CN113514531B - 一种化合物的碎片离子预测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种化合物的碎片离子预测方法及应用，所述方法包括：1)确定用于实验的化合物，化合物的母离子分子式和碎片离子分子式；2)根据母离子和碎片离子的元素组成，选取稳定同位素；3)根据确定的化合物、母离子分子式和碎片离子分子式、母离子和碎片离子中稳定同位素元素个数，计算所述母离子和所述碎片离子被稳定同位素标记的情况；4)计算全部母离子和全部碎片离子被所述稳定同位素标记情况的个数；5)根据步骤4)中得到的标记情况的数量，计算全部标记情况中母离子和碎片离子的精确质量数，并计算质荷比；6)建立化合物的碎片离子的质荷比数据库。

Description

一种化合物的碎片离子预测方法及应用

技术领域

本申请涉及同位素标记实验中质谱数据的预处理以及有效信息的提取方法，特别涉及一种基于质谱数据中呈现的稳定同位素标记的化合物碎片离子的预测、采集及定性方法。

背景技术

色谱质谱联用仪是将色谱的分离能力与质谱的定性功能相结合，从而对复杂样品中的化合物实现定量和定性分析功能，是代谢组学分析的主要工具。与质谱联用的色谱仪主要有气相色谱和液相色谱，质谱仪根据分析器主要有四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪等，按分辨率能力可分为低分辩、中分辨和高分辨质谱仪。其检测原理是经色谱分离的各种组分在离子源中发生电离，带不同荷质比的离子在加速电场的作用下形成离子束，注入质量分析器，质量分析器记录各种带电离子的质量数和丰度。用于分析的带电离子可以是原子、分子、分子碎片、同位素离子等。色谱质谱联用仪数据的定性分析包括：1)母离子峰和主要碎片离子峰与标准图谱一致；2)目标物的保留时间与标准品的相同；3)母离子和碎片离子的荷质比满足相应仪器的质量精度；4)目标化合物的母离子峰同位素分布与该分子式的自然分布相匹配。

母离子和碎片离子的质量数对代谢物的鉴定有着至关重要的作用，用色谱质谱仪检测代谢流实验时，其实验复杂性在于不同待测物的标记元素不同，不同待测物的标记位置不同；不同待测物使用同一种标记元素时，标记位置和标记数量的不同也会得到完全不同的待测目标物；即使是同一种标记化合物，由于代谢网络复杂，各种代谢物之间交流复杂多变，同一代谢物不同通路来源标记情况也不尽相同，从而使得目标代谢物的标记呈现多样性；有些待测物特征碎片离子的结构未知进一步增加了与同位素标记化合物之间的关联难度，尤其是非特征基团。代谢物的来源复杂多样、碎片离子标记情况复杂多变，因此存在标记化合物与待测物的代谢关系不明确的情况。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制本申请的保护范围。

一种基于质谱数据中呈现的稳定同位素标记的化合物碎片离子的预测、采集及定性方法。无需碎片离子的结构，也不用去追溯与被标记化合物之间的元素关联，只需母离子和子离子的分子式组成即可快速、准确、无遗漏地推算所有可能的标记情况，并计算出精确质量数，并且可根据标记元素进行不同的预测。该方法可使用各种类型的色谱质谱联用仪的方法建立或者数据分析阶段。

本申请通过归纳总结的规则对化合物进行不同元素标记情况下的所有可能出现的母离子与特征碎片离子的组合进行计算，采用软件或其他形式，可对数据进行批量处理，速度快，准确率高，无需追溯特征碎片离子的结构以及上游代谢物的结构关联，极大的方便了未知代谢通路或者与标记物关联较弱的代谢物的检测。

标记化合物与待测物的代谢关系不明确时，在数据采集时收集母离子和碎片离子的所有标记情况，可不用考虑特征碎片离子是否全部或者部分来源于被标记物的某个基团，而且不用担心丢失重要信息。

本申请提供了一种化合物的碎片离子预测方法，包括以下步骤：

1)确定用于实验的化合物，确定所述化合物的母离子分子式和碎片离子分子式；

2)根据所述母离子和所述碎片离子的元素组成，选取稳定同位素；

3)根据步骤1)确定的所述化合物、母离子分子式和碎片离子分子式、所述母离子和所述碎片离子中所述稳定同位素元素个数，计算所述母离子和所述碎片离子被所述稳定同位素标记的情况；

