DE112009001094T5

DE112009001094T5 - MS/MS-Datenverarbeitung

Info

Publication number: DE112009001094T5
Application number: DE112009001094T
Authority: DE
Inventors: M. M. Savitski; Roman Zubarev
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2008-05-15
Filing date: 2009-05-04
Publication date: 2011-03-03
Anticipated expiration: 2029-05-05
Also published as: DE112009001094B4; WO2009138179A3; CN102017058B; GB2463633A; WO2009138179A2; CA2723928A1; US20180040463A1; WO2009138179A8; GB2463633B; US8481924B2; US20130228678A1; CA2723928C; GB0808876D0; US20110121172A1; CN102017058A; JP2011520129A; US9786476B2; US10224191B2

Abstract

Verfahren zum Identifizieren von Vorläuferionenspezies aus ihren Fragmenten, umfassend:
(a) Bestimmen einer Größe, die die Masse von mehreren Vorläuferionenspezies anzeigt;
(b) Fragmentieren der Ionen der mehreren Vorläuferionenspezies, um mehrere, von den mehreren Vorläuferionen abgeleitete Fragmentionen auszubilden;
(c) gleichzeitige/simultane Massenanalyse der von den mehreren Vorläuferionenspezies abgeleiteten Fragmentionen;
(d) Zuordnen von einem oder mehreren Probensätzen von mehreren Fragmentionenspezies zu einer bestimmten der mehreren Vorläuferionenspezies, wobei der oder jeder Probensatz Fragmentionenspezies enthält, deren kombinierte Masse, wie in Schritt (c) bestimmt, der der bestimmten der Vorläuferprobenionenspezies entspricht, der jene Fragmentionenspezies zugeordnet sind;
(e) für eine oder mehrere der Vorläuferionenspezies, Weiterleiten von Probendaten, die (i) die Masse der in Schritt (a) identifizierten bestimmten Vorläuferprobenionenspezies und (ii) die Masse der mehreren Fragmentionenspezies in dem oder jedem zugeordneten Probensatz für diese bestimmte Vorläuferionenspezies für ein Vergleichsmittel identifizieren zum Vergleich von Größen, die die Masse des Vorläufers und zugeordnete Fragmentionenspezies anzeigen, mit...

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Massenspektrometrie und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren von Vorläuferionenspezies aus ihren Fragmenten (MS/MS-Datenverarbeitung).
Allgemeiner Stand der Technik
Die massenspektrometrische Analyse von Molekülen wird durch die Anwesenheit von vielen verschiedenen Molekülen mit sehr ähnlichen Masse-Ladungs-Verhältnissen erschwert. Es wurden Fragmentierungstechniken entwickelt, um das Identifizieren von verschiedenen Elternmolekülen zu unterstützen, indem die Masse-Ladungs-Verhältnisse ihrer charakteristischen Fragmente gemessen werden. Ionen eines Moleküls von Interesse werden anhand eines masseselektiven ionenoptischen Geräts nach Masse-Ladung ausgewählt, zusammen mit anderen Molekülionen, die ein sehr ähnliches Masse-Ladungs-Verhältnis aufweisen. Diese Ionen werden als die Eltern- oder Vorläuferionen bezeichnet. Diese Elternionen werden dann über einen oder mehrere Prozesse fragmentiert, und die fragmentierten Ionen werden dann einer Masseanalyse unterzogen – wodurch man ein sogenanntes MS/MS-Massenspektrum erhält. Moleküle unterschiedlicher Struktur fragmentieren in der Regel unter Ausbildung unterschiedlicher Fragmentionen, und die Elternmoleküle können identifiziert werden, indem die Masse-Ladungs-Verhältnisse von jenen Fragmentionen untersucht werden.
Wenn die Fragmentmassenspektren auch Interferenzen enthalten oder wenn eine größere Informationsmenge erforderlich ist, als in dem MS/MS vorliegt, können weitere Fragmentierungsstadien verwendet werden, wodurch MS^n Massenspektren erzeugt werden. Es wurden Bibliotheken von Proteinsequenzen entwickelt, und diese werden durchsucht, wobei für den Zweck entwickelte Algorithmen verwendet werden, um die Fragmentionenspektren mit wahrscheinlichen Elternmolekülen abzugleichen.
Dies ist ein wichtiges und weit verbreitetes Verfahren bei der organischen Massenspektrometrie. Es besitzt jedoch gewisse Nachteile, was die Anforderung nach mehr als einem massenselektiven Schritt betrifft. Diese Anforderung vergrößert die Komplexität der zum Durchführen des Verfahrens erforderlichen Instrumentierung und verlängert die Analysezeit.
Neben der Verwendung der Technik der Ionenfragmentierung, damit ein Elternmolekülion identifiziert werden kann, kann ein Massenspektrometer mit hoher Massenauflösung verwendet werden, um zwischen Molekülionen mit sehr ähnlichen Masse-Ladungs-Verhältnissen zu unterscheiden. Solche Spektrometer mit hoher Massenauflösung sind jedoch in der Regel sehr teuer und oftmals (wegen der längeren Messzeiten) sehr viel langsamer als ihre Pendants mit niedrigerer Auflösung.
Falls die Fragmentionenmassenspektren eine hohe Auflösung und eine hohe Massengenauigkeit aufweisen, kann der Abgleich zwischen den Fragmentionen und wahrscheinlichen Elternmolekülen mit einem höheren Konfidenzgrad erfolgen. Um große Molekülionen höchst effektiv zu identifizieren, verwenden die Analytiker oftmals eine Kombination aus Massenspektrometrie mit hoher Auflösung und Fragmentierungsverfahren. Das Kombinieren der beiden Verfahren führt jedoch zu einer noch längeren Analysezeit.
Verfahren wie die oben umrissenen werden routinemäßig für Proben verwendet, die Proteine enthalten. In der Regel werden die Proteine aufgeschlossen, um Peptide zu erzeugen, und diese werden ionisiert und in das Massenspektrometer gegeben.
Das Targetprotein oder die Targetmischung (zum Beispiel ein Zelllysat) wird vorverarbeitet. Die Vorverarbeitung kann Filtern oder Reinigen beinhalten. Es wird dann mit einem geeigneten Spaltungsreagens aufgeschlossen. Das am häufigsten verwendete ist das Enzym Trypsin, doch werden auch andere wie etwa Chymotrypsin, Cyanogenbromid, Iodosobenzoat verwendet. Nach dem Aufschließen und möglichen Reinigen wird die Mischung einem Massenspektrometer, üblicherweise nach einer chromatischen Trennung, zugeführt. Die chromatische Trennung begrenzt üblicherweise die für den Tandem-Massenspektrometrieprozess zur Verfügung stehende Zeit. Die Chromatographiezeiten pro Peak liegen im Bereich von 30 Sekunden bis weniger als einer Sekunde, wobei der Trend zu schnelleren Zeiten geht.
Anfänglich wird ein ganzes Massenspektrum genommen, wodurch ein sogenanntes Vorläuferionenspektrum erzeugt wird. Fragmentionenspektren können für jede Ionenspezies in dem Vorläuferionenspektrum erhalten werden (datenunabhängige MS/MS). Alternativ ist ein häufig genutzter Ansatz die „datenabhängige” MS/MS. Bei diesem Verfahren wird ein ganzes Spektrum erfasst und danach werden der eine oder mehrere intensivste Peaks üblicherweise automatisch gewählt und nacheinander einer MS/MS-Fragmentierung unterzogen. Die Vorläufer- und Fragmentspektren werden gespeichert. Zu verschiedenen Verbesserungen daran zählen: vorübergehendes Blacklisten von Vorläufern, um eine erneute Messung von intensiven Ionen zu vermeiden; permanentes Blacklisten von Vorläufern, um eine Sammlung von MS/MS-Daten von wohlbekannten Peptiden oder Lösemittelkomponenten zu vermeiden; das Whitelisten von interessierenden Massen, um eine Fragmentierung selbst dann zu gestatten, wenn die intensivsten Kriterien nicht erfüllt sind. Mit diesem Ansatz der datenabhängigen MS/MS gibt es jedoch zwei Probleme. Erstens können verschiedene Durchläufe der einen Probe sehr verschiedene Ergebnisse erzeugen, weil beispielsweise selbst kleine Variationen bei Peakhöhen in den Vorläuferionenspektren dazu führen können, dass automatisch verschiedene Entscheidungen getroffen werden, was zu der Auswahl von verschiedenen Vorläuferionenspezies für die Fragmentierung führt. Zweitens ist in vielen Fällen möglicherweise wegen des vorausgegangenen Chromatographieprozesses nicht ausreichend Zeit, um alle interessierenden Ionen innerhalb des Zeitfensters zu fragmentieren.
Der datenabhängige Prozess nach dem Stand der Technik, bei dem zwei Vorläuferionen für MS/MS ausgewählt werden, ist als ein Beispiel in dem Flussdiagramm von 1 gezeigt.
Nach oder manchmal während der Messung werden die erfassten Daten evaluiert. Dazu sind viele Verfahren bekannt, wie etwa (1) „De-Novo-Sequenzierung”, bei der direkt aus den Spektren auf die Aminosäuresequenz geschlossen wird; (2) „Sequenz-Tagging”, bei dem aus den Spektren nur auf einen Teil der Aminosäuresequenz direkt geschlossen wird, und diese kleinen Sektionen („Tags”) werden in einer Datenbanksuchroutine verwendet; (3) eine direkte Datenbanksuche wird durchgeführt, wobei lediglich die Fragmentionenspektren verwendet werden.
Eine Datenbanksuche wird durchgeführt, um Fragmentionen mit ihren wahrscheinlichen Peptidvorläufern abzugleichen. Zur Durchführung der Suchen wurden automatische Routinen entwickelt. Das Ergebnis ist eine Liste von wahrscheinlichen Vorläufern mit einem Wert, der die Konfidenz bei der Abgleichung bezeichnet. Optional kann die zu durchsuchende Datenbank von dem Benutzer vorgewählt werden, der die Suche auf Peptidvorläufer begrenzen kann, die als relevant bekannt sind, wie etwa beispielsweise jene für Hefen, wo bekannt ist, dass die Probe von einer Hefe gekommen ist. Alternativ kann die Computersuche auch Proteinwerte liefern, die aus den Peptidwerten berechnet wurden, um eine Anzeige der in der voraufgeschlossenen Probe enthaltenen wahrscheinlichen Proteine zu liefern. Der Suchalgorithmus liefert in der Regel eine nach Werten sortierte Liste der Protein- oder Peptidkandidaten zusammen mit ihren Werten. Die Interpretation wird dann in der Regel dem Benutzer überlassen.
Der Standardansatz besteht darin, eine Peakliste jedes der MS/MS-Spektren mit der jeweiligen Vorläufermasse (dies ist üblicherweise die Masse, die bei dem datenabhängigen Aufbau das MS/MS-Ereignis ausgelöst hat) einer „Suchmaschine” zum Vergleich mit einer Datenbank zu unterbreiten. Normalerweise erfolgt keine Prüfung auf mehr als einen Vorläufer in dem Massenauswahlfenster. Viele Datenbanken von Proteinen sind öffentlich zugänglich. Einige von ihnen enthalten direkt Proteine aus einer vorausgegangenen Analyse, andere wie etwa SwissProt (http://expasy.org/sprot/), sind Computerübersetzungen von Gensequenzen.
Da das Endziel der Suchmaschine darin besteht, ein oder mehrere Proteine zu finden, die sich nach Bestimmung in der Analytmischung befinden, werden die Proteine in einer Datenbank „elektronisch aufgeschlossen” zu Peptiden mit Eigenschaften, die dem von dem Benutzer gewählten Trennungsreagens entsprechen. Diese „in silico Aufschließung” kann im laufenden Betrieb oder als ein „Indexierungsschritt” erfolgen, bevor die eigentliche Suche durchgeführt wird. Alle Peptide, die der Vorläufermasse innerhalb eines Toleranzfensters entsprechen, das von dem Benutzer definiert wird oder das aus den Daten abgeleitet wird, werden als „Kandidaten” angesehen. Fragmentionen von diesen Kandidaten werden dann vorhergesagt. Werte werden mit diesen Kandidaten auf der Basis der MS/MS-Daten assoziiert, wobei sich ein höherer Wert ergibt, wenn das MS/MS-Fragmentionenspektrum die vorhergesagten Fragmente der vorhergesagten Kandidaten enthält.
Der Datenbanksuchprozess nach dem Stand der Technik ist als ein Beispiel in dem Flussdiagramm in 2 gezeigt.
Falls absichtlich oder unabsichtlich mehr als eine Vorläuferionenspezies zur gleichen Zeit zur Fragmentierung gewählt wird, wird das Fragmentionenspektrum komplexer sein und die Ergebnisse von der Datenbanksuchmaschine werden weniger präzise sein.
Die in 1 und 2 beschriebenen Prozesse nach dem Stand der Technik sind mit dem Nachteil behaftet, dass die Zeit zur Erlangung der wertesortierten Liste von wahrscheinlichen Peptiden langsam ist, selbst wenn diese datenabhängigen Verfahren verwendet werden, weil jedes interessante Vorläuferion alleine gewählt und individuell fragmentiert werden muss und die resultierende Ionenmasse sequenziell analysiert werden muss, bevor sie unter Einsatz von standardmäßigen Suchmaschinentechniken verarbeitet werden können. Dies ist kostspielig, da die Instrumentenzeit teuer ist, und es ist verschwenderisch, da während des Prozesses relativ große Anteile der Probe (die möglicherweise nur in sehr kleinen Größen existiert) verbraucht werden.
Ein besonderes Verfahren zum Verbessern des Durchsatzes wird von Masselon und Smith in Analytical Chemistry, Band 72, Nr. 8, S. 1918–1924, 2000, beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine Form des Multiplexens durchgeführt. Fragmentionen von mehr als einem Vorläufer werden absichtlich in einem einzigen Massenspektrum gemessen, das mit einer sehr hohen Massengenauigkeit genommen wird. Das Fragmentionenspektrum enthält dann Fragmente von mehr als einer Vorläuferionenspezies. Dieses Spektrum wird wie üblich an die Datenbanksuchmaschine geschickt, und das Verfahren basiert auf der hohen Massengenauigkeit des Fragmentspektrums, wodurch die meisten der Fragmentionen einem spezifischen Elternpolypeptid zugeschrieben werden können, wenngleich möglicherweise nicht jede Fragmentionenspezies einem Elternteil zugeordnet werden kann.
Bei dem Verfahren von Masselon und Smith gibt es verschiedene Nachteile. Wenn, wie oben erwähnt, Fragmentionenspektren von mehr als einer Vorläuferionenspezies durch die standardmäßigen Suchmaschinenverfahren verarbeitet werden, sind die Ergebnisse, weil die Fragmentionenspektren komplexer sind, von der Datenbanksuchmaschine weniger genau, wenngleich eine hohe Massengenauigkeit verwendet wurde. Zudem sind nicht nur die Werte weniger genau, es kommt auch zu einer weit größeren Anzahl von falschen positiven Identifikationen. Wegen der Komplexität der Fragmentionenspektren ist die Geschwindigkeit der Suchmaschine stark reduziert.
Die vorliegende Erfindung versucht, diese und andere Probleme mit der MS/MS-Datenverarbeitung zu lösen.
Kurze Darstellung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund und gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Vorläuferionenspezies aus ihren Fragmenten bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

