Die
Befüllung
der Ionenfalle mit Ionen für eine
anschließende
Isolierung der Eltern-Ionen muss entsprechend geregelt werden, um
noch genügend viele
Ionen für
die Aufnahme des Tochter-Ionenspektrums zur Verfügung zu haben. Eine solche
Regelung ist beispielsweise in der Offenlegungsschrift
DE 197 09 086 A1 beschrieben
(entsprechend
GB 2 322
961 B ,
US 5,936,241
A ).
Neben
dieser meist „dreidimensionale
Ionenfalle" genannten
Ionenfallenart gibt es auch eine Ionenfalle, die „zweidimensional" oder „linear" genannt wird und
aus vier Polstäben
mit lochblendenartigen Endelektroden besteht. Auf die Funktionsweise
dieser linearen Ionenfalle soll hier nicht eingegangen werden: sie
ist aber in den Erfindungsgedanken einzubeziehen, da dieser von
der Art der Ionenfalle unabhängig
ist, so lange diese Ionenfalle quadrupolare Hochfrequenz-Wechselfelder
mit der Möglichkeit
zur Stoßfragmentierung
aufweist.
Die
Ionenfallen-Massenspektrometer sind für den genannten Zweck der Strukturaufklärung von Peptiden
mit Elektrosprüh-Ionenquellen
ausgestattet, die in der Regel nicht nur einfach geladene Ionen der
Verdaupeptide liefert, sondern auch doppelt und dreifach geladene
Ionen, die sich für
eine aussagekräftige
Fragmentierung besonders gut eignen. Die klassische Art der Fragmentierung
ist dabei eine Stoßfragmentierung
(CID = collision induced dissociation) durch eine resonante Anregung
der Ionen zu Schwingungen durch die Ionenfalle, wobei sie mit den
in der Ionenfalle enthaltenen Stoßgasmolekülen (meist Helium, seltener
Stickstoff) stoßen,
dabei Energie aufnehmen und schließlich zerfallen. Moderne Ionenfallen-Massenspektrometer
sind des Weiteren mit Fragmentierungseinrichtungen versehen, die
auf einer Übertragung
von Elektronen beruhen und ein anderes Fragmentierungsmuster ergeben.
Diese Fragmentierung kann auf verschiedene Arten erzeugt werden;
diese werden hier unter dem Sammelnamen „elektroneninduzierte Fragmentierung" zusammengefasst
(EID = electron induced dissociation). Diese Fragmentierung resultiert
entweder aus dem Einfang sehr niederenergetischer Elektronen (ECD
= electron capture dissociation), aus einem Transfer der Elektronen
von negativ geladenen Ionen auf die positiv geladenen Analytionen
(ETD = electron transfer dissociation) oder aus dem Transfer von Elektronen
aus hoch angeregten Neutralteilchen (MAID = metastable-atom-induced
dissociation).
Die
beiden grundsätzlich
verschiedenen Fragmentierungsverfahren CID und EID enthalten komplementäre Informationen,
werden also vorzugsweise beide auf die gleiche Ionensorte, wenn
auch vorzugsweise auf Ionen verschiedener Ladungszustände dieser
Ionensorte, angewandt.
Es
ist ein Charakteristikum der Stoßfragmentierung CID, dass längere oder
schwerere modifizierende Seitenketten, beispielsweise Phosphoryl-,
Sulfat- oder Glykogruppen, bevorzugt als neutrale Bruchstücke von
der Kette der Aminosäuren
abgespalten werden, weil sie in der Regel mit geringer Bindungsenergie
gebunden sind. Das Fragment-Ionenspektrum spiegelt daher nur die
nackte Kette der Aminosäuren
wider, nicht deren Modifizierungen. Die Kenntnis über die
Modifizierung geht ganz verloren, wenn ihre Abspaltung nicht Veränderungen
der Aminosäuren
selbst zurücklässt, wie
beispielsweise die Entstehung von Dehydroxi-Serin bei der Dephosphorylierung
von Serin.
