DE102013018496A1

DE102013018496A1 - Massenspektrometer mit Laserspotmuster für MALDI

Info

Publication number: DE102013018496A1
Application number: DE102013018496.7A
Authority: DE
Inventors: Andreas Haase
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2013-11-04
Filing date: 2013-11-04
Publication date: 2015-05-21
Anticipated expiration: 2033-11-05
Also published as: US20150122986A1; GB2521730B; GB2521730A; DE102013018496B4; US9741550B2; GB201418879D0

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Massenspektrometer mit einer Laserdesorptions-Ionenquelle, die ein Lasersystem für massenspektrometrische Analysen mit einer Ionisierung von Analytmolekülen in einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption umfasst. Es wird ein Massenspektrometer mit einem UV-Lasersystem vorgeschlagen, das mit geringsten Energieverlusten außer einem Einzelspot auf der Probe auch räumlich verteilte Spotmuster mit mehreren gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt, wodurch für jede Aufgabenstellung ein optimaler Ionisierungsgrad für Analytionen erzielt werden kann. Aus dem UV-Strahl mit hoher transversaler Kohärenz kann mit einer Kombination aus einem Linsenarray und einer Linse ein solches Spotmuster mit jeweils gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt werden, wenn für das Linsenarray eine mathematische Bedingung für Linsenabstand voneinander (Pitch) und Fokuslänge eingehalten wird. Aus einem Linsenarray mit quadratischen Linsen entsteht beispielsweise ein Neuner-Muster, aus einem Linsenarray mit runden Linsen ein Fünfer-Muster. Die Linsenarrays sind preiswert gegenüber diffraktiven Optiken und bedürfen in dieser Anordnung keiner lateralen Justierung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Massenspektrometer mit einer Laserdesorptions-Ionenquelle, die ein Lasersystem für massenspektrometrische Analysen mit Ionisierung der Analytmoleküle einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption umfasst.
Es wird ein Massenspektrometer mit einem UV-Lasersystem vorgeschlagen, das mit geringsten Energieverlusten außer einem Einzelspot auf der Probe auch räumlich verteilte Spotmuster mit etwa gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt, wodurch für jede Aufgabenstellung ein optimaler Ionisierungsgrad für Analytionen erzielt werden kann. Aus einem gaußförmigen Profil eines UV-Strahls aus einem Festkörper-Laser zum Beispiel kann mit einer Kombination aus einem (insbesondere zweidimensionalen) Linsenarray und einer Linse ein Spotmuster mit etwa gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt werden, wenn für das Linsenarray eine mathematische Bedingung für Linsenabstand (Pitch) und Fokuslänge eingehalten wird. Aus einem Linsenarray mit quadratischen Linsen entsteht beispielsweise ein Neuner-Muster, aus einem Linsenarray mit runden Linsen ein Fünfer-Muster. Linsen-Arrays, die nicht diese mathematische Bedingung einhalten, ergeben Spotmuster, deren Spitzen eine deutlich ungleichmäßige Intensität aufweisen und damit für die Anwendung ungeeignet sind. Die Linsenarrays sind preiswert gegenüber diffraktiven Optiken und bedürfen in dieser Anordnung keiner lateralen Justierung.
Stand der Technik
In der Massenspektrometrie von biologischen Makromolekülen haben sich in den letzten zwanzig Jahren zwei Verfahren durchgesetzt: die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI, Abkürzung für „Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization”) und das Elektrosprühen (ESI, Abkürzung für „Electrospray Ionization”). Die zu analysierenden biologischen Makromoleküle werden im Folgenden als Analytmoleküle bezeichnet. Beim MALDI-Verfahren sind die Analytmoleküle in der Regel auf der Oberfläche eines Probenträgers in einer festen, polykristallinen Matrixschicht präpariert und werden ganz überwiegend einfach geladen ionisiert, während sie beim ESI-Verfahren in einer Flüssigkeit gelöst sind und vielfach geladen ionisiert werden. Beide Verfahren ermöglichten es erstmals, biologische Makromoleküle für Untersuchungen in der Genomik, Proteomik und Metabolomik massenspektrometrisch zu analysieren; ihre Erfinder, John B. Fenn und Koichi Tanaka, wurden im Jahr 2002 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt.
Die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) ist in den letzten Jahren durch eine Umstellung von Stickstoff-Lasern auf Festkörper-UV-Laser mit höherer Lebensdauer und insbesondere durch eine Strahlerzeugung mit örtlichem moduliertem Strahlprofil für eine erhöhte Ionenausbeute außerordentlich verbessert worden. Das Verfahren der Strahlerzeugung und die entsprechenden Lasersysteme sind in den äquivalenten Dokumenten DE 10 2004 044 196 A1 , GB 2 421 352 B und US 7,235,781 B2 (A. Haase et al., 2004) beschrieben und unter der Bezeichnung „Smart Beam” bekannt geworden. Das Dokument DE 10 2004 044 196 A1 soll hier durch Referenz vollinhaltlich eingeschlossen sein.
