DE102018000832B4

DE102018000832B4 - Hochauflösende MS1-basierte Quantifizierung

Info

Publication number: DE102018000832B4
Application number: DE102018000832.1A
Authority: DE
Inventors: Yue XUAN
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2021-12-02
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: CN108389772A; US10989698B2; GB2559395B; US20200264142A1; DE102018000832A1; US10656127B2; GB201701857D0; US20180224406A1; GB2559395A; CN108389772B

Abstract

Datenunabhängiges Erfassungsverfahren der Massenspektrometrie zum Analysieren einer Probe, wobei das Verfahren innerhalb eines auf einer Breite eines chromatografischen Peaks der Probe beim Eluieren aus einem Chromatografiesystem basierenden Zeitraums durchgeführt wird, umfassend folgende Schritte:Ionisieren der Probe zum Erzeugen einer Mehrzahl von Vorläuferionen;Auswählen eines interessierenden Vorläufer-Massenbereichs für die zu analysierende Probe;Durchführen einer Mehrzahl von MS1-Scans, wobei jeder der MS1-Scans umfasst:Scannen von Vorläuferionen der Probe über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich unter Verwendung eines Massenanalysators (110), der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung von mindestens 50.000 bei m/z=200 u (amu) betrieben wird, zum Identifizieren und/oder Quantifizieren der Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich; undErhalten eines Satzes MS2-Scans durch:Segmentieren des interessierenden Vorläufer-Massenbereichs in eine Mehrzahl von Vorläufer-Massenbereichssegmenten, dabeifür jedes Vorläufer-Massenbereichssegment:Fragmentieren der Vorläuferionen innerhalb dieses Massenbereichssegments, undDurchführen eines MS2-Scans des fragmentierten Massenbereichssegments mit dem Massenanalysator (110), der mit einer zweiten, relativ niedrigeren Auflösung betrieben wird, sodass jedes der fragmentierten Probensegmente über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich in der MS2-Domäne fragmentiert und gescannt wird,wobei die Durchführung der MS1-Scans während der gesamten Durchführung jedes Satzes MS2-Scans verschachtelt ist, sodass die MS1-Scans ein Massenchromatogramm der Probe bereitstellen; undhöchstens 2 Sätze MS2-Scans erhalten werden.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die datenunabhängige Analyse (DIA) von organischen und insbesondere biologischen Proben wie z. B. Proteinen, Peptiden, Metaboliten, Lipiden und dergleichen. Sie betrifft insbesondere eine hochauflösende datenunabhängige Identifizierungs- und Quantifizierungstechnik mit Anwendungen in der Proteomik, Metabolomik, Lipidomik usw.
Hintergründe der Erfindung
Die Massenspektrometrie ist eine seit langem eingeführte Technik zur Identifizierung und Quantifizierung von häufig komplexen Gemischen von großen organischen Molekülen. In den letzten Jahren wurden Techniken entwickelt, die die Analyse einer breiten Palette von sowohl biologischen als auch nicht-biologischen Materialien ermöglichen, mit Anwendung über die Gebiete der Strafverfolgung (z. B. Identifizierung von Drogen und Sprengstoffen), Umwelt, wissenschaftliche Forschung und Biologie (z. B. in der Proteomik, der Untersuchung von einfachen und komplexen Proteingemischen, mit Anwendungen in der Entdeckung von Wirkstoffen, Identifizierung von Krankheiten usw.).
Proteine, die große Mengen Aminosäuren umfassen, weisen typischerweise ein signifikantes Molekulargewicht auf. Die genaue Identifikation und Quantifizierung des Proteins durch direkte massenspektrometrische Messung ist anspruchsvoll. Deshalb ist die Durchführung der Fragmentierung des Vorläufer-Probenmaterials gut bekannt. Es ist eine Mehrzahl von Fragmentierungstechniken bekannt, die zur Generierung von verschiedenen Fragmentionen aus den Vorläuferionen führen können. Weiterhin kann der Fragmentierungsmechanismus durch verschiedene angelegte Fragmentierungsenergien beeinflusst werden.
Eine Anzahl von unterschiedlichen Anordnungen ist für die Bildung von Fragmentionen aus Vorläufern bekannt. So umfasst z. B. die TSQ™ Tripel-Quadrupol-Gerätegruppe, die von Thermo Fisher Scientific LLC vertrieben wird, drei normalerweise aus einem Flüssigkeitschromatografen (LC) mit Probenionen versorgte Quadrupole zur Tandem-Massenspektrometrie. Der erste Quadrupol fungiert als ein Massenfilter, um eine vom LC zugeführte Reihe von Vorläuferionen auszuwählen. Der zweite Quadrupol bewirkt die Fragmentierung der vom ersten Quadrupol ausgewählten Ionen, typischerweise durch Nutzung eines Kollisionsgases. Der dritte Quadrupol fungiert dann als ein Massenfilter, typischerweise im Scan-Modus, um den Erhalt eines Massenspektrums von Häufigkeit gegenüber m/q (Masse-/Ladungsverhältnis) zu ermöglichen.
Anstelle eines Tripel-Quadrupolsystems kann die Endstufe der Massenanalyse nach der Fragmentierung mit Hilfe anderer Vorrichtungen durchgeführt werden, wie z. B. eines Time-of-Flight-Massenspektrometers, eines Fourier-Transformationslonenzyklotronresonanz-(FT-ICR)-Massenspektrometers, Orbitalfallen-Massenspektrometers wie dem Orbitrap® oder dergleichen. Jeder einzelne Endstufen-Massenanalysator hat seine eigenen Vor- und Nachteile in Bezug auf z. B. Massenauflösung, Arbeitszyklus, Empfindlichkeit, Kosten usw.
Die Analyse von Proben kann in groben Zügen in datenunabhängige Analyse/Erfassung (DIA) und datenabhängige Analyse/Erfassung (DDA) unterteilt werden. DIA dient zur Bestimmung, was in einer Probe von potenziell unbekannter Identität vorliegt. Um die Molekularstruktur von Probenmolekülen zu bestimmen, ist der erste Massenfilter in einem Tandem-Massenspektrometer dazu eingestellt, alle Ionen innerhalb eines ausgewählten m/z-Bereichs durchzulassen. Dieser Bereich von Vorläuferionen wird dann auf der zweiten Stufe des Tandem-Massenspektrometers fragmentiert und die entstehenden Fragmente werden nachfolgend auf der dritten Stufe des Tandem-Massenspektrometers analysiert, wobei es sich um einen Linearquadrupol, eine TOF-Vorrichtung oder andernfalls wie vorstehend erwähnt, handeln kann. Bei der Breitband-DIA (auch bekannt als „Allmassen-/Allionen-MS/MS“) werden Tandem-Massenspektren durch Fragmentieren all der Ionen, die zu einer gegebenen Zeit in das Massenspektrometer eintreten, erfasst. Alternativ können m/z-Bereiche der Vorläuferionen sequenziell isoliert, fragmentiert und dann die Fragmente detektiert werden.
Dagegen dient DDA zur Bestätigung, dass eine oder mehrere Spezies in einer gegebenen Probe vorliegt/vorliegen. DDA-Verfahren identifizieren eine feste Anzahl von Vorläufer-Ionenspezies und wählen und analysieren diese mittels Tandem-Massenspektrometrie. Die Bestimmung, welche Spezies von Vorläuferionen in der DDA von Interesse sind, kann auf einer Intensitätsrangfolge basieren (z. B. die zehn häufigsten Spezies, wie sie durch Peaks in einem Vorläufer-Massenspektrum beobachtet werden, nachstehend als „MS1“ bezeichnet), oder durch Definieren einer „Auswahlliste“ von Peaks von Vorstufen-Massenspektren (z. B. durch Benutzerauswahl), von denen stets Fragmentspektren - nachstehend als „MS2“ bezeichnet - erfasst werden, unabhängig von der Intensitätsrangfolge des Peaks im Vorstufen-Massenspektrum (MS1). Oder es kann eine „Ausschlussliste“ von Peaks in MS1 definiert werden, z. B. durch einen Benutzer, basierend z. B. auf Vorwissen über den erwarteten Probeninhalt.
DIA vermeidet die in DDA erforderlichen Entscheidungen, indem einfach der interessierende Massenbereich (typischerweise benutzerdefiniert) in Segmente unterteilt wird und für jedes Segment MS2-Spektren erhalten werden (anders als im vorstehend aufgeführten spezifischen Fall der Breitband-DIA). Bei DIA wird die Erfassung eines MS1-Vorläuferspektrums mehr oder weniger optional, da die Parameter des Vorläufer-Auswahlfensters selbst Informationen über den Bereich möglicher Vorläuferionen beinhalten.
Frühe DIA-Techniken wurden in Patentanmeldungen von Micromass UK Ltd und Water Technologies Corporation in deren so genannten MS^E-Anordnungen offenbart. Die DIA-Techniken gingen auf die Anwendung von bekannten Tripel-Quadrupol-Verfahren auf Quadrupol-TOF-Anordnungen zurück.
In US 6,717,130 B2 ist eine Technik offenbart, in der MS1 und MS2 alternativ durch wiederholtes Umschalten der Energie der Fragmentierungszelle erfasst werden. Die Technik stützt sich auf die Trennung der Probenmoleküle durch unterschiedliche Elutionszeiten in einer Chromatografieumgebung. Am Ende einer Versuchsreihe werden Vorläufer- und Fragmentionen durch Vergleichen der Massenspektren in den beiden verschiedenen Fragmentierungsmodi erkannt. Fragmentionen werden bestimmten Vorläuferionen auf der Basis der Passgenauigkeit von deren Elutionszeiten zugeordnet, sodass die Vorläuferionen dann identifiziert werden können.
US -6,982,414 B2 offenbart eine Entwicklung der DIA-Technik im vorstehend beschriebenen '130-er Patent. Hier wird die auf die Fragmentierungszelle angelegte Energie erneut wiederholt umgeschaltet, um sowohl MS1 als auch MS2 zu erhalten. Hier erhält man allerdings MS1 und MS2 getrennt sowohl aus einer ersten als auch einer zweiten Probe.
Dann werden die Massenspektren verglichen und die weitere Analyse durchgeführt, wobei Vorläuferionen in MS1 von jeder Probe, oder Fragmentionen in MS2 von jeder Probe unterschiedlich exprimiert sind.
Schließlich verwendet US 7,800,055 B2 wieder die Umschaltung zwischen Energiepegeln in der Fragmentierungskammer, um abwechselnd MS1 und MS2 zu generieren. Der Vergleich der chromatografischen Peak-Form der Vorläufer- und Fragment-Peaks wird zur Identifizierung einer Verbindung zwischen Vorläufer- und Fragment-(Produkt-)lonen durchgeführt.
Ein alternativer Ansatz für DIA, der unter der Bezeichnung „SWATH“ bekannt ist, wurde in verschiedenen Patenten an DH Technologies Development Pte. Ltd. vorgeschlagen.
In US8,809,770 B2 wird ein DIA-Datensatz erfasst, sodass die Daten nachfolgend auf eine Zielsubstanz analysiert werden können. Dies steht im Gegensatz zu der Vorstellung, ein Ziel festzulegen und dann Daten nur zu diesem Zweck zu erfassen. Das Verfahren bedient sich der LC-MS und verwendet ein breites Fenster von Vorläuferionen (z. B. >10, >15, >20 u (amu)) für MS2, wobei der gesamte Vorläuferraum abgedeckt werden kann.
Wiederum betont das '770-er Patent, wie wichtig es ist, die Genauigkeit der chromatografischen Peaks im MS2-Spektrum durch geeignetes Einstellen der Fenster zu erhalten. Ein MS1-Spektrum wird als optional angegeben.
