DE102011116405A1

DE102011116405A1 - Massenspektrometer mit MALDI-Lasersystem

Info

Publication number: DE102011116405A1
Application number: DE102011116405A
Authority: DE
Inventors: Andreas Haase; Jens Höhndorf
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2013-04-25
Anticipated expiration: 2031-10-20
Also published as: GB2495815A; US20130099112A1; US8431890B1; GB2495815B; DE102011116405B4; GB201217476D0

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Massenspektrometer mit Lasersystem für massenspektrometrische Analysen mit einer Ionisierung von Analytmolekülen in einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption. Die Erfindung beinhaltet ein Lasersystem, das mit geringstem Energieaufwand auf der Probe ein räumlich verteiltes Spotmuster mit annähernd gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt, wodurch der Ionisierungsgrad für Analytionen gegenüber konventionellen Spotmustern steigt. Das Spotmuster mit gleich hohen Intensitätsspitzen wird vorzugsweise durch homogene Ausleuchtung eines Mustergenerators, beispielsweise eines Linsenarrays, erzeugt, wobei die homogene Ausleuchtung durch ein preiswertes Strahlformungselement, das nicht auf den UV-Strahl, sondern auf den ursprünglichen Infrarotstrahl wirkt, in Verbindung mit den Strahlquerschnitts- und Strahlprofiländerungen durch die nichtlinearen Konversionskristalle hergestellt wird. Durch diese Strahlformung kann nicht nur ein Strahlprofil erzeugt werden, das verlustarm den Mustergenerator homogen ausleuchtet, sondern gleichzeitig auch die Effizienz der Frequenzvervielfachung und die Lebensdauer der Konversionskristalle erhöht, so dass durch Verringerung der notwendigen Laserenergie und Erhöhung der Lebensdauer erhebliche Kosteneinsparungen erbracht werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Massenspektrometer mit einer Laserdesorptions-Ionenquelle, die ein Lasersystem für massenspektrometrische Analysen mit einer Ionisierung von Analytmolekülen in einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption umfasst.
Es wird ein Massenspektrometer mit einem Lasersystem vorgeschlagen, das mit geringstem Energieaufwand auf der Probe ein räumlich verteiltes Spotmuster mit gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt, wodurch der Ionisierungsgrad für Analytionen gegenüber konventionellen Spotmustern steigt. Das Spotmuster kann mit gleich hohen Intensitätsspitzen durch homogene Ausleuchtung eines Mustergenerators, beispielsweise eines Linsenarrays, erzeugt werden, wobei sich die homogene Ausleuchtung durch ein preiswertes Strahlformungselement, das nicht auf den UV-Strahl, sondern auf den ursprünglichen Infrarotstrahl wirkt, in Verbindung mit den Strahlquerschnitts- und Strahlprofiländerungen durch die nichtlinearen Konversionskristalle herstellen lässt. Durch diese Strahlformung wird nicht nur ein Strahlprofil erzeugt, das verlustarm den Mustergenerator homogen ausleuchtet, sondern gleichzeitig auch die Effizienz der Frequenzvervielfachung und die Lebensdauer der Konversionskristalle erhöht, so dass durch Verringerung der notwendigen Laserenergie und Erhöhung der Lebensdauer erhebliche Kosteneinsparungen erbracht werden.
Stand der Technik
In der Massenspektrometrie von biologischen Makromolekülen haben sich in den letzten zwanzig Jahren zwei Verfahren durchgesetzt: die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI, Abkürzung für „Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization”) und das Elektrosprühen (ESI, Abkürzung für „Electrospray Ionization”). Die zu analysierenden biologischen Makromoleküle werden im Folgenden als Analytmoleküle bezeichnet. Beim MALDI-Verfahren sind die Analytmoleküle in der Regel auf der Oberfläche eines Probenträgers in einer festen, polykristallinen Matrixschicht präpariert und werden ganz überwiegend einfach geladen ionisiert, während sie beim ESI-Verfahren in einer Flüssigkeit gelöst sind und vielfach geladen ionisiert werden. Beide Verfahren ermöglichen es erstmals, biologische Makromoleküle für Untersuchungen in der Genomik, Proteomik und Metabolomik massenspektrometrisch zu analysieren; ihre Erfinder, John B. Fenn und Koichi Tanaka, wurden im Jahr 2002 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt.
In einer präparierten MALDI-Probe sind die Matrixmoleküle gegenüber den Analytmolekülen mit einem 10³- bis 10⁵-fachen Überschuss vorhanden und bilden eine polykristalline Schicht, in der die Analytmoleküle weitgehend ohne Berührung mit anderen Analytmolekülen im Inneren der Kristalle oder an deren Korngrenzen eingebaut sind. Die Matrixsubstanz ist so ausgesucht, dass ihre Moleküle einerseits das Ultraviolettlicht des Laserpulses absorbieren und andererseits die Analytmoleküle protonieren können. Ein kleiner Belichtungsbereich (im Folgenden mit „Spot” bezeichnet) auf der präparierten MALDI-Probe von etwa 50 bis 200 Mikrometer Durchmesser wird kurzzeitig mit einem Laserpuls bestrahlt, der von den Matrixmolekülen stark absorbiert wird. Durch die gepulste Bestrahlung wird oberflächliches Matrixmaterial in wenigen Nanosekunden aus dem festen Aggregatzustand in die Plasmaphase überführt, wobei viele Matrixmoleküle (oder deren Bruchstücke) thermisch ionisiert werden. Die Ionisierung der Analytmoleküle erfolgt in der Regel durch deren Protonierung oder Deprotonierung in Reaktionen mit Matrixmolekülen oder Matrixionen im dichten Plasma. Die Plasmawolke dehnt sich unter stetiger Beschleunigung aller Moleküle in einigen Hundert Nanosekunden in das Vakuum hinein aus und kühlt sich dabei adiabatisch stark ab. Bei der Ausdehnung bricht bei einer kritischen Gasdichte der Kontakt der Gasmoleküle untereinander ab: der Ionisierungszustand der Moleküle in der Plasmawolke wird eingefroren. Der Ionisierungsgrad der Analytmoleküle beträgt bei klassischem MALDI nur etwa 10^–4. Die Analytionen liegen vorwiegend einfach geladen vor. Es handelt sich hier um eine „weiche Ionisierung”, da die Analytmoleküle ionisiert werden, ohne Bindungsbrüche zu erleiden.
