EP2185919A1 - Sted-fluoreszenzmikroskopie mit zweiphotonen-anregung - Google Patents

Sted-fluoreszenzmikroskopie mit zweiphotonen-anregung

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EP2185919A1
EP2185919A1 EP08787227A EP08787227A EP2185919A1 EP 2185919 A1 EP2185919 A1 EP 2185919A1 EP 08787227 A EP08787227 A EP 08787227A EP 08787227 A EP08787227 A EP 08787227A EP 2185919 A1 EP2185919 A1 EP 2185919A1
Authority
EP
European Patent Office
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excitation light
light
sample
fluorescent
pulses
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08787227A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan W. Hell
Katrin Willig
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP2185919A1 publication Critical patent/EP2185919A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/636—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited using an arrangement of pump beam and probe beam; using the measurement of optical non-linear properties
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to a method having the features of the preamble of independent claim 1 and an apparatus having the features of the preamble of independent claim 11 for spatially high-resolution imaging of a structure labeled with a fluorescent dye in a sample.
  • the method defined in the preamble of independent claim 1 is also referred to as STED (Stimulated Emission Depletion) fluorescence light microscopy.
  • the method falls below the diffraction limit, which is normally the limit of resolution in far-field microscopic methods.
  • the diffraction-limited focus area in which the excitation light basically excites the fluorescent dye in the sample for spontaneous emission of fluorescent light, reduced to expansions below the diffraction limit by parts of the focus area are superimposed with de-excitation light, the excited fluorescent dye before the fluorescence emission again dissipates. This leaves only a measuring range which is smaller than the focal range and from which the fluorescent light spontaneously emitted by the fluorescent dye can originate.
  • the structure marked with the fluorescent dye in the sample can be imaged with a spatial resolution that exceeds the diffraction limit.
  • the spatial resolution is particularly good when the de-excitation light is directed in the form of an interference pattern on the sample, which is a zero at the location of the measuring range and otherwise reaches saturation in the de-excitation of excited with the excitation light state of the fluorescent dye.
  • the excitation light source can be a continuous wave laser (cw laser), while the depletion light source can be a pulse laser which is synchronized with the detector in order to detect the fluorescent light from the sample only after the Decay each one pulse of the de-excitation light register. In this way it is avoided that the detector detects reflected light reflected by the sample or also fluorescent light whose emission was stimulated by the de-excitation light and thus does not originate from the measuring range of interest.
  • the polarization of the excitation light and the polarization filtering of the light incident on the detector from the sample in the orthogonal direction to the polarization of the excitation light is described.
  • the average light intensity available for the de-excitation light is also to focus on pulses that are applied as soon as possible to the pulses of the excitation light on the sample in order to give the fluorescent dye outside the measuring range as little as possible opportunity to emit fluorescent light spontaneously.
  • This proximity to time can be achieved by an immediate sequence or even a partial or even complete temporal coverage.
  • a prerequisite for this sequence is a synchronization of the pulses of the de-excitation light with the pulses of the excitation light, if appropriate in addition to a synchronization of the detector with the pulses of the de-excitation light.
  • Fluorescent dyes below and above the focal plane are excited and thus be distracted by the de-excitation light or must be distracted.
  • Using a confocal pinhole in front of the detector can reduce the measuring range along the optical axis to the focal plane, it means that the
  • Fluorescent dye is uselessly excited and de-excitated outside the focal plane, resulting in significant bleaching of the fluorescent dye by the Abregungsstrahl and thus prevents the capture of 3D images in many dyes.
  • the excitation light can have portions of different wavelengths, and three or even more individual photons can be involved in the multiphoton process.
  • the excitation light can have portions of different wavelengths, and three or even more individual photons can be involved in the multiphoton process.
  • a two-photon excitation with excitation light only one wavelength at which the photons each contribute half of the photon energy required for the multiphoton process takes place.
  • the selectivity of the excitation at the focal plane is based here on the nonlinearity between the intensity of the excitation light and the excitation probability of the fluorescent dye in its fluorescent state over the - A -
  • Multiphoton process In a two-photon excitation, this excitation probability is dependent on the square of the intensity of the excitation light and thus focuses on the main diffraction peak of the focus region of the excitation light in the sample.
  • this temporal concentration of the excitation light and the concomitant increased photon concentrations in each individual pulse of the excitation light there is a markedly increased yield of fluorescent light compared to continuously, ie with excitation light incident on the sample with constant time intensity.
  • the fluorescent dye known to vary a time repetition distance of an incident on the sample optical signal in a range of at least 0.1 microseconds to 2 microseconds to maximize the fluorescent light output.
  • the optical signal from a continuous wave laser come when a scanning device is provided for spatially scanning the sample with the optical signal having a sampling rate that sets the desired repetition distance.
  • the pauses provided by the repeating interval allow the fluorescent dye to relax back to its singlet, fluorescent state from a dark state, particularly a triplet state, into which it is exposed to some extent on each exposure to the optical signal.
  • WO 2007/030835 A2 discloses a method for spatially high-resolution imaging of a structure labeled with a fluorescent dye in a sample and a device suitable therefor.
  • the fluorescent dye is a compound which has a dark state in which it is not excitable for fluorescence and a fluorescent state in which it is excitable with excitation light for fluorescence. From the Dark state, the connection with the switch-on light in the fluorescent state can be switched on, the transition to the fluorescent state is to take place via an intermediate state, from which the compound after a pulse of the switch-on with a pulse of down light back to the dark state should be transferred. With this downshift light, the switched-on state is reduced in relation to the focus range of the switch-on light to a measuring range.
  • excitation light which excites the compound in the fluorescent state to fluorescence.
  • This excitation light can have the same wavelength as the return light but has a different spatial distribution and in each case simultaneously acts as a switch-off light, which switches off the connection switched into the fluorescent state back into its dark state.
  • another pulse of the switch-on light must be incident on the sample with a subsequent pulse of the switch-back light.
  • the pulsed turn-on light may have a wavelength such that it turns on the compound via a multi-photon process in its fluorescent state.