Als Beispiel beschreibt das '770-er Patent ein Verfahren - ähnlich der Einzelreaktionsüberwachung (single reaction monitoring - SRM) - zur Auswertung der MS2-Daten eines Vorläufer-Massenfensters als eine Funktion der Verweilzeit, und für den anschließenden Vergleich mit einer Referenzspektrenbibliothek.
US 8,809,772 B2 verwendet Fenster zum Isolieren der Vorläuferionen, die unterschiedliche Breite aufweisen, wobei die Breite von der Vorläufermasse abhängig ist. Das Verfahren bietet einen Kompromiss zwischen der Geschwindigkeit der Analyse (bei einem breiten Fenster) und ihrer Empfindlichkeit/Spezifität (bei einem engen Fenster).
US 9,343,276 B2 behandelt Nachteile in Verbindung mit den in US 8,809,770 B2 offenbarten Verfahren durch Scoring von Peak-Kandidaten eines extrahierten lonenchromatogramms (XIC) basierend auf verschiedenen Kriterien, in einem Vergleich zwischen den XIC-Fragment-Peaks mit der MS1-Information, wie z. B. Massengenauigkeit, Ladungszustand, Isotopenzustand, bekannte Neutralverluste usw.
Ein häufiger Aspekt des Ansatzes bei den vorstehend beschriebenen MS^E- und SWATH-Techniken besteht darin, dass sie optimierte Messungen für eine gute MS2-Zeitauflösung anstreben. Um ausreichend Datenpunkte über den LC-Peak für eine gute Quantifizierung zu erhalten, muss entweder ein relativ breites Fenster für das Isolieren von Vorläufern (24u (Da)) - wie in den vorstehend genannten MS^E-Patenten vorgeschlagen - oder ein Fenster von variabler Breite für das Isolieren von Vorläufern (der bevorzugte Ansatz für die vorstehend behandelten SWATH-Patente) verwendet werden.
Daraus folgt, dass die traditionelle Datenbanksuche - in der Probenfragmentspektren mit Fragmentspektren von bekannten Spezies in einer Bibliothek verglichen werden, wie es bei DDA der Fall ist - eventuell nicht gut geeignet für die DIA-Datenanalyse sind. Bei der SWATH-Technik muss zuerst eine große Spektralbibliothek (für dieselben oder ähnliche Probentypen) für die gezielte Extraktion von MS2-Chromatogrammen aus konvolutierten Spektren erzeugt werden, was eine kostspielige und zeitraubende Aufgabe darstellt.
In „MS1 Based Quantification Optimization on DIA-Verfahrens on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer“, Yue Xuan et al (verfügbar unter https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/PN-64738-MS1-Based-Quantification-ASMS2016-PN64738-EN.pdf) wird ein Verfahren zur DIA-Analyse offenbart, in dem ein einziger MS1-Scan mit einer Auflösung von 120.000 über einen m/z-Bereich von 350 bis 1650 Th durchgeführt wird und ein Satz segmentierter MS2-Scans über den gesamten Massenbereich (350 bis 1650) mit einer Auflösung von 30.000 innerhalb einer Gesamt-Arbeitszykluszeit von 2 Sekunden durchgeführt wird. Der kombinierte MS1- und MS2-Arbeitszyklus wird mehrmals über die Laufzeit eines LC-Peaks durchgeführt, um eine Mehrzahl von Datenpunkten je Peak zur Identifizierung und Quantifizierung bereitzustellen. Die hohe Auflösung des MS1-Scans kann die Interferenzen vom interessierenden Analyten unterscheiden.
Sogar dann erfordern bei komplexen Proben die DIA-Ansätze nach dem früheren Stand der Technik eine hohe MS/MS-Scangeschwindigkeit und Wiederholrate, sowie relativ breite MS/MS-Fenster, sodass ausreichend Datenpunkte in der MS/MS-Domäne zur Quantifizierung in der Fragmentdomäne und für eine erfolgreiche Ausrichtung zwischen den MS1- und MS2-Datenströmen vorliegen. Ein Durchsatz von so hoher Geschwindigkeit ist für hochauflösende Massenanalysatoren nicht optimal.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung versucht, die Unzulänglichkeiten von bestehenden DIA-Ansätzen zu behandeln. Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur datenunabhängigen Analyse (DIA) nach Anspruch 1 bereitgestellt. Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Massenspektrometer nach Anspruch 15.
Die vorliegende Erfindung schlägt somit eine DIA-Technik vor, bei der hochauflösende Identifizierung und/oder Quantifizierung der Probe in der MS1-Domäne (d. h. mit den Vorläufer- (unfragmentierten) Ionen) ausgeführt wird. Beispielsweise kann ein Orbitalfallen-Massenanalysator (z. B. der Orbitrap® von Thermo Fisher Scientific, Inc.) mit einer Auflösung von 100.000 oder mehr verwendet werden, um ein MS1-Massenspektrum zu erhalten, aus dem Vorläufer-Ionenspezies identifiziert und quantifiziert werden können. Infolge der in der MS1-Domäne verwendeten relativ hohen Auflösung ist es möglich, zwischen zwei verschiedenen Probenmolekülen mit niedrigen Massendifferenzen zu unterscheiden, z. B. kann eine MS1-Scan-Auflösung von 120.00 zwischen Peptiden mit einer Massendifferenz von ca. 30 ppm (Teilen pro Million). Der Orbitalfallen-Massenanalysator wird ebenfalls dazu verwendet, MS2-Spektren mit niedrigerer Auflösung zu erhalten, um eine sekundäre Bestätigung der vorläufigen Identifizierung basierend auf der Analyse von MS1 zu erhalten.
In der vorliegenden Offenbarung wird Bezug genommen auf Auflösungen eines Massenanalysators. Alle Auflösungen, auf die in dieser Offenlegung Bezug genommen wird, werden vom Fachmann verstanden als bezogen auf eine Auflösung eines Massenanalysators mit einem Masse-Ladungsverhältnis (m/z) gleich 200 u (amu) (m/z=200 u (amu)). Der Fachmann wird verstehen, dass das m/z-Verhältnis, mit dem die Auflösung des Massenanalysators angegeben ist, nur die Auflösung des Massenanalysators bei diesem m/z-Wert angibt und nicht an den m/z-Bereich gebunden ist, über den mit dem Massenanalysator nach der Methodik der vorliegenden Erfindung gescannt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein datenunabhängiges Erfassungsverfahren der Massenspektrometrie zum Analysieren einer Probe, wenn sie aus einem Chromatografiesystem eluiert. Als solches muss das DIA-Verfahren der vorliegenden Erfindung über einen Zeitraum basierend auf einer Breite eines chromatografischen Peaks (d. h. der Laufzeit eines chromatografischen Peaks) einer Probe ausgeführt werden, wenn sie aus dem Chromatografiesystem eluiert. Das Verfahren beinhaltet den Schritt der Ionisierung der Probe zur Erzeugung einer Mehrzahl von Vorläuferionen und den Schritt des Auswählens eines interessierenden Vorläufer-Massenbereichs für die zu analysierende Probe. Das Verfahren beinhaltet ebenfalls die Durchführung einer Mehrzahl von MS1-Scans, wobei jeder der MS1-Scans umfasst: Scannen von Vorläuferionen der Probe über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich, Einsatz eines Massenanalysators, der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung, zur Identifizierung und/oder Quantifizierung der Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich betrieben wird. Das Verfahren beinhaltet auch die Durchführung eines Satzes MS2-Scans (und von höchstens zwei Sätzen MS2-Scans), wobei der Satz MS2-Scans umfasst: Segmentieren des interessierenden Vorläufer-Massenbereichs in eine Mehrzahl von Vorläufer-Massenbereichssegmenten, wobei für jedes Vorläufer-Massenbereichssegment die Vorläuferionen innerhalb dieses Massenbereichssegments fragmentiert werden, und Durchführen eines MS2-Scans vom fragmentierten Massenbereichssegment mit dem Massenanalysator, der bei einer zweiten, relativ niedrigeren Auflösung betrieben wird, sodass jedes der fragmentierten Probensegmente über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich fragmentiert und in der MS2-Domäne gescannt wird. Das Verfahren sieht ebenfalls vor, dass die MS1-Scans während der gesamten Durchführung des Satzes MS2-Scans verschachtelt sind.
Die Mehrzahl von MS1-Scans der Vorläuferionen der Probe werden über den interessierenden Massenbereich durchgeführt, sodass jeder MS1-Scan zur Quantifizierung und/oder Identifizierung der Probe in der MS1-Domäne über den gesamten interessierenden Massenbereich geeignet ist. Als solches versteht sich, dass jeder der MS1-Scans sich im Wesentlichen über den gesamten interessierenden Massenbereich erstreckt. Die MS1-Scans werden mittels eines Massenanalysators durchgeführt, der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung zur Quantifizierung der Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Massenbereich betrieben wird. Als solche ist die relativ hohe Auflösung des Massenanalysators eine Auflösung, die ausgewählt wird, um Interferenzen von Matrix- oder anderen Probenionen im MS1-Scan zu reduzieren oder zu minimieren und am bevorzugtesten zu unterbinden, wodurch die Identifizierung und Quantifizierung der Vorläufer-Probenionen in der MS1-Domäne ermöglicht wird. Die relativ hohe Auflösung der MS1-Scans wird mit einer Auflösung von mindestens 50.000 durchgeführt, um ausreichend zwischen Vorläuferionen mit ähnlichen Massen zu unterscheiden, sodass die genaue Quantifizierung und/oder Identifizierung in der MS1-Domäne durchgeführt werden kann. Die relativ hohe Auflösung der MS1-Scans wird auch in Bezug auf die Auflösung der durchgeführten MS2-Scans definiert, die an anderer Stelle detaillierter beschrieben wird.
Die MS1-Scans werden mehrmals, verschachtelt mit der Durchführung der einzelnen MS2-Scans des Sets, durchgeführt. Als solche werden die MS1-Scans während der gesamten Durchführung eines Satzes MS2-Scans mehrmals wiederholt, um die Vorläuferionen in der MS1-Domäne über die Laufzeit des chromatografischen Peaks abzutasten. Als solche liefern die MS1-Scans ein Massenchromatogramm der Probe, wenn sie aus dem Chromatografiesystem eluiert. Vorzugsweise werden die MS1-Scans mindestens 3 Mal, bevorzugter mindestens 5 Mal und am bevorzugtesten mindestens 7 Mal über die Laufzeit eines chromatografischen Peaks durchgeführt. Durch mehrfaches Wiederholen des MS1-Scans kann eine genauere Quantifizierung der Vorläuferionen festgestellt werden. Als solche können die MS1-Scans wiederholt werden, um eine Probe von Vorläuferionen mehrmals abzutasten, z. B. mit einer Abtastrate. Wo die Probe aus einer LC-Säule eluiert (d. h. prozessaufwärts der lonenquelle des Massenspektrometers), wird die zuvor genannte Anzahl von MS1-Scans vorzugsweise innerhalb eines Zeitraums basierend auf der Breite eines LC-Peaks der Probe durchgeführt. Beispielsweise kann der Zeitraum einem Zeitraum entsprechen, der gleichwertig der Breite eines LC-Peaks, vorzugsweise an seiner Basis, ist, wie er aus 4 Standardabweichungen des LC-Peaks berechnet wird. Die Abtastrate der MS1-Scans kann vorbestimmt sein, oder die Abtastrate kann als Reaktion auf eine Veränderung in der Probenzufuhr unterschiedlich sein, zum Beispiel aufgrund einer erkannten Veränderung im Elutionsprofil von einer LC-Säule (zum Beispiel einer erkannten Veränderung bei der Standardabweichung). Die variable Steuerung der MS1-Scans ist nachstehend detaillierter beschrieben.