In
der Kette der Aminosäuren
spalten sich bei der Stoßfragmentierung
CID die peptidischen Bindungen, das sind die Bindungen der Stickstoff-Atome
zum Kohlenstoff auf der N-terminalen Seite
des Stickstoffs. Die so entstehenden Ionen werden als b-Fragment-Ionen
bezeichnet, wenn das N-terminale Bruchstück mit einem Proton geladen
als Ion zurückbleibt,
sonst als y-Fragment-Ion für
das C-terminale Bruchstück-Ion.
Wird von doppelt geladenen Ionen ausgegangen, so entstehen häufig beide
Ionen des komplementären
b- und y-Fragment-Ionenpaares.
Im
Gegensatz dazu spalten bei elektroneninduzierter Fragmentierung
die Bindungen der Stickstoff-Atome in der Kette der Aminosäuren auf
der C-terminalen Seite. Die entstehenden Ionen werden c-Ionen oder
z-Ionen genannt. Die Fragmentierung greift durch einen Umlagerungsbruch
punktförmig dort
an, wo ehemals das Proton anlagerte, das durch das Elektron neutralisiert
wurde. Die Fragmentierung ist außerordentlich sanft, alle Modifizierungen
bleiben erhalten. Es ist hier günstig,
von dreifach geladenen Eltern-Ionen auszugehen. Der Vergleich dieses EID-Fragment-Ionenspektrums
mit einem CID-Spektrum zeigt sofort auf, welche der Ionen im CID-Spektrum
vom b-Typ und welche vom y-Typ sind, da immer feste Massenabstände von
17 atomaren Masseneinheiten zwischen den b-Ionen des CID-Spektrums
und den c-Ionen des EID-Spektrums herrschen. Komplementär dazu sind
die y-Ionen immer um 16 atomare Masseneinheiten größer als
die z-Ionen. Außerdem
wird anhand ungewöhnlicher
Massen für
die Massenabstände
zwischen den Ionensignalen im EID-Spektrum sofort sichtbar, welche
der Aminosäuren
die Modifizierung trägt
und welche Masse diese Modifizierung hat. Es ist also günstig, für jedes
Peptid sowohl das CID- wie auch das EID-Fragment-Ionenspektrum zu messen. Ist das aus
Zeitgründen
nicht möglich,
so sollen die EID-Fragment-Ionenspektren
zumindest für
die modifizierten Peptid-Ionen gemessen werden. Modifizierte Peptid-Ionen
sind häufig
an Verlusten neutraler Bruchstücke
bestimmter Masse zu erkennen, beispielsweise die Dephosphorylierung
an der Masse m/z = 98 atomaren Masseneinheiten.
Das
vorgeschaltete Trennverfahren für
die Biopolymere bietet dem Massenspektrometer die Analytsubstanz,
also im speziellen Fall ein Verdaupeptid, nur wenige Sekunden lang
an. Bei den oben geschilderten komplexen Gemischen werden zu einem
Zeitpunkt häufig
mehrere Verdaupeptide gleichzeitig angeliefert, nicht selten sogar
zehn bis zwanzig Verdaupeptide gleichzeitig. Ein Ionenfallen-Massenspektrometer
kann pro Sekunde etwa drei bis fünf Massenspektren
aufnehmen, es ist also mit den Messungen sparsam umzugehen. Die
Steuerungsprogramme dieser Ionenfallen-Massenspektrometer enthalten
Verfahren zur automatischen Aufnahme von Fragmentmassenspektren,
diese seien hier kurz geschildert:
Es werden bis zu einer Unerbrechung
für die
Aufnahme eines Fragment-Ionenspektrums zunächst normale Massenspektren
in steter Folge aufgenommen, die dann digital im Speicher des Massenspektrometers
abgelegt werden. Für
jedes Massenspektrum ist dann in Echtzeit durch ein Auswerteprogramm
zu ermitteln, ob überhaupt
ein oder mehrere Verdaupeptide in genügender Konzentration angeliefert
werden. In diesem Fall ist dann durch eine mathematische Analyse
des Massenspektrums eine Auswahl zu treffen, welche Ionensorte für die Aufnahme
eines Fragment-Ionenspektrums am günstigsten zu fragmentieren
ist. Solche Untersuchungen sind dem einschlägigen Fachmann bekannt; dabei
ist es insbesondere bekannt, wie einfach, doppelt oder dreifach
geladene Ionensorten durch die Massenabstände im Isotopenmuster erkannt
werden können.