  • the excitation light acting at the same time as the switch-off light can be provided with a continuous-wave laser, for example a diode laser, which can be switched on and off as required.
  • Declare light which again excites the fluorescence-excited compound before the spontaneous emission of fluorescent light, is not used according to WO 2007/030 835 A2.
  • the expense for the method known from this document and the apparatus used for this purpose are great, because light with at least three different wavelengths and / or spatial distributions, namely the switch-on light, the switch-back light and the excitation light which also acts as switch-off light, must be provided the switch-on light and the switch-back light are provided in exactly synchronized pulses, since the intermediate state of the switchable connection on which the switchback light can act is only short-lived, and the use of switchable fluorophores already represents a basic outlay that goes far beyond the expense goes beyond simple fluorescent dyes.
  • the invention has for its object to provide a method and apparatus for spatially high-resolution three-dimensional (3D) imaging of a marked with a fluorescent dye structure in a sample that can be realized with relatively little effort, which avoids premature bleaching of the sample by the Abregungsstrahl and yet allow a significant increase in the spatial resolution on the diffraction limit in all directions.
  • the object of the invention is achieved by a method having the features of independent claim 1 and by an apparatus having the features of independent claim 11.
  • Preferred embodiments of the new method are defined in the dependent claims 2 to 10, while the dependent claims 12 to 20 describe preferred embodiments of the new device.
  • the wavelength of the excitation light is selected so that the excitation light excites the fluorescent dye via a multi-photon process.
  • this is a two-photon process.
  • the excitation light for the multi-photon excitation is pulsed, which in a known manner has a favorable effect on the fluorescent light yield due to multiphoton excitation
  • the de-excitation light which has a shorter wavelength than the excitation light, becomes continuous or quasi-continuous over a plurality of pulses of the excitation light directed to the test.
  • the focus area in which an effective excitation of the fluorescent dye takes place, is clearly spatially limited compared to a possible excitation via a one-photon process.
  • this non-linear excitation is limited to a focal depth of typically -1 ⁇ m for high-aperture objectives that corresponds to the extent of its principal diffraction maximum along the optical axis. Because the excitation is spatially confined in 3D, less or no fluorescent dyes must be disturbed, which are located above and below the focal plane. In particular, fluorescent dyes that are outside the main focal maximum and that would otherwise be excited by a one-photon process need not be de-excited by the de-excitation light.
  • the wavelength of the depletion light is preferably selected to fall within the red end of the emission spectrum of the dye. Basically, therefore, applying a non-excited sample with de-excitation light does not lead to bleaching because its photon energy is too low to excite the fluorescent dye.
  • the de-excitation light can not only quench as desired fluorescence dyes that are already excited, but also bleach. Bleaching by the de-excitation light takes place only on already excited fluorescent dyes.
  • the excitation by the multiphoton excitation is narrowed from the outset in three dimensions to the main diffraction peak, the range in which fluorescent dyes must be reduced is also reduced. Because the number of unnecessary de-excitations per fluorescent dye molecule is reduced, the bleaching is also reduced, which considerably simplifies the nanoscale 3D imaging by STED fluorescence microscopy and even makes it possible with many dyes. If the multiphoton excitation is only in a 1 micron thick layer, the number of unnecessary de-excitation is reduced by a factor of 10 with a 10 micron thick sample. Accordingly, if the area of the sample in which the de-excitation light is needed can be significantly reduced from the measuring area, bleaching by the de-excitation light is correspondingly reduced. This is achieved by excitation of the fluorescent dye via a multiphoton process to fluorescence.
  • any synchronization of the detector for the fluorescent light spontaneously emitted by the fluorescent dye with any pulses of the illumination or de-excitation light can be completely eliminated.
  • the detector can continuously register the fluorescent light spontaneously emitted from the fluorescent dye over a plurality of pulses of the excitation light.
  • the detector, the fluorescent light z. B. by an edge filter or a narrow-band bandpass filter extract from the Abregungslicht or through a polarizing filter, to which then the de-excitation light is to polarize targeted.
  • the de-excitation light is provided with a diode laser.
  • diode lasers can be provided at approximately one-tenth of the cost of a conventional pulsed laser for providing de-excitation light in STED fluorescent light microscopy as a continuous wave laser.
  • the new method also has a positive effect that the effective multi-photon excitation of the sample by the excitation light at any time is also limited to a smaller spatial area and thereby also the total burden with the excitation light, which corresponds to the risk of bleaching the fluorescent dye, is reduced compared with the fluorescence yield.
  • the excitation light may in the new method with a comparatively high frequency of at least 80 MHz, preferably at least 100 MHz, more preferably at least
  • This range is 80 to 100 MHz. Due to the very high frequency of the pulses of the excitation light, the pauses between the pulses of the excitation light are very short. This prevents that very large portions of the de-excitation light fall onto the sample without there being very large proportions of the fluorescent dye in the ground state.
  • the individual pulses of the excitation light are, as in fluorescence light microscopy, under multi-photon excitation of the fluorescent dye compared to its pulse distance preferred. wise relatively short.
  • the individual pulses of the excitation light may have a duration of at most one-tenth, preferably at most one-hundredth, more preferably at most one-thousandth, and most preferably at most one ten-thousandth of their pulse spacing. As already stated in the introduction, this increases the relative yield of fluorescent light from the sample, while maintaining the average power of the excitation beam.
  • the new method it is possible, in particular, to scan the sample three-dimensionally with the measuring range or a plurality of similar measuring ranges, from which the fluorescent light spontaneously emitted by the fluorescent dye is spatially separated, the structure labeled with the fluorescent dye in the sample being three-dimensional is resolved.
  • a confocal pinhole in front of the detector and, in the case of multiple focal measurement areas, a confocal array of pinhole diaphragms.
  • Aperture diaphragms suppress stray light from both the depletion and excitation beams.
  • the fluorescent light is not returned via the optical scanning means, but registered in a simplified optical path, i. H. a "non-descanned detection", as is known in the art.