Der Erfindung in diesen oben genannten Dokumenten liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die Ionenausbeute sehr stark ansteigt, wenn man die Laserspots sehr klein macht, bis herunter zu etwa fünf Mikrometer Durchmesser. Dabei gelangt man aber schnell zu Energiedichten, die eine spontane Fragmentierung der ionisierten Moleküle bewirken. Bleibt man unter dieser Grenze, so werden aus diesem geringen Volumen wiederum zu wenige Ionen pro Schuss erzeugt. Als Lösung wird ein Muster aus mehreren Spots angeboten, um genügend Ionen ohne Fragmentierung zu erhalten, wobei auch andere Größen, wie etwa die Massenauflösung, positiv beeinflusst werden. Auch wird praktisch kein Probenmaterial mehr verspritzt; bei größeren Spotdurchmessern mit größeren Mengen aufgeschmolzenen Materials ist das immer ein Problem. Es werden vorzugsweise etwa neun scharfe Laserspots von etwa fünf Mikrometer Durchmesser erzeugt, die jeweils gleiche Amplituden haben müssen, da die Ionenerzeugungsrate mit etwa der sechsten bis siebten Potenz der Energiedichte im Laserspot ansteigt. Wäre beispielsweise die Energiedichte für einen Spot um 50 Prozent erhöht, so stiege hier der Ionisierungsgrad um mehr als einen Faktor 10. Die anderen Spots des Musters würden im Vergleich kaum Analyt-Ionen erzeugen, würden aber in unerwünschter Weise Probe verbrauchen.
Die Mustererzeugung steigert die Ionenausbeute pro Analytmolekül um weit mehr als einen Faktor 10 und verringert entsprechend den Probenverbrauch, was insbesondere für die bildgebende Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten wichtig ist. Da moderne Massenspektrometer auf eine Wiederholungsfrequenz der Spektrenaufnahme von 10000 Aufnahmen pro Sekunde und mehr ausgelegt werden sollen, muss außerdem die Erzeugung des Spotmusters sehr energieeffizient sein, um keine teuren Höchstleistungslaser einsetzen zu müssen.
Die Erzeugung eines Musters mit wenigen UV-Spots gleicher Energiedichte ist nicht trivial. So kann man mit einer Anordnung von zwei aufeinander abgestimmten Linsenarrays („fly's eye”) ein Gebiet mit Intensitätsspitzen gleicher Intensität schaffen (siehe beispielsweise „Refractive Micro-optics for Multi-spot and Multi-line Generation", M. Zimmermann et al., Procedings of the 9th International Symposium on Laser Precision Microfabrication; LPM2008). Dieses Gebiet kann im Infraroten bei einer Wellenlänge von 10 Mikrometern genau neun Spots umfassen, im Ultravioletten jedoch umfasst es Hunderte von Spots. Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung diffraktiver Strahlteiler, die aber hohe Herstellkosten aufweisen. Da bei diesen Wellenlängen Quarzglas (Fused Silica) für die optischen Elemente zu verwenden ist, ist die Herstellung entsprechender Strahlformungsoptiken in der Regel sehr teuer.
Ein Verfahren zur energieeffizienten Erzeugung von wenigen UV-Spots gleicher Energiedichte und zugehöriges Gerät sind in den äquivalenten Schriften DE 10 2011 116 405 A1 , US 8,431,890 B2 und GB 2 495 815 A (A. Haase und J. Höhndorf) dargelegt. Die Schrift DE 10 2011 116 405 A1 soll hier ebenfalls durch Referenz vollinhaltlich eingeschlossen sein. Diese Schrift enthält auch eine längere Einführung in heutige Kenntnisse über MALDI und beschreibt ausführlich den Grund für die Einführung von Spotmustern.