Zur Durchführung von jedem der MS2-Scans in einem Satz MS2-Scans wird der interessierende (Vorläufer-) Massenbereich in eine Mehrzahl von (Vorläufer-) Massenbereichssegmente mittels eines Massenselektors, wie z. B. eines Quadrupol-Massenfilters, segmentiert. Es können andere Massenselektoren als ein Quadrupol-Massenfilter zur Anwendung kommen, zum Beispiel einschließlich Massenselektoren, bei denen ein Isolieren in einer Ionenfalle oder einer anderen Vorrichtung erfolgt, die kein Massenfilter ist. Der Quadrupol-Massenfilter filtert (oder ansonsten ein Massenselektor selektiert) die Vorläufer-Probenionen basierend auf einem im Vergleich zum interessierenden Vorläufer-Massenbereich relativ kleinen Massenbereichssegment. Durch Segmentieren der Vorläufer-Probenionen in relativ kleine Massenbereichssegmente können die aus dem Satz MS2-Scans erhaltenen Informationen zum Validieren der Quantifizierungs-/Identifizierungsdaten von den MS1-Scans verwendet werden. Ein Satz MS2-Scans ist so zu verstehen, dass er das Durchführen eines einzigen MS2-Scans für jedes der relativ kleinen Massenbereichssegmente über den gesamten interessierenden Massenbereich bedeutet.
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die MS1-Scans während der Durchführung des Satzes MS2-Scans verschachtelt. Durch derartiges Verschachteln der MS1-Scans mit den MS2-Scans wird die MS1-Domäne während des gesamten DIA-Verfahrens mehrmals durch den Massenanalysator abgetastet, um eine genauere Quantifizierung der Vorläuferionen bereitzustellen, während das Abtasten aller Massenbereichssegmente im Satz MS2-Scans nur einmal erfolgt. Vorteilhafterweise wird durch Verschachteln der MS1-Scans mit den MS2-Scans die Abtastrate in der MS1-Domäne gegenüber der Abtastrate des Satzes von Scans in der MS2-Domäne erhöht. Die Erfinder nach diesem Dokument haben erkannt, dass in einem DIA-Verfahren, das sich der MS2-Domäne nur zur Validierung bedient, die Abtastrate der Scan-Sätze in der MS2-Domäne gegenüber der Abtastrate in der MS1-Domäne reduziert werden kann. Insbesondere haben die Erfinder nach diesem Dokument ein DIA-Verfahren entwickelt, wobei höchstens zwei Sätze MS2-Scans über die Laufzeit eines chromatografischen Peaks durchgeführt werden. Die Erfinder nach diesem Dokument haben realisiert, dass durch Durchführen von hochauflösenden MS1-Scans (Auflösung >60.000) zur Quantifizierung/Identifizierung der Probe keine regelmäßige Abtastung der MS2-Domäne über den chromatografischen Peak erfolgen muss, da die MS2-Daten zur Validierung der MS1-Daten verwendet werden. Als solche haben die Erfinder nach diesem Dokument eine DIA-Methodik entwickelt, bei der es nicht erforderlich ist, ein Massenchromatogramm in der MS2-Domäne zu erhalten, und somit die Anzahl der Sätze MS2-Scans signifikant reduziert werden kann. Daher wird durch Durchführen von höchstens zwei Sätzen MS2-Scans über einen chromatografischen Peak die zum Durchführen jedes MS2-Scans innerhalb eines Satzes verfügbare Zeit verlängert. Als solche kann die Qualität der Scansätze in der MS2-Domäne optimiert (verbessert) werden, z. B. können die Massenbereiche der Massenbereichssegmente für den Satz MS2-Scans reduziert und/oder die Auflösung erhöht werden. Alternativ kann die zur Durchführung des DIA-Verfahrens nach dieser Erfindung benötigte Gesamtzeit reduziert werden. Durch Durchführen von zwei Sätzen MS2-Scans über den chromatografischen Peak kann das Signal-/Rauschverhältnis verbessert werden, das Verfahren kann aber auch mit nur einem Satz MS2-Scans durchgeführt werden. Durch Durchführung von nur einem einzigen Satz MS2-Scans wird die zum Durchführen des Satzes MS2-Scans verfügbare Zeit verdoppelt (gegenüber der Durchführung von zwei Sätzen MS2-Scans). Alternativ kann durch Reduzieren der Anzahl der durchzuführenden Sätze von MS2-Scans mehr Zeit über die Laufzeit des chromatografischen Peaks zur Durchführung der MS1-Scans verwendet werden. Somit kann die Anzahl der durchgeführten MS1-Scans erhöht werden, oder die Auflösung von jedem MS1-Scans kann erhöht werden. Als solche bietet die DIA-Methodik nach der vorliegenden Erfindung Verbesserungen sowohl in der MS1- als auch der MS2-Domäne, verglichen mit Verfahren nach dem früheren Stand der Technik.
Der Schritt des Auswählens eines interessierenden Vorläufer-Massenbereichs für die zu analysierende Probe kann eines oder mehrere vom Auswählen einer Untergrenze für den Vorläufer-Massenbereich, Auswählen einer Obergrenze für den Vorläufer-Massenbereich oder Auswählen einer Massenfensterbreite für den Vorläufer-Massenbereich beinhalten. Die Steuerung kann einen Massenselektor (Massenfilter) steuern, Ionen zu filtern, die während des MS1-Scans nicht innerhalb des interessierenden Massenbereichs liegen. Durch Filtern von Ionen, die nicht innerhalb des interessierenden Massenbereichs liegen, kann die Genauigkeit des MS1-Scans verbessert werden.
Der interessierende Vorläufer-Massenbereich kann auf einem m/z-Verhältnis basieren. Eine Untergrenze für den Vorläufer-Massenbereich kann durch ein m/z-Verhältnis größer als 0, oder bevorzugter mindestens 10, oder mindestens 20, oder mindestens 50 definiert werden. Vorzugsweise kann die Untergrenze ein m/z-Verhältnis von mindestens 100, oder mindestens 200 oder mindestens 300 und am bevorzugtesten ein m/z-Verhältnis von mindestens 400 sein. Eine Obergrenze für den Vorläufer-Massenbereich kann durch ein m/z-Verhältnis von nicht größer als 4000 definiert werden. Vorzugsweise kann die Obergrenze für den Vorläufer-Massenbereich durch ein m/z-Verhältnis von nicht größer als 2000, oder nicht größer als 1600 oder bevorzugter von nicht größer als 1200 definiert werden. Durch Begrenzen des in den MS1-Scans zu analysierenden Massenbereichs auf einen interessierenden Massenbereich kann ein relativ hochauflösender Scan über den interessierenden Massenbereich für eine gegebene Arbeitstakt-Laufzeit durchgeführt werden. Alternativ wird der Fachmann jedoch erkennen, dass ein interessierender Massenbereich durch eine Massenfensterbreite und eines von einer oberen Massengrenze oder einer unteren Massengrenze definiert werden kann. Eine Massenfensterbreite kann definiert werden durch einen m/z-Verhältnisbereich von mindestens 100, oder bevorzugter mindestens 500, oder mindestens 750, oder mindestens 1000, oder mindestens 2000, oder mindestens 4000. Entsprechend können unterschiedliche interessierende Massenbereiche durch das datenunabhängige Erfassungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Durch Reduzieren des ausgewählten interessierenden Massenbereichs kann die zur vollständigen Durchführung des DIA-Verfahrens benötigte Gesamtzeit verringert werden. Entsprechend ist es für den Bediener vorteilhaft, einen interessierenden Massenbereich für das Verfahren vor den Scan-Schritten vorgeben/auswählen zu können.
Entsprechend einem ausgewählten interessierenden Massenbereich werden MS1-Scans der Vorläuferionen der Probe über den interessierenden Massenbereich durchgeführt. Die MS1-Scans werden mittels eines Massenanalysators durchgeführt, der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung zur Quantifizierung der Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Massenbereich betrieben wird. Die für den MS1-Scan verwendete relativ hohe Auflösung ist eine Auflösung von mindestens 50.000 und bevorzugter mindestens 60.000, oder mindestens 75.000, oder mindestens 100.000, oder mindestens 120.000 (Beispiele für hohe Auflösungen, die in einem Orbitalfallen-Massenanalysator, wie z. B. einem Orbitrap™ Massenanalysator von Thermo Fisher Scientific erreicht werden können, betragen dabei 120.000 oder 240.000). Durch Verwendung einer Auflösung von mindestens 50.000 für die MS1-Scans können die Vorläuferionen auf geeignete Weise in der MS1-Domäne quantifiziert werden, während Interferenzen von anderen Vorläuferionen oder Matrixionen im MS1-Scan minimiert werden.
Vorzugsweise ist der zur Durchführung der Scans verwendete Massenanalysator ein Orbitalfallen-Massenanalysator. Vorteilhafterweise können unter Verwendung eines Orbitalfallen-Massenanalysators MS1-Scans mit einer relativ hohen Auflösung durchgeführt werden und ein Satz MS2-Scans kann mit einer relativ niedrigen Auflösung durchgeführt werden, während ein relativ kompakter Massenanalysator eingesetzt wird. Vorzugsweise dient der Orbitalfallenanalysator zur Durchführung von MS1-Scans mit einer Auflösung von mindestens 50.000, um eine verbesserte Quantifizierung von Vorläuferionen in der MS1-Domäne bereitzustellen. Beispielsweise kann eine relativ hohe Auflösung für den Orbitalfallen-Massenanalysator nach der vorliegenden Erfindung mindestens 100.000 betragen, und eine relativ niedrige Auflösung (für die MS2-Scans) kann weniger als 60.000, oder weniger als 50.000, oder weniger als 40.000, bevorzugter weniger als 30.000 betragen. In einigen Ausführungsformen können Auflösungen für die MS2-Scans von weniger als 20.000, oder weniger als 15.000, oder weniger als 10.000 (z. B. 7.500) ausreichend sein, wodurch die Verwendung von engeren Massenbereichssegmenten möglich ist, was das Validieren der Identifizierung/Quantifizierung der Vorläuferionen unterstützt. Entsprechend kann ein Orbitalfallen-Massenanalysator im vorliegenden Verfahren dazu eingesetzt werden, die Auflösung des MS1-Scans zur Quantifizierung der Vorläuferionen zu optimieren, während die Auflösung der MS2-Scans optimiert wird, um die Quantifizierung der Vorläuferionen zu validieren. Obwohl ein Orbitalfallen-Massenanalysator vorzugsweise dazu verwendet werden kann, die relativ hohe Auflösung von mindestens 100.000 bereitzustellen, wird der Fachmann verstehen, dass andere Massenanalysatoren mit einer Auflösung von mindestens 100.000 ebenfalls geeignet wären. Beispielsweise kann ein Mehrfachreflexions-Flugzeit-Massenspektrometer oder ein Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-(FT-ICR)-Massenspektrometer verwendet werden. Die hohe Massengenauigkeit des Orbitalfallen-Massenanalysators oder FT-ICR-Massenanalysators ermöglicht eine hohe Zuverlässigkeit der Identifizierung von Proben aus den MS1-Scans, wobei die MS2-Scans die Identifizierung bestätigen. Bevorzugter kann ein Massenanalysator (z. B. ein Orbitalfallen-Massenanalysator) dazu verwendet werden, MS1-Scans mit einer relativ hohen Auflösung von mindestens 120.000, oder mindestens 130.000, oder mindestens 140.000 oder mindestens 150.000 durchzuführen. Durch Erhöhen der Auflösung der MS1-Scans wird die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Probenionen und Matrixionen verbessert, wodurch die Genauigkeit der Proben-Quantifizierung verbessert wird.