  • Abregungsetter interrupted after a plurality of pulses of the excitation light for a limited period of time. These interruptions have the purpose of relaxing the fluorescent dye from a dark state, in particular its Triplet state, to wait back to the fluorescent singlet state, after this dark state has been populated during the previous pulse of the excitation light by the excitation light already to a considerable extent.
  • This population of dark states results in a reduced yield of fluorescent light from the sample and may also be associated with an increased risk of bleaching the fluorescent dye.
  • the dark state decays again, so that corresponding interruptions of the excitation lead to an overall increased yield of fluorescence light from the sample.
  • the period of the plurality of pulses of the excitation light between the pauses of the excitation light over which the excitation light is continuously applied to the sample is typically from 100 ns to 50 ⁇ s and preferably 0.5 to 2 ⁇ s. The exact duration of this period depends on how fast the triplet state or the dark state practically populates.
  • the excitation light source irradiates the excitation light at such a wavelength that the excitation light excites the fluorescent dye through a multi-photon process, and the depletion light source continuously directs the depletion light having a shorter wavelength than the excitation light across a plurality of pulses of the excitation light to the test.
  • the detector of the device will also continuously register the fluorescent light spontaneously emitted by the fluorescent dye over a plurality of pulses of the excitation light.
  • the depletion light source has a continuously emitting diode laser.
  • the excitation light source has a pulse laser which excites the excitation light in pulses with the one explained above
  • a scanner which is provided in the new device to the sample with the measuring range or a
  • scanning is preferably carried out by displacing an optical element which counts both the optics focusing the excitation light into the specimen and the optic directing the excitation light into the specimen.
  • Various devices for the screening of a focused beam over the sample are known to the person skilled in the art sufficiently from the literature of laser scanning microscopy.
  • the new device may comprise a controller which is preferably adjustable to control the limited period and a period of the plurality of pulses between two such limited periods is set.
  • controllers preferably include acousto-optic or electro-optic beam modulators.
  • the detector of the new device need not be synchronized with the limited periods in which the excitation light and the excitation light are interrupted, but it can continuously register the fluorescent light spontaneously emitted from the fluorescent dye over these periods, but this does not occur.
  • Fig. 1 shows the schematic structure of an embodiment of the new device.
  • Fig. 2 shows at the top the schematic time course of the intensity of the excitation light, in the middle the schematic time course of the intensity of the depletion light and at the bottom the schematic time profile of the sensitivity of the detector for registering fluorescent light from a sample in one embodiment of the new method.
  • the device 1 sketched in FIG. 1 is used for spatially high-resolution imaging of a structure marked with a fluorescent dye in a sample 2.
  • an excitation light source 3 in the form of a pulsed laser 4 emits pulsed excitation light 5 through an optical system 6 into a focal region of an objective 7 in FIG Directed sample.
  • the fluorescent dye in sample 2 is excited by a Zweiprotonen Anlagen for fluorescence, ie the spontaneous emission of fluorescent light.
  • the focus area is defined here as the area in which an effective excitation of the fluorescent dye takes place via the two-photon process for the spontaneous emission of fluorescent light.
  • the fluorescent dye is immediately de-excited again by continuously applying depletion light 10 to the sample with a deenergizing light source 8 in the form of a diode laser 9.
  • the plane waves of the excitation light 10 are deformed with a phase modulator 11 in such a way that an intensity distribution of the excitation light 10 with a central zero point adjoins the intensity maxima covering the remainder of the focal region.
  • a detector 12 which registers fluorescent light spontaneously emitted by the fluorescent dye of the sample 2 only detects fluorescent light from the measuring range which has dimensions below the diffraction limit of the light with the wavelengths used.
  • the excitation light 5 is kept away from the detector 12 by a dichroic mirror 14 which detects the beam paths of the Excitation light 5 and the fluorescent light 13 separates.
  • the de-excitation light 10 is kept away from the detector 12 by a dichroic mirror 15 which separates the optical paths of the depletion light 10 and the fluorescent light 13.
  • a scanning device 16 can be provided to move an optical element 17 of the optics 6, through which the excitation light 5 as well as the excitation light 10 as well as the fluorescent light 13 from the sample passes, such that the structures labeled with the fluorescent dye in the sample have two is scanned three-dimensionally.
  • Fig. 2 shows the temporal progression of the intensity of the excitation light 5 above. Between limited periods 18, in which the intensity of the excitation light is zero, the excitation light consists of individual pulses with a pulse duration shorter than their distance. The limited periods 18 have a typical duration of 1 ⁇ s. The frequency of the pulses 19 of the excitation light 5 is above 120 MHz, their distance being at least 10 times greater than their duration. These numerical ratios are not fully reflected in FIG.
  • Fig. 2 shows the intensity profile of the depletion light 10 over time. The de-excitation light 10 is applied continuously, ie, with constant intensity, to the sample 2, except in the limited periods 18, in which its intensity is also zero.
  • Fig. 2 shows the sensitivity 20 of the detector 12 of Fig. 1 over time. This is continuous, ie also given over the limited periods 18 away.

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Abstract

Zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe, wobei gepulstes Anregungslicht (5) in die Probe fokussiert wird, um den in einem Fokusbereich befindlichen Fluoreszenzfarbstoff zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht anzuregen, wobei Abregungslicht (10), das eine andere Wellenlänge als das Anregungslicht (5) aufweist, auf die Probe gerichtet wird, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb eines gegenüber dem Fokusbereich verkleinerten Messbereichs vor der spontanen Emission von Fluoreszenzlicht abzuregen, und wobei von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiertes Fluoreszenzlicht registriert wird, wird die Wellenlänge des Anregungslichts (5) so ausgewählt, dass das Anregungslicht (5) den Fluoreszenzfarbstoff über einen Mehrphotonenprozess anregt, und das Abregungslicht (10), das eine kürzere Wellenlänge als das Anregungslicht (5) aufweist, wird über eine Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) hinweg kontinuierlich auf die Probe gerichtet.