Die Bauteile für Geräte nach DE 10 2011 116 405 A1 sind aber relativ teuer und verlangen eine sehr präzise und reproduzierbare Justierung der verwendeten Bauteile. Daher besteht nach wie vor ein Bedarf für preiswerte und besonders für justierunempfindliche Verfahren und Geräte. Die Unempfindlichkeit der Justierung wird besonders wichtig, wenn mehrere Mustergeneratoren im schnellen Austausch eingesetzt werden sollen, um die Spotmuster an die analytische Aufgabe anpassen zu können.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Massenspektrometer mit einem Lasersystem vorgeschlagen, das mit geringsten Energieverlusten außer einem Einzelspot auf der Probe auch räumlich aufgeteilte Spotmuster mit etwa gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugen kann, wodurch für jede analytische Aufgabenstellung und jede Art der Probenpräparation ein optimaler Ionisierungsgrad für Analyt-Ionen erzielt werden kann. Aus einem natürlicherweise gaußförmigen Profil eines UV-Strahls aus einem Festkörper-Laser beispielsweise mit seiner hohen transversalen Kohärenz kann mit einer Kombination eines einzigen (insbesondere zweidimensionalen) Linsenarrays mit einer abbildenden Linse ein Spotmuster erzeugt werden, wobei das Spotmuster durch die vom Linsenarray eingebrachte periodische Phase durch Fourier-Transformation in der Brennebene der Linse erzeugt wird. Vom Array ausgehende Parallelstrahlen gleicher Richtung (0., 1., 2., n-te Ordnung) werden in der Brennebene vereinigt und erzeugen Spots, die je nach Interferenzbedingungen verschieden hohe Intensitäten haben. Dabei können mehrere Spots gleicher Energiedichte erzeugt werden, wenn für das Linsenarray bestimmte mathematische Bedingungen für den Linsenabstand im Array (Pitch) in mindestens einer Richtung und die Fokuslänge eingehalten werden. Es wird also keine Fliegenaugen-Optik (fly's eye) mit zwei aufeinander abgestimmten und zueinander präzise justierten Linsenarrays benötigt. Das gleichmäßige Muster mit mehreren Signalspitzen entsteht bei einer UV-Wellenlänge durch eine bisher nicht bekannte mathematische Besonderheit. Aus einem Linsenarray mit quadratischen Linsen entsteht zum Beispiel ein Neuner-Muster, aus einem Linsenarray mit runden Linsen ein Fünfer-Muster. Linsen-Arrays, die nicht der mathematischen Bedingung genügen, ergeben Spotmuster mit weitgehend ungleichmäßiger Intensität. Wie eingangs beschrieben, sind UV-Spotmuster gleicher Höhe bisher nur für große Anzahlen an Intensitätsspitzen bekannt (Hunderte von Spots).
So kann aus einem quadratisch angeordneten Linsenarray mit einem Abstandsmaß der Linsen im Array zueinander („Pitch”) von 150 Mikrometern und einem Strahldurchmesser von etwa fünf Millimetern mit einer Fourier-Linse ein Muster mit drei mal drei Spitzen gleicher Höhe mit Abständen von jeweils 33 Mikrometern erzeugt werden, ideal für das Abrastern eines Bildpunkts von 100 mal 100 Quadratmikrometern in der bildgebenden Massenspektrometrie. Mit größerem Pitch können Muster mit engerem Abstand erzeugt werden, beispielsweise 17 oder 8 Mikrometer, für das Abrastern von Bildpunkten mit 50 oder 25 Mikrometer Kantenlänge.
Die Justierung des einzelnen Linsenarrays verlangt keinerlei Präzision: wird das Linsenarray lateral (also senkrecht zum Strahlengang des UV-Laserlichts) verschoben, so ändern sich weder die Lage noch die Intensitätsverteilung des Musters. Das Verhältnis des Durchmessers der Intensitätsspitzen in Höhe 1/e² zum Spotabstand im Muster hängt vom Durchmesser des primären Laserstrahls ab; je größer der Strahldurchmesser, desto kleiner der Durchmesser der Spots. Mit einem gaußförmigen Strahl eines Durchmessers von 1,2 Millimeter in Höhe 1/e² ergibt sich beispielsweise ein Muster von Intensitätsspitzen, deren Durchmesser bei optimaler Abbildung etwa einem Achtel der Spotabstände entspricht. Für Spitzen mit einem Abstand von 33 Mikrometern sind die Spotdurchmesser etwa vier Mikrometer. Der Durchmesser der Spots kann in einfacher Weise erhöht werden, indem die Spots des Musters unscharf auf die Probe abgebildet werden, mit anderen Worten, die Abbildung der Laserspots wird leicht aus der Ebene des zu beschießenden Probenträgers verschoben.
Um das Muster herum (das heißt, um die zentralen Laserspots mit annähernd homogener Intensität herum) können weitere Intensitätsspitzen auftreten, deren Amplitude aber mindestens um den Faktor 3 geringer ist. Sie können, falls störend, durch Aperturen weggefiltert werden. Über 60% der Gesamtenergie des Laserstrahls findet sich in den mehreren herausragenden, zentralen Intensitätsspitzen des Musters wieder. Durch das Spotmuster mit gleich hohen Intensitätsspitzen wird ein außerordentlich hoher Ionisierungsgrad für Analytionen erreicht.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
stellt dar, wie aus einem gaußförmigen Laserstrahl (2) hoher lateraler Kohärenz ein Spotmuster (24 bis 26) erzeugt wird. Der Laserstrahl (2) wird dabei zunächst durch eine periodische Anordnung von Beugungs- oder Brechungselementen (3) in Parallelstrahlen von minus n-ter bis plus n-ter Ordnung aufgespalten, wobei in nur die Parallelstrahlen –1., 0. und +1. Ordnung gezeichnet sind. Diese Parallelstrahlen verschiedener Richtung werden durch eine Fourier-Linse (4) in das Spotmuster (24 bis 26) in der Ebene (5) transformiert. Die periodisch angeordneten Beugungs- oder Brechungselemente (3) können beispielsweise als Beugungsgitter ausgebildet sein. Das Spotmuster wird durch die Abbildungslinse (8) wieder in Parallelstrahlen (9) verwandelt, die letztendlich das Spotmuster auf der Probe erzeugen.
