bekannter Verfah ren, selbst wenn sich diese auf einen Mittelwert über die Einzellagenbestimmungen mehrerer Ionenpeaks beziehen. Der Grund für diese Verbesserung liegt darin, daß in die mathematisch einzupassende Funktion aus Glockenkurven die physikalisch vorgegebenen Massenabstände und die ebenfalls physikalisch vorgegebenen Breitenverhältnisse vorher hineingesteckt werden. Bei einer sonst üblichen Optimierung einzelner Ionenpeaks werden diese eigentlich vorher be kannten Abstände als unnötige und mit Unsicherheiten behaftete Nebenresultate gewonnen, ähnliches gilt für die Breiten der Ionenpeaks.

Aus der Breite der optimal eingepaßten Glockenkurven ergibt sich bei der erfindungsgemäßen Methode als Nebenresultat die Massenauflösung. Aus der Anpassungsgüte kann man als weite res Nebenresultat einen Gütefaktor erhalten, der automatisch die Präzision der Lagekoordinate, und damit die Güte der Massenbestimmung in diesem Individualfall, wiedergibt.

Im Falle von Isotopenmustern kann man die wahren Massenabstände der Peaks und ihre Häu figkeitsverteilung aus berechneten Isotopenmustern bestimmen. Dazu müssen allerdings die Zusammensetzungen der Substanzen aus den Elementen vorher bekannt sein, gerade bei unbe kannten Substanzen ist das aber nicht der Fall. Häufig kann man aber die Substanz einer chemi schen Klasse von Substanzen mit annähernd konstanten prozentualen Anteilen an Elementen zuordnen. Aus dieser läßt sich bei grober Kenntnis der Masse der Ionen ein Isotopenmuster berechnen, dessen Massenabstände den wahren Abständen in außerordentlich guter Näherung entsprechen. Schwankungen in der Zusammensetzung schlagen sich nur äußerst geringfügig auf die Massenabstände nieder. Die berechnete Häufigkeitsverteilung ist durch Schwankungen der Elementzusammensetzung etwas stärker betroffen, aber diese spielt bei der erfindungsge mäßen Lagebestimmung eines Peaks eine untergeordnete Rolle.

Für die näherungsweise Berechnung des Isotopenmusters kann man für die Substanzen einer chemischen Klasse Annahmen über die Anteile an Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stick stoff und anderer Elemente machen, beispielsweise durch die Berechnung von mittleren pro zentualen Gehalten. Als eine chemische Klasse kann man beispielsweise die Proteine ansehen, deren Zusammensetzung aus Aminosäuren eine zumindest grob gleiche statistische Zusammen setzung aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff zeigt. Diese grobe Gleichheit der prozentualen Zusammensetzung genügt für dieses Verfahren durchaus und liefert erstaun lich gute Resultate für die Massenbestimmung.

Weitere chemische Klassen in diesem Sinne sind beispielsweise DNA (Polymere der vier Des oxyribonukleinsäuren allen Genmaterials), die einen zusätzlichen Anteil an Phosphor tragen; oder Glycoproteine, deren Kohlenstoff und Sauerstoffanteil höher ist als der reiner Proteine. Auch für polymere Kunststoffe kann man solche statistisch ermittelten Zusammensetzungen erstellen.

Die Berechnung des Isotopenmusters ist durchaus kompliziert, kann aber zum Beispiel in an sich bekannter Weise über eine Fourier-Transformation erhalten werden. Es können diese Be rechnungen für eine chemische Klasse als Funktion der Masse in gewissen Massenabständen einmalig durchgeführt, in Tabellen abgespeichert, und in Zukunft immer wieder benutzt wer den.

Bei der Benutzung berechneter Isotopenverteilungen ergibt sich nun ganz automatisch ein weiterer, unschätzbarer Vorteil: es wird automatisch die Lage des monoisotopischen Peaks erkannt und dessen Masse berechnet. Das ist selbst dann der Fall, wenn dieser Peak gar nicht im gemessenen Isotopenmuster sichtbar wird. Die Sicherheit im Auffinden des monoisotopi schen Peaks ist sehr hoch.