Description

STED-FLUORESZENZMIKROSKOPIE MIT ZWEIPHOTONEN-ANREGUNG
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 11 zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe.
STAND DER TECHNIK
Das im Oberbegriff des unabhängigen Patentanspruchs 1 definierte Verfahren wird auch als STED (Stimulated Emission Depletion)-Fluoreszenzlichtmikroskopie bezeichnet. Mit dem Verfahren wird die Beugungsgrenze, die normalerweise die Auflösungsgrenze bei fernfeldlicht- mikroskopischen Verfahren darstellt, unterschritten. Dabei wird der beugungsbegrenzte Fokusbereich, in dem das Anregungslicht den Fluoreszenzfarbstoff in der Probe grundsätzlich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht anregt, zu Ausdehnungen unterhalb der Beugungsgrenze reduziert, indem Teile des Fokusbereichs mit Abregungslicht überlagert werden, das angeregten Fluoreszenzfarbstoff vor der Fluoreszenzemission wieder abregt. Damit verbleibt nur ein gegenüber dem Fokusbereich verkleinerter Messbereich, aus dem das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht stammen kann. Durch Registrierung dieses Fluoreszenzlichts kann die mit dem Fluoreszenzfarbstoff in der Probe markierte Struktur mit einer die Beugungsgrenze überschreitenden Ortsauflösung abgebildet werden. Besonders gut ist die Ortsauflösung dann, wenn das Abregungslicht in Form eines Interferenzmusters auf die Probe gerichtet wird, das am Ort des Messbereichs eine Nullstelle aufweist und ansonsten eine Sättigung bei der Abregung des mit dem Anregungslicht angeregten Zustande des Fluoreszenzfarbstoffs erreicht.
Ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 11 sind aus der US 5,731 ,588 bekannt. Hier ist erwähnt, dass die Anregungslichtquelle ein Dauerstrichlaser (engl.: continous wave Laser = cw-Laser) sein kann, während die Abregungs- lichtquelle ein Pulslaser sein kann, der mit dem Detektor synchronisiert ist, um das Fluoreszenzlicht von der Probe erst nach dem Abklingen jeweils eines Pulses des Abregungslichts zu registrieren. Auf diese Weise wird vermieden, dass der Detektor von der Probe reflektiertes Abregungslicht oder auch Fluoreszenzlicht erfasst, dessen Emission von dem Abregungslicht stimuliert wurde und so nicht aus dem interessierenden Messbereich stammt. Als alternative Möglichkeit des Extrahierens des spontan emittierten Fluoreszenzlichts ist die Polarisierung des Anregungslichts und die Polarisationsfilterung des von der Probe auf den Detektor fallenden Lichts in orthogonaler Richtung zu der Polarisierung des Anregungslichts beschrieben.
Um bei einem Verfahren der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 die gewünschte Sättigung bei der Wiederabregung des Fluoreszenzfarbstoffs außerhalb des Messbereichs nach jedem Puls des Anregungslichts zu erreichen, ist es sinnvoll, die mittlere Lichtintensität, die für das Abregungslicht zur Verfügung steht, ebenfalls auf Pulse zu konzentrieren, die möglichst zeitnah zu den Pulsen des Anregungslichts auf die Probe aufgebracht werden, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des Messbereichs möglichst wenig Gelegenheit zu geben, Fluoreszenzlicht spontan zu emittieren. Diese Zeitnähe kann durch eine unmittelbare Abfolge oder auch eine teilweise oder gar vollständige zeitliche Überdeckung erreicht werden. Voraussetzung für diese Abfolge ist aber eine Synchronisation der Pulse des Abregungslichts mit den Pulsen des Anregungs- lichts ggf. zusätzlich zu einer Synchronisation des Detektors mit den Pulsen des Abregungslichts.
Der Aufwand für die praktische Realisierung eines STED-Fluoreszenzlichtmikroskops oder auch die Umrüstung eines herkömmlichen Fluoreszenzlichtmikroskops für die STED-Fluoreszenz- lichtmikroskopie ist daher allein deshalb hoch, weil synchronisierbare Pulslaser für das Anregungslicht und das Abregungslicht teuer sind. Hinzu kommt, dass die Laserpulse nicht vornherein die für die STED-Fluoreszenzmikroskopie erforderliche Pulsdauer haben. Neben der Synchronisation führt das erforderliche zeitliche Strecken und Präparieren von Pulsen über dispersive optische Elemente wie Gitter- oder Glasfaseranordnungen zu hohem technischfinanziellem Aufwand und zu Funktionsanfälligkeiten.
Im Bereich der cw-Laser sind grundsätzlich kostengünstigere Laser verfügbar, beispielsweise in Form so genannter Diodenlaser, die eine oder mehrere elektrisch gepumpte Laserdioden aufweisen. Pulspräparation und Synchronisierung entfallen damit automatisch. Wenn Diodenlaser zur Abstrahlung von Pulsen modifiziert werden, entfällt jedoch der durch sie erbrachte grundsätzliche technisch-finanzielle Vorteil.
Bei den bekannten Formen der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie erweist es sich als schwierig, den Messbereich entlang der optischen Achse einzuengen, weil es mit einer
Einphotonen-Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes grundsätzlich nicht möglich ist, die
Anregung auf die Fokalebene oder das Fokalvolumen zu beschränken. Genauso ist es nicht möglich, das Abregungslicht auf die Fokalebene zu beschränken. Das bedeutet, dass
Fluoreszenzfarbstoffe unter- und oberhalb der Fokalebene angeregt werden und somit auch durch das Abregungslicht abgeregt werden oder abgeregt werden müssen. Obwohl man durch
Verwendung einer konfokalen Lochblende vor dem Detektor den Messbereich entlang der optischen Achse auf die Fokalebene reduzieren kann, so bedeutet es doch, dass der
Fluoreszenzfarbstoff außerhalb der Fokalebene unnütz an- und abgeregt wird, was zu erheblichem Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den Abregungsstrahl führt und somit das Aufnehmen von 3D Bildern bei vielen Farbstoffen verhindert.