Für die
Stoßfragmentierung
sind doppelt geladene Ionen am besten geeignet, somit wird für gewöhnlich für die jetzt
anstehende Aufnahme eines Fragment-Ionenspektrums die intensivste
Ionensorte verwendet, die innerhalb eines vorbestimmtem Massenbereiches
doppelt geladen vorkommt und nicht in einer Ausschlusstabelle steht.
Die Ausschlusstabelle enthält
die Massenwerte solcher Peptide, die bereits in vorherigen Messzyklen
analysiert wurden oder von vornherein als nicht interessant markiert
wurden. Daraufhin wird in der nächsten
Spektrenaufnahme diese ausgewählte
Eltern-Ionensorte in der Ionenfalle isoliert, durch resonante Anregung
fragmentiert, und die Fragment-Ionen werden in Form eines Fragment-Ionenspektrums
gemessen.
Ist
eine Einrichtung für
elektroneninduzierte Fragmentierung vorhanden, so wird für die Aufnahme
eines EID-Fragment-Ionenspektrums am günstigsten von dreifach geladenen
Eltern-Ionen ausgegangen. Ist genügend Zeit vorhanden, so ist
es zweckmäßig, für alle auftretenden
Ionensorten sofort sowohl die CID- wie auch die EID-Fragment-Ionenspektren
zu messen.
Für beide
Fragmentierungsarten gibt es Verfahrensparameter, die für gewöhnlich von
der automatisch arbeitenden Steuersoftware blind so eingestellt
werden, wie es sich für
Ionen eines Verdaupeptids dieser Masse im Durchschnitt als günstig erwiesen
hat. Für
Peptide ohne Modifikationen hat sich dieses Verfahren auch einigermaßen gut
bewährt, aber
gerade für
modifizierte Peptide erscheint dieses Verfahren als nicht ausreichend.
In einem mehrstündigen
Lauf einer einzigen flüssigkeitschromatographischen
Trennung mit automatischer massenspektrometrischer Analyse werden
etwa ein bis mehrere Tausend gut auswertbarer Tochter-Ionenspektren gemessen,
was bei naiver Betrachtung als guter Erfolg gewertet werden könnte. Da
in diesem Lauf aber insgesamt 10 000 bis 100 000 Fragment-Ionenspektren aufgenommen
werden, ist die Anzahl qualitativ guter Tochter-Ionenspektren viel
zu gering. Untersuchungen zeigen, dass die Anzahl der qualitativ
ausreichend guten Fragment-Ionenspektren häufig nicht über zehn Prozent, sehr selten über 20 Prozent
der aufgenommenen Fragment-Ionenspektren hinauskommt. Die analytische
Aufgabe einer Erfassung möglichst
aller Analytsubstanzen wird bisher nicht ausreichend gelöst, was
sich leider sehr häufig
erst bei der Verwendung dieser Tochter-Ionenspektren zur Identitäts- und
Struktursuche mit Hilfe von „Suchmaschinen" in Proteinsequenzdatenbanken
erweist.
Untersucht
man die Stoßfragmentierungsspektren
näher,
so kann man feststellen, dass insbesondere die modifizierten Peptide
häufig
keine guten Fragmentspektren liefern. In vielen Fällen spaltet
dabei eine Modifizierungsgruppe als neutrales Bruchstück vom Peptid
ab, das Restpeptid wird dann nicht mehr resonant angeregt, stattdessen
im Stoßgas schnell
gekühlt;
es kann unter diesen Umständen nicht
mehr weiter zerfallen. Das Fragmentspektrum besteht dann im Wesentlichen
aus nur einer einzigen dominanten Ionensorte, die noch die gleiche
Anzahl von Ladungen trägt
wie die Elternionen, aber eine geringere Masse hat.
Auch
Peptidionen, die mit Alkali-Ionen komplexiert sind, zeichnen sich
durch das Auftreten einer dominanten Ionensorte im Fragment-Ionenspektrum aus,
wobei aber die dominante Ionensorte eine Ladung weniger trägt als die
ausgewählten
Eltern-Ionen. Es tritt hier der Verlust des Alkali-Ions auf.