Eine überraschend starke Vereinfachung dieses Verfahrens mit trotzdem sehr guten Resultaten kann man dadurch erhalten, daß man für die Häufigkeitsverhältnisse der Isotopengruppe und für die Berechnung der Abstände nicht alle beteiligten Elemente benutzt, sondern nur und allein den Kohlenstoff, da das Muster der Isotopengruppe vorrangig durch den Kohlenstoff und seine Isotope bestimmt wird. Das gilt allerdings nur, soweit die Moleküle keine doppelisotopischen Elemente wie Chlor, Brom oder Silber mit näherungsweise gleichen Häufigkeiten beider Iso tope enthalten. Für organische Substanzen, die nur Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sau erstoff und Phosphor, ja selbst geringe Anteile an Schwefel enthalten, läßt sich im Massenbe reich von 1000 bis 5000 atomaren Masseneinheiten eine Lagebestimmung des monoisotopi schen Peaks unter alleiniger Berücksichtigung des Kohlenstoffs im Isotopenmuster der Iso topengruppe verblüffend gut durchführen.

Die Häufigkeit I_n des n-ten Kohlenstoffisotops (n = 0, 1, 2...) im Isotopenmuster kann sehr einfach durch eine geschlossene Formel berechnet werden, in die die Zahl N_C der Kohlenstoffa tome und die Häufigkeit H₁₃ (0,0111) des Kohlenstoffisotops ¹³C eingeht:

wobei die Anzahl N_C der Kohlenstoffatome beispielsweise aus der mittleren Anzahl der Koh lenstoffatome A_C pro Aminosäure, der Masse m und der mittleren Masse m_A der Aminosäuren berechnet werden kann:

mit m_A = 117,5 atomaren Masseneinheiten und A_C = 5,25.

Der Abstand der Peaks kann in weiterer Vereinfachung immer konstant gleich 1,003355 ato maren Masseneinheiten (dem Abstand der Kohlenstoffisotopen) gesetzt werden. Dadurch ist die Anpassung relativ einfach und schnell zu berechnen, als einzige Anpassungsvariable werden der Lageparameter und die Breite der Gaußkurven so lange variiert, bis die Summe der qua dratischen Abweichungen ein Minimum annimmt. Dieses Verfahren führt zumindestens im höchstinteressanten Bereich von 1000 bis 5000 atomaren Masseneinheiten zu überraschend guten Ergebnissen, da hier die Einflüsse der Nicht-Kohlenstoff-Elemente auf die Häufigkeits verteilung und auf die Genauigkeit der Lagebestimmung sehr gering sind.

Es ist daher keine Verbesserung der präzisen Lageberechnung zu erwarten, wenn man auch noch den mittleren Kohlenstoffanteil bei der Peakanpassung mit variiert. Es kann aber (vor allem im höheren Massenbereich) damit gerechnet werden, daß bei einer grob falschen Häufig keitsverteilung eine falsche Anpassung der Glockenkurven insofern passiert, daß die Verteilung um eine ganze Massenzahl falsch eingepaßt wird. Dagegen hilft nur eine Verbesserung der Berechnung der Häufigkeitsverteilung.

Eine einfache Methode zur Berechnung einer deutlich "richtigeren" Häufigkeitsberechnung besteht darin, die Häufigkeitsberechnung nach wie vor nur aus dem Kohlenstoff zu berechnen, aber die mittlere Zusammensetzung aus den Elementen durch eine leichte, fiktive Erhöhung der Häufigkeit H₁₃ des ¹³C-Isotops zu berücksichtigen. Die normale Häufigkeit dieses Isotops 13 mißt 1,108% der Häufigkeit des ¹²C-Isotops; eine leichte Erhöhung (auf Werte von 1,2 bis 1,4%) führt zu einer erwünschten Verbreiterung der Häufigkeitsverteilung. Dabei darf der prozentuale Kohlenstoffanteil praktisch nicht verändert werden; allein die Erhöhung des ¹³C- Anteils bewirkt die gewünschte Änderung der Verteilung in Anpassung an die Anwesenheit der anderen Elemente. Man kann aber in ähnlicher Weise auch eine extrem schwache, fiktive Kor rektur (Verringerung) des Massenabstands vornehmen, der für Kohlenstoff 1,003355 atomaren Masseneinheiten beträgt. Die Berechnungen der Korrektur (oder die einfachere experimentelle Bestimmung solcher Korrekturen) brauchen für die Substanzen einer chemischen Klasse nur einmalig vorgenommen zu werden. Sie ergeben aber nur im höheren Massenbereich eine Ver besserung gegenüber der sehr einfachen Methode, nur den Kohlenstoff mit unverfälschten Da ten zu benutzen.