Als Möglichkeit, die fluoreszenzmikroskopische Abbildung einer Probe auf die Fokalebene zu beschränken und eine Selektivität entlang der optischen Achse zu erreichen, ist es bekannt, den Fluoreszenzfarbstoff mit dem Anregungslicht über einen Mehrphotonenprozess anzuregen. Grundsätzlich kann dabei das Anregungslicht Anteile verschiedener Wellenlängen aufweisen, und an dem Mehrphotonenprozess können drei oder sogar noch mehr einzelne Photonen beteiligt sein. In der Praxis der Mehrphotonenanregung eines Fluoreszenzfarbstoffs erfolgt jedoch in aller Regel eine Zweiphotonenanregung mit Anregungslicht nur einer Wellenlänge, bei der die Photonen jeweils die Hälfte der für den Mehrphotonenprozess insgesamt benötigten Photonenenergie beitragen. Die Selektivität der Anregung auf die Fokalebene beruht hier auf der Nichtlinearität zwischen der Intensität des Anregungslichts und der Anregungswahrscheinlichkeit des Fluoreszenzfarbstoffs in seinen fluoreszierenden Zustand über den - A -
Mehrphotonenprozess. Bei einer Zweiphotonenanregung ist diese Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat der Intensität des Anregungslichts abhängig und konzentriert sich damit auf das Beugungshauptmaximum des Fokusbereichs des Anregungslichts in der Probe. Um angesichts der grundsätzlich geringeren Übergangswahrscheinlichkeit des Fluoreszenzfarbstoffs aufgrund eines Mehrphotonenprozesses eine ausreichende Ausbeute an Fluoreszenzlicht von der Probe zu erhalten, ohne die Probe mit extremen Intensitäten des Anregungslichts zu beaufschlagen, ist es bekannt, das Anregungslicht zeitlich zu einzelnen Pulsen zusammenzuziehen. Allein aufgrund dieser zeitlichen Konzentration des Anregungslichts und der damit einhergehenden erhöhten Photonenkonzentrationen in jedem einzelnen Puls des Anregungslichts kommt es zu einer deutlich gesteigerten Ausbeute an Fluoreszenzlicht gegenüber kontinuierlich, d. h. mit zeitlich konstanter Intensität auf die Probe einfallendem Anregungslicht. Beispielsweise sorgt im Falle einer Zweiphotonenanregung die zeitliche Konzentration des Anregungslichts auf ein Zehntel der Zeit für eine in dem Zehntel der Zeit auf das Zehnfache erhöhte Intensität des Anregungslichts und damit für eine auf 102 = 100-fach erhöhte Ausbeute an Fluoreszenzlicht wäh- rend dieses Zehntels der Zeit. Im Mittel über die Zeit resultiert hieraus immer noch ein 100/10 = 10-facher Anstieg der Intensität des Fluoreszenzlichts bei gleicher Durchschnittsleistung.
Aus der DE 10 2005 027 896.5 A1 ist es z. B. bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie aber auch bei der Fluoreszenzlichtmikroskopie unter Mehrphotonenanregung des Fluoreszenzfarbstoffs bekannt, einen zeitlichen Wiederholungsabstand eines auf die Probe fallenden optischen Signals in einem Bereich von mindestens 0,1 μs bis 2 μs zu variieren, um die Fluoreszenzlichtausbeute zu maximieren. Dabei kann das optische Signal von einem Dauerstrichlaser kommen, wenn eine Abtasteinrichtung zum räumlichen Abtasten der Probe mit dem optischen Signal vorgesehen ist, die eine solche Abtastgeschwindigkeit aufweist, dass sich der gewünschte Wiederholungsabstand einstellt. Die durch den Wiederholungsabstand bereitgestellten Pausen erlauben es dem Fluoreszenzfarbstoff aus einem Dunkelzustand, insbesondere einem Triplettzustand, in den er zu einem gewissen Anteil bei jeder Beaufschlagung mit dem optischen Signal gelangt, zurück in seinen fluoreszenzfähigen Singulettzustand zu relaxieren.
Aus der WO 2007/030835 A2 sind ein Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe und eine dafür geeignete Vorrichtung bekannt. Bei dem Fluoreszenzfarbstoff handelt es sich um eine Verbindung, die einen Dunkelzustand, in dem sie nicht zur Fluoreszenz anregbar ist, und einen fluoreszenten Zustand aufweist, in dem sie mit Anregungslicht zur Fluoreszenz anregbar ist. Aus dem Dunkelzustand ist die Verbindung mit Einschaltlicht in den fluoreszenten Zustand einschaltbar, wobei der Übergang in den fluoreszenten Zustand über einen Zwischenzustand erfolgen soll, aus dem die Verbindung nach einem Puls des Einschaltlichts mit einem Puls aus Rückschaltlicht zurück in den Dunkelzustand überführbar sein soll. Mit diesem Rückschaltlicht wird der eingeschaltete Zustand gegenüber dem Fokusbereich des Einschaltlichts auf einen Messbereich verkleinert. Die eigentliche Messung erfolgt dann mit Anregungslicht, das die Verbindung in dem fluoreszenten Zustand zur Fluoreszenz anregt. Dieses Anregungslicht kann dieselbe Wellenlänge haben wie das Rückschaltlicht hat aber eine andere räumlich Verteilung und wirkt in jedem Fall gleichzeitig als Ausschaltlicht, das die in den fluoreszenten Zustand eingeschaltete Verbindung zurück in ihren Dunkelzustand ausschaltet. Um danach weiter messen zu können, muss ein weiterer Puls des Einschaltlichts mit einem nachfolgenden Puls des Rückschaltlichts auf die Probe fallen. Das gepulste Einschaltlicht kann eine solche Wellenlänge haben, dass es die Verbindung über einen Mehrphotonenprozess in ihren fluoreszenten Zustand einschaltet. Das zugleich als Ausschaltlicht wirkende Anregungslicht kann mit einem Dauerstrichlaser, beispielsweise einem Diodenlaser bereitgestellt werden, der nach Bedarf ein- und ausgeschaltet werden kann. Abregungslicht, das die zur Fluoreszenz angeregte Verbindung vor der Spontanemission von Fluoreszenzlicht wieder abregt, wird gemäß der WO 2007/030 835 A2 nicht eingesetzt. Der Aufwand für das aus dieser Druckschrift bekannte Verfahren und die hierzu eingesetzte Vorrichtung sind groß, weil Licht mit mindestens drei unterschiedlichen Wellenlängen und(/oder räumlichen Verteilungen, nämlich das Einschaltlicht, das Rückschaltlicht und das auch als Ausschaltlicht wirkende Anregungslicht bereitgestellt werden müssen. Zudem müssen das Einschaltlicht und das Rückschaltlicht in genau miteinander synchronisierten Pulsen bereitgestellt werden, da der Zwischenzustand der schaltbaren Verbindung, auf die das Rückschaltlicht einwirken kann, nur von kurzer Lebensdauer ist. Dabei stellt bereits die Verwendung von schaltbaren Fluorophoren einen Grundaufwand dar, der weit über den Aufwand für einfache Fluoreszenzfarbstoffe hinausgeht.