(a) Bestimmen einer Größe, die die Masse von mehreren Vorläuferionenspezies anzeigt;
(b) Fragmentieren der Ionen der mehreren Vorläuferionenspezies, um mehrere, von den mehreren Vorläuferionen abgeleitete Fragmentionen auszubilden;
(c) gleichzeitige/simultane Massenanalyse der von den mehreren Vorläuferionenspezies abgeleiteten Fragmentionen;
(d) Zuordnen von einem oder mehreren Probensätzen von mehreren Fragmentionenspezies zu einer bestimmten der mehreren Vorläuferionenspezies, wobei der oder jeder Probensatz Fragmentionenspezies enthält, deren kombinierte Masse, wie in Schritt (c) bestimmt, der der bestimmten der Vorläuferprobenionenspezies entspricht, der jene Fragmentionenspezies zugeordnet sind;
(e) für eine oder mehrere der Vorläuferionenspezies, Weiterleiten von Probendaten, die (i) die Masse der in Schritt (a) identifizierten bestimmten Vorläuferprobenionenspezies und (ii) die Masse der mehreren Fragmentionenspezies in dem oder jedem zugeordneten Probensatz für diese bestimmte Vorläuferionenspezies für ein Vergleichsmittel identifizieren zum Vergleich von Größen, die die Masse des Vorläufers und zugeordnete Fragmentionenspezies anzeigen, mit Größen, die die Masse von Ionen in einem oder mehreren Referenzsätzen von Referenzfragmentionendaten bzw. Referenzvorläuferionendaten anzeigen; und
(f) Empfangen von Informationen von dem Vergleichsmittel, die die Ergebnisse des Vergleichs anzeigen, der versuchte, die Vorläuferionenspezies zu identifizieren, denen die mehreren Fragmentprobenionenspezies zugeordnet wurden.