Aber
auch die Spektren elektroneninduzierter Fragmentierung zeigen häufig nur
einen einzigen dominanten Peak, in der Regel ein nicht eigenständig weiter
zerfallenes Radikalion, das allerdings eine geringere Ladung trägt als das
Eltern-Ion.
Als
grobe Faustregel kann gelten, dass etwa fünf bis fünfzehn Prozent aller Fragment-Ionenspektren
ein solches dominantes Ionensignal zeigen.
Aufgabe der
Erfindung
Es
ist die Aufgabe der Erfindung, in Analysenläufen mit Peptidgemischen die
Anzahl derjenigen Tochter-Ionenspektren zu erhöhen, die mit genügend guter
Qualität
für eine
Identifizierung des Peptids anhand der Aminosäurenkette und für die Identifizierung
und Lokalisierung der Modifikationen nutzbar sind. Insbesondere
ist es Aufgabe der Erfindung, die unbrauchbaren Fragment-Ionenspektren
mit dominanten Ionensorten in Spektren guter Qualität umzuwandeln,
um so einen erheblichen Zuwachs an qualitativ guten und informationsreichen
Spektren zu erhalten.
Kurze Beschreibung
der Erfindung
Die
Erfindung stellt ein Verfahren bereit, dass in Echtzeit jedes Fragment-Ionenspektrum
darauf untersucht, ob es ein dominantes Ionensignal enthält, und
gegebenenfalls die Messung an derselben Ionensorte wiederholt, dabei
aber das Ergebnis dadurch verbessert, dass die Ionen des dominanten
Ionensignals einer zusätzlichen
Stoßfragmentierung durch
eine resonante Anregung unterworfen werden. Dabei kann als erste
Fragmentierungsart sowohl eine stoßinduzierte wie auch eine elektroneninduzierte
Fragmentierung verwendet werden. Die zusätzliche Stoßfragmentierung kann in der
Wiederholungsmessung durch ein MS/MS/MS (MS3)
genanntes Verfahren erzeugt werden, wobei die Ionen der dominanten
Ionensorte auch einer Isolation unterworfen werden; günstiger
und zeitsparender ist es jedoch, diese Ionensorte in der Wiederholungsmessung
nach der ersten Fragmentierung ohne weitere Isolation einer zweiten
Fragmentierung durch resonante Anregung zu unterwerfen.
Sollte
sich nach der zweiten Fragmentierung wieder ein dominantes Ionensignal
im Fragment-Ionenspektrum
ergeben, so kann das Verfahren nochmals unter Fragmentierung dieses
neuen, dominanten Ionensignals wiederholt werden, um auch die sequentielle
Abspaltung von zwei Modifizierungsgruppen zu erfassen. Es kommen
durchaus in geringer Zahl dreifach phosphorylierte Peptide vor;
so dass ein weiterer Schritt dieser Art sinnvoll sein kann, im Allgemeinen
können
aber diese Versuche nach der zweiten Wiederholung abgebrochen werden,
da es sich dann mit hoher Wahrscheinlichkeit überhaupt nicht um ein Peptid,
sondern um eine Verunreinigung handelt.
Wurde
als erste Fragmentierungsart die elektroneninduzierte Fragmentierung
verwendet, so hat die Wiederholungsmessung meist sofortigen Erfolg.
Es handelt sich dann bei dem dominierenden Ionensignal überwiegend
um Radikal-Ionen, die durch den Elektronenübertrag entstanden und nicht
sofort weiter zerfallen sind. Hier genügt meist eine relativ kleine
Hilfe durch Stöße aus resonanter
Anregung, um weiter zu zerfallen. Das Ergebnis sind Spektren, wie
sie aus elektroneninduzierter Fragmentierung stammen, nicht etwa
solche, die der Stoßfragmentierung ähneln.