4)计算全部所述母离子和全部所述碎片离子被所述稳定同位素标记情况的个数；

5)根据步骤4)中得到的所述标记情况的数量，计算全部所述标记情况中所述母离子和所述碎片离子的精确质量数，并计算质荷比；

可选地，预测方法还包括步骤6)建立所述化合物的碎片离子的质荷比数据库。

在本申请提供的一种实施方式中，所述目标化合物的数量可以为一个或两个以上。

在本申请提供的一种实施方式中，步骤1)中所述母离子和所述碎片离子为所述化合物通过软件预测、文章报道、网站数据库查询到的所述母离子和所述碎片离子。

在本申请提供的一种实施方式中，所述标记元素选自C、H、N、O和S中的任意一种元素或更多种元素。

在本申请提供的一种实施方式中，步骤4)中计算所述全部碎片离子被所述稳定同位素标记情况的个数的方法包括：

a)选取所述稳定同位素的种类为1种，所述特定化合物对应的母离子种类为1种，所述母离子对应的碎片离子种类为1种；

b)记所述母离子中可以被所述稳定同位素标记的元素个数为x个，所述碎片离子中可以被所述稳定同位素标记的元素个数为y个；

若母离子中实际被标记的元素个数a与y之和大于x时，则所述碎片离子中标记元素的数量为a+y-x个、a+y-x+1个、a+y-x+2个至z个，当所述a+y-x＝z时，所述标记情况的数量为1种；当a+y-x≠z时，所述标记情况的数量为z-(a+y-x)+1种；

若母离子中实际被标记的元素数a与y之和不大于x时，则所述碎片离子标记元素数量为0、1、至z个；所述标记情况的数量为z+1种；

z取a和y最小值。

在本申请提供的一种实施方式中，当选取所述稳定同位素的种类大于1种时，分别计算每一种稳定同位素的母离子标记情况和碎片离子标记情况的数量；

将每一种所述稳定同位素的母离子标记情况的数量的乘积即为所述稳定同位素的种类大于1种时所述母离子标记情况的数量；

将每一种所述稳定同位素的碎片离子标记情况的数量的乘积即为所述稳定同位素的种类大于1种时所述碎片离子标记情况的数量。

又一方面，本申请提供了一种检测装置，所述检测装置在使用过程中使用权利要求1至6中任一项所述的稳定同位素标记的化合物的碎片离子的质荷比数据库。

又一方面，本申请提供了上述的稳定同位素标记的化合物的碎片离子的应用，用于代谢流检测。

在本申请提供的一种实施方式中，所述应用用于未知代谢物与标记物之间代谢关系情况下的代谢流检测。

在本申请提供的一种实施方式中，所述数据库用于低分辨率色谱仪或更高分辨率的色谱质谱仪。

本申请提供的技术方案，根据选取的稳定同位素标记的化合物和获取的母离子和碎片离子分子式计算所有的同位素标记的母离子和碎片离子组合，确定母离子不同标记情况下的碎片离子的所有标记规则；4)根据总结的规则可以对所有已知碎片离子分子式和未知碎片离子分子式但可借用软件计算碎片离子分子式的化合物进行计算。

本申请具有一下优势：

1、采用母离子和碎片离子的分子式直接计算所有可能的标记情况，涵盖所有情况，信息更加全面，有助于发现未知的代谢通路；不需要考虑待测物与标记物之间的代谢关系，也不需要待测物碎片离子的结构与基团来源，而且不用担心丢失重要信息。克服代谢网络复杂，代谢物来源不单一，标记物复杂多样导致的代谢流检测对专业的高度依赖性，采用母离子和碎片离子的分子式计算待测物所有可能的标记情况，从而使代谢流实验检测变得简单快速、易操作、信息全面无遗漏。对生物背景比较弱或者代谢流初学者友好，简单易操作，适应面广。

2、本申请提供的方法适应所有稳定同位素的标记实验，只需选择标记物的稳定同位素，即可对待测物的所有碎片离子的标记情况进行计算而且支持批量处理，方便快捷。

3、经本申请技术方案计算的母离子和碎片离子可以适应所有色谱质谱联用仪，不仅可用于低分辩四极杆仪器的方法建立，也可用高分辨仪器的后期数据分析。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书中所描述的方案来发明实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1按照本申请实现的同位素标记的目标母离子和碎片离子计算方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