Die Ionisierung der Analytmoleküle durch die Matrix ist in Bezug auf die Energiedichte im Laserspot ein extrem nichtlinearer Prozess: der Ionisierungsgrad steigt nach mehreren übereinstimmenden Literaturangaben mindestens mit der sechsten Potenz der Energiedichte an. Die ersten Analytionen erscheinen bei einer Energiedichtenschwelle von etwa 10 Millijoule pro Quadratzentimeter. Bei ungefähr 100 Millijoule pro Quadratzentimeter liegt eine Obergrenze für eine weiche Ionisierung; ab hier treten spontane Fragmentierungen der Analytmoleküle auf. Die Einstellung der optimalen Energiedichte ist kritisch, da einerseits die Massenauflösung von der Energiedichte abhängt und andererseits nur maximal etwa tausend Analytionen pro Laserpuls erzeugt werden dürfen, weil sonst die Sättigungsgrenze des Ionendetektorsystems, das in der Regel mit einem 8-bit-DAC bestückt ist, überschritten wird. Für die Analysen ist es wichtig, auch einzelne Ionen noch sicher nachweisen zu können; bei maximal tausend Ionen im stärksten Ionensignal und einer Messrate von vier Gigahertz verteilen sich die Ionen des stärksten Ionensignals so auf mehrere Messintervalle, dass die Sättigung knapp vermieden wird, aber einzelne Ionen noch detektierbare Signale erzeugen. Da eine Verdoppelung der Energiedichte den Ionisierungsgrad der Analytmoleküle um mindestens einen Faktor 2⁶ = 64 erhöht, liegt diese optimale Energiedichte nur um etwa einen Faktor 2,5 bis 3,0 über der Energiedichtenschwelle, bei der die ersten Ionen erscheinen. Gesamtenergie und Energiedichte müssen auf etwa ein Prozent konstant gehalten werden; dadurch werden Schwankungen der Ionenerzeugung und des Ionisierungsgrades bei etwa 6 bis 7 Prozent gehalten. Eine weitere Erhöhung der Energiedichte um einen Faktor 3 würde den Ionisierungsgrad für Analytmoleküle auf über 10 Prozent steigern können, dabei aber das Ionendetektorsystem hoffnungslos übersteuern. Außerdem steigt bei einer Erhöhung der Energiedichte gleichzeitig auch die Anzahl der „metastabilen” Ionen, das sind solche Ionen, die auf dem Wege zum Ionendetektor zerfallen und den Ionendetektor aus Ionenoptischen Gründen nicht mehr erreichen können. Wird die Anzahl der metastabilen Ionen zu hoch, so kann zwar der Ionisierungsgrad noch ansteigen, die Anzahl an detektierbaren Ionen aber nicht.
Der MALDI-Prozess ist komplex und wird durch viele und zum Teil voneinander abhängige Faktoren beeinflusst. Seit der Erstveröffentlichung des MALDI-Verfahrens im Jahr 1988 wurden viele Parameter untersucht und variiert. Trotzdem sind die Prozesse in der Matrix und in der Verdampfungswolke, die zur Ionisierung der Analytmoleküle fuhren, noch nicht vollständig verstanden und werden weiterhin intensiv erforscht (K. Dreisewerd, Chem Rev. 103 (2003), 395–425: „The Desorption Process in MALDI").
Die chemischen Parameter des MALDI-Prozesses, wie zum Beispiel die Art der Matrixsubstanzen, das Konzentrationsverhältnis zwischen Matrix- und Analytmolekülen und die Präparationsbedingungen, sind eingehend untersucht worden. Für Analytmoleküle unterschiedlicher chemischer Substanzklassen, wie etwa für Proteine oder Nukleinsäuren, sind über hundert verschiedene chemische Matrixsubstanzen bekannt, wie zum Beispiel Sinapinsäure, DHB (Abkürzung für „2,5-dihydroxy-benzoic acid”), CHCA (Abkürzung für „α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid”, Zimtsäure) oder HPA (Abkürzung für „3-hydroxypicolinic acid”), die den MALDI-Prozess in unterschiedlicher Weise beeinflussen und für unterschiedliche Zielsetzungen eingesetzt werden können. Die Matrixsubstanzen sind in aller Regel aromatische Säuren; sie weisen durch den aromatischen Ring im Wellenlängenbereich zwischen 330 und 360 Nanometer eine starke Absorptionsfähigkeit auf und können als Säure leicht ein Proton abgeben.
Eine MALDI-Probe kann auf verschiedene Arten präpariert werden, zum Beispiel mit der „Dried Droplet”-Präparation oder der zu bevorzugenden Dünnschichtpräparation. In der „Dried Droplet” Präparation wird die Matrixsubstanz zusammen mit den Analytmolekülen in einem Lösungsmittel gelöst, auf einen Probenträger aufgetragen und anschließend getrocknet, diese Präparation verteilt aber Analytmoleküle extrem inhomogen in den Matrixkristallkomplexen und ist für quantitative Analysen kaum zu gebrauchen. In der Dünnschichtpräparation hingegen wird die Matrixsubstanz ohne Analytmoleküle auf den Probenträger aufgetragen und zu einer dünnen polykristallinen Matrixschicht von nur wenigen Mikrometern Dicke eingetrocknet. Diese Matrixdünnschicht besitzt eine hohe Absorptivität für Peptide und Proteine. Danach wird ein Tropfen einer Lösung mit Analytmolekülen auf die dünne Matrixschicht gegeben, der Tropfen verteilt sich rasch über die gesamte Dünnschicht und die Analytmoleküle werden gleichmäßig absorbiert. Durch besondere Maßnahmen kann die Matrixschicht teilweise erneut gelöst und die Analytmoleküle können bei der anschließenden Trocknung sehr gleichmäßig in die Matrixschicht eingebaut werden.