Aus der US 6,958,470 B2 ist es bei einem Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 11 bekannt, das Anregungslicht und das Abregungslicht durch zwei miteinander synchronisierte gepulste Laser mit einer Repetitionsrate von ungefähr 80 MHz bereitzustellen. AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum räumlich hochaufgelösten dreidimensionalen (3D) Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe aufzuzeigen, die mit vergleichsweise geringem Aufwand realisierbar sind, das vorzeitige Bleichen der Probe durch den Abregungsstrahl vermeidet und dennoch eine erhebliche Steigerung der Ortsauflösung über die Beugungsgrenze in allen Raumrichtungen ermöglichen.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 11 gelöst. Bevorzugte Ausführungsform des neuen Verfahrens sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 10 definiert, während die abhängigen Patentansprüche 12 bis 20 bevorzugte Ausführungsformen der neuen Vorrichtung beschreiben.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem neuen Verfahren wird die Wellenlänge des Anregungslichts so ausgewählt, dass das Anregungslicht den Fluoreszenzfarbstoff über einen Mehrphotonenprozess anregt. In aller Regel handelt es sich hierbei um einen Zweiphotonenprozess. Während das Anregungslicht für die Mehrphotonenanregung gepulst ist, was sich in bekannter Weise günstig auf die Fluoreszenzlichtausbeute aufgrund der Mehrphotonenanregung auswirkt, wird das Abregungs- licht, das eine kürzere Wellenlänge als das Anregungslicht aufweist, über eine Vielzahl von Pulsen des Anregungslichts hinweg kontinuierlich oder quasi kontinuierlich auf die Probe gerichtet. Durch die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Anregungslicht über einen Mehrphotonenprozess ist der Fokusbereich, indem eine effektive Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs erfolgt, im Vergleich zu einer möglichen Anregung über einen Einphotonenprozess deutlich räumlich eingegrenzt. Insbesondere ist diese nichtlineare Anregung auf eine Fokustiefe von typischerweise -1 μm bei hochaperturigen Objektiven, die der Ausdehnung dessen Beugungshauptmaximums entlang der optischen Achse entspricht, beschränkt. Dadurch dass die Anregung räumlich in 3D eingegrenzt ist, müssen auch weniger oder gar keine Fluoreszenzfarbstoffe abgeregt werden, die sich ober- und unterhalb der Fokalebene befinden. Insbesondere müssen Fluoreszenzfarbstoffe, die sich außerhalb des fokalen Hauptmaximums befinden, und andernfalls durch einen Einphotonenprozess angeregt werden würden, nicht durch das Abregungslicht abgeregt werden.
Die Wellenlänge des Abregungslichts ist bevorzugt so gewählt, dass sie in das rote Ende des Emissionsspektrums des Farbstoffes fällt. Grundsätzlich gilt daher, dass das Beaufschlagen einer nicht angeregten Probe mit Abregungslicht nicht zu Bleichen führt, weil seine Photonenenergie zu gering ist, um den Fluoreszenzfarbstoff anzuregen. Das Abregungslicht kann aber Fluoreszenzfarbstoffe, die bereits angeregt sind, nicht nur wie erwünscht abregen, sondern auch bleichen. Bleichen durch das Abregungslicht erfolgt nur an bereits angeregten Fluoreszenzfarbstoffen.
Da also die Anregung durch die Mehrphotonenanregung von vornherein dreidimensional auf das Beugungshauptmaximum eingeengt ist, reduziert sich auch der Bereich in welchem Fluoreszenzfarbstoffe abgeregt werden müssen. Weil sich die Zahl der unnötigen Abregungen pro Fluoreszenzfarbstoffmolekül reduziert, reduziert sich auch das Bleichen, was die nanoskalige 3D-Abbildung durch die STED-Fluoreszenzmikroskopie erheblich vereinfacht und bei vielen Farbstoffen sogar erst ermöglicht. Wenn die Multiphotonenanregung nur in einer 1 μm dicken Schicht erfolgt, wird bei einer 10 μm dicken Probe die Zahl der unnötigen Abregungen um das 10-fache reduziert. Wenn also der Bereich der Probe, in dem das Abregungslicht benötigt wird, gegenüber dem Messbereich deutlich verkleinert werden kann, reduziert sich entsprechend das Bleichen durch das Abregungslicht entsprechend. Dies wird durch die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs über einen Mehrphotonenprozess zu Fluoreszenz erreicht.