在本申请实施例中，样本的来源包含但不仅限于模式生物、细胞、细菌、真菌、模式植物及其他可用于进行标记实验的植物；

在本申请实施例中，使用的示踪剂包含但不仅限于葡萄糖Glucose-¹³C₆H₁₂O₆、谷氨酰胺Glutamine-C₅H₁₀ ¹⁵N₂O₃、谷氨酰胺Glutamine-¹³C₅H₁₀N₂O₃、十六烷酸Palmitic acid-C₁₆D₃₂O₂、十六烷酸Palmitic acid-¹³C₁₆H₃₂O₂、¹³CO₂等有机或无机化合物，用于标记的同位素包含但不仅限于¹³C、¹⁵N、¹⁸O、³⁴S、D等已知或可被用于标记的元素，获取目标化合物碎片离子信息的方式包含但不仅限于网站(HMDB、metlin等)、文章、软件等途径。

本申请提供了一种不需要追溯同位素标记化合物的与目标分子中碎片离子之间的关联即可预测目标分子与碎片离子的所有标记情况。

实施例1

本实施例是基于¹³C、¹⁵N、¹⁸O、³⁴S等不同标记元素的同一化合物的标记。本实施例的目标化合物选取腺苷为例计算不同标记元素下统一化合物的母离子及碎片离子的标记情况。基于标记的腺苷Adenosine的母离子质荷比组合与碎片离子的质荷比组合建立的数据库。

本实施例以腺苷为例，建立腺苷的质荷比数据库，腺苷有一分子腺嘌呤和一分子核糖组成，腺苷在生物体内可从头合成和降解生成，参与生物体内氧化还原反应。腺苷的来源具有多样性，不同的同位素标记数量、位置或者同一同位素的不同化合物的标记都得到不同的标记情况，而使用本申请提供的方法只需确定同位素标记元素即可计算所有可能标记情况，如表1所示。计算方法如下：

结合HMDB网站、mz cloud软件等途径选取腺苷Adenosine的母离子分子式为C₁₀H₁₂N₅O₄，[M-H]^-的m/z为426.02214；并选取所述腺苷母离子的对应特征性碎片离子。

特征性碎片离子一：m/z 328.0447[C₁₀H₉N₅O₆P]^-、特征性碎片离子二：m/z134.0467[C₅H₄N₅]^-、特征性碎片离子三：m/z 158.9248[HO₆P₂]^-、特征性碎片离子四：m/z 408.0110[C₁₀H₁₂N₅O₉P₂]^-。

以碳13标记，母离子有6个¹³C标记为例(负离子模式，详见表1中第第59行至第63行)进行计算：

特征碎片离子二：

母离子有6个13C标记(即a＝6)，母离子中共有10个碳(即x＝10)，碎片离子二中共有5个C(即y＝5)，即a+y＞x，z取a和y中的最小值即5，因此被标记的碎片二共有a+y-x＝1、a+y-x+1＝2、a+y-x+2＝3、a+y-x+3＝4、z＝5，共5种标记情况，即z-(a+y-x)+1＝5。

实际情况如下：当母离子有6个¹³C标记时m/z为432.04227，特征碎片离子二有至少1个C原子被标记，特征碎片离子二含有5个C原子，与母离子相比缺少5个C原子，所以碎片离子标记情况为5个C原子中有1、2、3、4、5个C原子被标记，因为缺少的5个C原子中分别有5、4、3、2、1个C原子被标记，所以特征碎片离子二有m/z135.05005、m/z136.05341、m/z137.056765、m/z138.06012、m/z139.063475。

特征碎片离子一：

母离子有6个13C标记(即a＝6)，母离子中共有10个碳(即x＝10)，碎片离子二中共有10个C(即y＝10)，即a+y＞x，z取a和y中的最小值即6，因此被标记的碎片二共有a+y-x＝6，z＝6，因此，共1种标记情况，即z-(a+y-x)+1＝1。

实际情况如下：当母离子有6个¹³C标记时m/z为432.04227，特征碎片离子一中的6个C原子被标记，特征碎片离子一有10个C原子与母离子一致，所以碎片离子10个C原子均被标记为m/z334.06483；