Somit wird wieder das Multiplexen als das Verfahren zum Verbessern des Durchsatzes verwendet, und Fragmentionendaten wie etwa ein Fragmentmassenspektrum wird aus Fragmentionen erhalten, die von mehr als einer Vorläuferionenspezies abgeleitet wurden. Sowohl die Fragmentionendaten als auch die Vorläuferionendaten werden bevorzugt mit einer hohen Massengenauigkeit erhalten (z. B. < 5 ppm, besonders bevorzugt < 2 ppm für die Fragment- und Vorläuferprobenionendaten mit einem Auflösungsvermögen von 100.000 bei FWHM). Anstatt jedoch die Datenbanksuchmaschine an diesen resultierenden Fragmentionendaten einzusetzen, werden sie stattdessen weiter verarbeitet. Bei diesem zusätzlichen Verarbeitungsschritt werden die Fragmentionendaten nach mehreren Fragmenten durchsucht, deren kombinierte Masse der von Vorläuferionenmassen entspricht, die in den Vorläuferionendaten gefunden werden, und zwar innerhalb gewisser Genauigkeitsgrenzen. Die Genauigkeitsgrenzen können beispielsweise aus der Massengenauigkeit der Fragment- und Elternionendaten bestimmt werden. Nachdem ein Satz oder mehrere Sätze von mehreren Fragmentionen mit Vorläuferionenspezies abgeglichen worden sind, werden die Fragmentionendaten in Abschnitte zerlegt, ein Abschnitt für jede Vorläuferionenspezies, und die nur den oder die Sätze von Fragmentionenspezies enthalten, die den jeweiligen Vorläuferionenspezies zugeordnet sind. Dieser Prozess gestattet effektiv bei bevorzugten Ausführungsformen die Rekonstruktion von vereinfachten Fragmentprobenionenspektren aus Vorläuferionenspezies. Ein Fragmentionenspektrum kann beispielsweise für jede Vorläuferionenspezies erzeugt werden, als ob MS/MS-Spektren jeweils nacheinander für jede Vorläuferionenspezies erhalten worden wären. Dieser Prozess schlüsselt den Multiplizierungsprozess auf und behält dennoch den ganzen, durch den Multiplexierungsprozess erhaltenen Geschwindigkeitsvorteil bei. Die resultierenden Probensätze von Fragmentionendaten (beispielsweise aufgeschlüsselte Fragmentionenspektren) werden dann bevorzugt nacheinander an die Datenbanksuchmaschine geschickt, die an jeder die Standarddatenbanksuche durchführt, was bei bevorzugten Ausführungsformen eine wertesortierte Liste von wahrscheinlichen Kandidaten für jedes aufgeschlüsselte Fragmentionenspektrum ergibt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verbessert dadurch die Genauigkeit der Ergebnisse aus der Datenbanksuchmaschine stark. Es verbessert auch stark die Geschwindigkeit der Suche.
Unter dem Ausdruck „zusammen/simultan analysieren” wird verstanden, dass das Verfahren das Durchsuchen der Fragmentionen von mehr als einem Vorläuferprobenion zur gleichen oder im Wesentlichen zur gleichen Zeit beinhaltet (unabhängig davon ob jene Fragmentionen zur gleichen Zeit, durch simultane Fragmentierung von mehreren Vorläufern oder durch Akkumulation von Fragmenten aus sequenzieller Fragmentierung von einem oder mehreren Vorläufern zusammen erzeugt wurden). Insbesondere soll dadurch nicht impliziert werden, dass die tatsächliche Detektion/Identifikation der Fragmentionen als ein einzelnes Ereignis stattfindet. Während im Fall von verschiedenen Arten von Massenspektrometrie wie etwa FT-ICR oder Orbitrap^TM-MS die Fragmentionen zusammen detektiert werden, werden die Ionen bei anderen wie etwa TOF-MS stattdessen sequenziell an einen Detektor ausgestoßen. Dennoch wird die Analyse selbst (vor der Detektion) an Fragmentionen von mehr als einem Vorläufer parallel ausgeführt, um das oben erwähnte Multiplexen zu gestatten.
Zudem ist zu verstehen, dass, wenngleich einige bevorzugte Ausführungsformen die Masse (oder sogar das Masse-Ladungs-Verhältnis m/z) der Vorläufer und/oder Fragmentionen bestimmen, dies für die erfolgreiche Ausübung der Erfindung nicht essenziell ist. Viele verschiedene physikalische Parameter wie etwa unter anderem Flugzeit, Frequenz, Spannung, Ablenkung des Magnetfelds usw. könnten (beispielsweise je nach dem gewählten Verfahren der Ionendetektion) gemessen werden, wobei jeder zu der Ionenmasse oder m/z in Beziehung steht oder eine Ableitung dieser gestattet. Es ist jedoch nicht erforderlich, dass die Masse selbst in jedem Fall berechnet wird; es kann rechnerisch effizienter sein, gemessene Parameter in einem Nicht-Masseraum nicht in Masse umzuwandeln. Zudem wird die in der vergleichenden Datenbank gespeicherte Größe möglicherweise selbst nicht als eine Masse gehalten, sondern stattdessen als eine andere, zu der Masse in Beziehung stehenden Größe. Somit ist der Ausdruck „eine eine Masse anzeigende Größe” allgemein so zu verstehen, dass er Masse und andere Größen umfasst.
Bevorzugt umfasst das Verfahren das Zuordnen von einem oder mehreren Paaren von Fragmentionen zu einer bestimmten Vorläuferionenspezies. Dies kann auf der Basis einer kombinierten Masse der beiden Fragmentionenspezies entsprechend der Masse dieser zugeordneten Vorläuferionenspezies erfolgen, indem man eine Gesamtmasse nimmt, die auf die Masse der Vorläuferionenspezies hinausläuft oder ihr ansonsten entspricht, indem man eine vorbestimmte Offsetmasse von diesem Vorläufer nimmt (z. B. als ein Ergebnis eines neutralen Verlusts von Wassermolekülen während der Fragmentierung). Die Paare von zugeordneten Fragmentierungen können sogenannte „goldene Paare” von Ionen sein, wie über verschiedene Fragmentierungstechniken identifiziert.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung offenbart auch Ionenspezies in den Fragmentprobenionendaten, die keinen Vorläuferionenspezies in dem Vorläuferionenspektrum zugeordnet werden können. Diese Fragmentionenspezies können dann an die Datenbanksuchmaschine geschickt werden oder auch nicht. Falls sie geschickt werden, können sie alleine geschickt werden und werden dann nicht zu der Komplexität der anderen aufgeschlüsselten Fragmentprobenionendaten in den Probesätzen beitragen, wie sie es bei Verfahren nach dem Stand der Technik tun würden.
Die Erfindung kann auch verwendet werden, um die Geschwindigkeits- und Genauigkeitsvorteile mit MS/MS/MS-Techniken oder MSⁿ zu erhalten. Da die Multiplexieranordnung von Masselson und Smith nach dem Stand der Technik tatsächlich sowohl für die Vorläufer- als auch Fragmentionen eine hohe Massengenauigkeit erfordert, ist mit dem Verfahren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung keine zusätzliche Zeitstrafe relativ zu dieser Technik (hinsichtlich Datensammlung) verbunden, während es im Gegensatz eine signifikant höhere Genauigkeit liefert. Natürlich sorgen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung relativ zu vorherigen Verfahren, die nicht versuchten, Vorläufer zu multiplexen, für signifikante Zeiteinsparungen.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den beigefügten Ansprüchen und der folgenden Beschreibung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Flussdiagramm eines datenabhängigen Prozesses nach dem Stand der Technik zum Wählen von zwei Vorläuferionenspezies für die MS/MS-Analyse;
2 zeigt ein Flussdiagramm einer Datenbanksuchprozedur nach dem Stand der Technik;
3 zeigt in Blockdiagrammform einen Überblick auf ein beispielhaftes Massenspektrometer, das sich zum Implementieren des Verfahrens von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eignet;
4 zeigt funktional und schematisch ein zweites beispielhaftes Massenspektrometer, das sich zum Implementieren der Verfahren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eignet;
5 zeigt funktional und schematisch ein weiteres beispielhaftes Massenspektrometer, das sich zum Implementieren des Verfahrens von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eignet;
6 zeigt noch ein weiteres beispielhaftes Massenspektrometer in funktionaler und schematischer Form, gleichermaßen zum Implementieren des Verfahrens von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet;
7 zeigt einen Teil eines Massenspektrums für das Molekül C₂₂H₄₂N₉O₆ und seine Fragmente;
8 zeigt eine grafische Darstellung eines Gütefaktors für die Genauigkeit der Identifikation von Vorläuferionenspezies aus experimentellen Fragmentdaten als Funktion der Anzahl von gemultiplexten Probefragmentdatensätzen bei Verwendung eines Verfahrens nach dem Stand der Technik bzw. eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung;
9 zeigt eine Verteilung von experimentell bestimmten Gütefaktoren für die Genauigkeit der Identifikation von 1000 MS/MS-Spektren, wenn sie individuell erhalten werden und wenn sie durch Multiplexen von Gruppen von 4 Fragmentprobenionendatensätzen zusammen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erhalten werden; und
10, zeigt ein Flussdiagramm einer Prozedur, die das Verfahren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet, für mehrere Fragmentierungsstadien (MSⁿ).
Ausführliche Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sorgen für ein Verfahren zum Identifizieren von Vorläuferionenspezies anhand ihrer Fragmente. Wenngleich die Art und Weise, wie die Fragmentionen erzeugt werden, nicht selbst kritisch ist (und tatsächlich optional andere Fragmentierungstechniken und -energien an den gleichen vorläufigen Ionen eingesetzt werden könnten, um andere Fragmentionspezies zu erhalten), wird dennoch zuerst eine geeignete Technik für die Fragmentierung von Vorläuferprobenionen und die Sammlung von massenspektrometrischen Daten aus einem derartigen Prozess beschrieben, um ein besseres Verständnis der Erfindung zu gestatten. Es wird dennoch betont, dass die folgende Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform einer Anordnung zum Fragmentieren von Vorläuferionen lediglich einen von vielen unterschiedlichen Wegen dafür darstellt und zudem die Art und Weise, wie die Ionen detektiert werden, gleichermaßen in einer Vielzahl unterschiedlicher Wege implementiert werden kann.
Zuerst unter Bezugnahme auf 3 wird ein Massenspektrometer 10 gezeigt. Das Massenspektrometer 10 umfasst eine Ionenquelle 20 zum Erzeugen von Ionen zur Massenanalyse. Die in 3 gezeigte Ionenquelle 20 kann eine gepulste Laserquelle (bevorzugt eine MALDI-Quelle (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation) sein, in der Ionen durch Bestrahlung von einer gepulsten Laserquelle 22 erzeugt werden), eine kontinuierliche Ionenquelle wie etwa eine Elektrosprayquelle bei Atmosphärendruck oder anderweitig sein.