Damit wird es ermöglicht, das Abregungslicht in kontinuierlicher Form, d. h. auf besonders kostengünstige Weise auf die Probe aufzubringen, ohne den Fluoreszenzfarbstoff dabei zu überbeanspruchen. Kostenvorteile entstehen in diesem Zusammenhang nicht nur durch den Verzicht auf ein Pulsen des Abregungslichts, sondern auch durch die damit entfallende Notwendigkeit, eine Synchronisation zwischen den Pulsen des Anregungslichts und den Pulsen des Abregungslichts herzustellen. So ist insbesondere der Aufwand zur Durchführung des neuen Verfahrens mit einem Fluoreszenzlichtmikroskop, das sowieso bereits zur Mehr- photonenanregung des Fluoreszenzfarbstoffs ausgerüstet ist, mit nur minimalem zusätzlichem Aufwand verbunden. Es muss nur noch das Abregungslicht mit einem einfachen Dauer- strichlaser bereitgestellt und in geeigneter Weise in das Objektiv des Fluoreszenzlichtmikroskops eingekoppelt werden.
Auch jegliche Synchronisation des Detektors für das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht mit irgendwelchen Pulsen des An- oder Abregungslichts kann vollständig entfallen. So kann der Detektor das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht über eine Vielzahl von Pulsen des Anregungslichts hinweg kontinuierlich registrieren. Dabei kann der Detektor das Fluoreszenzlicht z. B. durch einen Kantenfilter oder ein schmalbandigen Bandpassfilter von dem Abregungslicht extrahieren oder aber durch einen Polarisationsfilter, wozu dann auch das Abregungslicht gezielt zu polarisieren ist.
Besonders bevorzugt ist es bei dem neuen Verfahren, wenn das Abregungslicht mit einem Diodenlaser bereitgestellt wird. Derartige Diodenlaser können zu etwa einem Zehntel der Kosten eines sonst üblichen Pulslasers für die Bereitstellung des Abregungslichts bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie als Dauerstrichlaser bereitgestellt werden.
Bei dem neuen Verfahren macht sich auch positiv bemerkbar, dass die effektive Mehrphotonen- anregung der Probe durch das Anregungslicht zu jedem Zeitpunkt ebenfalls auf einen kleineren räumlichen Bereich beschränkt ist und auch dadurch die Gesamtbelastung mit dem Anregungslicht, die der Gefahr eines Bleichens des Fluoreszenzfarbstoff entspricht, verglichen mit der Fluoreszenzausbeute reduziert ist.
Das Anregungslicht kann bei dem neuen Verfahren mit einer vergleichsweise hohen Frequenz von mindestens 80 MHz, vorzugsweise mindestens 100 MHz, mehr bevorzugt mindestens
120 MHz und am meisten bevorzugt von mindestens 150 MHz gepulst werden. Zumindest mit den beiden letzten Zahlenangaben wird der übliche Frequenzbereich von Pulslasern überschritten, die üblicherweise bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie eingesetzt werden.
Dieser Bereich liegt bei 80 bis 100 MHz. Durch die sehr hohe Frequenz der Pulse des Anregungslichts sind die Pausen zwischen den Pulsen des Anregungslichts sehr kurz. So wird verhindert, dass sehr große Anteile des Abregungslichts auf die Probe fallen, ohne dass sich dort sehr große Anteile des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Grundzustand befinden.
Die einzelnen Pulse des Anregungslichts sind wie bei der Fluoreszenzlichtmikroskopie unter Mehrphotonenanregung des Fluoreszenzfarbstoffs verglichen mit ihrem Pulsabstand Vorzugs- weise relativ kurz. So können die einzelnen Pulse des Anregungslichts eine Dauer von höchstens ein Zehntel, vorzugsweise von höchstens ein Hundertstel, mehr bevorzugt von höchsten ein Tausendstel und am meisten bevorzugt von höchstens ein Zehntausendstel ihres Pulsabstands aufweisen. Wie bereits einleitend dargelegt wurde, wird hierdurch die relative Ausbeute an Fluoreszenzlicht von der Probe gesteigert, bei gleichbleibender Durchschnittsleistung des Anregungsstrahls.
Mit dem neuen Verfahren ist es insbesondere möglich, die Probe mit dem Messbereich oder einer Mehrzahl gleichartiger Messbereiche, aus denen das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht räumlich getrennt registriert wird, dreidimensional abzu- tasten, wobei die mit dem Fluoreszenzfarbstoff in der Probe markierte Struktur dreidimensional aufgelöst wird.
Um diese Auflösung insbesondere in z-Richtung, d. h. der Richtung der optischen Achse des Anregungslichts, zu erreichen, ist es sinnvoll, das Abregungslicht gerade in dieser Richtung vor und hinter dem Messbereich auf die Probe zu richten, wie es aus der Druckschrift Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 97, 8206 (2000) bekannt ist. Dabei reicht jeweils ein Maximum neben einer Intensitätsnullstelle des Abregungslichts am Ort des Messbereichs aus, um den in dem Fokusbereich durch Mehrphotonenanregung zur Fluoreszenz angeregten Fluoreszenzfarbstoff wieder abzuregen. Generell sind mehrere Verfahren und Vorrichtungen zur Modifikation des Abregestrahls bekannt, die dazu führen, dass der fokale Messbereich vorteilhaft einengt wird: Phys. Rev. E, 64, 066613 (2001 ); Appl. Phys. B 77: 1 1 (2003); New J. Phys. 8: 106 (2006).
Auch ist es vorteilhaft vor dem Detektor eine konfokale Lochblende, und im Falle von mehreren fokalen Messbereichen ein konfokales Array von Lochblenden, anzuordnen. Lochblenden unterdrücken Streulicht sowohl von dem Abregungs- als auch von dem Anregungsstrahl. In einer weiteren speziellen Ausführungsform wird das Fluorezenzlicht nicht über die optische Abtasteinrichtung zurückgeführt, sondern auf einem vereinfachtem optischen Wege registriert, d. h. einer „non-descanned detection", wie sie dem Fachmann bekannt ist.