特征碎片离子三：

母离子有个13C标记(即a＝6)，母离子中共有10个碳(即x＝10)，碎片离子三中共有0个C(即y＝0)，即a+y＜x，z＝a和y中的最小值即0，因此被标记的碎片二共有z＝0个，因此，共1种标记情况，即z+1＝1。

实际情况如下：特征碎片离子三不含有C原子，所以为m/z158.9248；

特征碎片离子四：

母离子有6个13C标记(即a＝6)，母离子中共有10个碳(即x＝10)，碎片离子四中共有10个C(即y＝10)，即a+y＞x，z取a和y中的最小值即6，因此被标记的碎片四共有a+y-x＝6，z＝6，因此，共1种标记情况，即z-(a+y-x)+1＝1。

实际情况如下：当母离子有6个¹³C标记时m/z为432.04227，特征碎片离子四中的6个C原子被标记，特征碎片离子四与母离子一样含有10个C原子，所以有6个C原子被标记，其m/z为414.03113。

即，当母离子有6个13C标记时，碎片离子的质荷比存在5+1+1+1共8种标记情况，如表1中第59行至第63行所示。

以此类推，如表1中第53行至第58行所示，当母离子有5个¹³C时(阴离子模式)碎片离子的质荷比存在9种标记情况，即：特征碎片离子一存在1种，特征碎片离子二中存在6种，特征碎片离子三存在1种，特征碎片离子四存在1种。

同理可依据本申请公开的规则计算基于¹³C标记的腺苷Adenosine以及其他标记的腺苷Adenosine(见表1)。

以此类推，当母离子腺苷中的标记元素同时包括5个¹³C、2个¹⁵N时，特征碎片离子二的标记情况的个数计算如下：存在6种5个¹³C标记特征碎片离子二的情况，存在3种两个¹⁵N标记特征碎片离子二的情况，6和3的乘积为同时包括5个¹³C、2个¹⁵N时，特征碎片离子二的标记情况的个数即18种。以此类推，3个¹³C，2个¹⁵N标记腺苷时：特征碎片离子二的标记情况的个数为4与3的乘积即12种。(未在表1中显示)

表1：基于¹³C、¹⁵N、¹⁸O、³⁴S的腺苷Adenosine标记情况

实施例2

本实施例以谷胱甘肽为例，建立谷胱甘肽的荷质比数据库，谷胱甘肽Glutathione有三分子氨基酸谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸组成。由于谷胱甘肽参与生物体内氧化还原反应，来源具有多样性，不同的同位素标记数量、位置或者同一同位素的不同化合物的标记都得到不同的标记情况，而使用本申请提供的方法只需确定同位素标记元素即可计算所有可能标记情况，如表2所示。

表2：基于¹³C、¹⁵N、¹⁸O、³⁴S的谷胱甘肽Glutathione标记情况

同理，除实施例1和实施例2给出的技术方案外，还可以选用不同元素的不同标记位置的葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、核苷酸、二氧化碳、有机酸等对中心碳代谢通路(比如三羧酸循环、糖酵解通路、磷酸戊糖途径相关化合物)、能量代谢通路、脂肪酸代谢通路、核苷酸代谢通路、一碳代谢通路等进行研究。本申请提供的方法可计算出精确的母离子和碎片离子的质核比，因而可分别用于低分辨、中分辨和高分辨质谱仪中的方法设置和数据分析，具有普适性。

一般选用的示踪剂包括但不限于不同标记位置和不同标记数量C原子的葡萄糖、谷氨酰胺、脂肪酸、氨基酸等，可用于标记的中心碳代谢通路(比如三羧酸循环、糖酵解通路、磷酸戊糖途径相关化合物)的化合物包括并不仅限于柠檬酸、异柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、乙酰辅酶A、葡萄糖、磷酸甘油酸、磷酸甘油、磷酸核糖等。

应用例1：

以稳定同位素¹³C为示踪元素的中心碳代谢及能量代谢通路的标记，基于液相质谱联用仪的稳定同位素¹³C标记的模式生物组织样品的检测；

以¹³C标记的化合物，可主要检测三羧酸循环、糖酵解磷酸戊糖途径、氨基酸代谢、核苷酸代谢、一碳代谢、尿素循环、脂质代谢等，本应用例以¹³C标记的葡萄糖C₆H₁₂O₆作为示踪剂，选取模式生物小鼠的脑和肝脏组织为例进行说明，其具体的实施步骤为：