Der(die) Satz(Sätze) MS2-Scans wird(werden) mit einer relativ niedrigeren als der für die MS1-Scans verwendeten Auflösung durchgeführt. Vorzugsweise beträgt die Auflösung des Massenanalysators in der MS2-Domäne weniger als die Hälfte der Auflösung des Massenanalysators in der MS1-Domäne. Bevorzugter beträgt die Auflösung des Massenanalysators in der MS2-Domäne weniger als 40%, oder weniger als 30%, oder weniger als 25%, oder in einigen Ausführungsformen ca. 25%, oder weniger als 10% der Auflösung des Massenanalysators in der MS1-Domäne. Da die Quantifizierung in der MS1-Domäne durchgeführt wird, kann die Auflösung von Scans in der MS2-Domäne reduziert werden, ohne die Quantifizierungsgenauigkeit zu beeinträchtigen.
Vorzugsweise beträgt die Auflösung der MS2-Scans mindestens 2.500 oder mindestens 5.000. Die MS2-Scans können oberhalb einer minimalen Auflösung durchgeführt werden, um zu gewährleisten, dass die Fragmentionen ausreichend genau detektiert werden können. Vorzugsweise ist die Auflösung der MS2-Scans nicht größer als 75.000. Durch Erhöhen der Auflösung über diesen Grenzwert wird die Zeit erhöht, die zur Durchführung der MS2-Scans erforderlich ist, was unerwünscht ist. Da weiterhin die MS2-Daten nur zur Validierung der MS1-Quantifizierung erforderlich sind, werden sie nicht für die Durchführung von Scans mit relativ hoher Auflösung in der MS2-Domäne benötigt. Vielmehr versucht die vorliegende Erfindung, das DIA-Verfahren durch Abtasten der Vorläuferionen in der MS1-Domäne (mit relativ hochauflösenden Scans) mit einer Abtastrate zu optimieren, die höher als die Abtastrate zur Durchführung eines Satzes MS2-Scans (bei einer relativ niedrigeren Auflösung) des Massenbereichssegments ist.
Jedes durch den Massenselektor erzeugte Massenbereichssegment wird fragmentiert, um eine Mehrzahl von fragmentierten Ionen für jeden der MS2-Scans zu erzeugen. Die Fragmentierung kann mittels einer Fragmentierungszelle oder -kammer durchgeführt werden. Die Fragmentierung der Vorläuferionen kann mittels beliebiger bekannter Verfahren zum Fragmentieren von Ionen durchgeführt werden, zum Beispiel kollisionsinduzierte Dissoziation (CID), Elektronentransfer-Dissoziation (ETD), Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD), photoinduzierte Dissoziation (PID) oder oberflächeninduzierte Dissoziation (SID). Die fragmentierten Ionen werden anschließend dem Massenanalysator zum MS2-Scannen zugeführt.
Vorzugsweise ist der Massenbereich in jedem Massenbereichssegment nicht größer als 10 u(Da), und bevorzugter nicht größer als 7u (Da). Durch Einschränken des Massenbereichs jedes Segments wird die Genauigkeit des MS2-Validierungsschritts verbessert. Dies kommt daher, dass der potenzielle Massenbereich der zum Generieren der Fragmente für die MS2-Scans verwendeten Vorläuferionen reduziert ist. Somit kann eine genauere Validierung über die Vorläuferionen basierend auf der Kenntnis des reduzierten Vorläufer-Massenbereichs, der zum Generieren der fragmentierten Ionen für jeden MS2-Scan verwendet wird, durchgeführt werden. Beispielsweise kann durch Verwendung eines Massenbereichs für jedes Massenbereichssegment, das nicht größer als 10u (Da) ist, eine Spektralbibliothek für datenabhängige Erfassung (DDA) als Bestandteil des MS2-Validierungsprozesses verwendet werden, wodurch die Anforderungen zur Verarbeitung der Daten der MS2-Domäne vermindert werden.
Vorzugsweise beträgt eine Untergrenze für den Massenbereich von jedem Massenbereichssegment mindestens 1u (Da), bevorzugter 2u (Da), und am bevorzugtesten 4u (Da). Das Vermindern des Massenbereichs von jedem Massenbereichssegment unter die genannte Untergrenze führt dazu, dass eine zu hohe Anzahl von MS2-Scans über den interessierenden Massenbereich durchgeführt wird. Entsprechend führt die sich ergebende Auflösung und Empfindlichkeit der MS2-Scans bei einem derartigen Massenbereich zu mangelhafter Validierung in der MS2-Domäne.
Vorzugsweise kann die Auflösung von jedem der MS2-Scans im Satz MS2-Scans variabel sein. Die Auflösung von jedem der MS2-Scans kann, basierend auf Daten in einem früheren MS1-Scan, der als Bestandteil des DIA-Verfahrens durchgeführt wurde, dynamisch modifiziert („im Flug“ verändert) werden. Ein früherer MS1-Scan kann jeder MS1-Scan sein, der als Bestandteil des DIA-Verfahrens vor dem durchzuführenden MS2-Scan durchgeführt wurde. Als solcher kann ein früherer MS1-Scan der erste (anfängliche) MS1-Scan sein, der als Bestandteil des DIA-Verfahrens durchgeführt wurde. Vorzugsweise ist der frühere MS1-Scan der MS1-Scan, der unmittelbar zuvor durchgeführt wurde (der zuletzt durchgeführte MS1-Scan), entsprechend dem Verschachteln der MS1-Scans mit den MS2-Scans.
Vorzugsweise ist die Auflösung von jedem der MS2-Scans unterschiedlich (dynamisch modifiziert), basierend auf Proben-Quantifizierung (z. B. von der Peak-Höhe des Vorläuferions in der MS1-Domäne) in einem früheren/unmittelbar vorhergehenden/anfänglichen MS1-Scan. Beispielsweise weist in einigen Proben (z. B. tryptisch verdauten Proteinproben) ein niedriger m/z-Bereich eine höhere Ionendichte auf als der hohe m/z-Bereich. In einer Region hoher Dichte können ausreichend viele Ionen zum Zweck der Identifizierung mittels eines relativ kurzzeitigen Scans mit niedriger Auflösung gesammelt werden. In diesem Fall kann die Steuerung die Auflösung der MS2-Scans automatisch an eine relativ niedrige Auflösungseinstellung anpassen, um die höchste Geschwindigkeit zu erzielen. Dagegen kann die Steuerung in der m/z-Region mit niedriger Ionendichte die Auflösung des MS2-Scans an eine relativ höhere Auflösung anpassen. Eine relativ längere loneninjektionszeit für den MS2-Scan kann in diesem Fall ebenfalls durch die Steuerung angewandt werden. Auf diese Weise kann das Signal-/Rauschverhältnis der MS2-Scans verbessert werden, wodurch die Identifikationsrate für Ionen mit geringer Häufigkeit verbessert wird.
Die Auflösung von jedem der MS2-Scans im Satz MS2-Scans kann ebenfalls in Abhängigkeit vom Massenbereich des Massenbereichssegments, das gerade gescannt wird, variieren. Die Auflösung des MS2-Scans für einen gegebenen Massenbereich kann nach vorbestimmten Werten eingestellt werden, die in der Steuerung gespeichert sind oder vor der Analyse durch eine benutzerdefinierte Eingabe oder Datendatei eingestellt wurden.
Es versteht sich, dass die MS2-Scans der Massenbereichssegmente nicht sequenziell durchgeführt zu werden brauchen (z. B. in der Reihenfolge ihrer Masse), sondern auch nicht-sequenziell durchgeführt werden könnten.
Vorzugsweise ist der Zeitraum zum Durchführen des DIA-Verfahrens der vorliegenden Erfindung derselbe wie die Breite (Laufzeit) des chromatografischen Peaks. Beispielsweise kann die Breite (Laufzeit) des chromatografischen Peaks entsprechend einer Anzahl von Standardabweichungen des Peaks (vorzugsweise 2 oder 4) berechnet werden. Alternativ kann die Peak-Breite basierend auf der Breite bei der Hälfte der Maximalhöhe berechnet werden. Durch genaues Bestimmen der Breite (Laufzeit) des chromatografischen Peaks können die MS1-Scans über die Laufzeit des Peaks abgetastet werden, sodass die Genauigkeit des Massenchromatogramms verbessert wird, wodurch die Genauigkeit der Probenquantifizierung verbessert wird.
Vorzugsweise werden die MS1-Scans in regelmäßigen Abständen über die Laufzeit des chromatografischen Peaks durchgeführt, wodurch die Genauigkeit des Massenchromatogramms der Probe verbessert wird.
Vorzugsweise werden mindestens 7 MS1-Scans und zwei Sätze MS2-Scans im DIA-Verfahren nach der vorliegenden Erfindung durchgeführt. Wenn somit ein vorgegebener Zeitraum zum Durchführen des DIA-Verfahrens auf einer Breite (Laufzeit) eines chromatografischen Peaks der Probe basiert, wird der chromatografische Peak mindestens 7 Mal in der MS1-Domäne abgetastet. Weiterhin werden zwei Sätze MS2-Scans über die Breite (Laufzeit) des chromatografischen Peaks durchgeführt. Durch Durchführen von zwei Sätzen MS2-Scans kann die Genauigkeit der MS2-Validierung verbessert werden, da ein größerer Anteil des Massenbereichssegments des Satzes MS2-Scans im mittleren Abschnitt des Peaks durchgeführt werden kann, ohne dass jedoch eine große Anzahl von MS2-Messungen dupliziert wird, die nicht zur Probenvalidierung (in der MS2-Domäne) benötigt werden.
Somit wird im Gegensatz zum früheren Stand der Technik die MS1-Scan-Wiederholrate in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unabhängig von der Abtastrate für den Satz MS2-Scans eingestellt, sodass eine ausreichende Anzahl von Datenpunkten von der MS1-Domäne über einen chromatografischen Peak erfasst wird, um die genaue Bestimmung von Peak-Bereichen (Quantifizierung) zu ermöglichen. Die Gesamtdauer des MS2-Zyklus wird in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung maximiert, jedoch unter der Bedingung, dass jedes Vorläuferion mindestens einmal (zum Beispiel ein- oder höchstens zweimal) innerhalb der Laufzeit eines typischen chromatografischen Peaks für MS2 abgetastet werden muss.
Dies führt zu relativ engen (z. B. ≤ 10 u (Da)) Fenstern für das Isolieren von Vorläufern. Bei engen Fenstern für das Isolieren von Vorläufern wird die Anzahl von unterschiedlichen lonenspezies innerhalb der einzelnen Fenster auf einen Punkt reduziert, an dem die konventionelle DDA-Datenanalyse durchgeführt werden kann, ohne dass große Datenbankbibliotheken mit mehreren Vorläuferionen generiert zu werden brauchen.
Im Allgemeinen basiert die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, dass eine Abdeckung derselben Vorläuferionen mit einer großen Anzahl von Sätzen MS2-Scans (z. B. >5) die verfügbare Zeit zum Scannen eines chromatografischen Peaks nicht optimal nutzt. Als solche werden im DIA-Verfahren der vorliegenden Erfindung die Anzahl und Auflösung der MS1-Scans optimiert, um eine ausreichende Anzahl von MS1-Scans mit einer ausreichenden Auflösung über die Laufzeit eines chromatografischen Peaks zur Quantifizierung einer Probe in der MS1-Domäne durchzuführen. Weiterhin wird die Anzahl der durchgeführten Sätze MS2-Scans so optimiert, dass eine ausreichende Anzahl von Sätzen MS2-Scans über die Laufzeit eines chromatografischen Peaks zur Validierung der MS1-Daten (ohne unnötige Duplizierung von Daten in der MS2-Domäne) durchgeführt wird.