Die Ionen von der Ionenquelle 20 werden in eine Ionenfalle 30 eingeleitet, bei der es sich beispielsweise um einen gasgefüllten HF-Multipol oder einen gekrümmten Quadrupol handeln kann wie beispielsweise in WO-A-2005/124821 und in jüngerer Zeit in WO-A-2008/081334 beschrieben ist, deren Inhalte durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Die Ionen werden in der Ionenfalle 30 gespeichert, und eine Kollisionskühlung der Ionen kann stattfinden, wie beispielsweise in unserer gleichzeitig anhängigen Anmeldung Nr. WO-A-2006/103445 beschrieben ist, deren Inhalte ebenfalls durch Bezugnahme hier aufgenommen sind. Die Speicherung findet in der Ionenfalle 30 statt, bis die HF abgeschaltet wird und eine Gleichspannung an den Stäben angelegt wird. Diese Technik wird ausführlich in unseren gleichzeitig anhängigen Anmeldungen dargelegt, die als GB-A-352,415,541 und WO-A-2005/124821 veröffentlicht sind, deren Einzelheiten in ihrer Gänze durch Bezugnahme hier aufgenommen sind.
In einem ersten Zyklus wird ein Bereich von Vorläuferionen (entweder kontinuierlich über einen Bereich von m/z oder eine Serie von nicht benachbarten Massen) aus der Ionenfalle 30 zu einem Massenanalysator 70 wie etwa Orbitrap, FT-ICR oder einem anderen Analysator mit hoher Massengenauigkeit ausgestoßen. Dies erzeugt ein Vorläuferprobenionenmassenspektrum mit hoher Massengenauigkeit für die in dem ersten Zyklus aus der Ionenfalle 30 ausgestoßenen Vorläuferionen. Das Vorläuferprobenionenmassenspektrum dient mehreren Zwecken. Erstens kann es dazu benutzt werden, eine Teilmenge von zu analysierenden Vorläuferionen zu identifizieren (da wahrscheinlich nicht alle Vorläuferionen für die Analyse von Interesse sind). Zweitens kann durch Erhalten des Vorläuferspektrums mit hoher Genauigkeit ein gemessener Vorläufermassenpeak zur Analyse zusammen mit den Fragmentionendaten gesendet werden, wie weiter unten erläutert.
In einem zweiten Zyklus wird die Ionenfalle 30 von der Ionenquelle 20 erneut gefüllt. Wieder werden die Ionen gekühlt. Dieses Mal jedoch werden, anstatt alle Vorläuferionen zusammen einer Massenanalyse zu unterziehen, individuelle Vorläuferionen zur weiteren Analyse aus dem zuvor erhaltenen Vorläuferprobenionenmassenspektrum identifiziert. Um solche identifizierten Vorläuferionen zu isolieren, wird der Inhalt der Ionenfalle 30 auf gepulste Weise zu einer Ionenwahleinrichtung ausgeworfen, bei der es sich bevorzugt um eine elektrostatische Falle 40 handelt. Die gepulste Auswerfung erzeugt schmale Ionenpakete. Diese werden in der elektrostatischen Falle 40 eingefangen und erfahren darin Mehrfachreflexionen, wie in unserer gleichzeitig anhängigen Anmeldung GP0725066.5 und WO-A-2007/122378 beschrieben ist.
Das Auswerfen aus der Ionenfalle 30 zu der elektrostatischen Falle 40 erfolgt über eine in der 3 nicht gezeigte Ionenoptik mit einer optionalen Steuerung der Anzahl von Ionen, um spätere Probleme mit der Raumladung zu vermeiden.
Nach der Beschleunigung durch die Ionenoptik werden die Ionen in kurze Pakete mit einer Länge zwischen 10 und 100 ns für jedes m/z fokussiert und treten in die elektrostatische Falle 40 ein. Bei jeder Reflexion in der elektrostatischen Falle 40 oder nach einer bestimmten Anzahl von Reflexionen werden unerwünschte Ionen auf gepulste Weise aus der elektrostatischen Falle 40 heraus abgelenkt, beispielsweise zu einem Detektor 75 oder zu einer Fragmentierungszelle 50. Bevorzugt befindet sich der Ionendetektor 75 nahe an der Flugzeit-Brennebene der Ionenspiegel, wo die Dauer der Ionenpakete ein Minimum ist. Somit bleiben nur Ionen von analytischem Interesse in der elektrostatischen Falle 40 zurück. Weitere Reflexionen vergrößern weiterhin den Abstand zwischen benachbarten Massen, so dass eine weitere Verengung des Wahlfensters erreicht werden kann. Schließlich sind alle Ionen mit einem Masse-Ladungsverhältnis in der Nähe des interessierenden Masse-Ladungsverhältnisses m/z eliminiert, wodurch die einzelne Vorläuferprobenionenspezies in der Falle zurückbleibt, die aus dem in dem ersten Analysezyklus erhaltenen Vorläufermassenspektrum identifiziert wurde.
Diese einzelne Vorläuferprobenionenspezies in der elektrostatischen Falle wird dann an eine Fragmentierungszelle 50 ausgeworfen. Bevorzugt ist die Fragmentierungszelle 50 ein segmentierter Nur-HF-Multipol mit einem entlang seiner Segmente erzeugten axialen Gleichfeld. Die gewählten Vorläuferprobenionen werden aus der elektrostatischen Falle 40 mit ausreichender Energie zu der Fragmentierungszelle 50 ausgestoßen, damit sie innerhalb der Fragmentierungszelle 50 fragmentieren können.
Nach der Fragmentierung in der Fragmentierungszelle 50 werden Ionenfragmente von der ersten Vorläuferionenspezies zu einer Hilfsionenspeichereinrichtung 60 transferiert. Hier werden sie gespeichert, während nachfolgende Zyklen stattfinden, wie unten beschrieben.
Nachdem die Fragmentionen von der ersten Vorläuferprobenionenspezies in der Hilfsionenspeichereinrichtung 60 gespeichert worden sind, werden die Schritte für eine zweite Vorläuferprobenionenspezies wiederholt. Insbesondere wird eine zweite Vorläuferprobenionenspezies (bevorzugt wieder auf der Basis des zuvor erhaltenen Vorläuferprobenionenmassenspektrums gewählt) in der elektrostatischen Falle 40 isoliert und dann an die Fragmentierungszelle 50 geschickt und fragmentiert, wobei die Fragmente wie in dem vorausgegangenen Zyklus dann an die Hilfsionenspeichereinrichtung 60 gehen, wo die Fragmente von dem zweiten Vorläuferprobenion zusammen mit den Fragmenten von dem ersten Vorläuferprobenion dort gespeichert werden.
Weitere Zyklen wie oben können ausgeführt werden, und zwar vorbehaltlich der Grenzen der Datenverarbeitung (eine Erörterung dieser folgt unten), vorbehaltlich von Raumladungsbegrenzungen und vorbehaltlich einer Gesamtionenspeicherzeit für die mehreren Fragmentionen in der Hilfsionenspeichereinrichtung 60.
Nachdem die mehreren Fragmentionen in der Hilfsionenspeichereinrichtung 60 akkumuliert worden sind, werden sie zurück zur Ionenfalle 30 ausgestoßen, wobei sie sie über eine andere Öffnung zu der, aus der ihre Vorläufer ursprünglich ausgeworfen wurden, eintreten, wie ausführlich in der oben erwähnten WO-A-2007/122378 beschrieben wird. Von dort werden sie zu einem Massenanalysator mit hoher Massengenauigkeit (zum Beispiel Orbitrap) 70 zur Massenanalyse ausgestoßen. Nachdem die Massenanalyse abgeschlossen ist, werden die aus der Massenanalyse der Vorläuferionen erhaltenen Daten zusammen mit dem aus einer Massenanalyse von allen Fragmentionen zusammen erhaltenen Daten auf eine Weise verarbeitet, die unten zu beschreiben ist. Die Verarbeitung kann entweder lokal, beispielsweise in dem Prozessor eines lokalen Computers stattfinden, der das Massenspektrometer 10 steuert oder damit verbunden ist (nicht gezeigt), kann lokal zur späteren Analyse gespeichert werden und/oder kann als eine oder mehrere Datendateien zu einem abgesetzten Ort zur späteren Verarbeitung dort gesendet werden, wobei die Ergebnisse dieser Verarbeitung dann an den Benutzer des Massenspektrometers 10 zurückgeschickt werden.
Das oben Gesagte beschreibt die Erfassung von massenspektrometrischen Daten aus mehreren Vorläuferprobenionen in einem ersten Zyklus und dann, durch Isolieren jeder Vorläuferionenspezies (aus diesem Vorläuferprobenionenmassenspektrum als interessierend identifiziert) in aufeinanderfolgenden Zyklen, das Akkumulieren der Totalität der Fragmentionen von jeder Vorläuferionenspezies, indem sie zur simultanen/parallelen Analyse ihrer Fragmentmasse-zu-Ladungs-Verhältnisse zusammen gespeichert werden. Es versteht sich natürlich jedoch, dass dies lediglich ein Weg ist, wie mehrere Vorläufer- und Fragmentionen unter Einsatz der unten zu beschreibenden Techniken sofort analysiert werden können. Beispielsweise können alle Vorläuferionen zusammen in einem Schritt isoliert werden, beispielsweise unter Verwendung der in WO-A-2008/059246 beschriebenen Prozedur, deren Inhalt in seiner Gänze durch Bezugnahme hier aufgenommen ist, anstatt individuelle Vorläuferspezies zu isolieren und diese zur Fragmentierung zusammen zu akkumulieren.
Die Wahl von Vorläufern kann auf viele unterschiedliche Weisen erreicht werden, die als datenabhängig oder datenunabhängig klassifiziert werden können. In einem datenunabhängigen Modus beispielsweise kann ein zusammenhängender Massenbereich gewählt werden (der mehrere Ionenspezies enthalten oder nicht enthalten kann). Alternativ kann ein nicht zusammenhängender Massenbereich gewählt werden, das heißt Vorläufer von mehreren nichtbenachbarten Massenfenstern können gewählt werden. Bei einem datenabhängigen Modus kann eine vorbestimmte Anzahl von Vorläuferionenspezies gewählt werden (z. B. 4), und diese können beispielsweise nach Intensität sortiert werden. „Einschlusslisten” und „Ausschlusslisten” können für das Vorläuferauswählen verwendet werden (die Listen werden dem Fachmann vertraut sein), und diese können optional dynamische Listen sein. Es können andere Vorläuferidentifikationskriterien verwendet werden, z. B. Kendrick-Massenoffset („Massendefekt”), Neutralverlust für MS³ und so weiter. Schließlich kann es möglich sein, Vorläufer anfänglich auf der Basis gewisser Kriterien zu wählen und dann einen zusätzlichen „Sicherheits-MS” MSⁿ-Scan der Vorläuferionen durchzuführen, die zurückbleiben.
Hinsichtlich dessen, wie das Multiplexen erreicht wird, ist gleichermaßen zu verstehen, dass sich das Verfahren gleichermaßen sowohl auf die serielle Analyse und Fragmentierung von einzelnen Vorläuferionen (wobei alle die Fragmente zusammen in der Hilfsionenspeichereinrichtung 60 gesammelt werden, wie oben beschrieben) als auch auf die parallele Analyse von mehreren Vorläuferionen (seien sie in einem einzelnen Zyklus oder durch Akkumulation beispielsweise in der Hilfsionenspeichereinrichtung 60 in mehreren aufeinander folgenden Zyklen gewählt), durch Fragmentierung der mehreren Vorläuferprobenionenspezies zusammen als auch auf eine parallele Analyse der dadurch erzeugten mehreren Fragmentprobenionenspezies anwenden lässt.