1)选择葡萄糖为需要检测的目标化合物，利用网络或者软件预测目标代谢物母离子和碎片离子的分子式，以部分氨基酸为例，根据现有技术选取母离子包括：L-丙氨酸(L-Alanine)*C₃H₇NO₂、L-天冬氨酸(L-aspartic acid)*C₄H₇NO₄、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)*C₅H₁₀N₂O₃、L-甘氨酸(L-Glycine)*C₂H₅NO₂、L-异亮氨酸(L-isoLeucine)*C₆H₁₃NO₂、L-赖氨酸(L-lysine)*C₆H₁₄N₂O₂、L-蛋氨酸(L-Methionine)*C₅H₁₁NO₂S、L-苏氨酸(L-Threonine)*C₄H₉NO₃、2-羟戊二酸(2-HG)*C₅H₈O₅、a-酮戊二酸(a-ketoglutarate)*C₅H₆O₅、乌头酸(aconitate)*C₆H₆O₆、柠檬酸(citrate)*C₆H₈O₇、苹果酸(malate)*C₄H₆O₅、乳清酸(Oroticacid)*C₅H₄N₂O₄、琥珀酸(succinate)*C₄H₆O₄；对应的碎片离子依次为：C₂H₆N、C₄H₆NO₃、C₄H₆NO、CH₄N、C₅H₁₂N、C₅H₁₀N、C₄H₁₀NS、C₃H₈NO、C₅H₆O₄、C₄H₆O₃、C₄H₅O₂、C₃H₃O₃、C₃H₃O₂、C₄H₃N₂O₂、C₃H₆O₂。

经本申请提供的预测方法计算可得其标记情况为：

表3：基于¹³C-葡萄糖(¹³C-glucose)的氨基酸和三羧酸循环相关代谢物的母离子和子离子

2)利用表3获得的母离子、子离子信息在液相质谱联用仪上建立采集方法。色谱柱为UPLC ACQUITY BEH Amide(2.1mm×100mm×1.7μm)，柱温为35℃。流动相为A为95％乙腈/5％水溶液(10mM乙酸铵)，流动相为B为50％乙腈/50％水溶液(10mM乙酸铵)，流速为300μL/min。洗脱梯度为2％B相起始并保持2min，1至15min线性升至98％B，在98％B保持2min，然后降至2％并保持3min。将提取好的脑和心脏组织样品进行数据采集。

3)依据表3获得的母离子、子离子信息在数据分析软件上建立数据库，对采集的数据进行搜库分析，分析好的数据经软件扣除自然界干扰后，氨基酸的标记情况如表4。

表4：基于¹³C-葡萄糖(¹³C-glucose)的小鼠脑组织中部分代谢物的标记比例

从表4中可以得出如下结论：

从表4中可以看出三羧酸循环中有机酸以及谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸等氨基酸摄取了大量葡萄糖的碳源进行合成，这与已知的葡萄糖为细胞三羧酸循环提供碳源的结论一致(参考1：生物化学与分子生物学，人民卫生出版社)。

应用例2

以稳定同位素¹⁵N为示踪元素的中心氮代谢及能量代谢通路的标记，基于液相质谱联用仪的稳定同位素¹⁵N标记的细菌样品的检测；

以¹⁵N标记的的化合物，可主要检测三羧酸循环、糖酵解磷酸戊糖途径、氨基酸代谢、核苷酸代谢、一碳代谢、尿素循环、脂质代谢中含氮的化合物等，本应用例以¹⁵N标记的谷氨酰胺作为示踪剂，选取细菌中的肺炎链球菌为例进行说明，其具体的实施步骤为：