Die Massenfensterbreite (Massenbereich des Massenbereichssegments) für jeden MS2-Scan kann dieselbe oder variabel sein. Beispielsweise kann für Regionen des interessierenden Massenbereichs mit niedriger Vorläufer-Peakdichte, wie zum Beispiel aus den MS1-Scans (einem früheren/anfänglichen/unmittelbar vorhergehenden MS1-Scan) bestimmt wird, eine breitere Fensterbreite für die MS2-Massenbereichssegmente, verglichen mit Regionen des Massenbereichs mit höherer Peakdichte, verwendet werden. Daher können in einigen Ausführungsformen die Breiten der für die MS2-Scans genutzten Massenbereichssegmente basierend auf einem früheren MS1-Scan dynamisch ausgewählt werden und/oder von der Masse (m/z) abhängig sein.
Eine mit den Techniken der vorliegenden Erfindung verbundene Zeitersparnis kann für längere Ioneninjektion und höhere Auflösung eingesetzt werden, was wiederum in Bezug auf Genauigkeit in der MS2-Domäne vorteilhaft ist.
Somit beinhalten Vorteile von Aspekten der vorliegenden Erfindung eine bessere Quantifizierungspräzision (aufgrund der Nutzung von MS1 statt MS2); die Möglichkeit zur Nutzung von bereits bestehenden DDA-Bibliotheks-Datenbanken; und verbesserte MS2-Datenqualität in MS2 durch Maximierung der loneninjektions- und -Detektionszeit.
Die Steuerung kann entsprechend einem Computerprogramm betrieben werden, das Anweisungen umfasst, um das Massenspektrometer zur Ausführung der Schritte des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung zu veranlassen. Daher bietet die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Computerprogramm, das Anweisungen umfasst, um das vorstehend beschriebene Massenspektrometer zur Ausführung der Schritte des Verfahrens nach der Erfindung zu veranlassen. In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein computerlesbares Medium bereit, auf dem das Computerprogramm gespeichert ist.
Es versteht sich, dass das Massenspektrometer der vorliegenden Erfindung typischerweise andere Komponenten umfassen wird. Beispielsweise wird das Massenspektrometer im Allgemeinen eine lonisierungsquelle umfassen, um die Probenmoleküle zu ionisieren und die Vorläuferionen für die Massenanalyse zu erzeugen. Dies kann eine Elektrospray-Ionisierungsquelle (ESI-Quelle) oder eine andere z. B. mit atmosphärischem Druck arbeitende lonisierungsquelle sein.
Figurenliste
Die Erfindung kann auf vielerlei Art und Weise praktisch umgesetzt werden, und eine spezifische Ausführungsform wird nun lediglich beispielhaft anhand der Figuren beschrieben, in denen gilt:

1 zeigt eine schematische Anordnung eines Massenspektrometers, das zur Durchführung von Verfahren nach Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
2 zeigt ein Beispiel der DIA-Methodik nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, das den Kenndaten eines durch Flüssigkeitschromatografie erzeugten chromatografischen Peaks überlagert ist.
3 zeigt ein Zeitdiagramm, das das Verschachteln von MS1- und MS2-Scans nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.
4 zeigt ein Zeitdiagramm, das die dynamische Anpassung der MS2-Scans nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt; und
5 zeigt ein MS1-Massenspektrum nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
In diesem Dokument kann der Begriff Masse das Masse-zu-Ladungsverhältnis m/z bezeichnen.
1 zeigt eine schematische Anordnung eines Massenspektrometers 10, das zur Durchführung von Verfahren nach Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Anordnung von 1 stellt schematisch die Konfiguration des Q-Exactive® Massenspektrometers von Thermo Fisher Scientific, Inc., dar.
In 1 wird eine zu analysierende Probe (zum Beispiel von einem Autosampler) einem Chromatografieapparat, wie z. B. einer Flüssigkeitschromatografie-(LC)-Säule (nicht in 1 abgebildet) zugeführt. Ein derartiges Beispiel für eine LC-Säule ist die monolithische Säule ProSwift von Thermo Fisher Scientific, Inc., die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) bietet, indem sie die in einer mobilen Phase geführte Probe unter hohem Druck durch eine stationäre Phase von unregelmäßig geformten oder kugelförmigen Partikeln führt, die die stationäre Phase darstellen. In der HPLC-Säule eluieren Probenmoleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten je nach dem Grad an Interaktion mit der stationären Phase.
Ein Chromatograf kann durch Messen der Menge der aus der HPLC-Säule eluierenden Probenmoleküle im Zeitverlauf mittels eines Detektors (zum Beispiel eines Massenspektrometers) hergestellt werden. Probenmoleküle, die aus der HPLC-Säule eluieren, werden als Peak über einer Basismessung am Chromatografen detektiert. Wo unterschiedliche Probenmoleküle unterschiedliche Elutionsraten aufweisen, kann eine Mehrzahl von Peaks am Chromatografen detektiert werden. Vorzugsweise werden einzelne Proben-Peaks von anderen Peaks im Chromatogramm zeitlich getrennt, sodass unterschiedliche Probenmoleküle nicht miteinander interferieren.
An einem Chromatografen entspricht ein Vorliegen eines chromatografischen Peaks einem Zeitraum, über den die Probenmoleküle am Detektor vorliegen. Als solche ist eine Breite eines chromatografischen Peaks gleichwertig einem Zeitraum, über den die Probenmoleküle an einem Detektor vorliegen. Vorzugsweise weist ein chromatografischer Peak ein gaussförmiges Profil auf oder es kann angenommen werden, dass er ein gaussförmiges Profil aufweist. Entsprechend kann basierend auf einer Anzahl von ausgehend vom Peak berechneten Standardabweichungen eine Breite des chromatografischen Peaks berechnet werden. Beispielsweise kann eine Peak-Breite basierend auf 4 Standardabweichungen eines chromatografischen Peaks berechnet werden. Alternativ kann basierend auf der Breite bei der Hälfte der maximalen Peak-Höhe eine Peak-Breite berechnet werden. Es können auch andere zum Bestimmen der Peak-Breite in der Technik bekannte Verfahren geeignet sein. Als solche stellen die nach dem DIA-Verfahren der Erfindung MS1 erfassten Daten somit ein Massenchromatogramm der aus der Säule eluierten Probe bereit.
Die somit via Flüssigkeitschromatografie abgetrennten Probenmoleküle werden dann mittels einer Elektrospray-Ionisierungsquelle (ESI-Quelle) 20, die unter atmosphärischem Druck steht, ionisiert. Probenionen treten dann in eine Vakuumkammer des Massenspektrometers 10 ein und werden durch eine Kapillare 25 in eine Nur-HF-S-Linse 30 gelenkt. Die Ionen werden durch die S-Linse 30 in einen Injektions-Flatapol 40 fokussiert, der die Ionen in einen gebogenen Flatapol 50 mit einem axialen Feld injiziert. Der gebogene Flatapol 50 führt (geladene) Ionen entlang einer gekrümmten Bahn hindurch, während unerwünschte neutrale Moleküle, wie z. B. verschleppte Lösemittelmoleküle nicht entlang der gekrümmten Bahn geführt werden und verloren gehen.
Ein lonengatter (TK-Linse) 60 ist am distalen Ende des gebogenen Flatapols 50 angeordnet und steuert den Durchgang der Ionen vom gebogenen Flatapol 50 in einen prozessabwärts angeordneten Quadrupol-Massenfilter 70. Der Quadrupol-Massenfilter 70 ist typischerweise, aber nicht notwendigerweise segmentiert und dient als Bandpassfilter, wobei er den Durchgang einer ausgewählten Massenzahl oder eines begrenzten Massenbereichs gestattet, während er Ionen mit anderen Masse-Ladungsverhältnissen (m/z) ausschließt.
Die Ionen treten dann durch eine Anordnung einer Quadrupol-Austrittslinse / Halblinse 80 hindurch und in einen Transfer-Multipol 90 ein. Der Transfer-Multipol 90 führt die nach Masse gefilterten Ionen vom Quadrupol-Massenfilter 70 in eine gekrümmte Falle (C-Falle) 100. Die C-Falle 100 weist längs verlaufende, gekrümmte Elektroden auf, die mit HF-Spannungen versorgt werden, und Abschlusskappen, die mit Gleichspannungen versorgt werden. Das Ergebnis ist ein Potenzialtopf, der entlang der gekrümmten Längsachse der C-Falle 100 verläuft. In einer ersten Betriebsart werden die Abschlusskappen-Gleichspannungen auf die C-Falle aufgesetzt, sodass Ionen, die vom Transfer-Multipol 90 ankommen, im Potenzialtopf der C-Falle 100 abgefangen werden, wo sie gekühlt werden. Die Injektionszeit (IT) der Ionen in die C-Falle bestimmt die Anzahl der Ionen (lonenpopulation), die anschließend von der C-Falle in den Massenanalysator ausgestoßen werden.
Gekühlte Ionen befinden sich in einer Wolke zum Boden des Potenzialtopfes hin und werden dann rechtwinklig aus der C-Falle 100 zu einer Orbitalfallen-Vorrichtung 110 ausgestoßen, wie z. B. dem Orbitrap® Massenanalysator, der von Thermo Fisher Scientific, Inc., verkauft wird. Die Orbitalfallen-Vorrichtung 110 weist eine außermittige Injektionsblende auf und die Ionen werden als zusammenhängende Pakete durch die außermittige Injektionsblende in die Orbitalfallen-Vorrichtung 110 injiziert. Ionen werden dann innerhalb der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 durch ein hyperlogarithmisches elektrisches Feld eingefangen und einer Vor- und Rückwärtsbewegung in einer Längsrichtung unterzogen, während sie um die innere Elektrode kreisen.
Die axiale (z) Komponente der Bewegung der Ionenpakete in der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 ist (mehr oder weniger) definiert als einfache harmonische Bewegung, wobei die Winkelfrequenz in der z-Richtung auf die Quadratwurzel des Masse-Ladungsverhältnisses einer gegebenen lonenspezies bezogen ist. Somit werden Ionen im Zeitverlauf nach ihrem Masse-Ladungsverhältnis aufgetrennt.
Ionen in der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 werden durch Verwendung eines Bilddetektors (nicht in 1 abgebildet) detektiert, der eine „Transiente“ in dem Zeitbereich erzeugt, der Informationen über alle lonenspezies enthält, wenn sie den Bilddetektor passieren. Die Transiente wird dann einer schnellen Fourier-Transformation (FFT) unterzogen, die eine Reihe von Peaks im Frequenz-Bereich bewirkt. Aus diesen Peaks kann ein Massenspektrum erzeugt werden, das die Häufigkeit/Ionenintensität gegenüber m/z darstellt.
In der vorstehend beschriebenen Konfiguration werden die Probenionen (spezifischer, eine Teilmenge der Probenionen innerhalb eines interessierenden Massenbereichs, ausgewählt durch den Quadrupol-Massenfilter) durch die Orbitalfallen-Vorrichtung 110 ohne Fragmentierung analysiert. Das resultierende Massenspektrum wird mit MS1 bezeichnet.
MS/MS (oder allgemeiner MSⁿ) kann ebenfalls durch das Massenspektrometer 10 von 1 ausgeführt werden. Um dies zu erreichen, werden Vorläufer-Probenionen generiert und dem Quadrupol-Massenfilter 70 zugeführt, wo ein subsidiärer Massenbereich ausgewählt wird. Die Ionen, die aus dem Quadrupol-Massenfilter 70 austreten, werden erneut in der C-Falle 100 gekühlt, aber dann in einer axialen Richtung zu einer Fragmentierungskammer oder -Zelle 120 ausgestoßen. Die Fragmentierungskammer 120 ist im Massenspektrometer 10 von 1 eine Higher-Energy-Collision-Dissociation-(HCD)-Vorrichtung, der ein Kollisionsgas zugeführt wird. Vorläuferionen, die in der Fragmentierungskammer 120 ankommen, werden mit Molekülen von hochenergetischem Kollisionsgas bombardiert, was zur Fragmentierung der Vorläuferionen zu Fragmentionen führt. Die Fragmentionen werden dann aus der Fragmentierungskammer 120 zurück zur C-Falle 100 ausgestoßen, wo sie erneut eingefangen und im Potenzialtopf gekühlt werden. Schließlich werden die in der C-Falle eingefangenen Fragmentionen im rechten Winkel zur Orbitalfallen-Vorrichtung 110 zur Analyse und Detektion ausgestoßen. Das resultierende Massenspektrum der Fragmentionen wird mit MS2 bezeichnet.