Bei den physikalischen Parametern des MALDI-Prozesses sind bisher vornehmlich die Einflüsse der zeitlichen Dauer der Laserpulse, der Intensität im Laserfokus und der Wellenlänge der gepulsten Laserstrahlung auf Ionisierung und Fragmentierung untersucht worden. So treten beispielsweise spontane Fragmentierungen überwiegend nur bei hohen Energiedichten in der ersten Nanosekunde auf; der Hauptteil an metastabilen Ionen wird dagegen bei Bestrahlungen mit Zeitdauern von länger als drei Nanosekunden erzeugt.
Für kommerziell verfügbare MALDI-Massenspektrometer werden heutzutage überwiegend gepulste Lasersysteme im ultravioletten Spektralbereich (UV) verwendet. Der preiswerte Stickstofflaser mit λ = 337 nm Wellenlänge wird heute wegen seiner eingeschränkten Lebensdauer in anspruchsvollen MALDI-Massenspektrometern meist durch frequenzverdreifachte Nd:YAG-Laser mit einer Wellenlänge λ = 355 nm ersetzt. Der Nd:YAG-Laser basiert auf einem mit Neodym-Ionen dotierten YAG-Kristall (Yttrium-Aluminium-Granat: Y₃Al₅O₁₂). Beim Nd:YAG-Laser wird die Frequenz der stärksten Laserlinie, die bei einer Wellenlänge von 1064 Nanometern liegt, in einem ersten nichtlinearen optischen Konversionskristall zunächst zur zweiten harmonischen Frequenz verdoppelt, was grünes Licht ergibt, und in einem zweiten nichtlinearen Konversionskristall durch Mischung von Grundwellenlänge und zweiter harmonischer Frequenz in die angegebene UV-Wellenlänge der dritten harmonischen Frequenz umgewandelt. Dabei muss eine sogenannte Phasenanpassung in beiden Kristallen erfüllt sein, die durch eine sehr genaue Temperierung der Kristalle auf besser als 0,1 Kelvin erreicht wird. Die Kristalle sind dazu jeweils in entsprechend geregelte Öfen eingeschlossen. Der zweite Konversionskristall ist wie üblich so angeordnet, dass er den Walk-off des grünen Lichts gegenüber der Grundwellenlänge im ersten nichtlinearen Konversionskristall möglichst kompensiert. Die Dauer der im MALDI-Verfahren verwendeten Laserpulse beträgt im UV typischerweise zwischen 3 und 8 Nanosekunden.
Beim Übergang von Stickstoff-Lasern zu Nd:YAG-Lasern trat dabei überraschenderweise eine Verschlechterung des Ionisierungsgrades von Analytmolekülen auf, die zunächst nicht erklärt werden konnte. Durch Untersuchungen der Anmelderin kannte gezeigt werden, dass die Verschlechterung mit dem Übergang einer erratischen, zeitlich immer wieder veränderten Strahlstruktur im Strahlprofil des Stickstoff-Lasers zu einem unmodulierten und konstanten Gauß-Profil des Nd:YAG-Lasers zusammenhing. Die örtlich und zeitlich modulierte Strahlstruktur des Stickstoff-Lasers wurde durch auf die Probe abgebildete blitzartige Entladungen im Stickstoffgas erzeugt, deren Form und Position sich von Schuss zu Schuss immer wieder änderten. Der Festkörperlaser hingegen lieferte einen runden Strahl mit Gaußprofil. Die Ionenausbeute aus einem Spot von etwa 100 Mikrometer Durchmesser mit Gaußprofil war extrem gering und musste durch Erhöhung der Energiedichte kompensiert werden; dadurch aber wurden die Massenauflösung verschlechtert und der Probenverbrauch extrem gesteigert, zum Teil, weil flüssiges Matrixmaterial beim Desorptionsprozess verspritzt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass ein Spotdurchmesser von nur fünf bis zehn Mikrometer den Ionisierungsgrad verbesserte, aber unterhalb der Fragmentierungsgrenze zu wenig Ionen pro Laserschuss lieferte. Es wurde daher durch geeignete Maßnahmen ein strukturiertes Strahlprofil erzeugt, das auf der Probe als Spotmuster mit etwa zehn Intensitätsspitzen von je etwa 6 bis 10 Mikrometer Durchmesser abgebildet wurde. Durch diese Mustererzeugung ergab sich eine dramatische Verbesserung. Es konnte bei extrem niedrigem Probenverbrauch eine Erhöhung des Ionisierungsgrades von Analytmolekülen um einen Faktor 100 ohne Sättigung des Ionendetektorsystems erzielt werden. Das strukturierte Strahlprofil für das Spotmuster kann durch viele Einrichtungen wie der Einführung von Phasenstörungen bei transversal kohärenten Strahlen (wie beispielsweise durch zerknitterte Plastikfolien) erzeugt werden. Die gleichmäßigsten Spotmuster werden durch kommerziell erhältliche Linsenarrays aus Quarzglas generiert. Das Verfahren der Strahlerzeugung und die entsprechenden Lasersysteme sind in den äquivalenten Dokumenten DE 10 2004 044 196 A1 , GB 2 421 352 B und US 7,235,781 B2 (A. Haase et al., 2004) beschrieben und unter der Bezeichnung „Smart Beam” bekannt geworden. Das Dokument DE 10 2004 044 196 A1 soll hier durch Referenz vollinhaltlich eingeschlossen sein.