Wenngleich es wünschenswert, dass die Massenanalyse sowohl von Vorläufer- als auch Fragmentionen mit einer hohen Massengenauigkeit ausgeführt wird, kann dies dennoch an verschiedenen Stellen und auf unterschiedliche Weisen innerhalb der beispielhaften Anordnung von 3 erfolgen. Beispielsweise kann die Masse von in der Ionenfalle 30 gespeicherten Vorläuferionen in der elektrostatischen Falle 40 analysiert werden, indem die Masse aus der Ionenfalle 30 zu der elektrostatischen Falle 40 ausgeworfen wird, die Vorläuferionen dort isoliert werden und sie zu dem Detektor 75 ausgeworfen werden, anstatt sie von der Ionenfalle 30 zu dem Orbitrap oder einem anderen Massenanalysator 70 zu leiten. Lediglich beispielhaft kann der Detektor 75 ein Elektronenvervielfacher oder eine Mikrokanal-/Mikrokugelplatte sein, die eine Einzelionenempfindlichkeit aufweist und zur Detektion von schwachen Signalen verwendet werden kann. Alternativ kann der Detektor ein Kollektor sein und kann somit sehr starke Signale messen (potenziell mehr als 10⁴ Ionen in einem Peak). Es könnte mehr als ein Detektor verwendet werden, wobei Modulatoren Ionenpakete je nach beispielsweise aus dem vorausgegangenen Erfassungszyklus erhaltenen Spektralinformationen zu dem einen oder anderen lenken. Auf diese Weise können Daten mit hoher Massengenauigkeit von den Vorläuferprobenionenspezies über die elektrostatische Falle 40 erhalten werden. Zudem ist zu verstehen, dass die Art und Weise der Detektion ebenfalls von der Natur der eingesetzten Masseanalysetechnik abhängt. Falls beispielsweise die Flugzeitmassenanalyse ausgeführt wird, dann werden Ionen mit steigendem m/z-Wert in der Regel zeitlich sequenziell beispielsweise über eine Mikrokanalplatte detektiert. Falls andererseits eine Orbitrap- oder FT-MS-Analyse durchgeführt wird, kann stattdessen eine gleichzeitige Detektion von im Wesentlichen allen Ionen (über eine Zeitbereichstransiente), gefolgt von einer nachfolgenden Fourier-Transformation in den Frequenzbereich, ausgeführt werden. Daraus wiederum können Ionenmassen bestimmt werden. Es versteht sich somit, dass die Masse selbst nicht aus der Ionendetektion bestimmt werden muss; Zeit (Flugzeit), Frequenz, Spannung, Magnetfeld und andere physikalische Parameter können die primäre gemessene Größe sein, und es ist nicht notwendigerweise essenziell, dass diese primären Messungsparameter in Ionenmasse umgewandelt werden. Es kann stattdessen rechnerisch effektiv sein, eine Berechnung von Ionenmassen zu umgehen und einen Teil der nachfolgenden Analyse (unten näher zu beschreiben) direkt in dem Raum der ursprünglich detektierten Größe vorzunehmen. Nachfolgend wird zwar der Ausdruck „Masse” (oder Masse-Ladungs-Verhältnis) verwendet, doch ist zu verstehen, dass die Berechnungen tatsächlich an Größen durchgeführt werden könnten, die lediglich zur Ionenmasse in Beziehung stehen und diese nicht direkt repräsentieren. Übrigens detektieren auch viele Massenspektrometer Masse-Ladungs-Verhältnisse von Ionen. Für die Bestimmung einer molekularen Masse aus diesem gemessenen m/z-Wert gibt es verschiedene bekannte Verfahren (siehe z. B. US-A-5,072,115 und Hort et al., J. Am. Soc. Mass. Spectrometry, 2000, 11, 320–332). Die meisten der unten beschriebenen Berechnungen werden am zweckmäßigsten im Masseraum ausgeführt, wo üblicherweise bereits eine Korrektur für die ladungstragenden Addukte erfolgte. Die erforderlichen Transformationen sind in der Technik sowieso wohlbekannt und/oder können ohne weiteres herausgefunden werden.
Nachdem eine beispielhafte Möglichkeit zum Erhalten der massenspektrometrischen Daten von mehreren Vorläuferprobenionen und ihren Fragmenten beschrieben worden ist, wird nun ein Verfahren beschrieben, das die vorliegende Erfindung verkörpert, das das parallele Verarbeiten dieser Daten beinhaltet (Multiplexen), um eine Identifikation von mehreren Vorläuferprobenionen (oder Derivaten/Eltern davon) im Wesentlichen gleichzeitig zu gestatten.
Das zusammengesetzte Fragmentprobenionenmassenspektrum mit hoher Massengenauigkeit, das erhalten wurde, und das Vorläufermassenspektrum werden beide zuerst entladen und entisotopisiert, um vereinfachte Spektren zu erzeugen. Das Fragmentmassenspektrum wird dann abgetastet, um Paare von Fragmenten zu identifizieren, deren kombinierte Masse der Masse einer der Vorläuferionenspezies entspricht. Es hat sich herausgestellt, dass komplementäre Paare von Fragmentionen unter allen Arten von Fragmenten, die durch CAD (Collisionally Activated Dissociation) generiert wurden, eine einzigartige Spezifizität besitzen, wenngleich gleichermaßen andere Fragmentierungsformen eingesetzt werden können.
Wenngleich sowohl die Vorläufer- als auch die Fragmentionenmassen bis auf eine hohe Massengenauigkeit gemessen werden, sind sie dennoch infolge der endlichen Genauigkeit der Massenmessung einem Fehlergrad unterworfen. Dieser Messfehler kann verwendet werden, um die Verarbeitung der Fragmentmasseninformationen zu informieren: Eine Entsprechung kann nur identifiziert werden, wenn die kombinierte Masse der beiden Fragmentionen innerhalb einer vorbestimmten Fehlermarge gleich einer der Vorläufer ist (oder gleich einem festen vorbestimmten Offset von einem Vorläufer ist, infolge eines neutralen Verlustes von H₂O usw.).
Nachdem Paare von Fragmentionen mit Vorläuferionenspezies abgeglichen worden sind, wird das (zusammengesetzte) Fragmentionenspektrum in Abschnitte zerlegt, einen Abschnitt für jedes Fragmentpaar und nur jedes Fragmentpaar enthaltend. Die Analyse des zusammengesetzten Fragmentmassenspektrums wird fortgesetzt, bis innerhalb der vorgegebenen Genauigkeitsgrenzen keine weiteren Paare identifiziert werden. Etwaige einzelne Fragmentionen, die keiner Vorläuferionenspezies zugeordnet sind, können verworfen werden oder in die nachfolgende Identifikationsanalyse (unten beschrieben) aufgenommen, aber ignoriert werden.
Nachdem die Analyse des zusammengesetzten Fragmentspektrums fertiggestellt worden ist, wird ein (vereinfachtes) Fragmentionenspektrum jeweils für jedes Vorläuferprobenion rekonstruiert, indem jeder einzelne auseinandergenommene Abschnitt des zusammengesetzten Fragmentspektrums zusammengeheftet oder anderweitig verknüpft wird, und zwar für alle Paare von Fragmentionen, die mit einer bestimmten Vorläuferprobenionenspezies verknüpft worden sind. Mit anderen Worten ergeben sich aus der obigen Analyse für „n” Vorläuferprobenionen, die zusammen analysiert werden, mit einem zusammengesetzten Fragmentprobenionenmassenspektrum, das durch Fragmentieren jener „n” Vorläuferionenspezies erhalten wurde (entweder gleichzeitig oder sequenziell, aber mit allen zusammen analysierten Fragmenten), „n” separate vereinfachte Fragmentmassenspektren (die nur Daten von Paaren von Fragmenten mit der gleichen kombinierten Masse wie ein jeweiliger der „n” Vorläufer enthalten).
Die resultierenden aufgeschlüsselten Fragmentionenspektren werden dann nacheinander an eine Suchmaschine wie etwa Mascott^TM oder Sequest^TM zusammen mit dem gemessenen Masseladungsverhältnis der assoziierten Vorläuferprobenionenspezies geschickt. Die Suchmaschine führt dann auf jedem synthetischen Fragmentspektrum eine standardmäßige Datenbanksuche durch und gibt eine gewertete (und optional wertesortierte) Liste von wahrscheinlichen Kandidaten für jedes derartige aufgeschlüsselte (synthetische) Fragmentionenmassenspektrum aus. Wenngleich eine Identifikation von Vorläuferionen gegenwärtig nur auf der Basis der Masse der synthetischen Fragmentmassenspektren bevorzugt wird, kann dennoch der (relative) Überfluss von jeder optional ebenfalls verwendet werden, um die Identifikation weiter zu unterstützen.
Diese Technik schlüsselt den Multiplexierprozess auf, behält jedoch den ganzen Geschwindigkeitsvorteil bei, der durch diesen Multiplexierprozess erhalten wird: Bei dem Verfahren nach dem Stand der Technik von Masselson und Smith werden tatsächlich die genauesten Ergebnisse erhalten, wenn die Vorläuferionen in dem Vorläufermassenspektrum präzise identifiziert werden und dazu ist es wünschenswert, dass die Vorläuferionen mit hoher Massenauflösung analysiert werden (und damit das Verfahren nach dem Stand der Technik überhaupt funktioniert, ist, wie bereits erörtert, eine größte Massengenauigkeit der Fragmentionen erforderlich). Mit anderen Worten führen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung relativ zu dem Verfahren von Masselson und Smith keine zusätzliche Zeitstrafe ein und liefern signifikante Zeitvorteile gegenüber nichtgemultiplexten MS/MS-Techniken. Weiterhin führen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu keiner signifikanten Reduktion der Genauigkeit der Ergebnisse relativ zu Techniken ohne Multiplexieren. Im Gegensatz zu der Multiplexiertechnik von Masselson und Smith jedoch gibt es bei dem nun beschriebenen Verfahren keinen fatalen Abfall bei der Identifikationsgenauigkeit der Fragmentspektren, wenn die Anzahl der multiplexierten Vorläufer über 2 ansteigt.
Um die oben beschriebenen Prinzipien weiter zu veranschaulichen und insbesondere das Verfahren des Abgleichens von Fragmentionenmassen mit einer Vorläuferionenmasse zeigt 7 einen Teil eines Massenspektrums für das Molekül C₂₂H₄₂N₉O₆ und seine Fragmente. Gemäß den oben beschriebenen Techniken wird zunächst die Vorläuferionenspezies (C₂₂H₄₂N₉O₆ Addukt-korrigiert (das Addukt ist H⁺ mit einer (bekannten) Masse von 1,007825 Atommasseeinheiten). Die Addukt-korrigierte Masse p des Vorläufers beträgt somit 528,32526 – 1,007825 = 527,317984 Atommasseeinheiten.
Als Nächstes wird ein erster Fragmentpeak (in 7 als B₁[R] identifiziert) gewählt, und seine gemessene Masse wird wieder Addukt-korrigiert. Die (korrigierte) Masse wird gespeichert (in 7 wird sie als 157,10839 – 1,007825 = 156,101114 angemerkt). Als Nächstes werden alle anderen Peaks nach einer Masse M₂ durchsucht, die mit einer Adduktkorrektion eine Masse M₂ (= M₂ – 1,007825) aufweist, sodass M₁ + M₂ = p. Nachdem M₂ identifiziert ist, wird M₁ in einer Liste von verifizierten Fragmentmassen platziert. Der Prozess wird für andere Fragmentionen wiederholt. Die Tabellen 1 und 2 zeigen die unkorrigierten und Addukt-korrigierten Ergebnisse für die Fragmentionen [P] [R], [RK], [QP], [RKQ] bzw. [KQP] (die Molekülstruktur ist in 7 für jedes Fragmention gezeigt, ist der Kürze halber aber hier weggelassen). Es ist ersichtlich, dass in jedem Fall die Paare von Addukt-korrigierten Fragmentionenmassen bei Adduktkorrektur die Vorläuferionenmasse bilden.