Obwohl in 1 eine HCD-Fragmentierungskammer 120 dargestellt ist, können statt dessen andere Fragmentierungsvorrichtungen eingesetzt werden, wobei Verfahren wie kollisionsinduzierte Dissoziation (CID), Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD), Elektronentransfer-Dissoziation (ETD), Photodissoziation und so weiter zur Anwendung kommen.
Die „Sackgassen“-Konfiguration der Fragmentierungskammer 120 in 1, wobei Vorläuferionen axial aus der C-Falle 100 in einer ersten Richtung zur Fragmentierungskammer 120 ausgestoßen werden und die so entstehenden Fragmentionen in Gegenrichtung zur C-Falle 100 zurückgesandt werden, ist detaillierter beschrieben in WO-A-2006/103412 .
Das Massenspektrometer 10 wird gesteuert durch eine Steuerung 130, die beispielsweise dazu konfiguriert ist, die Zeitwahl für das Ausstoßen der Einfangkomponenten zu steuern, die geeigneten Potentiale an den Elektroden des Quadrupols einzustellen usw., um die Ionen zu fokussieren und zu filtern, die Massenspektraldaten von der Orbitalfallen-Vorrichtung 110 einzufangen, die Abfolge der MS1- und MS2-Scans zu steuern, und so weiter. Es versteht sich, dass die Steuerung einen Computer umfassen kann, der nach einem Computerprogramm betrieben werden kann, das Anweisungen umfasst, um das Massenspektrometer zur Ausführung der Schritte des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung zu veranlassen.
Es versteht sich, dass die spezifische Anordnung der in 1 dargestellten Komponenten für das anschließend beschriebene Verfahren nicht wesentlich ist. Tatsächlich sind andere Anordnungen zur Ausführung der DIA-Verfahren von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet.
Nun wird ein Ausführungsbeispiel des Verfahrens unter Bezugnahme auf die 2 und 3 beschrieben, in dem Probenionen von einer Flüssigkeitschromatografie-(LC)-Säule als Bestandteil dem vorstehend beschriebenen Beispielapparat zugeführt werden (wie in 1 dargestellt).
Im Ausführungsbeispiel der Erfindung werden die Probenionen von der LC-Säule zugeführt, sodass das datenunabhängige Erfassungserfahren entsprechend Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Daten über die Probenionen über eine Laufzeit entsprechend einem chromatografischen Peak der von der LC-Säule zugeführten Probe erfasst. Als solche ist die Steuerung dazu konfiguriert, das Verfahren innerhalb eines Zeitraums entsprechend der Breite (Laufzeit) des chromatografischen Peaks an seiner Basis durchzuführen.
Wie in 2 dargestellt, weist ein von der LC-Säule erzeugter chromatografischer Peak eine Laufzeit von 16 Sekunden auf, basierend auf einer Breite des Peaks, die gemäß 4 Standardabweichungen einer idealen Gaußschen Kurve, die an den in 2 dargestellten Peak angelegt wurde, berechnet wurde.
Wie in 2 dargestellt, werden im Verlauf der DIA-Methodik eine Mehrzahl von MS1-Scans und zwei Sätze MS2-Scans durchgeführt (Workflow). MS1-Scans können mit Hilfe des in 1 abgebildeten Apparats (oder eines anderen geeigneten Apparats) durchgeführt werden.
Zur Durchführung eines einzelnen MS1-Scans werden Probenmoleküle von einer LC-Säule mittels der ESI-Quelle 20 ionisiert. Die Probenionen treten anschließend in die Vakuumkammer des Massenspektrometers 10 ein. Die Probenionen werden auf die vorstehend beschriebene Weise durch die Kapillare 25, die Nur-HF-Linse 30, den Injektions- Flatapol 40, den gebogenen Flatapol 50 und in den Quadrupol-Massenfilter 70 geführt. Der Quadrupol-Massenfilter 70 wird von der Steuerung 130 dazu gesteuert, die Probenionen nach dem ausgewählten interessierenden Vorläufer-Massenbereich zu filtern. Ein breiter m/z-Bereich oder ein breites Fenster, z. B. >500 m/z-Einheiten, wie z. B. ein Fenster von 400-1200 m/z, wird durch den Massenfilter 70 ausgewählt.
Die Ionen treten dann durch die Anordnung einer Quadrupol-Austrittslinse / Halblinse 80 hindurch, durch den Transfer-Multipol 90 und in die C-Falle 100 ein. Von der C-Falle 100 können (Vorläufer-) Probenionen in den Orbitalfallen-Massenanalysator 110 injiziert werden. Nachdem die Ionen im Orbitalfallen-Massenanalysator stabilisiert sind, wird der MS1-Scan unter Verwendung des Bildstromdetektors durchgeführt, um die im Orbitalfallen-Massenanalysator 110 vorhandenen Ionen zu detektieren. Das Detektieren der Ionen im Orbitalfallen-Massenanalysator ist dazu konfiguriert, mit einer relativ hohen Auflösung für den MS1-Scan (gegenüber der Auflösung des MS2-Scans) durchgeführt zu werden.
Zur Durchführung eines einzigen MS2-Scans eines Massenbereichssegments werden Probenmoleküle von einer LC-Säule ionisiert und in das Massenspektrometer auf ähnliche Weise wie beim MS1-Scan injiziert. Die Probenionen für den MS2-Scan bewegen sich weiter durch die Kapillare 25, die Nur-HF-Linse 30, den Injektions-Flatapol 40, den gebogenen Flatapol 50 und in den Quadrupol-Massenfilter 70 auf eine Weise ähnlich den Probenionen für den MS1-Scan.
Nachdem die Probenionen für den MS2-Scan den Quadrupol-Massenfilter 70 erreichen, wird der Quadrupol-Massenfilter 70 durch die Steuerung dazu gesteuert, die Probenionen nach dem relativ engen Massenbereich des Massenbereichssegments zu filtern, das gerade gescannt wird (gegenüber dem interessierenden Vorläufer-Massenbereich).
Die (gefilterten Massensegment) -Vorläuferionen gelangen vom Quadrupol-Massenfilter 70 hindurch zur C-Falle 100, wie vorstehend für den MS1-Scan beschrieben. Die Steuerung weist dann die C-Falle an, die Vorläuferionen in einer axialen Richtung zur Fragmentierungskammer 120 hin auszustoßen.
In der HCD-Fragmentierungskammer 120 kollidieren die Vorläuferionen mit hochenergetischen Kollisionsgasmolekülen, was zur Fragmentierung der Vorläuferionen zu Fragmentionen führt. Die Fragmentionen werden dann aus der Fragmentierungskammer 120 zurück in die C-Falle ausgestoßen, wo sie eingefangen und gekühlt werden. Die Fragmentionen werden dann in den Orbitalfallen-Massenanalysator 110 ausgestoßen, der mit relativ niedrigerer Auflösung für die Analyse betrieben wird (MS2-Scan). Die resultierende Erfassung eines Massenspektrums wird als MS2-Scan bezeichnet.
Nach dem Ausführungsbeispiel steuert die Steuerung 130 das Massenspektrometer 10 an, die Mehrzahl von MS1-Scans über den interessierenden Massenbereich, sowie den Satz MS2-Scans durchzuführen.
Die Zeitwahl der verschiedenen Stufen von Ionisierung, Filtern, Einfangen, Ausstoßen, Fragmentierung (für MS2) und Analyse jeweils für den MS1- und MS2-Scan können von der Steuerung 130 dazu gesteuert werden, den Durchsatz zu optimieren. Beispielsweise ist es möglich, Vorläuferionen im Orbitalfallen-Massenanalysator 110 zu analysieren, um ein MS1-Scan zu erhalten, während ein Teilbereich der Vorläuferionen in der C-Falle 100 zur anschließenden Fragmentierung in der Fragmentierungskammer 120 eingefangen wird, oder sich bereits in der Fragmentierungskammer 120 zur Fragmentierung darin befindet. Alternativ können die Fragmentionen gekühlt und in der C-Falle 100 eingefangen werden, während die Analyse der Vorläuferionen im Orbitalfallen-Massenanalysator 110 durchgeführt wird, sodass die Fragmentionen in den Orbitalfallen-Massenanalysator 110 injiziert werden können, um einen MS2-Scan zu erhalten, sobald die Analyse der Vorläuferionen abgeschlossen ist.
Die MS1-Scans können über die Laufzeit des chromatografischen Peaks wiederholt werden, um den Peak über seine Laufzeit mehrmals abzutasten. Vorzugsweise wird der Peak mindestens 3 Mal, 5 Mal oder optimal 7 Mal abgetastet, wie in 2 veranschaulicht. Vorteilhafterweise nimmt durch mehrmaliges Abtasten des Peaks in der MS1-Domäne die Anzahl der Datenpunkte über den Peak zu, wobei die Detektion von Proben-Vorläuferionen im chromatografischen Peak verbessert wird. Durch mehrmaliges Abtasten des Peaks kann sichergestellt werden, dass das Vorläuferion oder jedes der Vorläuferionen im Proben-Peak in einer Mehrzahl der MS1-Scans detektiert wird, was die Genauigkeit der Quantifizierung verbessert.
Wie in 2 dargestellt, werden 7 MS1-Scans über die Laufzeit des Proben-Peaks durchgeführt, um eine gute Peak-Form für die MS1-Quantifizierung zu erhalten. Als solche müssen die MS1-Scans in Abständen von ungefähr 16/7 ≈ 2,3 Sekunden wiederholt werden (eine MS1-Abtastrate von -0,43 Hz). Die Auflösung für die MS1-Scans wird auf 120.000 über einen interessierenden Massenbereich von 400-1.200 m/z eingestellt. Entsprechend weist ein einziger MS1-Scan eine Laufzeit von ungefähr 0,3 Sekunden auf, sodass die Gesamtlaufzeit zur Durchführung der MS1-Scans ungefähr 2,1 beträgt.
Dagegen wird ein sinnvoller chromatografischer Peak für die MS2-Daten nicht benötigt, und so sind nur zwei Sätze MS2-Scans über die Laufzeit des chromatografischen Peaks durchzuführen. Somit wird die erforderliche Laufzeit für die Durchführung eines Satzes MS2-Scans auf ungefähr 6 Sekunden eingestellt. Wie in 2 dargestellt, ist die Durchführung der MS1-Scans während der gesamten Durchführung der MS2-Scans verschachtelt. In dem in 2 dargestellten Beispiel wird der interessierende Massenbereich ausgewählt als 400 - 1200 m/z, und der Massenbereich für jedes der Segmente wird ausgewählt als 10 u (Da). Daher müssen 80 MS2-Scans in einem einzigen Satz MS2-Scans durchgeführt werden. Wenn die Zeit für die Durchführung eines Satzes MS2-Scans gleichmäßig auf jeden MS2-Scan verteilt ist, kann jeder MS2-Scan eine Laufzeit von ~75ms aufweisen. Die resultierende Auflösung der MS2-Scans wird basierend auf der verfügbaren Laufzeit für jeden Scan bestimmt. Beispielsweise bedient sich in 2 die Methodik eines Q Exactive® HF-Apparats, wie vorstehend beschrieben, und damit kann jeder MS2-Scan in der vorgegebenen Laufzeit mit einer Auflösung von 30.000 erfasst werden. Entsprechend kann ein einziger Satz MS2-Scans, der mit einer Mehrzahl von MS1-Scans bei der erforderlichen MS1-Abtastrate verschachtelt ist, innerhalb von 6,9 Sekunden durchgeführt werden, wie dargestellt. Daher werden die zwei Sätze MS2-Scans dazu optimiert, mit der höchstmöglichen Auflösung für die vorgegebenen Massenbereichssegmente innerhalb der vorgegebenen Laufzeit des chromatografischen Peaks durchgeführt zu werden, während noch immer sichergestellt ist, dass die MS1-Domäne in regelmäßigen Abständen während des gesamten chromatografischen Peaks abgetastet wird.