1)选择谷氨酰胺为需要检测的目标化合物，利用网络或者软件预测目标代谢物母离子和碎片离子的分子式，以核苷酸代谢部分代谢物为例，根据现有技术选取母离子包括：腺嘌呤(Adenine)*C₅H₅N₅、腺嘌呤核苷酸(AMP)*C₁₀H₁₄N₅O₇P、瓜氨酸(Citrulline)*C₆H₁₃N₃O₃、胞嘧啶核苷酸(CMP)*C₉H₁₄N₃O₈P、胞嘧啶核糖核苷(Cytidine)*C₉H₁₃N₃O₅、谷氨酸(Glutamicacid)*C₅H₉NO₄、单磷酸鸟苷(GMP)*C₁₀H₁₄N₅O₈P、鸟苷(Guanosine)*C₁₀H₁₃N₅O₅、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)*C₂₁H₂₈N₇O₁₄P₂；对应的碎片离子依次为：C₅H₃N₄、O₃P、C₆H₁₁N₂O₃、O₃P、C₄H₆N₃O、C₄H₆NO、O₃P、C₅H₆N₅O、C₁₅H₂₀N₅O₁₃P₂。

经本申请提供的预测方法计算可得其标记情况为：

表5：基于¹⁵N-谷氨酰胺(¹⁵N-glutamine)标记的核苷酸的母离子和子离子

2)利用表5获得的母离子、子离子信息在液相质谱联用仪上建立采集方法。色谱柱为UPLC ACQUITY BEH Amide(2.1mm×100mm×1.7μm)，柱温为35℃。流动相为A为95％乙腈/5％水溶液(10mM乙酸铵)，流动相为B为50％乙腈/50％水溶液(10mM乙酸铵)，流速为300μL/min。洗脱梯度为2％B相起始并保持2min，1至15min线性升至98％B，在98％B保持2min，然后降至2％并保持3min。将提取好的细菌样品进行数据采集。

3)依据表5获得的母离子、子离子信息在数据分析软件上建立数据库，对采集的数据进行搜库分析，分析好的数据经软件扣除自然界干扰后，核苷酸相关代谢物的标记情况如表6。

表6：基于¹⁵N-谷胱甘肽(¹⁵N-glutamine)标记的细菌中核苷酸标记比例

从表6中可以得出如下结论：

从表6中可以看出细胞中核苷酸以及中间产物携带了大量的同位素标记，说明核苷酸合成依赖谷氨酰胺提供氮源，这一结论与现有知识是相同的(参考1：生物化学与分子生物学，人民卫生出版社)。

应用例3

以稳定同位素¹³C为示踪元素的中心碳代谢及能量代谢通路的标记，基于液相质谱联用仪的稳定同位素¹³C标记的模式生物组织样品的检测；

以¹³C标记的化合物，可主要检测三羧酸循环、糖酵解磷酸戊糖途径、氨基酸代谢、核苷酸代谢、一碳代谢、尿素循环、脂质代谢等，本应用例分别以¹³C标记的葡萄糖和谷氨酰胺作为示踪剂，选取293T细胞样品为例进行说明，其具体的实施步骤为：

1)选择分别以¹³C标记的葡萄糖和谷氨酰胺作为需要检测的目标化合物，利用网络或者软件预测目标代谢物母离子和碎片离子的分子式，以三羧酸循环相关代谢物为例，根据现有技术选取葡萄糖母离子包括：乌头酸(aconitate)*C₆H₆O₆、a-酮戊二酸(a-ketoglutarate)*C₅H₆O₅、柠檬酸(citrate)*C₆H₈O₇、苹果酸(malate)*C₄H₆O₅、琥珀酸(succinate)*C₄H₆O₄；对应的碎片离子依次为：C₄H₅O₂、C₄H₆O₃、C₃H₃O₃、C₃H₃O₂、C₃H₆O₂；

根据现有技术选取谷氨酰胺母离子包括：乌头酸(aconitate)*C₆H₆O₆、a-酮戊二酸(a-ketoglutarate)*C₅H₆O₅、柠檬酸(citrate)*C₆H₈O₇、乳酸(lactate)*C₃H₆O₃、苹果酸(malate)*C₄H₆O₅、丙酮酸(pyruvate)*C₃H₄O₃、琥珀酸(succinate)*C₄H₆O₄；对应的碎片离子依次为：C₄H₅O₂、C₄H₆O₃、C₃H₃O₃、C₃H₆O₃、C₃H₃O₂、C₃H₄O₃、C₃H₆O₂；