Nachdem die Liste verifizierter Fragmentmassen zusammengestellt worden ist, kann sie zur weiteren Analyse, beispielsweise durch eine Suchmaschine wie oben beschrieben, unterbreitet werden (zusammen mit Details der Vorläuferionenmasse).

Fragment-Name 1	Masse von Fragment 1	Fragment-Name 2	Masse von Fragment 2	Elternname	Masse von Eltern
[R]	157,10839	[KQP]	372,22415	[RKQP]	528,32526
[RK]	285,20335	[QP]	244,12918	[RKQP]	528,32526
[RKQ]	413,26193	[P]	116,07061	[RKQP]	528,32526

Tabelle 1 – unkorrigierte Eltern- und Fragmentionenmassen

Fragment-Name 1	Masse von Fragment 1	Fragment-Name 2	Masse von Fragment 2	Elternname	Masse von Eltern
[R]	156,101114	[KQP]	371,216874	[RKQP]	527,31799
[RK]	284,196074	[QP]	243,121904	[RKQP]	527,31799
[RKQ]	412,254654	[P]	115,063334	[RKQP]	527,31799

Tabelle 2 – Addukt-korrigierte Eltern- und Fragmentionenmassen

4 zeigt ein funktionales Schemadiagramm einer bevorzugten Massenspektrometeranordnung zur Implementierung von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. In 1 findet zuerst eine Probenvorbereitung bei einem Probenvorbereiter 5 statt. Die Chromatographie (und insbesondere Flüssigchromatographie LC) findet dann bei Stadium 15 statt, und die resultierenden Moleküle werden in einer Ionenquelle 20 ionisiert. Ein erster Satz von Ionen wird dann in einem Ionenwähler 25 aus diesen gewählt. Nach der Wahl werden die Ionen in einer Kollisionszelle 50 fragmentiert und dann stromabwärts davon in einem Ionensammler 35 gesammelt.
Der Prozess der Wahl in der Ionenwahl 25, Fragmentierung in der Kollisionszelle 50 und Sammlung in dem Ionensammler 35 wird wiederholt, bis die gewünschte Kombination von Ionen in dem Ionensammler 35 vorliegt. Danach werden Ionen zu einem Masseanalysator 45 ausgeworfen (der beispielsweise ein Orbitrap^TM-Massenanalysator sein kann), und die Ausgabe des Massenanalysators 45 wird in einem Datenverarbeitungssystem 55 verarbeitet. Die in dem Datenverarbeitungssystem 55 ausgeführten Schritte sind wie oben umrissen und enthalten die Schritte der Aufschlüsselung der Fragmentionen, um Datensätze für die jeweiligen Elternionen zu trennen, sowie optionale Datenbanksuche oder Sequenzieren.
Eine optionale Rückkopplung von dem Datenverarbeitungssystem 55 kann verwendet werden, um die Ionenwahl- und Fragmentierungsprozesse weiter zu steuern.
Es ist zu verstehen, dass die Anordnung von 4 eine funktionale Darstellung der bevorzugten Komponenten eines Massenspektrometersystems zum Implementieren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sein soll. Verschiedene Arbeitsstadien könnten in einem einzelnen Hardwareelement ausgeführt werden so beispielsweise die Stufen der Wahl, Fragmentierung und Sammlung könnten alle in einer einzelnen Ionenfalle wie etwa der „LTQ” (Linear Trap Quadrupole) linearen Ionenfalle eines LTQ-FT-ICR-Massenspektrometers (LTQ Fourier Transform Ion Cyclotron Resinence), wobei nur die präzise Massenanalyse in einer getrennten Masseanalysevorrichtung erfolgt. Theoretisch könnte sogar die Massenanalyse in der gleichen Ionenfalle erfolgen – siehe beispielsweise US-A-4,755,670 . Es ist auch zu verstehen, dass die Wahl von mehreren Ionen nicht sequenziell zu sein braucht. Eine geeignete Wellenform, wie sie etwa beispielsweise in US-A-4,761,545 beschrieben ist, kann verwendet werden, um simultan alle gewünschten Ionen in einer Ionenfalle zu wählen. Ähnliche Konzepte existieren für Massenfilter.
Nunmehr unter Bezugnahme auf 5 wird eine funktionale schematische Darstellung einer alternativen Massenspektrometeranordnung gezeigt, die sich wieder für eine Implementierung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eignet. Wie bei der Anordnung von 4 können Probemoleküle durch eine optionale Probevorbereitungsvorrichtung 5 bereitgestellt werden, gekoppelt an eine Flüssigchromatographieanordnung 15, die Probenmoleküle an eine Ionenquelle 20 liefert.
Wie in 5 zu sehen ist, liefert die Ionenquelle 20 Ionen an einen Massewahlquadrupol Q 27: von dort gehen ausgewählte Ionen zu einer Kollisionszelle q 50 und von dort zu einem quadrupolaren Ionensammler Q 29. Hinter dem quadrupolaren Ionensammler 29 befindet sich ein mit dem Datenverarbeitungssystem 55 verbundener optionaler Flugzeitmassenseparator 47.
Beim typischen Betrieb der Anordnung von 5 wird ein „normales” Massenspektrum entweder durch Abtasten des Massewahlquadrupols 27 oder durch Sammlung von Ionen in dem quadrupolaren Ionensammler 29 erfasst, gefolgt von einem massenselektiven Scan auf einem Detektor oder durch Sammeln von Ionen in dem quadrupolaren Ionensammler 29, gefolgt von einer Massenanalyse in dem Flugzeitanalysator 47. Optional basiert eine Entscheidung über die folgenden Massestufen zur Analyse auf dem zuvor erfassten Spektrum, wenngleich diese Prozedur natürlich nicht erforderlich ist, wenn das Endziel darin besteht, alle Ionen zu fragmentieren.
Als Nächstes wird der Massewahlquadrupol Q 27 dahingehend betrieben, die gewünschten Vorläufermassen oder Massenbereiche nacheinander zu wählen. Die Ionen, die den Massewahlquadrupol Q 27 dann durchlaufen, werden in der Kollisionszelle q 50 fragmentiert, und die resultierenden Fragmente werden entweder direkt in dieser Kollisionszelle q 50 gesammelt, wodurch die Notwendigkeit für den nachfolgenden quadrupolaren Ionensammler 29 entfällt, oder in diesem quadrupolaren Ionensammler 29.
Die Masse der resultierenden Fragmente wird in dem Flugzeitanalysator 47 analysiert. Die Datenverarbeitung, wie zuvor beschrieben und gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wird dann auf die erfassten Masseninformationen angewendet.
6 zeigt wieder funktional schematisch noch eine weitere Anordnung eines Massenspektrometers, das sich für das Implementieren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eignet. In 6 können wieder optionale Probenvorbereitungs- und Flüssigchromatographieschritte ausgeführt werden, um Probenmoleküle an eine Ionenquelle 20 zu liefern. Ionen von der Ionenquelle 20 werden dann zu einer linearen Ionenfalle 26 gelenkt. Hinter der linearen Ionenfalle befindet sich ein Ionensammler 31, der mit einem Ionenfragmentierungsmittel 50' (das eine Kollisionszelle sein kann) und auch unabhängig davon mit einem einfangenden Orbitrap^TM-Massenanalysator 70 kommunizieren kann. Der Orbitrap^TM-Massenanalysator 70 ist mit dem Datenverarbeitungssystem 55 verbunden.
Die Anordnung von 6 liefert mehrere Arbeitsmodi. In einem ersten Modus nach einem normalen Massenscan wird ein Vorläuferion gewählt und in der linearen Ionenfalle 26 fragmentiert. Die resultierenden Fragmente werden dann an den Zwischenionenspeicher 31 geschickt. Die nächsten Vorläuferionen werden dann auf die gleiche Weise behandelt und in den Zwischenionenspeicher 31 injiziert, um zusammen mit den zuvor gespeicherten Fragmentionen gespeichert zu werden. Nachdem alle gewünschten Fragmente von den verschiedenen Vorläuferionen in der Zwischenionenfalle 31 gesammelt worden sind, werden sie zur Massenanalyse und -detektion an den orbitalen einfangenden Orbitrap^TM-Massenanalysator 70 geschickt. Die Verarbeitung findet bei dem Datenverarbeitungssystem 55 gemäß zuvor beschriebenen Prinzipien statt.
In einem alternativen Arbeitsmodus der Anordnung von 6 werden mehrere Vorläufer gleichzeitig gewählt, beispielsweise mit einer SWIFT-Erregung (Stored Waveform Inverse Fourier Transform – gespeicherte funktionsumgekehrte Fouriertransformation) von einer gewissen anderen Form von „gekerbter” Wellenform in der linearen Ionenfalle 26. Die Ionen werden dann zusammen fragmentiert, entweder in der linearen Ionenfalle 26 beispielsweise durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) oder Elektronen-Transfer-Dissoziation (ETD) oder in einem separaten Fragmentierungsmittel 50', wo eine HCD (High energy Collision activated Dissociation – durch Kollision mit hoher Energie aktivierte Dissoziation) auftreten kann, wobei der Zugang auf das Fragmentierungsmittel 50' über die Zwischenionenfalle 31 erfolgt. Fragmente werden dann aus dem Ionenfragmentierungsmittel 50' zurückgeschickt und in dem Zwischenionenspeicher 31 gesammelt. Danach können sie zur Analyse in die Orbitrap^TM 70 injiziert werden.
In noch einem weiteren Arbeitsmodus der Anordnung von 6 können der oben beschriebene erste und zweite Modus kombiniert werden. Beispielsweise kann ein Massenbereich isoliert werden oder verschiedene Massenbereiche können isoliert und addiert werden.
Bei noch einem weiteren Arbeitsmodus der Anordnung von 6 kann eine sequenzielle Vorläuferionenwahl in der linearen Ionenfalle 26 stattfinden mit einem Transfer zu dem Zwischenionenspeicher 31, gefolgt von einer Fragmentierung aller Ionen zusammen in dem Ionenfragmentierungsmittel 50'. Die resultierenden Fragmentionen werden dann wieder in der Zwischenionenfalle 31 gesammelt und ihre Masse wird in der Orbitrap^TM 70 analysiert.
Nachdem die Massendaten erhalten worden sind, können sie natürlich in jedem Fall unter Einsatz des Datenverarbeitungssystems 55 gemäß den die vorliegende Erfindung verkörpernden, zuvor beschriebenen Prinzipien verarbeitet werden.
Unter Einsatz des die vorliegende Erfindung verkörpernden Verfahrens wurden tatsächliche Daten von einem MS/MS-Experiment erhalten. Sowohl das Vorläufer- als auch das Fragmentspektrum wurden mit einer hohen Massengenauigkeit erhalten (Massengenauigkeit 2 ppm bei 1 Sigma, wobei ein FT-ICR-Massenanalysator verwendet wurde und mit einer Massenauflösung von 100000 Halbwertsbreite (FWHM). Die die späteren Stadien des Verfahrens bildende Datenbanksuche wurde unter Verwendung des Mascot-Suchsystems mit Schwellwerten von 5 ppm (3 Sigma) und 10 ppm (6 Sigma) ausgeführt.
8 zeigt eine graphische Darstellung des mittleren Mascot-Werts als Funktion der Anzahl von Vorläuferionen und ihrer Fragmentspektren, die miteinander multiplexiert worden sind, wobei die so erhaltenen Daten verwendet wurden und das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet wurde. Zum Vergleich ist der unter Einsatz des Verfahrens von Masselson und Smith nach dem Stand der Technik erhaltene mittlere Mascot-Wert gezeigt (sie verwendeten tatsächlich das Sequest-System, das für Datensuchzwecke dem Mascot-System ähnlich ist).
Beide Verfahren ergaben Werte, die mit zunehmender Anzahl von multiplexierten Peaks sanken, aber für das Verfahren nach dem Stand der Technik fällt der vorhergesagte Wert (bei Einsatz von Mascot) selbst bei nur zwei multiplexierten Peaks dramatisch ab. Ein Wert von etwa 30 wird üblicherweise als annehmbar angesehen. Aus 8 ist ersichtlich, dass das Verfahren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Multiplexieren von viel mehr Vorläuferionenspezies gestattet als die Verfahren nach dem Stand der Technik für den gleichen annehmbaren Wert. Dies führt zu einer weit größeren Verbesserung beim Durchsatz. Es kann auch bedeuten, dass weit nützlichere Informationen über eine Probe in dem Zeitfenster erhalten werden können, das von der chromatographischen Trennung verfügbar ist, die oftmals der Massenspektrometrie vorausgeht.
Um MS/MS-Daten von 4 Vorläuferionenspezies zu erhalten, wobei eine spektroskopische Technik mit hoher Massengenauigkeit verwendet wird, wie etwa FT-ICR-MS oder Orbitrap-MS, die ~ 0,5 Sekunden pro spektraler Aufnahme erfordern, beträgt die Zeit, die zum individuellen Wählen, Fragmentieren und zur Massenanalyse benötigt wird, 2,5 Sekunden, die aus einem Vorläuferionenspektrum und 4 Fragmentspektren besteht. Die Zeit unter Verwendung der vorliegenden Erfindung beträgt nur eine Sekunde, die aus einem Vorläuferionenspektrum und einem Fragmentionenspektrum besteht. Eine zeitliche Reduktion um einen Faktor 2,5 wird erreicht, wobei die über Mascot vorhergesagten Werte deutlich über dem annehmbaren Niveau von 30 bleiben.
Wie oben bezüglich 8 angemerkt, leidet das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter einem Mascot-Wert, der mit zunehmender Anzahl von multiplexierten Vorläuferionenspezies sinkt, doch ist diese Reduktion bescheiden. Um dies näher zu veranschaulichen, wurde ein direkter Vergleich mit nichtmultiplexierten Ergebnissen vorgenommen. 1000 Massenspektren wurden aus einer Datenbank von CAD-MS/MS-Spektren gewählt. Gruppen von vier Spektren wurden zusammensummiert, um das multiplexierte Fragmentionenspektrum zu simulieren, das in jedem Fall erhalten worden wäre, wären die vier Vorläuferionenspezies fragmentiert und die Fragmente kombiniert und ihre Masse zusammen analysiert worden. Dies führte zu 250 simulierten multiplexierten MS/MS-Spektren. Das Verarbeitungsverfahren der vorliegenden Erfindung wurde dann befolgt, und die Ergebnisse wurden mit jenen verglichen, die ohne Multiplexieren erhalten wurden.
Gemäß dem die vorliegende Erfindung wie oben beschrieben verkörpernden Verfahren wurde jedes simulierte multiplexierte Fragmentmassenspektrum deisotopiert, entladen und in eine Liste von neutralen Fragmentmassen umgewandelt. Für jede der vier Vorläufermassen M_m wurden Paare m_i und m_j von Fragmentmassen gewählt, sodass m_i + m_j = M_m innerhalb einer Massenungewissheit von ±15 mDa, was zu der Massengenauigkeit der ursprünglichen Spektren in Beziehung steht. Somit wurde jedes simulierte multiplexierte Massenspektrum in vier aufgeschlüsselte MS/MS-Spektren getrennt.
Die ursprünglichen 1000 MS/MS-Spektren wurden Mascot vorgelegt, was zu 980 über dem Schwellwert liegenden Peptididentifikationen führte. Die übrigen 20 Massenspektren (0,2%) wurden hauptsächlich deshalb nicht identifiziert, weil die Proteindatenbank sich änderte, nachdem die identifizierten Spektren in die MS/MS-Datenbank gegeben wurden. Die Verteilung von Mascot-Werten ist in 9 mit schwarzen Säulen gezeigt. Die 1000 aufgeschlüsselten Massenspektren wurden ebenfalls Mascot vorgelegt. Insgesamt wurden 899 Peptide identifiziert (91%). Die resultierende Verteilung von Mascot-Werten ist in 9 durch graue Säulen gezeigt. Sequenzen von nur 2 aufgeschlüsselten Peptiden von 899 stimmten nicht mit den normal identifizierten Sequenzen überein, was einer Rate von 0,22% falschen positiven Werten entspricht.
Basierend auf der Verwendung von CAD zum Fragmentieren der Vorläuferionen und Detektion von Ionen in einem Orbitrap-Massenanalysator ist es möglich, relativ zu einem nicht-multiplexierten MS/MS-Experiment eine Durchsatzverbesserung zu schätzen. Falls das Ausführen von CAD ohne Fragmentdetektion eine Zeiteinheit benötigt und die Orbitrap-Detektion 4 Zeiteinheiten benötigt, dann beträgt die Gesamtzeit für einen 1-in-8-Zyklus im „normalen” (nichtmultiplexierten) Modus 1 × 4 (MS) plus 8 × 4 (MS/MS) = 36 Zeiteinheiten. Im Multiplexiermodus beträgt die benötigte Zeit 1 × 4 (MS) plus 2 × 4 (MS/MS) = 12 Zeiteinheiten. Somit gibt es eine etwa dreifache Durchsatzzunahme relativ zu einer nichtmultiplexierten Technik mit einer minimalen Reduktion bei der Identifizierungsgenauigkeit von Probenionenspezies.
Verschiedene Modifikationen, Alternativen und Zusätze zu den oben beschriebenen Techniken werden in Betracht gezogen. Um beispielsweise den Prozess des Abgleichens von Paaren von Fragmentionenspezies mit ihrem Vorläufer weiter zu unterstützen, können auch die folgenden Verfahren verwendet werden:

(1) Vor dem Deisotopieren des Vorläufers und der Fragmentionenspektren kann die feine Struktur von Isotopenpeaks angemerkt werden, beispielsweise die Anwesenheit von ¹³C oder ³²S. Solche Isotope in den Vorläuferspezies werden auch in ihren entsprechenden Fragmenten beobachtet. Dies kann dazu verwendet werden, Zuordnungen zu bestätigen oder zu widerlegen oder das Identifizieren von Vorläufer-Fragment-Beziehungen zu unterstützen, die durch Zusatz von Fragmentpaaren alleine nicht identifiziert werden können.
(2) Direktes Zuordnen von Fragmenten zu bestimmten Vorläufern, wenn ihre Masse nur zu einem der Vorläufer passt, wenn beispielsweise das Fragment zu massiv ist, um von einem Vorläufer mit niedrigerer Masse zu kommen.
(3) Verwenden von präzisen Masseninformationen, optional zusammen mit Informationen über eine Substanzplatte (z. B. Kenntnis, dass die Probe ein Peptid ist), um bestimmte Fragmente auszuschließen/einzuschließen. Einige Fragmente können lediglich aufgrund ihrer präzisen Masse, der präzisen Vorläufermasse und der möglichen Wahl von neutralen Verlusten nur von einem gewissen Vorläufer sein.
(4) Durchführen der Aufschlüsselung, während die Probenanalyse abläuft. Mögliche Störungen können in dem nächsten Zyklus der Analyse der gleichen Probe identifiziert und gelöst werden, indem die ungelöste Vorläuferionenspezies ein zweites Mal aufgenommen wird. Dieser nachfolgende Zyklus erzeugt ein anderes multiplexiertes Fragmentspektrum, da mit Ausnahme von einer Vorläuferionenspezies alle verschieden sein werden. Eine Identifikation der Fragmente der zuvor ungelösten Vorläuferionenspezies können an diesem Datensatz oder an einer Kombination aus diesem und dem vorigen Satz versucht werden.