Bei der Erzeugung des Spotmusters kommt es darauf an, dass alle Einzelspots möglichst genau die gleiche Energiedichte aufweisen. Wird beispielsweise ein quadratisches Linsenarray aus neun Linsen mit einem Laserstrahl mit Gaußprofil bestrahlt, so wird die zentrale Linse wegen des Maximums im Gaußprofil einen Spot mit höherer Energiedichte erzeugen. Ist hier die Energiedichte um 50 Prozent erhöht, so steigt hier der Ionisierungsgrad um mehr als einen Faktor 10, was die anderen Spots des Musters für die Ionenerzeugung bedeutungslos werden lässt. Sollen alle Spots etwa gleiche Ionisierung zeigen, so kann nur ein geringer, zentraler Teil des Gaußprofils eines stark verbreiterten Laserstrahls zur Ausleuchtung des Linsenarrays verwendet werden. Das Licht im übrigen Teil des Gaußprofils, der weitaus größte Teil des mühsam erzeugten UV-Lichts, muss durch Blenden oder andere Maßnahmen vernichtet werden. Außerdem ist die Justierung des Laserstrahls transversal zum Mustergenerator sehr anspruchsvoll.
In den Anfangszeiten kommerzieller MALDI-Flugzeitmassenspektrometer wurde mit Laserpulsraten von 20 bis 50 Hertz gearbeitet, da die Stickstofflaser nicht mit höheren Pulsraten zu betreiben waren, ohne ihre Lebensdauer dramatisch herabzusetzen. Ein gutes Massenspektrum setzt sich aus einigen Hundert bis Tausend Einzelspektren zusammen; die Aufnahme eines guten, rauscharmen Massenspektrums aus tausend Einzelspektren dauerte also etwa 20 Sekunden. Der Übergang auf Festkörperlaser ermöglichte schon bald Pulsraten von 1000 Hertz und Aufnahmezeiten von etwa einer Sekunde. Mit der Einführung der bildgebenden Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten mit einigen Zehntausend Bildpunkten und einem Massenspektrum für jeden Bildpunkt, wurde rasch der Wunsch nach höheren Aufnahmeraten laut, was aber Lasersysteme mit weit höherer Leistung erfordert. Für Flugzeitmassenspektrometer liegt die Grenze für die Laserpulsrate bei etwa 10 Kilohertz, weil dann gerade noch ausreichende 100 Mikrosekunden für die Messung des Flugzeitspektrums zur Verfügung stehen. Um aber 10 Kilohertz Laserpulsraten erreichen zu können, ist es ratsam, sehr sparsam mit der Laserenergie umzugehen und nicht den größten Teil des erzeugten UV-Lichts zu vernichten, da sonst die erforderlichen Lasersysteme aufgrund hoher Leistungsanforderungen weitaus zu teuer und aufwändig werden.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Massenspektrometer mit einem Lasersystem für die Ionisierung einer Probe bereitzustellen, mit dem sich die Ionisierungsausbeute erhöhen lässt, das insbesondere auch bei hoher Pulsfrequenz eine hohe Lebensdauer aufweist und mit geringem Energie- und Kostenaufwand betrieben werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Massenspektrometer mit einer Laserdesorptions-Ionenquelle vorgeschlagen, die ein gepulstes Festkörperlasersystem, Konversionskristalle zur Erhöhung der Frequenz und einen Mustergenerator im aus der Frequenzerhöhung resultierenden Laserstrahl umfasst, in dem sich zwischen dem Festkörperlasersystem und den Konversionskristallen ein Strahlformungselement befindet, das den runden Laserstrahl mit Gaußprofil in einen Strahl mit annähernd rechteckigem Querschnitt und einer Energiedichte wandelt, die über den ganzen rechteckigen Querschnitt annähernd gleich hoch ist. Bevorzugt wird ein Infrarot-Festkörperlasersystem eingesetzt. Ökonomische Vorteile lassen sich zum Beispiel dadurch realisieren, dass erstens Strahlformungselemente für infrarotes Licht wesentlich preiswerter als Strahlformungselemente für ultraviolettes Licht sind; zweitens können durch den rechteckigen Querschnitt und die homogene Energiedichte die nichtlinearen Konversionskristalle besser und mit höherer Konversionsrate ausgenutzt werden; drittens steigt die Lebensdauer der Konversionskristalle; und viertens besitzt der Strahl am Ausgang der Konversionskristalle einen Querschnitt, der in einem quadratischen Mittelteil, der über 90 Prozent der Strahlenergie enthält, eine homogene Energiedichte zeigt. Er eignet sich daher in idealer Weise für eine homogene Ausleuchtung des Mustergenerators, ohne dass wesentliche Anteile dieses höherenergetischen Lichts abgeschnitten und vernichtet werden müssen.
Das vom Mustergenerator erzeugte Strahlprofil, zum Beispiel eine Struktur mit neun einzelnen Spots mit kleinen Durchmessern in quadratischer Anordnung, lässt sich dann über ein Teleskop mit nachfolgender Linsenoptik verkleinert auf die Probe abbilden, wobei in diesem Beispiel neun Spots mit Durchmessern von je etwa fünf Mikrometern und gleichen Energiedichten erzeugt werden können.
Die Erfindung stellt also ein Massenspektrometer mit einem Lasersystem hoher Lebensdauer bereit, das mit nur geringen Energieverlusten auf der Probe ein räumlich verteiltes Spotmuster mit gleich hohen Intensitätsspitzen erzeugt, wodurch ein hoher Ionisierungsgrad für Analytionen erreicht wird.