Für die Einpassung der Glockenkurven können neben der Suche nach der kleinsten Summe der Abweichungsquadrate auch Korrelationsberechnungen (unter Maximierung der Korrelation) verwendet werden, auch die Einpassung unter Benutzung von Fourier-Transformationen ist möglich. Die Methode der kleinsten Summe der quadrierten Abweichungen hat sich aber bisher am besten bewährt.

Eine andere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es sich bei der Peakgruppe nicht um eine Isotopengruppe, sondern um verschiedene Polymere einer Substanz handelt (beispielsweise um Monomer, Dimer, Trimer der Matrixsubstanz in der MALDI- Flugzeitmassenspektrometrie). Auch ein Fragmentmuster kann verwendet werden. In beiden Fällen ist wiederum der zusätzliche Einbezug von Isotopenmustern möglich.

Eine weitere Anwendung besteht darin, die Gruppen von vielfach geladenen Molekülionen mit heranzuziehen, wie sie beispielsweise bei der Elektrosprüh-Ionisierung gebildet werden. Hier sind allerdings nicht die Massenabstände, sondern prinzipiell die ganzzahligen Verhältnisse der Massen zu ihren Ladungen vorbekannt (abgesehen von der jeweils zusätzlichen Anbindung eines Protons pro Ladung). Auch hier lassen sich die Isotopenmuster mit einbeziehen. Als Ne benresultat erhält man hier das Molekulargewicht des Neutralmoleküls.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt Ergebnisse einer Lagebestimmung der Molekülionen des Rinderinsulins in einem Flugzeitspektrum. Es wurde die stark vereinfachte Methode benutzt, die nur die Häufigkeiten der Kohlenstoffatome benutzt (relative Häufigkeit von C¹³ = 1.1122%) und die Massenabstän de gleich dem Abstand der Kohlenstoffisotope setzt. Es wurden hier (richtig) zu 5,25 Kohlen stoffatome pro Aminosäure angenommen, die Häufigkeitsverteilung ist daher wegen der Nichtberücksichtigung der anderen Elemente zu schmal. Die berechnete Flugzeit für den mo noisotopischen Peak beträgt hier 103056.855 Nanosekunden.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer gleichen Lagebestimmung, jedoch unter der Annahme von nur 8,25 Kohlenstoffatomen pro Aminosäure, um zu einer breiteren Verteilung zu kommen. Die Flugzeit des monoisotopischen Peaks wurde hier zu 103056.798 Nanosekunden berechnet und ist auf besser als 0,05 Nanosekunden genau, obwohl für die Messungen ein Transientenre korder mit nur 4 Gigahertz benutzt wurde.

In Fig. 3 wurde eine fiktive Häufigkeit des Kohlenstoffisotops 13 zu 1,6% angenommen, um die Anteile an Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel zu berücksichtigen. Die berechnete Vertei lung paßt sich (ähnlich wie in Fig. 2) quantitativ wesentlich besser in die gemessene ein, ob wohl der richtige Kohlenstoffanteil von 5.25 Kohlenstoffatomen pro Aminosäure angenommen wurden. Die Flugzeit der monoisotopischen Ionen wurde zu 103056.807 Nanosekunden be rechnet und stimmt sehr gut mit der Flugzeit aus Fig. 2 überein.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen

Eine besonders interessante Anwendung findet die erfindungsgemäße Methode bei der Auf nahme von Massenspektren großer, organischer Moleküle in Flugzeitmassenspektrometern. Es treten hier im Massenbereich von 1000 bis 10000 atomaren Masseneinheiten Isotopenmuster mit einer größeren Anzahl von 3 bis 30 Isotopenpeaks oberhalb einer Schwelle von etwa 5% der häufigsten Ionensorte. Diese Ionenpeaks lassen sich hervorragend für diese Methode nut zen.