3 zeigt ein Zeitreihendiagramm für die Durchführung eines einzigen Satzes von MS2-Scans nach der in Bezug auf 2 behandelten Methodik. Wie behandelt, sind die MS1-Scans alle 2,3 sec. zwischen den MS2-Scans verschachtelt und die Gesamtzeit zur Durchführung eines Satzes von mit MS1-Scans verschachtelten MS2-Scans beträgt 6,9 sec. Es erweist sich, dass 26 bis 27 MS2-Scans zwischen den MS1-Scans abgetastet werden. Dies bedeutet, dass die gesamte Sequenz zum Erfassen eines Satzes MS2-Scans lautet: MS1 (400-1200 m/z), MS2 (400-410m/z), MS2 (410-420m/z) ... MS2 (650-660m/z), MS1 (400-1200 m/z), MS2 (670-680)... MS2 (920-930), MS1 (400-1200 m/z), MS2 (930-940) ... MS2 (1190-1200).
Entsprechend bietet das Verfahren der bevorzugten Ausführungsform eine Reihe von MS1-Scans mit einer hohen Auflösungsleistung (120.000), sodass die MS1-Scans zur Quantifizierung der Vorläuferionen verwendet werden können. Die hohe Massengenauigkeit trug zur Einmaligkeit der Vorläufer-Identifizierungen bei. Die MS2-Scans der fragmentierten Vorläuferionen dienen zur Validierung. Aufgrund der in der MS1-Domäne durchgeführten hochauflösenden Quantifizierung ist in der MS2-Domäne eine relativ hohe zeitliche Auflösung nicht erforderlich, und daher kann der MS2-Scan dazu optimiert werden, nur die Identität des Vorläuferions zu validieren. Dieser Ansatz ermöglicht ein datenunabhängiges Erfassungsverfahren der Massenspektrometrie, das die Empfindlichkeit und Selektivität verbessert hat. Weiterhin kann die Quantifizierung von Vorläuferionen in der MS1-Domäne mittels eines „bibliotheksfreien“ Ansatzes durchgeführt werden, wodurch die Anforderungen an die Nachbearbeitung der erfassten Daten sinken.
Ein Verfahren zur Analyse von DIA MS1-Scan-Daten und Quantifizieren von Vorläuferionen mittels eines bibliotheksfreien Ansatzes ist beschrieben in „DIA-Umpire: comprehensive computational framework for data independent acquisition proteomics", Tsou et al, Nat Methods, März 2015, S. 258-264.
Vorzugsweise kann das Ausführungsbeispiel weiter modifiziert werden, um die MS2-Scans mittels dynamischer Regelung anzupassen (Online-Anpassung). Die Auflösung und loneninjektionszeit für jeden der MS2-Scans kann „im Flug“ basierend beispielsweise auf den lonenpopulationen im vorherigen MS1-Scan, einer vordefinierten Arbeitszykluszeit und/oder Informationen der Flüssigkeitschromatografiesäule modifiziert werden.
Vorzugsweise können für einen vorgegebenen Zeitraum zur Durchführung des Verfahrens (zum Beispiel basierend auf der Breite eines chromatografischen Peaks) die loneninjektionszeiten und die Detektionszeiten für jeden der MS2-Scans innerhalb des Zeitraums maximiert werden. Das Maximieren der loneninjektionszeiten und der Detektionszeiten hat direkte Vorteile hinsichtlich der Datenqualität insofern, als das Signal-/Rauschverhältnis verbessert wird. Allerdings kann bei einigen MS2-Scans, zum Beispiel Massenbereichssegmenten mit relativ hohen lonendichten, wie vorstehend behandelt, ein akzeptables Signal-/Rauschverhältnis mittels Scans von kürzerer Laufzeit erhalten werden. Als solche können die MS2-Scans dynamisch gesteuert werden, um das Signal-/Rauschverhältnis dadurch zu verbessern, dass die Scanlaufzeit (loneninjektionszeit und/oder Detektionszeit) für einige MS2-Scans erhöht und die Scanlaufzeit für andere MS2-Scans reduziert wird.
Vorzugsweise können bei einer typischen tryptischen Proteinprobe relativ niedrige Massenbereichssegmente eine höhere Ionendichte aufweisen als die relativ hohen Massenbereichssegmente. Daher kann eine relativ kurze loneninjektionszeit (zum Beispiel 10 Millisekunden) für relativ niedrige Massenbereichssegmente verwendet werden, da in dieser Zeit ausreichend Ionen zu Zwecken der Identifizierung aufgrund der relativ hohen Ionendichte in diesen m/z-Regionen gesammelt werden können. In diesem Fall kann die Steuerung automatisch die Injektionszeit anpassen, um die loneninjektionszeit zu reduzieren, um die Scan-Geschwindigkeit zu verbessern. Die Steuerung kann ebenfalls die Auflösung auf eine relativ niedrigere Auflösungseinstellung reduzieren (kürzere Ausregelzeit), um die MS2-Scangeschwindigkeit weiter zu verbessern. Beispielsweise kann die Steuerung die Injektionszeit als Reaktion auf die gemessene und/oder erwartete Ionendichte von einem normalen MS2-Wert von 55 ms auf 10 ms und die Auflösung von einem normalen MS2-Wert von 30.000 auf 7.500 reduzieren. In einer loneninjektionsregion von relativ niedriger Dichte kann eine längere Injektionszeit angewandt werden und/oder bei einer höheren Auflösung. Durch Erhöhen der Injektionszeit und/oder der Auflösung wird das Signal-/Rauschverhältnis für die lonenregionen mit niedriger Dichte verbessert. Beispielsweise kann die Steuerung die Injektionszeit von einem normalen Wert von 55 ms auf 119 ms erhöhen und die Auflösung kann von einem normalen Wert von 30.000 auf 60.000 erhöht werden. Durch dynamisches Modifizieren der MS2-Scan-Parameter kann das Signal-/Rauschverhältnis der MS2-Scans verbessert werden, ohne die Gesamtzeit zu erhöhen, die zur Durchführung eines einzigen Satzes MS2-Scans erforderlich ist. Es versteht sich, dass die vorstehend beispielhaft angegebenen normalen Werte für MS2-Einstellungen in Abhängigkeit von der Optimierung der MS2-Scans variieren können, um zu den vorgegebenen Massenbereichen zu passen, wie an anderer Stelle in dieser Anmeldung behandelt.

Eine Reihe von unterschiedlichen Auflösungseinstellungen und Injektionszeiteinstellungen, die die Steuerung für dynamische Modifizierung verwenden kann, ist in der nachstehenden Tabelle 1 enthalten. Tabelle 1

Auflösung	Detektionszeit	Maximale Injektionszeit	Scanzeit	Von der Ioneninjektionszeit abhängige Auflösung
7,5k	16ms	10ms	25ms	IT ≤ 16ms
15k	32ms	20ms	45ms	16ms≤IT≤50ms
30k	64ms	55ms	75ms	51ms≤IT≤115ms
60k	128ms	119ms	145ms	115ms≤IT≤120ms
120k	256ms	245ms	270ms

Tabelle 1 zeigt einen beispielhaften Bereich von unterschiedlichen Auflösungseinstellungen, wo für jede Auflösungseinstellung die entsprechende maximale Injektionszeit, Detektionszeit, Scanzeit und loneninjektionszeit angegeben sind. Auch für die Optimierung der MS2-Scangeschwindigkeit kann die loneninjektionszeit basierend auf MS1-Daten berechnet werden, wobei die resultierende berechnete loneninjektionszeit die Auflösung bestimmt, die auf den MS2-Scan nach den in Tabelle 1 vorgegebenen Bereichen angewandt werden. Als solche würde für eine berechnete loneninjektionszeit von 20 ms eine MS2-Scanauflösung von 15.000 angewandt.
Es versteht sich, dass die loneninjektionszeitbereiche und entsprechenden Auflösungseinstellungen nur beispielhaft sind und dass die Anzahl der verschiedenen Auflösungseinstellungen und entsprechenden loneninjektionszeitbereiche variieren können. Vorzugsweise gibt es mindestens 3 verschiedene Auflösungseinstellungen, und bevorzugter mindestens 4 verschiedene Auflösungseinstellungen für die MS2-Scans. Die Auflösungseinstellungen können im Bereich von mindestens 5.000 bis 200.000 liegen. Vorzugsweise können die Auflösungseinstellungen mindestens eines von 5.000, 7.500, 10.000, 12.500, 15.000, 17.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000 und 80.000 beinhalten. Die loneninjektionszeitsbereiche für jede der Auflösungseinstellungen können in einem Bereich von größer als 1 ms bis nicht größer als 150 ms liegen. Die Zeitintervalle über den Zeitbereich können basieren auf einer Zeit, die dazu nötig ist, ein Scan mit der vorgegebenen Auflösung durchzuführen.
Ein Beispiel für einen dynamisch gesteuerten Satz MS2-Scans ist in 4 dargestellt. 4 zeigt, dass die MS2-Scan-Ansteuerungen basierend auf der Kombination der berechneten loneninjektionszeit (IT) und der Bedingung bestimmt werden, dass der gesamte Satz MS2-Scans innerhalb von 6 Sekunden abgeschlossen sein muss, sodass der gesamte Satz MS2-Scans noch innerhalb der Laufzeit eines chromatografischen Peaks, zusammen mit MS1-Scans alle 2,3 Sekunden bei einer Auflösung von 120.000, abgeschlossen wird.
Vorzugsweise kann das Verfahren weiter optimiert werden, um dynamische Veränderungen im chromatografischen Peak, der von der LC-Säule gespeist wird, zu berücksichtigen. Im Ausführungsbeispiel beträgt die Peak-Breite 16 Sekunden. Allerdings wird der Fachmann verstehen, dass in anderen Ausführungsformen die Peak-Breite unterschiedlich sein kann. Die Peak-Breite kann ebenfalls dynamisch variieren aufgrund von Veränderungen in den chromatografischen Bedingungen. Als solche kann zu einer genaueren Bestimmung der Laufzeit des chromatografischen Peaks und somit genaueren Bestimmung des vorgegebenen Zeitraums des Verfahrens die Peak-Breite des chromatografischen Peaks dynamisch bestimmt werden (Online-Bestimmung). Als solche kann, basierend auf einem bestimmten (prognostizierten, gemessenen) Elutionsprofil des chromatografischen Peaks die Abtastrate des MS1-Scans dynamisch angepasst werden. Auf ähnliche Weise können die Abtastrate und/oder Laufzeiten (Auflösungen) der MS2-Scans dynamisch angepasst werden. Vorzugsweise ist die Abtastrate des MS1-Scans dynamisch angepasst, um sicherzustellen, dass vorzugsweise 7 MS1-Scans (oder eine andere vorausgewählte Menge von MS1-Scans, die vorzugsweise mindestens 7 MS1-Scans beträgt) über die Laufzeit des chromatografischen Peaks durchgeführt werden. Vorzugsweise ist die Scan-Rate dazu angepasst, dass die MS1-Scans in ungefähr regelmäßigen Abständen über den chromatografischen Peak durchgeführt werden. Als solche kann die Intervallzeit zwischen den MS1-Scans verkürzt werden, wenn bestimmt wird, dass die Laufzeit des chromatografischen Peaks reduziert ist. Alternativ kann die Intervallzeit zwischen den MS1-Scans verlängert werden, wenn bestimmt wird, dass die Laufzeit des chromatografischen Peaks erhöht ist. Es versteht sich, dass die Zeitintervalle zwischen den MS1-Scans zur Durchführung der MS2-Scans dienen.