zeigt, wie das Spotmuster außerhalb der gewünschten Spots zum Beispiel durch eine teilverspiegelte Quarzplatte entfernt werden kann. Aus dem Laserstrahl (2) des Lasers (1) wird wie in durch die periodische Elementanordnung, die hier als zweidimensionales Linsenarray (3) dargestellt ist, und die Fourier-Linse (4) in der Ebene (5) das Signalmuster erzeugt. Wird zwischen dem Pitch des Linsenarrays (3) und der Fokuslänge der Linsen des Arrays (3) eine bestimmte mathematische Bedingung eingehalten, so haben mehrere zentrale Signalspitzen eine herausragende, gleich hohe Intensität. Um die äußeren Signalspitzen auszublenden, kann sich in der Ebene (5) der Signalspitzen z. B. eine teilverspiegelte Quarzglasplatte (6) mit quadratischer Durchgangsöffnung in der Verspiegelung befinden, die die äußeren Strahlen einem Energieabsorber (7) zuführt. Die Strahlen aus den Intensitätsspitzen der Ebene (5) werden durch die Linse (8) in einen leicht strukturierten Parallelstrahl (9) verwandelt, mit dem letztendlich das Muster der Intensitätsspitzen auf die Probe in der Ionenquelle des Massenspektrometers übertragen wird.
zeigt, wie die Gesamtheit (1–9) aller optischen Elemente (1) bis (9) des Lasersystems aus schematisch in ein erweitertes Lasersystem (43) eingebettet wird, das mit einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer (44) verbunden ist. Es handelt sich hier um eine besondere Erweiterung (43) des Lasersystems, die durch ein Drehspiegelsystem (30) eine Steuerung der Position des Laserlichtmusters auf der Probenträgerplatte (35) zulässt. Der parallelisierte UV-Laserstrahl mit strukturiertern Profil kann in dem Drehspiegelsystem (30) mit zwei Galvospiegeln in beiden Raumrichtungen geringfügig abgelenkt werden. Der abgelenkte Laserstrahl wird dann in einem Keplerschen Teleskop (31) aufgeweitet und gemäß der Winkelablenkung parallel verschoben. Der austretende Laserstrahl wird mit verkleinerter Winkelablenkung über den Spiegel (32) wieder genau zentral in das Objektiv (33) gerichtet. Das Objektiv (33) wird je nach Winkelablenkung zentral, aber unter leicht verschiedenen Winkeln durchstrahlt, wodurch sich eine Positionsverschiebung des Spotmusters auf der Probenträgerplatte (35) ergibt. Die in den Plasmawolken des Laserspotmusters generierten Ionen werden durch Spannungen an den Blenden (36) und (37) zu einem Ionenstrahl (40) beschleunigt, der die beiden um 90° verdrehten Ablenkkondensatoren (38) und (39) zur Bahnkorrektur passiert und im Reflektor (41) auf den Detektor (42) fokussiert wird. Es sei hier angemerkt, dass die Strahlführung innerhalb eines Kepler-Teleskops (31) komplizierter ist und aus Vereinfachungsgründen von der Abbildung nicht real wiedergegeben wird, die Abbildung gibt aber die Außenwirkung des Teleskops auf den Laserlichtstrahl richtig wieder.
stellt in dreidimensionaler Ansicht ein Laserspotmuster mit neun herausragenden Laserspots etwa gleicher Energiedichte dar. Die Abstände zwischen den Spots sind hier etwa achtmal so groß gewählt wie die Durchmesser der Spots, es können jedoch auch Muster mit anderen Abständen und Spotdurchmessern hergestellt werden. Die neun Spots enthalten mehr als 60 Prozent der gesamten Energie des Laserstrahls. Die weniger intensiven Spots außerhalb der neun herausragenden Spots liefern keine Ionen; falls diese Spots stören sollten, können sie ausgeblendet werden, wie in gezeigt.
zeigt einen Querschnitt durch die Energiedichten in der Mitte des Spotmusters.
gibt eine dreidimensionale Ansicht eines Laserspotmusters mit fünf herausragend hohen Spots wieder; ein Querschnitt durch die Energiedichten ist in zu sehen.
zeigt ein Linsenarray mit quadratischen Linsen in quadratischer Anordnung, aus gekreuzten Zylinderlinsen auf Vorder- und Rückseite zusammengesetzt, mit dem Abstandsmaß Pitch p.
gibt ein Linsenarray mit kreisförmigen Linsen in quadratisch angelegter Anordnung wieder, mit Pitch p.