Das oben Gesagte beschreibt eine Technik für die multiplexierte Analyse von Vorläufer- und Fragmentionen in MS/MS-Experimenten. Es versteht sich jedoch, dass die Erfindung nicht auf eine einstufige Fragmentierung beschränkt ist. Insbesondere lassen sich die oben beschriebenen Verfahren gleichermaßen auf MS³ oder sogar MSⁿ Experimente anwenden.
10 zeigt ein Flussdiagramm, das darstellt, wie MS³ ausgeführt werden kann, und insbesondere, wie das Verfahren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auf Fragmentionen sowohl der ersten als auch der zweiten Generation („Enkelfragmente”) angewendet werden kann. Bei Schritt 100 wird, wie zuvor in Verbindung mit 3 beschrieben, ein Vorläufermassenspektrum mit hoher Genauigkeit erhalten, genau wie MS/MS. Bei Schritt 200 werden die interessierenden Vorläuferionenspezies miteinander akkumuliert, entweder durch mehrere Zyklen, die verschiedene Vorläuferionenspezies in der elektrostatischen Falle 40 isolieren, oder alternativ durch Wählen von schmaleren „Fenstern” von mehreren Vorläuferionenspezies in der elektrostatischen Falle 40. Die akkumulierten Vorläuferionenspezies werden zusammen in der Fragmentierungseinrichtung 50 fragmentiert (Schritt 300), und die mehreren Fragmentionenspezies von den mehreren Ionenvorläuferionenspezies werden in der Hilfsionenspeichereinrichtung 60 zusammen akkumuliert, Schritt 400. Als eine Alternative zu der Akkumulation von allen interessierenden Vorläuferionenspezies vor der Fragmentierung insgesamt können stattdessen die Vorläuferionenspezies jeweils einzeln isoliert und individuell fragmentiert werden, wobei aber immer noch die Fragmentionen von jedem Vorläuferion zusammen akkumuliert werden, wieder wie zuvor beschrieben.
Als nächstes wird bei Schritt 500 ein Massenspektrum der Fragmente über den Massenanalysator 70 mit hoher Massengenauigkeit erhalten. Das erhaltene Massenspektrum der Fragmente wird bei den Schritten 600 und 700 zur Verarbeitung weggeschickt, was unten zu beschreiben ist.
Als nächstes wird in einer ersten Schleife ein weiterer Satz von Vorläuferionen akkumuliert (wieder Schritt 200). Diese werden zusammen fragmentiert (Schritt 300), um einen akkumulierten Satz von Fragmentionen der ersten Generation auszubilden, die in der Hilfsionenspeichereinrichtung 60 gespeichert werden (wieder Schritt 400). Dieses Mal jedoch werden sie, anstatt ein Massenspektrum dieser Fragmente zu erhalten, stattdessen von der Hilfsionenspeichereinrichtung 60 zurück zu der Fragmentierungseinrichtung 50 geschickt, wo sie ein weiteres Mal fragmentiert werden. Dies ist als Schritt 800 in 10 gezeigt. Die resultierenden Fragmentionen der zweiten Generation (Enkelfragmente) werden dann bei Schritt 900 hinsichtlich ihrer Masse analysiert, indem sie über die Ionenfalle 30 an den Massenanalysator 70 geschickt werden.
Das oben beschriebene Verfahren, das die vorliegende Erfindung verkörpert, wird auf das bei Schritt 500 erhaltene Massenspektrum der ersten Generation angewendet, um Fragmentionen Vorläuferionenspezies zuzuordnen (Schritt 600). Die Ergebnisse dieser Zuordnung werden bei Schritt 700 gespeichert. Gleichermaßen wird das Massenspektrum der Fragmentionen der zweiten Generation (Enkel) unter Einsatz der Technik von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung analysiert, um Fragmentionen der zweiten Generation Fragmentionenspezies der ersten Generation zuzuordnen. Dies ist bei Schritt 1000 gezeigt. Wieder werden die Ergebnisse dieser Analyse bei Schritt 700 gespeichert.
Das Anwenden von Techniken der vorliegenden Erfindung auf mehrere Stadien der Massenspektrometrie (MSⁿ) sorgt für eine potenziell sehr signifikante Zeiteinsparung relativ zum Stand der Technik. Der Schritt 100 des Erhaltens eines Spektrums der Vorläuferionen erfordert etwa 0,5 Sekunden. Auch das Erhalten des Massenspektrums der Fragmentionen der ersten Generation (Schritt 500) erfordert 0,5 Sekunden, und es kann sogar möglich sein, ganz auf diesen Schritt zu verzichten, wenn MS³ verwendet wird. Schließlich benötigt das Massenspektrum von Fragmentionen der zweiten Generation bei Schritt 900 etwa 0,5 Sekunden.
Somit beträgt im schlimmsten Fall die Gesamtdatensammelzeit 1,5 Sekunden. Die Techniken nach dem Stand der Technik benötigen mindestens 10,5 Sekunden, weil die vier separaten Fragmentionenspektren etwa 2 Sekunden zum Erhalten benötigen und die 16 folgenden Fragmentspektren der zweiten Generation insgesamt 8 Sekunden benötigen.
Eindeutig wird die Technik komplizierter, wenn weitere Generationen von Fragmenten erhalten werden könnten, doch wird gleichermaßen die Zeiteinsparung größer. Einer der Zwecke von MS³-Experimenten besteht darin, neutrale Fragmente wie etwa Wasser, Ammoniak, Phosphorylierung oder andere Seitenkettenverluste und Verlust von Zuckern von Glykopeptiden zu disambiguieren.
Wenngleich das obengesagte die Analyse von durch CAD generierten Fragmentionen beschreibt, ist weiterhin zu verstehen, dass sich die Techniken gleichermaßen auf viele andere Formen von Ionenfragmentierung anwenden lassen, wie etwa unter anderem ECD, ETD, metastabiles Ionenbombardement, CID (sowohl Fallen-CID als auch HCD) und IRMPD, als Beispiel. Tatsächlich können als noch eine weitere Variation an den oben beschriebenen Verfahren und zum Liefern weiterer Informationen die Isolation von Vorläuferionenspezies und die nachfolgende Fragmentierung wiederholt werden, aber mit den Fragmentierungsverfahren und/oder den Fragmentierungsenergien, die für die gleiche Vorläuferionenspezies variiert sind. Diese Technik gestattet eine potenzielle Identifikation von sogenannten „goldenen Paaren” von Fragmenten, wobei die verschiedenen Fragmentierungstechniken unterschiedliche Spaltungsmechanismen erzeugen, die mehr oder weniger verstanden werden. Beispielsweise kann ein B2-Fragment, das durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) erzeugt wurde, mit einem entsprechendem C2-Fragment in ETD übereinstimmen, wobei die feste Massendifferenz von 17,0265 die Masse von Ammoniak (NH₃) ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf die Analyse von Polymeren und Biopolymeren wie etwa Proteinen, Peptiden, DNA/RNA, Lipide und Modifikationen von diesen angewendet werden.
Zusammenfassung:
Ein Verfahren zum Identifizieren von Vorläuferionenspezies anhand ihrer Fragmente umfasst das Erhalten von Massenspektren von mehreren Vorläuferionenspezies und ihrer Fragmente mit hoher Massengenauigkeit. Das Fragmentmassenspektrum, aus einer Fragmentierung von mehreren Vorläuferionenspezies erhalten, wird dann abgetastet, um Paare von Fragmenten zu identifizieren, deren kombinierte Masse der Masse einer der Vorläuferionenspezies entspricht. Nachdem Paare von Fragmentionen mit Vorläuferionen abgeglichen worden sind, wird das zusammengesetzte Fragmentionenspektrum in Abschnitte zerlegt, einer pro Fragmentpaar. Die Analyse wird fortgesetzt, bis keine weiteren Paare identifiziert werden. Ein vereinfachtes Fragmentionenspektrum wird dann für jedes Vorläuferprobenion rekonstruiert, indem die zerlegten Sektionen des zusammengesetzten Fragmentspektrums zusammengeheftet werden. Die resultierenden, vereinfachten Fragmentspektren werden dann an eine Suchmaschine geschickt, die eine wertesortierte Liste von wahrscheinlichen Kandidaten für jedes synthetische Fragmentionenspektrum zurückschickt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2005/124821 A [0042, 0042]
WO 2008/081334 A [0042]
WO 2006/103445 A [0042]
GB 352415541 A [0042]
WO 2007/122378 A [0044, 0051]
WO 2008/059246 A [0052]
US 5072115 A [0055]
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US 4761545 A [0069]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

http://expasy.org/sprot/ [0013]
Masselon und Smith in Analytical Chemistry, Band 72, Nr. 8, S. 1918–1924, 2000 [0018]
Hort et al., J. Am. Soc. Mass. Spectrometry, 2000, 11, 320–332 [0055]