Die
entscheidende Festlegung, was unter einer „dominanten Ionensorte" zu verstehen ist,
kann dabei weitgehend frei festgesetzt werden: Es kann sich um eine
Ionensorte handeln, deren Intensität mehr als doppelt so groß ist wie
die nächst
häufigere Ionensorte,
es kann sich aber auch um eine Ionensorte handeln, die mehr als
zehnmal größer ist
als alle anderen Ionensorten zusammen. Es ist zweckmäßig, diese
Bedingung einstellbar zu halten, damit sie an die analytische Aufgabe
angepasst werden kann.
Beschreibung
der Abbildung
1 zeigt drei Fragment-Ionenspektren, die
im automatischen Messablauf von einem dreifach geladenen modifizierten
Peptid (Aminosäuresequenz:
IGRFSEPHAR) aufgenommen wurden. Die Aminosäure Serin an Position 5 ist
phosphoryliert.
1A zeigt das durch Stoßfragmentierung gewonnene
Tochterionenspektrum; durch die Stoßfragmentierung ist der Neutralverlust
von H3PO4 besonders
begünstigt,
so dass das Restpeptid-Ion im Spektrum als dominantes Signal (mit
einem „✦" gekennzeichnet)
auftritt. Das Auftreten dieses dominanten Ionensignals führt nach
dieser Erfindung zur automatischen Messung der Spektren 1B und 1C.
1B zeigt ein Fragmentspektrum,
das aus einer Stoßfragmentierung
des dominanten Ionensignals ohne weitere Isolierung gewonnen wurde. Das
Fragment-Ionenspektrum ist immer noch von mäßiger Qualität, aber
deutlich besser als das Spektrum aus 1A.
1C zeigt ein Spektrum der
Fragment-Ionen, die durch Elektronen-Transfer-Dissoziierung hergestellt wurden, getriggert
und automatisch aufgenommen durch das Auftreten des dominanten Ionensignals
im Spektrum der 1A.
Dieses ETD-Fragment-Ionenspektrum
ist von ausgezeichneter Qualität
und zeigt die gesamte Abfolge der Aminosäuren als c-Ionen, alle in einer
Intensität von
10 bis 20 %, wobei die Phosphorylierung des Serins erhalten bleibt.
Günstige Ausführungsformen
Die
Erfindung ist in Anspruch 1 dargelegt, mit weiteren Ausführungsformen
in den abhängigen
Ansprüchen
2 bis 7. Sie stellt ein Verfahren bereit, das anhand der Form des
Fragment-Ionenspektrums
abschätzt,
ob von einem Peptid ein zweites Fragment-Ionenspektrum unter erweiterten
oder veränderten
Fragmentierungsbedingungen aufgenommen werden soll. Die Untersuchung
des Fragment-Ionenspektrums ist auf die Feststellung ausgerichtet,
ob in diesem Spektrum eine dominante Ionensorte vorkommt.
Die
verschiedenen Ausführungsformen
dieses Verfahrens zur Aufnahme von Tochterionenspektren von Peptidionen
in einem Ionenfallen-Massenspektrometer laufen dabei immer nach
dem gleichen Grundschema ab, das auch das Gerüst der Erfindung darstellt:
- a) Es wird die Ionenfalle mit Ionen befällt, wie
sie von der Ionenquelle geliefert werden, und es wird ein normales
Massenspektrum aufgenommen,
- b) dieses Massenspektrum, das in digitaler Form im Speicher
des Massenspektrometers vorliegt, wird mathematisch untersucht,
und es wird in üblicher
Weise nach vorgegebenen Regeln eine Eltern-Ionensorte ausgewählt, von
der ein Tochter-Ionenspektrum gemessen werden soll,
- c) die Ionenfalle wird wiederum mit Ionen befüllt, und
die ausgewählte
Eltern-Ionensorte wird durch Auswurf aller anderen Ionensorten in üblicher Weise
in der Ionenfalle isoliert,
- d) die Ionen dieser ausgewählten
Eltern-Ionensorte werden nun in der Ionenfalle fragmentiert, wobei
Fragment-Ionen entstehen,
- e) es wird das Tochter-Ionenspektrum der Fragment-Ionen gemessen,
- f) das Tochter-Ionenspektrum, das in digitaler Form im Speicher
des Massenspektrometers vorliegt, wird auf das Vorkommen einer dominanten Ionensorte
untersucht, und
- g) im Falle des Vorkommens einer dominanten Ionensorte werden
die Schritte b) bis e) wiederholt, wobei zwischen Schritten d) und
e) eine resonante Anregung der dominanten Ionensorte erfolgt, um
diese zu fragmentieren.