Bevorzugte Ausführungsformen
Es wird in der Erfindung ein Massenspektrometer mit einem Lasersystem vorgeschlagen, das als Hauptziel räumlich aufgeteilte Spotmuster mit mehreren etwa gleich hohen Intensitätsspitzen auf der MALDI-Probe unter nur geringen Energieverlusten erzeugen kann, wobei die mustererzeugenden Elemente preiswert und justierunempfindlich sind. Mit einer ersten, weiter unten zu beschreibenden Ausführungsform werden jeweils neun, mit einer zweiten jeweils fünf Spots erzeugt; es erscheinen aber auch andere Muster mit anderen Anzahlen von Spots möglich zu sein. Die Spots können, beispielsweise durch Verschiebungen von Linsen, in ihrem Durchmesser beliebig verändert werden. Auch Einzelspots oder Spotmuster mit mehr als zwanzig Spots können erzeugt werden, wodurch für jede Probenform, jede Präparationsart und jede Aufgabenstellung ein optimaler Ionisierungsgrad für Analytionen erzielt werden kann.
Wie in dargelegt, kann man aus dem natürlicherweise gaußförmigen Profil eines UV-Strahls (2) aus einem Festkörperlaser mit einer Kombination aus periodisch angeordneten Brechnngs- oder Beugungselementen (3) und einer abbildenden Linse (4), die wegen ihrer Funktion oft Fourier-Linse genannt wird, durch Interferenzen ein Spotmuster erzeugen, von dem hier nur die mittleren Spots (24) bis (26) dargestellt sind. Die Intensitätsspitzen sind jedoch in der Regel nicht gleich hoch, sondern weisen je nach Spitzenzahl eine stark modulierte Einhüllende auf. Verwendet man jedoch Linsenarrays (3) mit bestimmten Eigenschaften, so können für alle Wellenlängen, selbst im ultravioletten Bereich, jeweils eine geringe Anzahl an gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt werden, die den wesentlichen Anteil der Strahlenergie enthalten. Als Beispiele sind neun bzw. fünf herausragende Intensitätsspitzen etwa gleicher Höhe in den , , und dargestellt.
Für die Erzeugung der wenigen Intensitätsspitzen gleicher Energiedichte ist es erforderlich, für das Linsenarray im Wesentlichen eine bestimmte Form und mindestens in einer Richtung eine bestimmte mathematische Bedingung zwischen dem Linsen-Abstand des Arrays (Pitch) und der Fokuslänge der Linsen einzuhalten: f_A = cp²/λ, wobei f_A die Brennweite der Linsen des Linsenarrays, c eine Optimierungskonstante, p der Abstand (Pitch) der Linsen im Array voneinander und λ die Wellenlänge der Strahlung ist. Ein bevorzugter, mathematisch bestimmter Wert der Konstanten ist etwa ein Fünftel, c = 0,2067. Quadratische Linsen in einem quadratisch angelegten Array bewirken dabei eine Schwächung der zentralen Intensitätsspitze und eine Stärkung der vier in den Ecken des Neunerfeldes befindlichen Intensitätsspitzen, wobei durch eine mathematische Besonderheit alle neun Intensitätsspitzen etwa gleich hoch werden. Runde Linsen in einer quadratisch angelegten Anordnung erzeugen fünf gleich hohe Intensitätsspitzen. Die Konstante c = 0,2067 in der Gleichung f_A = cp²/λ gilt für ideal sphärische Linsen des Arrays; abhängig von der realen Form der Linsen kann die Konstante c um bis zu zehn Prozent nach unten oder oben abweichen.
Das gleichmäßige Muster mit mehreren Intensitätsspitzen gleicher Energiedichte entsteht also durch eine bisher nicht bekannte mathematische Besonderheit. Bisher ist die Erzeugung eines Spotmusters mit Intensitätsspitzen gleicher Höhe nur durch zwei korrespondierende Linsenarrays in einer Anordnung bekannt, die fly's eye (Fliegenauge) genannt wird, wodurch aber im Ultravioletten jeweils große Anzahlen von über hundert Intensitätsspitzen entstehen, wohingegen es zu bevorzugen ist, dass die Energiedichte des Laserlichts in einige wenige Intensitätsspitzen annähernd homogener Intensität konzentriert wird. Beispielhaft sei hier eine Zahl von weniger als zwanzig Intensitätsspitzen erwähnt.
Aus einem Linsenarray mit quadratischen Linsen in quadratischer Anordnung entsteht zum Beispiel ein Neuner-Muster, aus einem Linsenarray mit runden Linsen in quadratischer Anordnung ein Fünfer-Muster. Als (zweidimensionales) Linsenarray mit quadratischen Linsen kann beispielsweise auch eine Quarzglasplatte verwendet werden, deren Oberfläche auf Vorder- und Rückseite die Form gekreuzter Zylinderlinsen aufweist, wie in dargestellt. Ein (zweidimensionales) Linsenarray mit runden Linsen gibt wieder. Für diese Linsenarrays aus Quarzglas gibt es preiswerte Herstellungsverfahren, siehe beispielsweise „Design, fabrication and testing of microlens arrays for sensors and microsystems", Ph. Nussbaum et al., Pure Appl. Opt. 6 (1997) 617–636.