Im einfachsten Fall kann man die Optimierung unter folgenden Verhältnissen durchführen:

a) die mathematisch eingepaßte Kurve besteht aus einer additiven Überlagerung von gleich breiten Gaußkurven;
b) die Häufigkeitsverteilung der Isotopenpeaks wird nur mit den beiden Kohlenstoffisotopen und mit einen prozentual für die chemische Klasse festgelegten Kohlenstoffanteil berechnet;
c) für die Massenabstände wird der feste Wert von 1,003355 atomaren Masseneinheiten (Abstand der Kohlenstoffisotope) benutzt;
d) es werden nur die Flugzeitkoordinate und die Breite der Gaußkurven für die Optimierung variiert.

Trotz dieser gegenüber der Grundidee der Erfindung extrem vereinfachten Methode werden bereits ganz hervorragende Ergebnisse gewonnen, besonders in dem meist interessierenden Massenbereich von 1000 bis 5000 atomaren Masseneinheiten, aber durchaus auch darüber hin aus. Dabei braucht nicht einmal die Abschätzung des Kohlenstoffanteils sehr gut zu sein. Die Fig. 1 und 2 zeigen Ergebnisse für Rinderinsulin, die unter sehr verschiedenen Annahmen über den Kohlenstoffgehalt gewonnen wurden. In Fig. 1 wurden 5,25 Kohlenstoffatome pro Aminosäure angenommen, in Fig. 2 dagegen 8,25 Kohlenstoffatome. Die Bestimmung der Flugzeit weicht für diese beiden Fälle nur um 0,057 Nanosekunden voneinander ab (0,6 ppm der Flugzeit). In beiden Fällen wurde die Lage des monoisotopischen Peaks richtig gefunden, obwohl die Anpassung über insgesamt fünf atomare Masseneinheiten variiert wurde und somit zu falschen Zuordnungen einlud.

Die Genauigkeit der Massenbestimmung unter Anwendung dieser extrem einfachen Methode liegt bei einigermaßen rauschfreien Spektren im allgemeinen unter 1 ppm (parts per million) der zu bestimmenden Masse. Außerdem gibt diese Methode praktisch irrtumsfrei die Masse des monoisotopischen Peaks wieder.

Die Resultate können verbessert werden, indem in die Häufigkeitsberechnung die Isotopenver hältnisse unter Einbeziehung aller beteiligten Elemente und ihrer mittleren Häufigkeiten vorge nommen wird. Die Berechnung wird dann aber kompliziert, zumal die Auflösung dann in Breiten und Höhen der einzelnen Massenpeaks eingeht und nicht mehr alle Massenpeaks die gleiche Breite haben. Die Berechnungen brauchen allerdings für eine chemische Klasse nur einmal für eine Reihe von abgestuften Massen durchgeführt zu werden. Die Tabellen der Häu figkeiten werden abgespeichert und später für die Optimierungen genutzt.

Eine einfachere Methode besteht darin, die anderen Elemente dadurch zu berücksichtigen, daß man fiktiv die Häufigkeit des ¹³C-Isotops erhöht und die Abstände der Massenpeaks voneinan der geringfügig verringert. Die Häufigkeitsverteilungen werden dadurch breiter und nähern sich der gemessenen Häufigkeitsverteilung besser an. Die fiktiven Änderungen kann man zwar be rechnen, aber es ist bedeutend einfacher, sie experimentell (durch Ausprobieren) zu bestimmen.