Eine
erste günstige
Ausführungsform
dieses allgemeinen Schemas verwendet als Fragmentierungsart für die Peptid-Ionen
in Schritt d) die gewöhnliche
Stoßfragmentierung,
die als softwaregesteuertes Verfahren in jedem Ionenfallen-Massenspektrometer
enthalten ist. Diese stoßinduzierte
Fragmentierung ergibt für
modifizierte Peptide häufig
nur Tochter-Ionenspektren, die im Wesentlichen aus einer dominanten
Ionensorte bestehen, mit sehr wenigen und meist niedrig intensiven
weiteren Ionensorten. Diese letzteren weiteren Ionensorten geringer
Intensität sind
häufig
wegen schlechten Verhältnisses
von Signal zu Rauschen kaum auswertbar. Der Grund für das Auftreten
der dominanten Ionensorten ist, wie oben schon kurz beschrieben,
die Abspaltung der Modifizierungsgruppe in Form eines neutralen
Bruchstücks,
und die schnelle Kühlung
des Restpeptid-Ions. Die Modifizierungsgruppen sind häufig mit geringerer
Bindungsenergie gebunden als die Bindungen längs der Kette aus Aminosäuren, sie
spalten daher sehr leicht ab.
Die
dominante Ionensorte besteht also hier aus den Restpeptid-Ionen
nach Abspaltung der Modifizierungsgruppe von den Eltern-Ionen. Die
Abspaltung einer neutralen Modifizierungsgruppe ist daran zu erkennen,
dass die dominante Ionensorte die gleiche Anzahl von Ladungen pro
Ion trägt
wie die Eltern-Ionen. Wurden als Eltern-Ionen für eine günstige Stoßfragmentierung die doppelt
geladenen Eltern-Ionen ausgewählt,
dann liegen auch die Ionen der dominanten Ionensorte doppelt geladen
vor. Sind jetzt keine weiteren Modifizierungsgruppen mehr vorhanden,
so wird eine Stoßfragmentierung
dieser dominanten Ionensorte ein informationsreiches Tochter-Ionenspektrum
ergeben.
Eine
Fragmentierung einer Ionensorte aus einem Tochter-Ionenspektrum
wird im Allgemeinen durch eine Aufnahme eines Enkel-Ionenspektrums
in einem MS/MS/MS genannten Verfahren vorgenommen. Dabei wird die
Ionenfalle zunächst
mit Ionen befüllt,
dann werden die Eltern-Ionen isoliert und fragmentiert, dann wird
die weiter zu untersuchende Tochter-Ionensorte isoliert und fragmentiert,
und schließlich
werden deren Fragment-Ionen als Enkel-Ionenspektrum gemessen. Ein solches
Verfahren ist in vielen Ionenfallen-Massenspektrometern standardmäßig enthalten.
Dieses Verfahren kostet aber Zeit. Es ist für das erfindungsgemäße Verfahren
aber die weitere Isolation der dominanten Ionensorte nicht notwendig,
so dass hier kein vollständiges MS/MS/MS-Verfahren
durchgeführt
werden muss.
In
Schritt b) sollte zu diesem Zweck für die Wiederholungsmessung
die gleiche Eltern-Ionensorte
mit gleicher Anzahl von Ladungen pro Ion, also bevorzugt doppelte
Ladung, ausgesucht werden. Nach Isolierung und Fragmentierung dieser
Eltern-Ionensorte wird dann sofort eine weitere Stoßfragmentierung
der so entstandenen dominanten Ionensorte vorgenommen, ohne die
dominante Ionensorte vorher zu isolieren. Die Fragmentierung dieser
Restpeptid-Ionen kann das Tochter-Ionenspektrum qualitativ verbessern
und ein auswertbares Spektrum ergeben, es tritt aber diese Verbesserung
nicht immer in gewünschten
Umfang ein. 1B zeigt
ein solches Fragment-Ionenspektrum einer dominanten Ionensorte,
das hier immer noch nicht in genügender
Qualität
vorliegt.