Beschreibung der Abbildungen
gibt in der linken Spalte für eine bevorzugte Ausführungsform die Geräteteile (1) bis (9), die zur Erzeugung eines strukturierten UV-Strahls notwendig sind, deren optische Anordnung und die Bildebenen A bis F wieder; daneben sind die Intensitätsprofile des infraroten, grünen und ultravioletten Lichts in den Bildebenen quer zum jeweiligen Laserstrahl eingezeichnet; und in der rechten Spalte die Strahlquerschnittsformen, dargestellt für Höhen gleicher Intensität. Der Strahlerzeuger (1) enthält die Pumpdioden und den Resonator mit Laserkristall und gegebenenfalls einer Pockelzelle; hier wird der zeitlich gepulste Infrarotstrahl (10) erzeugt. Die Strahlformungsoptik (2) formt den runden Strahl mit Gaußprofil (13, 14) in einen Rechteckstrahl (15) von etwa 5 mal 6 Quadratmillimeter mit einem Profil (16) konstanter Energiedichte um, das in der Bildebene B entsteht. Linse (3) bildet die Bildebene B auf etwa 500 mal 600 Quadratmikrometer verkleinert in die Bildebene C ab; die Verkleinerung ist in aus Gründen höherer Deutlichkeit nicht wiedergegeben. Die Entfernungen sind hier für eine übersichtliche Darstellung nicht maßstabsgetreu, sondern stark verkürzt dargestellt; der rechteckige Querschnitt des Strahls von 500 mal 600 Quadratmikrometer zieht sich fast unverändert durch die beiden temperierten Konversionskristalle (4) und (5). Im nichtlinearen Kristall (4) wird durch Frequenzverdopplung grünes Licht (11) erzeugt, das durch die Doppelbrechung mit einem sehr kleinen Winkel seitlich abgelenkt wird („Walk off”) und mit etwa 100 Mikrometer Versatz austritt. Das grüne Licht hat zwischen den beiden Konversionskristallen quer zum Strahl ein Energiedichtenprofil (18), das einem Trapez nahe kommt, wobei aber durch den Abfall der Energiedichte des Infrarotstrahls längs des Konversionskristalls (4) die Seiten des Trapezes leicht gebogen sind. Der grüne Strahl wird im entsprechend orientierten nichtlinearen Kristall (5) zum infraroten Strahl (10) zurückgelenkt und reagiert mit diesem zum ultravioletten Strahl (12), der wiederum ein trapezförmiges Energiedichtenprofil (20) aufweist, hier mit weniger gebogenen Flanken. Das infrarote Licht (10) und das grüne Licht (11) werden im Filter (6) ausgeblendet, so dass nur das ultraviolette Licht (12) weitergeleitet wird. Die Linse (7) bildet die Bildebene D vergrößert in die Bildebene E ab, die die Oberfläche des Strahlteilers (8) bildet; hier hat ein etwa rechteckiger Teil von etwa 4 mal 4 Quadratmillimeter des Querschnitts (21) homogen gleiche Intensität (22). Der Strahlteiler (8), beispielsweise ein Linsenarray mit geringer Brennweite, wird mit dem homogenen Teil des Querschnitts gut ausgeleuchtet und formt daraus das gewünschte Strahlmuster, in dem alle Spots die gleiche Intensität haben. Eine Linse (9) erzeugt dann in der Ebene F einen Parallelstrahl mit Querschnittsmuster (23) und Energiedichtenprofil (24). Dieser Strahl wird, wie in zu sehen ist, über entsprechende Optiken verkleinert auf die Probe abgebildet.
zeigt, wie die Gesamtheit (1–9) aller optischen Elemente (1) bis (9) aus schematisch in ein Gesamtlasersystem (43) eingebettet ist, das mit einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer (44) verbunden ist. Es handelt sich hier um ein besonderes Lasersystem, das durch ein Drehspiegelsystem (30) eine Steuerung der Position des Laserlichtmusters auf der Probenträgerplatte (35) bewirkt. Der parallelisierte UV-Laserstrahl mit strukturiertem Profil aus Ebene F kann in dem Drehspiegelsystem (30) mit zwei Galvospiegeln in beiden Raumrichtungen geringfügig abgelenkt werden. Der abgelenkte Laserstrahl wird dann in einem Keplerschen Teleskop (31) aufgeweitet und gemäß der Winkelablenkung parallel verschoben. Der austretende Laserstrahl wird mit verkleinerter Winkelablenkung über den Spiegel (32) wieder genau zentral in das Objektiv (33) gerichtet. Das Objektiv (33) wird je nach Winkelablenkung zentral, aber unter leicht verschiedenen Winkeln durchstrahlt, wodurch sich eine Positionsverschiebung des Spotmusters auf der Probenträgerplatte (35) ergibt. Die in den Plasmawolken des Laserspotmusters generierten Ionen werden durch Spannungen an den Blenden (36) und (37) zu einem Ionenstrahl (40) beschleunigt, der die beiden um 90° verdrehten Ablenkkondensatoren (38) und (39) zur Bahnkorrektur passiert und im Reflektor (41) auf den Detektor (42) fokussiert wird. Es sei hier angemerkt, dass die Strahlführung innerhalb eines Teleskops (31) nach Kepler komplizierter ist und aus Vereinfachungsgründen von der Abbildung nicht real wiedergegeben wird, die Abbildung gibt aber die Außenwirkung des Teleskops auf den Laserlichtstrahl richtig wieder.
stellt verschiedene regelmäßige Laserspotmuster mit 4, 7, 9, 16 und 19 einzelnen Laserspots dar. Die Abstände zwischen den Spots sind hier gerade so groß gewählt wie der Spotdurchmesser, es können jedoch auch Muster mit anderen Abständen und Spotdurchmessern hergestellt werden. Mustergeneratoren für quadratische Muster mit 4, 9, 16 oder auch 25 Spots können durch rechteckige Formen des Infrarotstrahls und daraus erzeugtem quadratischen Flat-Top-Profil des UV-Strahls mit den geringsten Verlusten optimal ausgeleuchtet werden.