Es erscheint durchaus möglich, dass mit Linsenarrays in anderer Form und Anordnung, beispielsweise mit dreieckigen Linsen oder sechseckigen Linsen in Wabenanordnung, oder mit einem linearen oder eindimensionalen Linsenarray, andere Anzahlen von Intensitätsspitzen gleicher Höhe erzeugt werden können, wenn bestimmte Verhältnisse f_A = cp²/λ eingehalten werden. Die Konstante c kann je nach veränderter Geometrie des Linsenarrays mathematisch oder experimentell neu zu bestimmen oder zu optimieren sein.
Linsenarrays mit verschiedenen Linsenabständen p im Array in einer Richtung ergeben Spotmuster mit verschiedenen Spot-Abständen A in der entsprechenden Richtung, und zwar nach der Gleichung: A = λf_L/p, wobei f_L die Brennweite der Fourier-Linse ist. Je größer der Pitch p, umso kleiner wird der Abstand A der Spots. Die Durchmesser ∅_S der Spots in Höhe 1/e² wird durch ∅_S = 1,22 λf_L/∅_UV bestimmt, wobei ∅_UV der Durchmesser der UV-Strahls ist, der das Linsenarray beleuchtet. Der Durchmesser des UV-Strahls, der zum Beispiel ein gaußförmiges Profil hat, wird dabei ebenfalls als 1/e² Durchmesser angegeben.
Ein Linsenarray (3) mit einem Pitch von p = 170 μm erzeugt aus einem UV-Strahl (2) mit ∅_UV = 1.7 mm Durchmesser ein Muster mit drei mal drei Spitzen etwa gleicher Höhe, bei denen das Verhältnis von Spotdurchmesser zu Spotabstand wie 1:8 ist. Dieses Muster kann vergrößert oder verkleinert auf die Probe projiziert werden; so kann beispielsweise auf der Probe ein Muster erzeugt werden, das bei Spot-Abständen von A = 32 μ jeweils Spotdurchmesser von ∅_S = 4 μ aufweist. Ein solches Muster ist ideal für das Abrastern eines Bildpunkts von etwa 100 mal 100 Quadratmikrometern in der bildgebenden Massenspektrometrie. Durch achtmaliges seitliches Verschieben des Spotmusters um jeweils 4 Mikrometer können acht Einzelspektren gewonnen werden. Diese Prozedur kann achtmal durch Verschieben senkrecht zur ersten Verschiebungsrichtung wiederholt werden; es ergeben sich 64 Einzelspektren. Erlaubt die Probe die Aufnahme von 4 Einzelspektren an einem Ort, so ergeben sich 256 Einzelspektren pro Bildpunkt. Werden auch noch die Zwischenräume in den Ecken zwischen den benutzten, kreisförmigen Probenlöchern verwendet, so kann man 512 Einzelspektren für ein Summenspektrum des Bildpunkts von 100 mal 100 Quadratmikrometer Größe erhalten: das ergibt einen außergewöhnlich hohen dynamischen Messbereich. Da bei einer Aufnahmerate von 10000 Spektren pro Sekunde 20 Bildpunkte pro Sekunde abgerastert werden können, dauert die Aufnahme aller 10000 Summenspektren eines Quadratzentimeters Gewebedünnschnitt nur etwa acht Minuten.
Mit größerem Pitch können Muster mit engerem Abstand erzeugt werden, beispielsweise mit Abständen von A = 17 μ oder A = 8 μ, für das Abrastern von kleineren Bildpunkten mit 50 oder 25 Mikrometer Kantenlänge für die Aufnahme von hochauflösenden massenspektrometrischen Bildern, dann aber mit geringerem dynamischen Messbereich.
Durch axiales Verschieben von Linsen im optischen Strahlengang lassen sich die Intensitätsspitzen unscharf abbilden, wodurch sich die Durchmesser ∅_S der Intensitätsspitzen beliebig vergrößern lassen. Besondere Analysenaufgaben oder besondere Probenvorbereitungen können solche Signalspitzen mit größerem Durchmesser verlangen. Macht man die Unschärfe so groß, dass sich die Intensitätsspitzen überlappen, so entsteht durch Interferenzen ein Muster mit einer großen Anzahl von weit über zwanzig Intensitätsspitzen, das ebenfalls für besondere Aufgabenstellungen eingesetzt werden kann.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Massenspektrometer wie in ein Festkörper-Lasersystem (1), das einen gepulsten UV-Laserstrahl (2) mit Gauß-Profil liefert, ein Linsenarray (3) mit besonderen Abmessungen, das vom UV-Strahl (2) angeleuchtet wird, und eine Linse (4), die das Spotmuster in der Ebene (5) erzeugt. Eine teilverspiegelte Quarzglasplatte (6) kann die Randbezirke des Spotmusters reflektierend ausblenden, so dass die restliche Strahlenergie in einem Strahlabsorber (7) vernichtet werden kann.