Da
es mehrfach modifizierte Peptide gibt, kann auch das so erstellte
Quasi-Enkel-Ionenspektrum wieder aus einer dominanten Ionensorte
bestehen. Es kann in diesem Fall das Verfahren unter weiterer Fragmentierung
dieser nun dominanten Ionensorte wiederholt werden.
Für dieses
Verfahren einer Stoßfragmentierung
in Schritt d) und Abspaltung eines Neutralbruchstücks sollte
die Festlegung, was unter einer dominanten Ionensorte zu verstehen
ist, nicht zu scharf gezogen werden. Das Auftreten einer Ionensorte,
die mehr als fünfmal
größer ist
als die nächst
intensive Ionensorte, rechtfertigt bereits dieses Verfahren, da in
der Regel das Tochter-Ionenspektrum verbessert wird.
Es
kann die Untersuchung des Tochter-Ionenspektrums aber auch ergeben,
dass zwar eine dominante Ionensorte vorliegt, diese aber eine Ladung
pro Ion weniger trägt
als die Eltern-Ionen.
Es liegt hier die Abspaltung eines leicht zu entfernenden Kations
vor. In der Regel tritt diese Abspaltung eines Kations auf, wenn
das Peptid-Ion mit einem Alkali-Ion komplexiert ist. Häufig ist
die Abspaltung von Natrium-Ionen (23 atomare Masseneinheiten), Kalium-Ionen (39 Masseneinheiten)
oder Ammonium-Ionen (18 Masseneinheiten); es kommen aber auch komplexere
Kationen zur Abspaltung. In diesem Fall sollte in Schritt b) für die Wiederholungsmessung
wenn möglich
eine Eltern-Ionensorte ausgewählt
werden, die eine Ladung pro Ion mehr trägt als die vorher gemessene
Eltern-Ionensorte, damit die zweite Fragmentierung eine mehrfach
geladenen Ionensorte betrifft.
Eine
zweite günstige
Ausführungsform
des Verfahrens bedingt ein Ionenfallen-Massenspektrometer, das mit
einer Einrichtung für
eine elektroneninduzierte Fragmentierung versehen ist. Diese Einrichtung
kann eine Ionenquelle zur Erzeugung negativer Reaktant-Ionen umfassen,
die dann nach Isolierung der Eltern-Ionen in die Ionenfalle eingefüllt werden
und dort unter Abgabe von Elektronen mit den positiv geladenen Eltern-Ionen
unter Bildung von Bruchstück-Ionen
reagieren. Die Einrichtung kann aber auch eine Quelle für hoch angeregte
Neutralatome enthalten, beispielsweise eine Fast-Atom-Bombardment-Quelle
(FAB), die hoch angeregte, aber gut fokussierte Helium-Atome liefert,
mit der die isolierten Eltern-Ionen in der Ionenfalle beschossen
werden können
und dort unter Übertragung
eines Elektrons die elektroneninduzierte Fragmentierung einleiten (MAID).
In
Ionenfallen-Massenspektrometern mit Einrichtung zur EID-Fragmentierung
ist es zweckmäßig, immer
abwechselnd CID-Fragment-Ionen und EID-Fragment-Ionen zu messen.
Die Gründe
dafür sind
oben beschrieben, Es ist aber manchmal aus Zeitgründen nicht
möglich,
eine so aufwendige Messserie durchzuführen. Dann ist es im Sinne
dieser Erfindung zweckmäßig, ein
EID-Fragment-Ionenspektrum immer genau dann zu messen, wenn das CID-Fragment-Ionenspektrum
einen dominanten Ionensignal zeigte. Es ist dann die Wahrscheinlichkeit groß, dass
dann eine Modifizierung vorliegt, deren Identität und Lokalisierung durch das
EID-Fragment-Ionenspektrum angezeigt wird.