Das Verfahren der Suche nach der kleinsten Summe der quadrierten Abweichungen wird hier als bekannt vorausgesetzt. In der Nähe des Minimums der Summe besteht eine parabolische Abhängigkeit von der Lagekoordinate. Die Enge oder Weite der Parabel beschreibt dabei, wie präzise die Lagekoordinate bestimmt werden kann. Ein sehr enge Parabel ergibt eine hohe Präzision, eine sehr weite Parabel eine geringe Präzision. Die Enge der Parabel in ihrem Mini mum kann sehr leicht über die zweite Ableitung der Summe nach der Lagekoordinate (oder bei konkret berechneten Summen) über den zweiten Differenzenquotienten bestimmt werden. Die se zweite Ableitung beschreibt die Krümmung der Parabel in ihrem Minimum. Der zweite Dif ferenzenquotient stellt somit einen Gütewert dar, der die individuelle Präzision der Lagebe stimmung, und damit der später aus der Lagebestimmung gewonnenen Massenbestimmung wiedergibt. Der Gütewert ist einem Fehlerintervall für die Bestimmung der Lagekoordinate umgekehrt proportional. Aus diesem Gütewert kann beispielweise ein Genauigkeitsintervall berechnet werden, in dem mit einer vorgegeben Wahrscheinlichkeit die richtige Masse liegt.

Das Verfahren einer Massenbestimmung auf der Grundlage dieser Erfindung erlaubt es daher, selbst komplizierte Massenspektren in intelligenter Weise zu einfachen Substanzpeaklisten zu reduzieren, wobei in den Listen

1. nur noch die monoisotopischen Peaks gelistet werden (stark vereinfachtes Spektrum),
2. sehr genaue Massen für diese monoisotopischen Peaks angegeben werden können,
3. integrierte Intensitäten aus den Isotopengruppen angegeben werden, und
4. jeder Eintrag mit einem individuellen Gütewert für die Genauigkeit der Massenbestimmung versehen ist.

Es brauchen aber nicht die Isotopenmuster zu sein, die als Grundlage für dieses Verfahren die nen. Es können genausogut bekannte Fragmentierungsmuster oder bekannte Verteilungen von Polymeren benutzt werden. Wenn die Massen der einzelnen Ionen sehr weit auseinanderliegen, werden dabei die Peakbreiten nicht mehr als identisch angenommen werden können, meist sind aber die Verhältnisse der Peakbreiten aus den theoretischen Grundlagen der betreffenden mas senspektrometrischen Methode bekannt.

Einen besonderen Fall bieten die Serien aus vielfach geladenen Ionen verschiedener Ladungs zustände, die durch das Ionisierungsverfahren des Elektrosprühens erzeugt werden. Hier sind nicht die Massenabstände, sondern die Massenverhältnisse konstant, und selbst diese nicht ge nau, weil für jede zusätzliche Ladung auch ein zusätzliches Proton als Masse hinzutritt. Trotz dem wird es jedem Fachmann auf diesem Gebiet gelingen, aus der erfindungsgemäßen Grundi dee auch für diesen Fall die richtige Berechnungsmethode zu entwickeln. Es müssen die Gloc kenkurven dazu aus den Serien mit den Masse-zu-Ladungsverhältnissen (m + n)ⁿ⁺ erstellt wer den, wobei m die Masse der Moleküle und n die Anzahl von zusätzlichen Protonen ist. Für die Breiten der Ionenpeaks müssen wieder die theoretischen Grundlagen für das betreffende Mas senspektrometer, eventuell aber auch Erfahrungswerte, herangezogen werden. Für die Intensi tätsverteilungen können die gemessenen Werte genommen werden.

Sowohl die Serien von Fragmentionen, Polymerionen oder Ladungszustandsionen können je weils mit Isotopenhäufigkeitsmustern kombiniert werden.

Mit dem Verständnis der Grundidee dieser Erfindung wird es jedem Fachmann auf diesem Ge biet möglich sein, für eine analytische Aufgabe das jeweils beste Verfahren für die Bestimmung präziser Massen zu finden und auszuführen.

Verfahren nach der Grundidee dieser Erfindung lassen sich auch leicht in Software-Auswerte programme für Massenspektren integrieren. Der Benutzer braucht dann letztendlich nur noch die chemische Klasse der untersuchten Substanzen und die Art der Peakgruppen anzugeben, um zu einer vollautomatischen Auswertung der Spektren bis zu reduzierten Peaklisten zu ge langen.