Bevorzugte Ausführungsformen
In einer möglichen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Massenspektrometer ein Lasersystem mit einem gepulsten Infrarot-Festkörperlasersystem (1), zwei Konversionskristallen (4) und (5) zur Verdreifachung der Frequenz und einem Mustergenerator (8) im ultravioletten Laserstrahl, in dem sich zwischen dem Festkörperpulslasersystem (1) und den Konversionskristallen (4) und (5) eine preiswerte Strahlformungsoptik (2) befindet, die den runden Infrarot-Strahl mit Gaußprofil (14) in einen Strahl (10) mit annähernd rechteckiger Form (15) mit annähernd überall gleich hoher Energiedichte (16) wandelt. Das Lasersystem erzeugt bevorzugt einen Infrarotstrahl, dessen Frequenzverdreifachung UV-Licht mit einer Wellenlänge zwischen 300 und 450 Nanometer, vorzugsweise zwischen 330 und 370 Nanometer, liefert.
Es wird dabei bewusst darauf verzichtet, in herkömmlicher Weise einen UV-Laserlichtstrahl mit einem Gaußprofil zu erzeugen, und diesen Laserlichtstrahl in einen Strahl mit homogener Energiedichte umzuwandeln, um eine homogene Ausleuchtung des Mustergenerators zu ermöglichen. Strahlformungsoptiken für UV-Strahlen müssen aus sauberen, UV-durchlässigen Materialien, bevorzugt aus Quarzglas, gefertigt sein: sie sind wegen schwieriger Bearbeitbarkeit extrem teuer.
Strahlformungsoptiken (2) für einen Infrarotstrahl sind dagegen wesentlich preiswerter. Es gibt hier auf dem Markt verschiedene refraktive und diffraktive Strahlformungsoptiken, die alle darauf beruhen, Laserlicht aus dem Zentrum der Gaußverteilung in die Randgebiete zu verteilen, aber den Parallelstrahl mit möglichst hoher Güte beizubehalten. Das kann refraktiv durch besonders geformte Linsen erreicht werden. Diffraktive Strahlformungselemente sind ein wenig teurer, liefern in der Regel aber qualitativ bessere Strahlformen. Die Strahlformungselemente können aus den runden Infrarotstrahlen mit etwa 5 Millimeter Durchmesser und gaußförmiger Energieverteilung rechteckige Strahlquerschnitte mit wählbaren Abmessungen von beispielsweise 5 mal 6 Quadratmillimeter und homogener Energiedichte formen.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist in wiedergegeben. stellt in der linken Spalte die Geräteteile (1) bis (9) dar, die für die Erzeugung eines strukturierten UV-Strahls notwendig sind. Neben der optischen Anordnung der Geräteteile sind Bildebenen A bis F wiedergegeben. In einer zweiten Spalte daneben sind für die Bildebenen A bis F die Energiedichtenprofile, also die Intensitätsverteilungen quer zum jeweiligen Laserstrahl dargestellt. In der rechten Spalte der sind die Strahlquerschnittsformen des jeweils wichtigen infraroten, grünen oder ultravioletten Lichts in einer jeweils frei gewählten (also nicht maßstabsgetreuen) Intensitätshöhe eingezeichnet. Der Strahlerzeuger (1) enthält Pumpdioden, Resonator mit Laserkristall und erforderlichenfalls auch einer Pockelzelle und einen Strahlabsschwächer; hier wird der gepulste Infrarotstrahl erzeugt. Die Strahlformungsoptik (2) formt aus dem Strahl mit rundem Querschnitt (13) und Gaußprofil (14) einen Rechteckstrahl mit Querschnitt (15) und dem rechteckigen Profil (16) annähernd gleicher Intensität über den gesamten Querschnitt, das für die Bildebene B dargestellt ist. Linse (3) bildet die Bildebene B in die Bildebene C ab. Die Entfernungen sind hier für eine übersichtliche Darstellung nicht maßstabsgetreu sondern stark verkürzt; der auf etwa 500 mal 600 Quadratmikrometer verkleinerte rechteckige Querschnitt des Strahls zieht sich ohne wesentliche Änderungen durch beide Konversionskristalle (4) und (5). Im nichtlinearen Kristall (4) wird durch Frequenzverdopplung grünes Licht (11) erzeugt, das sich unter einem kleinen Winkel seitlich abgelenkt fortpflanzt. Diese Ablenkung wird „Walk-off” genannt; beim Austritt aus dem etwa 15 Millimeter langen Konversionskristall (4) ist der grüne Strahl gegenüber dem infraroten um etwa 100 Mikrometer verschoben. Dieser Walk-off wird, wie im Stand der Technik bekannt, im entsprechend geschnittenen und angeordneten nichtlinearen Kristall (5) mit einer Walk-off-Kompensation zurückgelenkt und reagiert mit dem restlichen Infrarotstrahl (10) zum ultravioletten Strahl (12). Die erforderlichen Phasenabstimmungen für die Ablenkungen für die beiden nichtlinearen Konversionskristalle werden durch präzise Temperierung eingestellt; die Temperierungsöfen sind in nicht dargestellt. Das restliche infrarote Licht (10) und das restliche grüne Licht (11) werden im Filter (6) ausgeblendet, so dass nur das ultraviolette Licht (12) weitergeleitet wird. Wie für die Bildebene D gezeigt, hat der entstehende UV-Strahl ein etwa trapezförmiges Intensitätsprofil (20) mit leicht gebogenen Seiten, wobei die Basislinie des Trapezes gegenüber der Deckellinie um einen Betrag größer ist, der etwa dem doppelten Walk-off entspricht. Im Mitteleteil des Querschnitts (19) befindet sich ein etwa quadratisches Teilstück von etwa 500 mal 500 Quadratmikrometer mit homogen gleicher Energiedichte. Die Linse (7) bildet die Bildebene D vergrößert auf die Oberfläche des Mustergenerators (8) (Bildebene E) ab, der mit dem quadratischen Teilstück homogener Energiedichte gleichmäßig ausgeleuchtet wird. Nur ein sehr geringer Energieanteil des UV-Strahls von etwa 5 bis 10 Prozent unter den Seitenlinien des Trapezes geht bei der Ausleuchtung verloren. Der Mustergenerator (8) formt mit seinen Linsen geringer Brennweite das gewünschte Strahlmuster, in dem alle Spots die annähernd gleiche Intensität haben. Eine weitere Linse (9) bildet die Fokuspunkte der Linsen des Mustergenerators (8) ins Unendliche ab. In der Bildebene F hat der Parallelstrahl das gewünschte Querschnittsmuster (23) mit dem Profil (24) gleich hoher Energiedichten in den Spots des Musters. Dieser Strahl wird, wie in zu sehen ist, über entsprechende Optiken verkleinert auf die Probe abgebildet.