Auch
bei elektroneninduzierter Fragmentierung ist häufig zu beobachten, dass Tochter-Ionenspektren
generiert werden, die im Wesentlichen aus einer einzigen, dominanten
Ionensorte mit ihren Isotopenpeaks besteht. Das Auftreten ist unabhängig davon,
ob die EID-Fragment-Ionenspektren
durch dominante Ionensorten getriggert oder durch abwechselnde Aufnahme
mit beiden Fragmentierungsarten gewonnen wurden. Es handelt sich
hier überwiegend
um Fälle,
in denen die Übertragung
des Elektrons nicht sofort zu einem Umlagerungsbruch der Peptidkette
führt,
sondern zur Bildung eines Peptid-Ionenradikals, das neben dem aufgenommenen Elektron
auch noch das Proton enthält.
Diese Ionen entsprechen in ihrer Masse genau dem Eltern-Ion, haben
aber eine Ladung weniger und damit ein anderes m/z. Diese Radikal-Ionen zerfallen relativ
leicht, die Wiederholungsmessung bedarf daher einer nur schwachen
resonanten Anregung. Das ermöglicht es,
bei einer niedrigen Hochfrequenzspannung zu fraktionieren, wodurch
auch sehr kleine Bruchstück-Ionen
noch in der Ionenfalle gehalten werden können.
Die
für diese
Verfahren notwendigen Steuerungen der Messabläufe in der Ionenfalle sind
dem einschlägigen
Fachmann bekannt. Sie werden in der Steuersoftware für das Ionenfallen-Massenspektrometer
implementiert.
Die
heutigen Arten der Flüssigkeitschromatographie,
einschließlich
der Nano-LC, bieten dem direkt gekoppelten Massenspektrometer die
aufgetrennten Peptide jeweils etwa fünf bis zwanzig Sekunden lang
an. Eine Analytsubstanz steht also mehrere Sekunden lang für die Messung
zur Verfügung. Damit
besteht für
heutige Ionenfallen-Massenspektrometer, die mehrere Fragment-Ionenspektren
pro Sekunde aufnehmen können,
die Möglichkeit,
zwar aussichtsreiche, aber nicht genügend gute Fragment-Ionenspektren
noch einmal zu messen. Für
solche Massenspektrometer, die sowohl die stoßinduzierte wie auch die elektroneninduzierte
Fragmentierung zur Verfügung
haben, besteht die Möglichkeit, die
Tochter-Ionenspektren genau dann mathematisch zu untersuchen, wenn
gerade die andere Fragmentierungsart auf die Eltern-Ionen angewandt
wird. Dadurch steht für
eine sorgfältige
Auswertung praktisch beliebig lange Zeit zur Verfügung. Aber
auch ohne diese Möglichkeit
zur abwechselnden Messung geht nicht sehr viel Zeit verloren, da
schnelle Algorithmen durchaus in der Lage sind, die Tochter-Ionenspektren
in wenigen Millisekunden (oder sogar in weniger als einer Millisekunde)
auf das Auftreten von dominanten Ionensorten und auf die Feststellung
von deren Ladungszustand zu untersuchen.
Das
Separationsverfahren braucht aber nicht unbedingt direkt mit der
Massenspektrometrie gekoppelt zu sein, um Nutzen aus der vorliegenden
Erfindung ziehen zu können.
Ein immer häufiger
angewendetes Messverfahren ist die nicht-direkte Kopplung der Flüssigkeitschromatographie
mit einem Massenspektrometer, das feste Proben auf einem Probenträger mit
matrixunterstützter
Laserdesorption ionisiert („LC-MALDI"). Das Eluat aus
dem Flüssig keitschromatographen
wird dabei in vielen einzelnen Tröpfchen auf vorpräparierte
Probenträger
aufgegeben, die Hunderte oder sogar Tausende von Proben aufnehmen
können.
Die Probentröpfchen
werden getrocknet und dann der Massenspektrometrie zugeführt. Die
vorliegende Erfindung kann allerdings für LC-MALDI erst richtig zum
Einsatz kommen, wenn es gelingt, mehrfach geladene Ionen zu erzeugen,
die für
eine Fragmentierung günstiger
sind als einfach geladene.
Der
Fachmann auf diesem Gebiet wird mit Kenntnis dieser Erfindung weitere
Modifizierungen der Messverfahren vornehmen können, insbesondere wird er
weitere geeignete Bedingungen für
die Entscheidung vorgeben können,
wann eine dominante Ionensorte vorliegt.