Die Justierung des Linsenarrays (3) ist unempfindlich: wird das Linsenarray (3) lateral verschoben, so ändern sich weder die Lage noch die Intensitätsverteilung des durch Interferenz entstandenen Musters in der Ebene (5). Dadurch können in einfacher Weise verschiedenartige (eindimensionale oder zweidimensionale) Linsenarrays für verschiedenartige Muster und verschiedene Signalspitzenabstände A in den Strahlengang eingefahren oder eingeklappt werden, ohne besondere Anforderungen an die Präzision der Lage des Linsenarrays zu stellen.
Um das Muster mit den zentralen, etwa gleich hohen Intensitätsspitzen herum gibt es weitere Intensitätsspitzen, deren Amplitude aber mindestens um den Faktor 3 geringer ist. Sie spielen beim MALDI-Prozess keine Rolle, da sie wegen der starken Nichtlinearität mit weit weniger als einem Tausendstel zur Ionenbildung beitragen. Sie schmelzen aber Punkte der Probe auf und verdampfen geringe Mengen an Material. Daher ist es günstig, die Strahlen für diese Randspots auszublenden, wie es in dargestellt ist. Über 60% der Gesamtenergie des Laserstrahls findet sich in den herausragenden Intensitätsspitzen des Musters wieder. Durch das Spotmuster mit gleich hohen Intensitätsspitzen werden ein außerordentlich hoher Ionisierungsgrad für Analytionen und ein extrem geringer Probenverbrauch erreicht.
Die Ausführungsform enthält im erweiterten Teil des Lasersystems, wie in dargestellt, ein Drehspiegelsystem (30), um das Spotmuster auf dem Probenträger (35) fein in beiden lateralen Richtungen verschieben zu können. Der parallelisierte UV-Laserstrahl mit strukturiertem Profil kann dazu in dem Drehspiegelsystem (30) mit zwei Galvospiegeln in beiden Raumrichtungen geringfügig abgelenkt werden. Der abgelenkte Laserstrahl wird dann in einem Keplerschen Teleskop (31) aufgeweitet und gemäß der Winkelablenkung parallel verschoben. Der austretende Laserstrahl wird mit verkleinerter Winkelablenkung über den Spiegel (32) wieder genau zentral in das Objektiv (33) gerichtet. Das Objektiv (33) wird je nach Winkelablenkung zentral, aber unter leicht verschiedenen Winkeln durchstrahlt, wodurch sich eine Positionsverschiebung des Spotmusters auf der Probenträgerplatte (35) ergibt. Einzelheiten dazu sind in der bereits oben zitierten Schrift DE 10 2011 116 405 A1 angegeben, die hier durch Referenz eingeschlossen ist.
Wie schon einleitend dargelegt, soll zwar der Ionisierungsgrad für die Analytmoleküle erhöht werden, um die Ionenausbeute zu maximieren, in der Regel soll gleichzeitig aber auch die Anzahl von Fragmentierungen der Ionen begrenzt werden, und zwar sowohl spontane Fragmentierungen wie auch Fragmentierungen metastabiler Ionen während des Fluges durch das Massenspektrometer. Die Bildung metastabiler Ionen kann durch kurze Laserpulse von höchstens etwa drei Nanosekunden eingeschränkt werden. Um Spontanfragmentierungen zu vermeiden, muss die Energiedichte beschränkt werden. Des Weiteren muss dafür gesorgt werden, dass pro Laserschuss nicht mehr als einige Tausend Analytionen erzeugt werden, um eine Sättigung des Ionendetektorsystems zu vermeiden.
Die Voraussetzungen für die gleichzeitige Erfüllung dieser verschiedenartigen Bedingungen sind nicht vollständig bekannt; es hat sich aber erwiesen, dass ein Muster von fünf oder neun Spots mit je fünf Mikrometer Durchmesser für die häufigsten Präparationsarten der Matrixschichten und für die meisten analytischen Ziele einem Optimum sehr nahe kommt. Für andere Präparationsarten, oder für andere analytische Ziele, müssen gelegentlich andere Muster gewählt werden. Durch Ausfahren oder Ausklappen der (eindimensionalen oder zweidimensionalen) Linsenarrays aus dem Strahlengang des UV-Laserlichts kann man einen einzelnen Spot erzeugen; und durch überlappende Unschärfe kann man Spotmuster mit mehr als zwanzig Spots generieren. Die Ausbeute an Analyt-Ionen kann durch geeignete Muster wahrscheinlich auf etwa ein Prozent der Analytmoleküle und mehr, also auf das Hundertfache der Ausbeute des klassischen MALDI-Verfahrens, heraufgesetzt werden.
Vom Normalen abweichende analytische Ziele können beispielsweise gezielte Spontan-fragmentierungen (für In-Source-Decay, ISD) oder hohe Anteile an metastabilen Ionen (für Tochterionenspektren mit Post-Source-Decay, PSD) erfordern, die aber mit den hier geschilderten Lasersystemen ebenfalls eingestellt werden können.