Wegen der exponentiellen Abnahme der Energiedichte im Infrarotstrahl (10) innerhalb des Konversionskristalls (4) hat der Querschnitt (17) des grünen Lichts ein trapezförmiges Profil (18) mit leicht gebogenen Seitenlinien; diese Form führt durch gegenläufige Kompensation im Konversionskristall (5) dazu, dass auch Querschnitt (19) des UV-Strahls ein Trapezprofil (20) mit leicht gebogenen Seitenlinien aufweist, wenn auch weniger stark ausgeprägt.
Durch den rechteckigen Querschnitt (15) und das homogene Energiedichtenprofil (16) des Infrarotstrahls können die beiden nichtlinearen Konversionskristalle (4) und (5) besser konvertieren, und der UV-Strahl besitzt in der Bildebene D am Ausgang der Konversionskristalle einen Querschnitt (19), der ein etwa trapezförmiges Profil (20) mit einem quadratischen Mittelteil homogener Energiedichte aufweist. Während theoretisch aus einem Infrarotstrahl mit Gaußprofil maximal 43 Prozent in UV-Licht umgewandelt werden können, kann man mit homogenen Rechteckprofilen eine weitaus höhere Wandlungsrate erreichen. Dabei liegt für ein Gaußprofil die Energiedichte im Maximum des Strahlquerschnitts dicht unter der Zerstörungsgrenze für den Kristall, was seine Lebensdauer herabsetzt. Für das Rechteckprofil hingegen liegt die Energiedichte deutlich niedriger: dieses Verfahren erhöht die Lebensdauer der nichtlinearen Konversionskristalle. Soll das Lasersystem bei zehn Kilohertz Pulsfrequenz etwa ein Jahr lang betrieben werden können, so muss die Lebensdauer des Lasersystems bei 10¹¹ Laserpulsen liegen. Da die Lebensdauer im Wesentlichen durch die Konversionskristalle bestimmt wird, wirkt sich auch hier der rechteckige Infrarotstrahl kostengünstig aus.
Das Strahlmuster des Mustergenerators (8), zum Beispiel die quadratische Struktur (23) mit neun einzelnen Teilstrahlen geringer Durchmesser, wird dann über Linse (9) ins Unendliche abgebildet. Wie in zu sehen, wird dieses Strahlmuster durch ein Teleskop (31) aufgeweitet und durch eine Linsenoptik (33) auf die Probe abgebildet, wobei beispielsweise neun Spots mit Durchmessern von je etwa fünf Mikrometern und gleichen Energiedichten erzeugt werden können. In ist auch gezeigt, wie sich durch ein doppeltes Drehspiegelsystem (30) eine Positionssteuerung des Spotmusters auf der MALDI-Probe erreichen lässt.
Statt der neun Spots können aber auch, wie in dargestellt, andere Muster mit beispielsweise 4, 7, 9, 16 oder 19 (oder auch 25 oder noch mehr) Spots erzeugt werden. Auch die Abstände und die Durchmesser der Spots auf der Probe können variiert werden, wobei sich durch die Art der Abbildung mit dem notwendigerweise weit von der Probe entfernten Objektiv (33) schon rein theoretisch ein minimaler Durchmesser von etwa vier bis fünf Mikrometern ergibt. Ist ein Wechsel zu anderen Spotmustern wünschenswert, so können verschiedene Mustergeneratoren (8) mit Hilfe einer Mechanik, wie zum Beispiel bei einem Dia- oder Filmprojektor, in den Laserstrahl gebracht werden. Für einen hohen Ionisierungsgrad sollen die einzelnen Spots auf der Probe auf jeden Fall Durchmesser haben, die kleiner als 10 Mikrometer sind.