Claims

1. Verfahren für die präzise Lagebestimmung eines Ionenpeaks innerhalb eines massenspek trometrisch gemessenen Massenspektrums als Grundlage für eine präzise Massenbestim mung der Ionen dieses Ionenpeaks, wobei das Massenspektrum als Serie digitalisierter Io nenstrommeßwerte mit aus dem Untergrundrauschen herausragenden Peakprofilen vor liegt und der Ionenpeak einer Peakgruppe angehört, deren Massenabstände und Breiten verhältnisse bekannt sind, dadurch gekennzeichnet, daß in das Profil der Ionenstrommeßwerte über die Peakgruppe hinweg durch eine mathe matische Optimierungsmethode eine Kurve eingepaßt wird, die aus additiv überlagerten Glockenkurven besteht, deren Abstände den bekannten Massenabständen und deren Breitenverhältnisse den bekannten Breitenverhältnissen entsprechen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als mathematische Optimie rungsmethode die Methode der Minimalisierung der Summe der Quadrate aller Abwei chungen zwischen Kurvenfunktionswerten und Ionenstrommeßwerten benutzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Bildung der Abwei chungsquadrate nur Ionenstrommeßwerte über einem frei gewählten Schwellenwert be nutzt werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Glockenkurve eine Verteilungskurve nach Gauß benutzt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß (1) die Höhen der Glockenkurven den gemessenen Peakhöhen entsprechen,
daß (2) die Breiten für alle Glockenkurven als gleich angenommen werden, und
daß (3) für die Einpassung lediglich die Lagekoordinate im Spektrum (je nach Art der Spektrennahme die Orts-, Frequenz- oder Zeitkoordinate) und die Breite der Glockenkur ve variiert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 unter Benutzung einer "Isotopengruppe" genannten Peakgruppe, die aus Ionen gleicher Elementzusammensetzung, aber verschie dener Zusammensetzung aus Isotopen bekannter Häufigkeitsverhältnisse besteht, dadurch gekennzeichnet,
daß (1) die Höhen der Glockenkurven den aus einer geschätzten Elementzusammenset zung berechneten Häufigkeiten der Isotopengruppe entspricht,
daß (2) die Breitenverhältnisse der Glockenkurven den berechneten Linienbreitenverhält nissen in der Isotopengruppe entsprechen, und
daß (3) für die Einpassung lediglich die Lagekoordinate im Spektrum und ein gemeinsa mer Faktor für die Breite der Glockenkurven variiert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Breiten der Glockenkurven näherungsweise als gleich angenommen werden.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß für die Berechnung der Häufigkeitsverteilung nur die Isotope des Kohlenstoffs und ein geschätzter prozentualer Gehalt der Substanz an Kohlenstoff in den Ionen benutzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß für die Abstände der Massen peaks der Ionen einer Isotopengruppe näherungsweise ein fester Abstand (beispielsweise der Abstand 1,003355 atomare Masseneinheiten der Kohlenstoffisotope) benutzt wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für Schätzung der Zusammensetzung aus den Elementen die mittlere Zusammenset zung der Substanzen einer chemischen Klasse genommen wird, der die untersuchte Sub stanz angehört.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht- Kohlenstoffelemente einer chemischen Klasse bei der Berechnung der Häufigkeitsvertei lung für diese Klasse dadurch berücksichtigt werden, daß

a) die Häufigkeit des Kohlenstoffisotops 13 als höher angenommen wird, als dem natürli chen Verhältnis entspricht, daß
b) die Abstände etwas geringer angenommen werden, als den natürlichen Kohlenstoffab ständen entspricht, und daß
c) die Häufigkeitsverteilung nur aus dem Kohlenstoff mit den korrigierten Werten für Häufigkeit und Abstand der Isotope berechnet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht- Kohlenstoffelemente einer chemischen Klasse bei der Berechnung der Häufigkeitsvertei lung für diese Klasse dadurch berücksichtigt werden, daß der prozentuale Anteil des Kohlenstoffs als höher angenommen wird, als dem geschätzten Anteil entspricht.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gütewert für die Präzision der Lagebestimmung bestimmt wird, der dem zweiten Diffe renzenquotienten der Summe der quadratischen Abweichungen nach der Lagekoordinate proportional (oder umgekehrt proportional) ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es auf die Gruppe der Fragmentionen, der Polymerionen oder der Ladungszustandsionen an gewendet wird.