Das Lasersystem des Massenspektrometers ist nicht nur vorteilhaft wegen seiner Energieeinsparungen und seiner hohen Ausbeute an Analytionen, besonders vorteilhaft ist es auch, dass durch die Bildung des Musters mit sehr kleinen Spots auch das Verspritzen von verflüssigtem Matrixmaterial oder auch Abplatzungen größerer Materialteile durch einen hohen Rückstoß beim Verdampfen unterdrückt wird, wodurch zusätzlich Probenmaterial eingespart wird. Speziell bei einer Vermessung einer sehr hohen Anzahl von Proben pro Zeit, wie sie mit Lasern hoher Pulsfrequenz in MALDI-TOF Massenspektrometern ermöglicht werden, ist die verringerte Verschmutzung der Ionenoptik ein immenser Vorteil. Ein weiterer Vorteil liegt auch darin, dass die Front der sich adiabatisch ausdehnenden Plasmawolken des Musters die Ionen bevorzugt in die Flugrichtung des Flugzeitmassenspektrometers beschleunigt.
Als Massenspektrometer kommen für die Erfindung verschiedene Arten in Betracht. Die Analytionen, die mit dem Lasersystem erzeugt werden, können vorzugsweise in einem besonderen MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss, wie es in schematisch dargestellt ist, nachgewiesen und analysiert werden. Es ist jedoch auch möglich, die Analytionen andersartigen Massenanalysatoren zur Analyse zuzuführen, wie beispielsweise Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS), Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (ICR-MS), Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometern (IT-MS) oder elektrostatischen Ionenfallen-Massenspektrometern vom Kingdon-Typ.
Die aufgeführten Ausführungsbeispiele stellen keine abschließende Liste dar. In Kenntnis der Erfindung ist es dem Fachmann möglich, weitere vorteilhafte Ausformungen von Massenspektrometern mit Lasersystemen zu entwerfen, die vom Schutzbereich der Patentansprüche umfasst sein sollen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102004044196 A1 [0004, 0004]
GB 2421352 B [0004]
US 7235781 B2 [0004]
DE 102011116405 A1 [0008, 0008, 0009, 0035]
US 8431890 B2 [0008]
GB 2495815 A [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Refractive Micro-optics for Multi-spot and Multi-line Generation”, M. Zimmermann et al., Procedings of the 9th International Symposium on Laser Precision Microfabrication; LPM2008 [0007]
Design, fabrication and testing of microlens arrays for sensors and microsystems”, Ph. Nussbaum et al., Pure Appl. Opt. 6 (1997) 617–636 [0026]

Claims

Massenspektrometer mit einer Laserdesorptions-Ionenquelle, die ein Lasersystem für die gepulste Ionisierung einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption umfasst, und einem Mustergenerator zur Erzeugung eines Spotmusters in dem vom Lasersystem gelieferten UV-Laserstrahl, dadurch gekennzeichnet, dass der Mustergenerator ein Linsenarray und eine abbildende Linse aufweist, wobei die Linsen des Linsenarrays einem Verhältnis von Abstandsmaße der Linsen in mindestens einer Richtung zueinander („Pitch”) und Brennweite f_A nach der Gleichung f_A = cp²/λ gehorchen, mit einer Konstante c und einer Wellenlänge λ der UV-Strahlung, so dass durch die abbildende Linse ein Muster mehrerer etwa gleich hoher Intensitätsspitzen erzeugt wird.
Massenspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durch eine quadratische Anordnung und quadratische Ausformung der Linsen des Arrays neun etwa gleich hohe Intensitätsspitzen erzeugt werden.
Massenspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durch eine quadratische Anordnung und kreisrunde Ausformung der Linsen des Arrays fünf etwa gleich hohe Intensitätsspitzen erzeugt werden.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Gleichung f_A = cp²/λ die Konstante c etwa ein Fünftel beträgt.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasersystem einen gepulsten Ultraviolettstrahl mit einer Wellenlänge λ im Bereich zwischen 300 und 450 Nanometer erzeugt.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein optisches System aus Teleskop und Objektiv vorhanden ist, das das Spotmuster auf eine zu ionisierende Probe abbildet.
Massenspektrometer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Mustergenerator und Teleskop ein Drehspiegelsystem vorhanden ist, mit dem ein Auftreffpunkt des Laserlichts auf der Probe verstellt werden kann.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasersystem zur Aussendung einer Folge von Laserlichtpulsen mit einer Pulsrate bis zu 10 Kilohertz oder mehr ausgelegt ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Mustergenerator mit einer Verstelleinrichtung gekoppelt ist und so in einen Strahlengang des ultravioletten Laserlichts hineingefahren oder hineingeklappt werden kann, um das Spotmuster zu erzeugen, und aus dem Strahlengang herausgefahren oder herausgeklappt werden kann, um den Laserlichtstrahl unmodifiziert auf die Probe treffen zu lassen.
Verfahren zur Ionisierung einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in einem Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Analytmoleküle enthaltende Probe bereitgestellt wird, und die Analytmoleküle mit einem Spotmuster ionisiert und massenspektrometrisch gemessen werden.