Wie schon einleitend dargelegt, soll zwar der Ionisierungsgrad für die Analytmoleküle erhöht werden, um die Ionenausbeute zu maximieren, in der Regel soll gleichzeitig aber auch die Anzahl von metastabilen Ionen begrenzt werden. Für die meisten Untersuchungen sollten Spontanfragmentierungen vermieden werden. Des Weiteren muss dafür gesorgt werden, dass pro Laserschuss nicht mehr als etwa tausend Analytionen erzeugt werden, um eine Sättigung des Ionendetektorsystems zu vermeiden. Die Voraussetzungen für die gleichzeitige Erfüllung dieser verschiedenartigen Bedingungen sind nicht vollständig bekannt, es deutet sich aber an, dass ein Muster von neun Spots mit je fünf Mikrometer Durchmesser für die häufigsten Präparationsarten der Matrixschichten und für die meisten analytischen Ziele einem Optimum sehr nahe kommt. Für andere Präparationsarten, oder für andere analytische Ziele, müssen gelegentlich andere Muster gewählt werden. Die Ausbeute an Analyt-Ionen kann durch geeignete Muster wahrscheinlich auf etwa zehn Prozent der Analytmoleküle, also auf das Tausendfache der Ausbeute des klassischen MALDI-Verfahrens, heraufgesetzt werden. Vom Normalen abweichende analytische Ziele können beispielsweise Spontanfragmentierungen (für In-Source-Dissociation, ISD) oder hohe Anteile an metastabilen Ionen (für Tochterionenspektren mit Post-Source-Dissociation, PSD) erfordern.
Das Lasersystem des Massenspektrometers ist nicht nur vorteilhaft wegen seiner Energieeinsparungen und seiner hohen Ausbeute an Analytionen, besonders vorteilhaft ist es auch, dass durch die Bildung des Musters mit sehr kleinen Spots auch das Verspritzen von verflüssigtem Matrixmaterial bei der Desorption unterdrückt wird, wodurch zusätzlich Probenmaterial eingespart wird. Speziell bei einer sehr hohen Anzahl von Proben pro Zeit, wie sie mit Lasern hoher Pulsfrequenz in MALDI-TOF Spektrometern ermöglicht werden, ist auch die verringerte Verschmutzung der Ionenoptik ein immenser Vorteil. Ein weiterer Vorteil liegt auch darin, dass die Front der sich adiabatisch ausdehnenden Plasmawolken des Musters die Ionen bevorzugt in die Flugrichtung des Flugzeitmassenspektrometers beschleunigt.
Als Massenspektrometer kommen für die Erfindung verschiedene Arten in Betracht. Die Analytionen, die mit dem Lasersystem erzeugt werden, können vorzugsweise in einem besonderen MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss, wie es in schematisch dargestellt ist, nachgewiesen und analysiert werden. Es ist jedoch auch möglich, die Analytionen andersartigen Massenanalysatoren zur Analyse zuzuführen, wie beispielsweise Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS), Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (ICR-MS), Hochfrequenz-Ionenfallen-Massenspektrometern (IT-MS) oder elektrostatischen Ionenfallen-Massenspektrometern vom Kingdon-Typ.
Die aufgeführten Ausführungsbeispiele stellen keine abschließende Liste dar. In Kenntnis der Erfindung ist es dem Fachmann möglich, weitere vorteilhafte Ausformungen von Massenspektrometern mit Lasersystemen zu entwerfen, die vom Schutzbereich der Patentansprüche umfasst sein sollen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102004044196 A1 [0011, 0011]
GB 2421352 B [0011]
US 7235781 B2 [0011]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

K. Dreisewerd, Chem Rev. 103 (2003), 395–425: „The Desorption Process in MALDI” [0006]

Claims

Massenspektrometer mit einer Laserdesorptions-Ionenquelle, die ein Lasersystem für die Ionisierung einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption umfasst, mit einem gepulsten Festkörperlasersystem, Konversionskristallen zur Frequenzerhöhung und einem Mustergenerator im frequenzerhöhten Laserstrahl, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen dem Festkörperlasersystem und den Konversionskristallen eine Strahlformungsoptik befindet, die den gepulsten Laserstrahl mit Gaußprofil in einen annähernd rechteckigen Strahl mit annähernd homogener Energiedichte wandelt.
Massenspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Festkörperlasersystem einen gepulsten Infrarotstrahl erzeugt, und dass die Frequenzerhöhung eine Frequenzverdreifachung auf eine UV-Laserwellenlänge im Bereich zwischen 300 und 450 Nanometer ist.
Massenspektrometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlformungsoptik eine refraktiv arbeitende Linse ist.
Massenspektrometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlformungsoptik eine diffraktive Optik ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass für die Erhöhung der Strahlfrequenz zwei nichtlineare Konversionskristalle vorhanden sind, die mit Walk-off-Kompensation arbeiten.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mustergenerator vorhanden ist, der ein Spotmuster mit 4, 7, 9, 16, 19 oder 25 Spots erzeugt.
Massenspektrometer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Mustergenerator als Linsenarray ausgebildet ist.
Massenspektrometer nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein optisches System aus Teleskop und Objektiv vorhanden ist, das das Spotmuster auf die Probe abbildet.
Massenspektrometer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Spots auf der Probe Durchmesser von maximal 10 Mikrometer haben.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasersystem zur Aussendung einer Folge von Laserlichtpulsen mit einer Pulsrate im Bereich von 1 bis 10 Kilohertz ausgelegt ist.
Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Mustergenerator und Teleskop ein Drehspiegelsystem vorhanden ist, mit dem eine Steuerung der Spotpositionen auf der Probe bewirkt werden kann.
Lasersystem für die Ionisierung einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in einem Massenspektrometer, mit einem gepulsten Festkörperlasersystem, Konversionskristallen zur Frequenzerhöhung und einem Mustergenerator im frequenzerhöhten Laserstrahl, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen dem Festkörperlasersystem und den Konversionskristallen eine Strahlformungsoptik befindet, die den gepulsten Laserstrahl mit Gaußprofil in einen annähernd rechteckigen Strahl mit annähernd homogener Energiedichte wandelt.
Verfahren zur Ionisierung einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in einem Massenspektrometer, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe mit Analytmolekülen bereitgestellt wird, die Analytmoleküle mit einem Lasersystem nach Anspruch 12 ionisiert und anschließend massenspektrometrisch gemessen werden.