经本发明方法计算可得其标记情况为：

表7：基于¹³C-谷氨酰胺(¹³C-glutamine)和¹³C-葡萄糖(¹³C-glucose)的三羧酸循环相关代谢物的母离子和子离子

2)利用表7获得的母离子、子离子信息在液相质谱联用仪上建立采集方法。色谱柱为UPLC ACQUITY BEH Amide(2.1mm×100mm×1.7μm)，柱温为35℃。流动相为A为95％乙腈/5％水溶液(10mM乙酸铵)，流动相为B为50％乙腈/50％水溶液(10mM乙酸铵)，流速为300μL/min。洗脱梯度为2％B相起始并保持2min，1至15min线性升至98％B，在98％B保持2min，然后降至2％并保持3min。将提取好的细胞样品进行数据采集。

3)依据表7获得的母离子、子离子信息在数据分析软件上建立数据库，对采集的数据进行搜库分析，分析好的数据经软件扣除自然界干扰后，核苷酸相关代谢物的标记情况如表8。

表8：基于¹³C-葡萄糖(¹³C-glucose)和¹³C-谷氨酰胺(¹³C-glutamine)的哺乳细胞中三羧酸循环相关代谢物的标记比例

从表8中可以得出如下结论：

从表8中可以看出细胞中三羧酸循环有机酸携带了大量来自葡萄糖与谷氨酰胺的标记，且标记状态不同，说明葡萄糖与谷氨酰胺都能够为细胞三羧酸循环提供碳源，并且代谢途径不同造成了标记状态不同。这一结论与现有知识是相同的(参考1：生物化学与分子生物学，人民卫生出版社)。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种化合物的碎片离子预测方法，包括以下步骤：

1)确定用于实验的化合物，确定所述化合物的母离子分子式和碎片离子分子式；

2)根据所述母离子和所述碎片离子的元素组成，根据所述元素组成选取稳定同位素；

3)根据步骤1)确定的化合物、母离子分子式和碎片离子分子式、所述母离子和所述碎片离子中所述稳定同位素元素个数，计算所述母离子和所述碎片离子被所述稳定同位素标记的情况；

4)计算全部所述母离子和全部所述碎片离子被所述稳定同位素标记情况的个数；

5)根据步骤4)中得到的所述标记情况的数量，计算全部所述标记情况中所述母离子和所述碎片离子的精确质量数，获得所述化合物的全部碎片离子；

步骤4)中计算全部所述碎片离子被所述稳定同位素标记情况的个数的方法包括：

a)选取所述稳定同位素的种类为1种，所述化合物对应的母离子种类为1种，所述母离子对应的碎片离子种类为1种；

b)记所述母离子中可以被所述稳定同位素标记的元素个数为x个，所述碎片离子中可以被所述稳定同位素标记的元素个数为y个；

若母离子中实际被标记的元素个数a与y之和大于x时，则所述碎片离子中标记元素的数量为a+y-x个、a+y-x+1个、a+y-x+2个至z个，当所述a+y-x＝z时，所述标记情况的数量为1种；当a+y-x≠z时，所述标记情况的数量为z-(a+y-x)+1种；

若母离子中实际被标记的元素数a与y之和不大于x时，则所述碎片离子标记元素数量为0、1、至z个；所述标记情况的数量为z+1种；

z取a和y最小值。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预测方法还包括步骤6)根据获得的所述化合物的全部碎片离子，建立所述全部碎片离子的质荷比数据库。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物的数量可以为一个或两个以上。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中所述母离子和所述碎片离子为所述化合物通过软件预测、文章报道、网站数据库查询到的所述母离子和所述碎片离子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述稳定同位素选自C、H、N、O和S中的稳定同位素的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，当选取所述稳定同位素的种类大于1种时，分别计算每一种稳定同位素的母离子标记情况和碎片离子标记情况的数量；

将每一种所述稳定同位素的母离子标记情况的数量的乘积即为所述稳定同位素的种类大于1种时所述母离子标记情况的数量；

将每一种所述稳定同位素的碎片离子标记情况的数量的乘积即为所述稳定同位素的种类大于1种时所述碎片离子标记情况的数量。

7.一种检测装置，所述检测装置在使用过程中使用权利要求1至6中任一项所述的化合物的碎片离子的质荷比数据库。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物的碎片离子预测方法建立的碎片离子质荷比数据库的应用，用于代谢流检测。

9.根据权利要求8的所述的应用，其中，所述应用用于未知代谢物与标记物之间代谢关系情况下的代谢流检测。

10.根据权利要求8或9的所述的应用，其中，所述数据库用于低分辨率色谱仪或更高分辨率的色谱质谱仪。

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