Vorteilhafterweise kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, einen DIA-Workflow mit hochauflösender MS1-basierter Quantifizierung zu schaffen, der Identifizierung mit hoher Konfidenz und genauere Quantifizierung bieten kann als früher in der Technik bekannte Ansätze. In einigen Ausführungsformen kann die vorliegende Erfindung 100 % Identifizierung aller nachweisbaren Merkmale in einer Probe auf der MS1-Ebene und mit einem höheren Empfindlichkeitsgrad als Quantifizierung auf der MS2-Ebene bieten, da die Quantifizierung vor der Fragmentierung der Probenvorläufer (d. h. mit unfragmentierten Vorläufern) durchgeführt wird.
Weiterhin kann die Methodik der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit dem traditionellen Datenbankrechercheansatz angewandt werden, der von der datenabhängigen Analyse (DDA) für die DIA-Datenanalyse bekannt ist, oder anderen Algorithmen ohne Spektralbibliothek zur Durchführung der DIA-Datenanalyse, und bietet Identifizierung von hoher Konfidenz von Vorläufern in der Probe. Auf diese Weise erfordert die DIA-Methodik der vorliegenden Erfindung nicht vorab den Aufbau einer Spektralbibliothek, wie es derzeit bei bekannten DIA-Methodiken der Fall ist. Darüber hinaus verbessert die Methodik der vorliegenden Erfindung die Identifikationsrate von Peptiden aus dem MS/MS-Scan durch automatisches Zuordnen der Ionendichte, loneninjektionszeit und Auflösungseinstellungen für die MS/MS-Scans.
5 legt ein beispielhaftes Massenspektrum offen, das durch eine Ausführungsform der Erfindung erzeugt wird. In diesem Ausführungsbeispiel kam eine MS1-Auflösung von 120.000 zur Anwendung. Als Ergebnis der relativ hohen Auflösung, die in der MS1-Domäne zur Anwendung kommt, kann unterschieden werden zwischen zwei unterschiedlichen Peptiden mit einer Massendifferenz von c.a. 30 ppm (Teilen pro Million). In diesem Ausführungsbeispiel sind die beiden Peptide [Lys-des-Arg⁹]-Bradykinin, monoisotopische Masse, m/z = 516,785 (2+), und [Val⁵]-Angiotensin II, monoisotopische Masse, m/z = 516,767 (2+), die eine Massendifferenz von 18 mmu aufweisen.

Claims

Datenunabhängiges Erfassungsverfahren der Massenspektrometrie zum Analysieren einer Probe, wobei das Verfahren innerhalb eines auf einer Breite eines chromatografischen Peaks der Probe beim Eluieren aus einem Chromatografiesystem basierenden Zeitraums durchgeführt wird, umfassend folgende Schritte: Ionisieren der Probe zum Erzeugen einer Mehrzahl von Vorläuferionen; Auswählen eines interessierenden Vorläufer-Massenbereichs für die zu analysierende Probe; Durchführen einer Mehrzahl von MS1-Scans, wobei jeder der MS1-Scans umfasst: Scannen von Vorläuferionen der Probe über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich unter Verwendung eines Massenanalysators (110), der mit einer ersten, relativ höheren Auflösung von mindestens 50.000 bei m/z=200 u (amu) betrieben wird, zum Identifizieren und/oder Quantifizieren der Probe in der MS1-Domäne über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich; und Erhalten eines Satzes MS2-Scans durch: Segmentieren des interessierenden Vorläufer-Massenbereichs in eine Mehrzahl von Vorläufer-Massenbereichssegmenten, dabei für jedes Vorläufer-Massenbereichssegment: Fragmentieren der Vorläuferionen innerhalb dieses Massenbereichssegments, und Durchführen eines MS2-Scans des fragmentierten Massenbereichssegments mit dem Massenanalysator (110), der mit einer zweiten, relativ niedrigeren Auflösung betrieben wird, sodass jedes der fragmentierten Probensegmente über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich in der MS2-Domäne fragmentiert und gescannt wird, wobei die Durchführung der MS1-Scans während der gesamten Durchführung jedes Satzes MS2-Scans verschachtelt ist, sodass die MS1-Scans ein Massenchromatogramm der Probe bereitstellen; und höchstens 2 Sätze MS2-Scans erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Massenanalysator (110) ein Orbitalfallen-Massenanalysator ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei eine Auflösung der MS2-Scans weniger als die Hälfte der Auflösung der MS1-Scans und vorzugsweise 25% der Auflösung der MS1-Scans beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die erste, relativ höhere Auflösung des Massenanalysators (110) mindestens 60.000, oder mindestens 100.000, oder mindestens 120.000, oder mindestens 140.000 beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite, relativ niedrigere Auflösung des Massenanalysators (110) weniger als 30.000, oder weniger als 15.000, oder weniger als 10.000 beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Auflösung der MS2-Scans für jedes Massenbereichssegment variabel ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5 und am bevorzugtesten mindestens 7 MS1-Scans in der Zeit durchgeführt werden, die zur Durchführung eines Satzes MS2-Scans benötigt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die MS1-Scans in regelmäßigen Abständen zwischen den MS2-Scans verschachtelt sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei innerhalb des Zeitraums basierend auf der Breite des chromatografischen Peaks mindestens 7 MS1-Scans durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein Verhältnis der Anzahl der durchgeführten MS1-Scans zur Anzahl der durchgeführten MS2-Sätze mindestens 3:1 beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei innerhalb des Zeitraums basierend auf einer Breite eines chromatografischen Peaks zwei Sätze von MS2-Scans durchgeführt werden und mindestens 7 MS1-Scans durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Massenbereich der Masse jedes Vorläufer-Massenbereichssegments jedes Probensegments nicht größer als 10u (Da), und bevorzugt nicht größer als 7u (Da) ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Auflösung der MS2-Scans basierend auf den Ergebnissen der Proben-Quantifizierung/-Identifizierung im unmittelbar vorherigen MS1-Scan dynamisch modifiziert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Injektionszeit der Probe für jeden der MS2-Scans basierend auf den Ergebnissen der Proben-Quantifizierung/-Identifizierung im unmittelbar vorherigen MS1-Scan dynamisch modifiziert ist.
Massenspektrometer (10) zur Durchführung einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrie an einer Probe, wobei das Massenspektrometer (10) umfasst: eine lonisierungsquelle (20) zum Erzeugen einer Mehrzahl von Vorläuferionen; einen Massenanalysator (110); einen Fragmentierungsapparat (120); einen Massenselektor (70); ein zum Auftrennen von Molekülen der Probe prozessaufwärts des Massenselektors (70) konfiguriertes Chromatografiesystem; und eine Steuerung, die dazu konfiguriert ist, (i) zu bewirken, dass der Massenselektor (70) einen interessierenden Vorläufer-Massenbereich für die zu analysierende Probe auswählt; (ii) zu bewirken, dass der Massenanalysator (110) mit einer ersten, relativ höheren Auflösung von mindestens 50.000 bei m/z=200 u (amu) arbeitet und eine Mehrzahl von MS1-Scans der Vorläuferionen der Probe über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich zur Quantifizierung und/oder Identifizierung der Probe in der MS1-Domäne über diesen interessierenden Vorläufer-Massenbereich durchführt; (iii) den interessierenden Vorläufer-Massenbereich in eine Mehrzahl von Vorläufer-Massenbereichssegmenten zu unterteilen; (iv) den Massenselektor (70) zu steuern, sodass er den interessierenden Vorläufer-Massenbereich in die vorgenannte Mehrzahl von Massenbereichssegmenten segmentiert; (v) für jedes vom Massenselektor (70) generierte Vorläufer-Massenbereichssegment den Fragmentierungsapparat so zu steuern, dass er das Fragmentieren der Vorläuferionen innerhalb dieses Massenbereichssegments bewirkt, (vi) für jedes Vorläufer-Massenbereichssegment: den Massenanalysator (110) zu veranlassen, mit einer zweiten, relativ niedrigeren Auflösung zu arbeiten und einen MS2-Scan dieses fragmentierten Probensegments durchzuführen, sodass jedes der fragmentierten Probensegmente über den interessierenden Vorläufer-Massenbereich fragmentiert und gescannt wird, um einen Satz MS2-Scans zu ergeben, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, die Mehrzahl von MS1-Scans durch den gesamten Satz MS2-Scans hindurch zu verschachteln, und die MS1-Scans und höchstens zwei Sätze MS2-Scans innerhalb eines Zeitraums durchzuführen, basierend auf einer Breite eines chromatografischen Peaks der Probe, wenn sie aus dem Chromatografiesystem eluiert, sodass die MS1-Scans ein Massenchromatogramm der Probe bereitstellen.
Massenspektrometer (10) nach Anspruch 15, wobei der Massenanalysator (110) ein Orbitalfallen-Massenanalysator (110) ist.
Massenspektrometer (10) nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, den Massenanalysator (110) zum Durchführen der MS1-Scans in regelmäßigen Abständen zu veranlassen.
Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, den Massenanalysator (110) zur Durchführung von mindestens 7 MS1-Scans innerhalb des Zeitraums basierend auf der Breite des chromatografischen Peaks zu veranlassen.
Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, den Massenanalysator (110) zur Durchführung von zwei Sätzen MS2-Scans und mindestens 7 MS1-Scans innerhalb des Zeitraums basierend auf der Breite des chromatografischen Peaks zu veranlassen.
Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, den interessierenden Vorläufer-Massenbereich für die Probe in eine Mehrzahl von Massenbereichssegmenten zu unterteilen, von denen jedes einen Bereich von Masse-/Ladungsverhältnissen (m/z) von höchstens 10 u (Da), und bevorzugt nicht größer als 7 u (Da) aufweist.
Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, den Massenanalysator (110) zu veranlassen, mit einer ersten, relativ höheren Auflösung für die MS1-Scans zu arbeiten, die mindestens das Doppelte der zweiten, relativ niedrigeren Auflösung der MS2-Scans und bevorzugt mindestens das 4-fache der Auflösung der MS2-Scans beträgt.
Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, die Auflösung des Massenanalysators (110) bei der Durchführung der MS2-Scans zu variieren, basierend auf den Ergebnissen der Probenquantifizierung im MS1-Scan, das unmittelbar zuvor mit der ersten, relativ höheren Auflösung durchgeführt wurde.
Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei die Steuerung dazu konfiguriert ist, eine Zeit für die Injektion in den Massenanalysator (110) für jedes der MS2-Segmente bei der Durchführung der MS2-Scans zu variieren, wobei die Injektionszeit für die MS2-Segmente auf den Ergebnissen der Probenquantifizierung im unmittelbar vorherigen MS1-Scan basiert.
Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 23, weiterhin umfassend einen Prozessor, der dazu konfiguriert ist, in der Probe vorliegende Vorläufer basierend auf den MS1-Scans zu identifizieren und die Identifizierung mittels der MS2-Scans zu validieren.
Massenspektrometer (10) nach Anspruch 24, wobei der Prozessor dazu konfiguriert ist, auf einen datenabhängigen Analysealgorithmus oder einen Algorithmus ohne Spektralbibliothek zurückzugreifen, um Vorläufer in der Probe zu identifizieren und die Identifizierung zu validieren.
Computerprogramm, umfassend Anweisungen, um das Massenspektrometer (10) nach einem der Ansprüche 15 bis 25 zu veranlassen, die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 auszuführen.
Computerlesbares Medium, auf dem das Computerprogramm nach Anspruch 26 gespeichert ist.