Claims

Verfahren zum Identifizieren von Vorläuferionenspezies aus ihren Fragmenten, umfassend: (a) Bestimmen einer Größe, die die Masse von mehreren Vorläuferionenspezies anzeigt; (b) Fragmentieren der Ionen der mehreren Vorläuferionenspezies, um mehrere, von den mehreren Vorläuferionen abgeleitete Fragmentionen auszubilden; (c) gleichzeitige/simultane Massenanalyse der von den mehreren Vorläuferionenspezies abgeleiteten Fragmentionen; (d) Zuordnen von einem oder mehreren Probensätzen von mehreren Fragmentionenspezies zu einer bestimmten der mehreren Vorläuferionenspezies, wobei der oder jeder Probensatz Fragmentionenspezies enthält, deren kombinierte Masse, wie in Schritt (c) bestimmt, der der bestimmten der Vorläuferprobenionenspezies entspricht, der jene Fragmentionenspezies zugeordnet sind; (e) für eine oder mehrere der Vorläuferionenspezies, Weiterleiten von Probendaten, die (i) die Masse der in Schritt (a) identifizierten bestimmten Vorläuferprobenionenspezies und (ii) die Masse der mehreren Fragmentionenspezies in dem oder jedem zugeordneten Probensatz für diese bestimmte Vorläuferionenspezies für ein Vergleichsmittel identifizieren zum Vergleich von Größen, die die Masse des Vorläufers und zugeordnete Fragmentionenspezies anzeigen, mit Größen, die die Masse von Ionen in einem oder mehreren Referenzsätzen von Referenzfragmentionendaten bzw. Referenzvorläuferionendaten anzeigen; und (f) Empfangen von Informationen von dem Vergleichsmittel, die die Ergebnisse des Vergleichs anzeigen, der versuchte, die Vorläuferionenspezies zu identifizieren, denen die mehreren Fragmentprobenionenspezies zugeordnet wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt des Bereitstellens einer Anzeige der Vorläuferionenspezies, die als eine wahrscheinliche Kandidatenvorläuferionenspezies angesehen wird, von der der oder ein bestimmter Probensatz von Fragmentionenspezies abgeleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, weiterhin umfassend: Bereitstellen einer Anzeige von mehreren möglichen Vorläufenionenspezies, von denen die Fragmentionenspezies in einem bestimmten Probensatz abgeleitet werden, zusammen mit einer Anzeige der Reihenfolge der Wahrscheinlichkeit einer Entsprechung dieses Fragmentionenprobensatzes mit jeder der jeweiligen mehreren Vorläuferionenspezies.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Schritt (a) des Bestimmens einer Größe, die die Masse von mehreren Vorläuferionenspezies anzeigt, Folgendes umfasst: Isolieren von Ionen einer ersten Vorläuferionenspezies; Isolieren von Ionen mindestens einer weiteren Vorläuferionenspezies; und Fragmentieren mindestens einiger der Ionen von jeder Vorläuferionenspezies, die isoliert wurde, um die von den mehreren Vorläuferionen abgeleiteten mehreren Fragmentionen auszubilden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Schritt des Isolierens von Ionen einer ersten Vorläuferionenspezies zu einer anderen Zeit ausgeführt wird als der Schritt des Isolierens von Ionen der oder jeder weiteren Vorläuferionenspezies.
Verfahren nach Anspruch 5, weiterhin umfassend das Speichern der isolierten Ionen der ersten Vorläuferionenspezies zusammen mit den isolierten Ionen der oder jeder weiteren Vorläuferionenspezies und das Fragmentieren mindestens einiger der Ionen jeder Vorläuferionenspezies im Wesentlichen simultan, nachdem die Ionen der mehreren verschiedenen Ionenspezies gespeichert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend das Fragmentieren mindestens einiger der Ionen der ersten Vorläuferionenspezies separat von einer Fragmentierung der Ionen der oder jeder weiteren Vorläuferionenspezies und Speichern der resultierenden Fragmente von jeder Vorläuferionenspezies zusammen als die von den mehreren Vorläuferionen abgeleiteten mehreren Fragmentionen.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiterhin umfassend, nach dem Schritt (e) des Zuordnens von einem oder mehreren Probensätzen von mehreren Fragmentionenspezies, den Schritt des Konstruierens eines Teilmassenspektrums von Fragmentionen für jede Voräuferionenspezies aus dem zugeordneten Probensatz oder den zugeordneten Probensätzen von Fragmentionen für diese Vorläuferionenspezies; wobei der oder jeder Referenzsatz von Referenzfragmentionendaten ein Referenzfragmentionenmassenspektrum ist, und wobei der Schritt (f) des Weiterleitens der Probendaten das Weiterleiten des Teilmassenspektrums von Fragmentionen zum Vergleich davon mit dem oder jedem Referenzfragmentionenmassenspektrum und das Weiterleiten der Masse der jeweiligen Vorläuferionenspezies oder eines dazu in Beziehung stehenden Werts, um die Vorläuferionenspezies identifizieren zu wollen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, weiterhin umfassend die folgenden Schritte: Erhalten eines Vorläufermassenspektrums der mehreren Vorläuferionenspezies; und Vergleichen der Feinstruktur des Vorläuferprobenmassenspektrums mit der Feinstruktur der konstruierten Fragmentionenmassenspektren, um eine bestimmte Feinstruktur des konstruierten Fragmentionenmassenspektrums mit der einer bestimmten der Vorläufermassenspektren korrelieren zu wollen.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiterhin umfassend den Schritt des Deisotopierens und Entladens einer oder beider der Vorläufer- und Fragmentionen.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Schritt (d) des Zuordnens von mehreren Fragmentionenspezies das Identifizieren von mehreren Fragmentionenspezies umfasst, deren Gesamtmasse der Masse einer der Vorläuferionenspezies bis zu innerhalb eines Massenfensters um diese Vorläuferionenspeziesmasse herum entspricht oder deren Gesamtmasse einer Masse entspricht die einen vorbestimmten Offset von einer der Vorläuferionenspezies ist, bis zu innerhalb eines Massenfensters um diese Offset-Vorläuferionenspeziesmasse herum.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Massenfenster ausgewählt ist aus der Liste umfassend: 20 Teile pro Million (ppm); 10 ppm; 5 ppm; 2 ppm; 1 ppm; 0,5 ppm und 0,2 ppm.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schritte (a) bis (f) in einem zweiten Zyklus wiederholt werden und wobei die Schritte (d) und (e) des Zuordnens von Mehrfachen von Fragmentionen und des Weiterleitens von Probesätzen für einen Vergleich an einem aus den Schritten (a), (b) und (c) in einem dem zweiten Zyklus vorausgegangenen ersten Zyklus erhaltenen ersten Satz von Daten ausgeführt werden während mindestens ein Teil von einem oder mehrerer der Schritte (a), (b) und/oder (c) des zweiten Zyklus ausgeführt werden.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiterhin umfassend das Wiederholen der Schritte (a) bis (f) in einer oder mehreren nachfolgenden Zyklen für die gleichen identifizierten Vorläuferionen, wobei aber in jedem Fall der Schritt (b) des Fragmentierens jener gleichen Vorläuferionen das Verwenden unterschiedlicher Fragmentierungsenergien und/oder Fragmentierungsmechanismen umfasst.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiterhin umfassend das Ignorieren oder Verwerfen etwaiger Fragmentionen, die nach dem Schritt (d) weiterhin nicht zugeordnet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, weiterhin umfassend das direkte Zuordnen einer beliebigen einzelnen Fragmentionenspezies zu einer bestimmten Vorläuferionenspezies, wenn die Masse dieser einzelnen Fragmentionenspezies derart ist, dass sie anzeigt, dass diese Fragmentionenspezies in der Praxis nur von dieser Vorläuferionenspezies gekommen sein kann.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Massen der Vorläufer- und Fragmentprobenionen mit einer Massengenauigkeit von 20 ppm oder besser mit einer Auflösungsleistung von 5000 oder besser bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Massen der Vorläufer- und Fragmentionen mit einer Massengenauigkeit bestimmt werden, die ausgewählt ist aus der Liste umfassend: 10 ppm oder besser; 5 ppm oder besser; 2 ppm oder besser; 1 ppm oder besser; 0,5 ppm oder besser; 0,2 ppm oder besser und 0,1 ppm oder besser, mit einer Auflösungsleistung von 5000 oder besser; 10000 oder besser; 25000 oder besser; 50000 oder besser; 100000 oder besser.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend, zwischen dem Schritt (e) des Weiterleitens der Fragmentionendaten und der Vorläuferionendaten an das Vergleichsmittel und dem Schritt (f) des Zurückempfangens von Informationen von dem Vergleichsmittel, den folgenden Schritt: Vergleichen der Masse (oder einer verwandten Größe) des einen oder der mehreren Probesätze von mehreren Fragmentionenspezies, die einer bestimmten der Vorläuferionenspezies zugeordnet worden sind, mit den Massen (oder jeweiligen verwandten Größen) der Ionen in dem einen oder den mehreren Referenzsätzen von Referenzfragmentionendaten, wobei jeder Referenzsatz von der jeweiligen Vorläuferionenspezies bekannter Identität und/oder Masse abgeleitet worden ist, um die Vorläuferionenspezies identifizieren zu wollen, von der die mehreren zugeordneten Fragmentionenspezies und/oder das diese Vorläuferionenspezies betreffende Material abgeleitet wurde.
Verfahren nach Anspruch 19, weiterhin umfassend, nach dem Vergleichsschritt, den Schritt des Identifizierens der Vorläuferionenspezies, mit der die mehreren Fragmentionen assoziiert wurden, und/oder des die Vorläuferionenspezies betreffenden Materials.
Verfahren nach Anspruch 19, weiterhin umfassend, nach dem Vergleichsschritt, den Schritt des Generierens einer Liste möglicher Kandidaten-Vorläuferionenspezies basierend auf dem Vergleich.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19, 20 oder 21, wobei der Schritt des Vergleichens für jede von mehreren separaten Probesätzen von Fragmentionen, von denen jeder mit Daten bezüglich der Masse von mehreren Fragmentionenspezies populiert ist, die für einen gegebenen Probesatz als von einem jeweiligen einzelnen von mehreren Vorläuferionen abgeleitet identifiziert ist oder sind, den folgenden Schritt: Vergleichen der Masse (oder einer dazu in Beziehung stehenden Größe) der Fragmentionen in jedem Probensatz mit der Masse (oder einer dazu in Beziehung stehenden Größe) von Ionen in mehreren Referenzsätzen von Referenzfragmentionendaten, um separat die wahrscheinlichste Vorläuferionenspezies oder ein dazu in Beziehung stehendes Molekül identifizieren zu wollen, von der jeder Probensatz jeweils abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Schritt des Vergleichens Folgendes umfasst: Vergleichen der Masse (oder einer verwandten Größe) von Ionen in einem ersten Probensatz mit der Masse (oder einer verwandten Größe) von Ionen in den mehreren Referenzsätzen, dann Vergleichen der Masse (oder einer verwandten Größe) von Ionen in einem weiteren n (≥ 1) Probensätzen, sequenziell, jeweils mit der Masse (oder einer verwandten Größe) von Ionen in den mehreren Referenzsätzen, um wiederum die wahrscheinlichste Vorläuferionenspezies oder ein dazu in Beziehung stehendes Molekül identifizieren zu wollen, von der jeder der (n + 1) Probensätze jeweils abgeleitet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei der Vergleichsschritt abgesetzt von den vorhergehenden Schritten (a) bis (e) und dem nachfolgenden Schritt (f) ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, weiterhin umfassend das Liefern der Informationen bezüglich der Masse der Vorläufer und/oder Fragmentionen an das Vergleichsmittel in einem Format, das von dem Vergleichsmittel bevorzugt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, weiterhin umfassend das Umwandeln der Informationen bezüglich der Masse der Vorläufer- und/oder Fragmentionen von einem ersten Format in ein zweites Format vor der Lieferung der Informationen an das Vergleichsmittel.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Informationen bezüglich der Masse der Vorläufer und/oder Fragmentionen entweder die Masse davon oder das Masse-Ladungs-Verhältnis davon sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, weiterhin umfassend das Umwandeln der Informationen bezüglich der Masse der Vorläufer- und/oder Fragmentionen in Masseeinheiten und optional weiterhin das Justieren der Masse für Addukte oder neutrale Verluste umfasst.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Schritt (d) des Zuordnens von einem oder mehreren Probensätzen von mehreren Fragmentionenspezies das Zuordnen von einem oder mehreren Probensätzen von Paaren von Fragmentionenspezies aus den von den mehreren Vorläuferionen abgeleiteten mehreren Fragmentionen umfasst, wobei das Paar von Fragmentionenspezies in dem oder jedem Probensatz eine kombinierte Masse aufweist, die der einer der mehreren Vorläuferionenspezies entspricht.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Schritt des Zuordnens des oder jedes Probensatzes von Paaren von Fragmentionenspezies, wenn die Masse des oder jedes Paars der von einer oder den mehreren von Vorläuferionenspezies entspricht, das Zuordnen des oder jedes Probensatzes von Paaren von Fragmentionenspezies umfasst, wenn die Masse des oder jedes Paars um ein vorbestimmtes Ausmaß von der einen der mehreren Vorläuferionenspezies versetzt ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiterhin umfassend, nach dem Schritt (b) des Fragmentierens der Ionen der mehreren Voräuferionenspezies, die folgenden zusätzlichen Schritte: (g) Fragmentieren der mehreren Fragmentionen, um mehrere Enkelfragmentionen auszubilden; (h) zusammen/simultanes Analysieren der Masse der von den mehreren Fragmentionenspezies abgeleiteten Enkelfragmentionen; (i) Zuordnen von einem oder mehreren Probensätzen von mehreren Enkelfragmentionenspezies zu einer bestimmten der mehreren Fragmentionenspezies, aus denen jene Enkelfragmentionen ausgebildet wurden, wobei der oder jeder Probensatz von mehreren Enkelfragmentierungsspezies eine Elternfragmentionenspezies enthält, deren kombinierte Masse nach Bestimmung in Schritt (h) der der bestimmten der Fragmentionenspezies entspricht, der jene Enkelfragmentionenspezies zugeordnet sind; (j) für eine oder mehrere der Fragmentionenspezies, Weiterleiten von Probendaten, die Folgendes identifizieren: (i) die Masse der identifizierten jeweiligen Fragmentionenspezies und (ii) die Masse der mehreren Enkelfragmentionenspezies in dem oder jedem zugeordneten Probensatz für diese jeweilige Fragmentionenspezies, an ein Vergleichsmittel zum Vergleichen der die Masse der Fragment- und zugeordneten Enkelfragmentionenspezies anzeigenden Größen mit den die Masse der Ionen in einem oder mehreren Referenzsätzen von Referenzenkelfragmentionendaten beziehungsweise Referenzfragmentionendaten anzeigenden Größen; und (k) Empfangen, von dem Vergleichsmittel, von Informationen, die die Ergebnisse des Vergleichs anzeigen, der die Fragmentionenspezies identifizieren wollte, der die mehreren Enkelfragmentionenspezies zugeordnet wurden.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiterhin umfassend: Identifizieren einer ersten Mehrzahl von Vorläuferionenspezies, die eine Teilmenge der Totalität von Vorläuferionenspezies bilden, die zur Analyse zur Verfügung stehen; Ausführen der Verfahrensschritte an dieser identifizierten ersten Mehrzahl von Vorläuferionenspezies und Wiederholen der Verfahrensschritte für mindestens einige der Vorläuferionen in der Totalität von Vorläuferionenspezies, die zur Analyse zur Verfügung stehen und die nicht in der Teilmenge davon enthalten waren.
Computerprogramm, das bei Ausführung bewirkt, dass ein oder mehrere Prozessoren die Schritte eines vorhergehenden Anspruchs ausführen.
Controller für ein Massenspektrometer, wenn mit dem Computerprogramm von Anspruch 33 beladen.
Massenspektrometer mit dem Controller von Anspruch 34.