In einer speziellen Ausführungsform des neuen Verfahrens werden das Anregungslicht und das
Abregungslicht jeweils nach einer Vielzahl von Pulsen des Anregungslichts für einen begrenzten Zeitraum unterbrochen. Diese Unterbrechungen haben ihren Zweck darin, das Relaxieren des Fluoreszenzfarbstoffs aus einem Dunkelzustand, insbesondere seinem Triplettzustand, zurück in den fluoreszenten Singulettzustand abzuwarten, nachdem dieser Dunkelzustand während der vorherigen Pulse des Anregungslichts durch das Anregungslicht bereits auf ein erhebliches Maß bevölkert wurde. Diese Bevölkerung des Dunkelzustands hat eine reduzierte Ausbeute von Fluoreszenzlicht von der Probe zur Folge und kann zudem mit einer erhöhten Gefahr des Bleichens des Fluoreszenzfarbstoffs verbunden sein. Über einen vergleichsweise kurzen Zeitraum im Bereich von 0,5 bis 3 μs, typischerweise 1 bis 2 μs, klingt der Dunkelzustand jedoch wieder ab, so dass entsprechende Unterbrechungen der Anregung zu einer insgesamt erhöhten Ausbeute des Fluoreszenzlichts von der Probe führen. Sinnvollerweise wird parallel zu der Zufuhr des Anregungslichts auch das Abregungslichts für die genannten Zeiträume unterbrochen, um die Probe nicht unnötig mit dem Abregungslicht zu beaufschlagen. Der Zeitraum der Vielzahl von Pulsen des Anregungslichts zwischen den Pausen des Anregungslichts über den das Abregungslicht kontinuierlich auf die Probe aufgebracht wird, beträgt demgegenüber typischerweise von 100 ns bis 50 μs und vorzugsweise 0,5 bis 2 μs. Die genaue Dauer dieses Zeitraums hängt davon ab, wie schnell sich der Triplett- zustand oder der Dunkelzustand praktisch bevölkert.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung strahlt die Anregungslichtquelle das Anregungslicht mit einer solchen Wellenlänge ab, dass das Anregungslicht den Fluoreszenzfarbstoff über einen Mehrphotonenprozess anregt, und die Abregungslichtquelle richtet das Abregungslicht, das eine kürzere Wellenlänge als das Anregungslicht aufweist, über eine Vielzahl von Pulsen des Anregungslichts hinweg kontinuierlich auf die Probe.
Der Detektor der Vorrichtung wird das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht ebenfalls über eine Vielzahl von Pulsen des Anregungslichts hinweg kontinuierlich registrieren.
Besonders günstig ist die Realisation der neuen Vorrichtung dann, wenn die Abregungslicht- quelle einen kontinuierlich emittierenden Diodenlaser aufweist. Die Anregungslichtquelle weist hingegen einen Pulslaser auf, der das Anregungslicht in Pulsen mit der oben erläuterten
Frequenz und der relativen Dauer bezogen auf ihren Abstand abgibt. Eine Abtasteinrichtung, die bei der neuen Vorrichtung vorgesehen ist, um die Probe mit dem Messbereich oder einer
Mehrzahl gleichartiger Messbereiche, aus denen der Detektor das von dem Fluoreszenz- farbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht räumlich getrennt registriert, dreidimensional abzutasten, kann grundsätzlich die Probe gegenüber dem Rest des Fluoreszenzlichtmikroskops bewegen. Vorzugsweise erfolgt das Abtasten aber durch Verschieben eines optisches Elements, das sowohl zu der das Anregungslicht in die Probe fokussierenden Optik als auch zu der das Abregungslicht in die Probe richtenden Optik zählt. Verschiedene Vorrichtungen zur Rasterung eines fokussierten Strahls über die Probe sind dem Fachmann hinreichend aus der Literatur der Laserrastermikroskopie bekannt.
Um das Einfallen des Anregungslichts und des Abregungslichts jeweils nach einer Vielzahl von Pulsen des Anregungslichts für einen begrenzten Zeitraum zu unterbrechen, kann die neue Vorrichtung eine Steuerungseinrichtung aufweisen, die vorzugsweise einstellbar ist, um den begrenzten Zeitraum sowie einen Zeitraum der Vielzahl von Pulsen, der zwischen zwei solchen begrenzten Zeiträumen liegt, einzustellen. Solche Steuerungseinrichtungen enthalten vorzugsweise akustooptische oder elektrooptische Strahlmodulatoren. Der Detektor der neuen Vorrichtung muss im Übrigen auch nicht mit den begrenzten Zeiträumen synchronisiert werden, in denen das Anregungslicht und das Abregungslicht unterbrochen werden, sondern er kann das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht auch über diese Zeiträume hinweg kontinuierlich registrieren, was aber nicht anfällt.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen. KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert und beschrieben.
Fig. 1 zeigt den schematischen Aufbau einer Ausführungsform der neuen Vorrichtung.
Fig. 2 zeigt oben den schematischen Zeitverlauf der Intensität des Anregungslichts, in der Mitte den schematischen Zeitverlauf der Intensität des Abregungslichts und unten den schematischen Zeitverlauf der Empfindlichkeit des Detektors zum Registrieren von Fluoreszenzlicht von einer Probe bei einer Ausführungsform des neuen Verfahrens.
FIGURENBESCHREIBUNG
Die in Fig. 1 skizzierte Vorrichtung 1 dient zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe 2. Hierzu wird mit einer Anregungslichtquelle 3 in Form eines Pulslasers 4 gepulstes Anregungslicht 5 durch eine Optik 6 in einen Fokusbereich eines Objektivs 7 in die Probe gerichtet. In diesem Fokusbereich wird der Fluoreszenzfarbstoff in der Probe 2 durch einen Zweiprotonenprozess zur Fluoreszenz, d. h. zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Der Fokusbereich ist hier als der Bereich definiert, in dem eine effektive Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs über den Zwei- photonenprozess zur Spontanemission von Fluoreszenzlicht erfolgt. Über einen Teilbereich des Fokusbereichs, und zwar außerhalb eines gegenüber dem Fokusbereich verkleinerten Mess- bereichs wird der Fluoreszenzfarbstoff sofort wieder abgeregt, indem mit einer Abregungs- lichtquelle 8 in Form eines Diodenlasers 9 Abregungslicht 10 kontinuierlich auf die Probe gerichtet wird. Dabei werden mit einem Phasenmodulator 11 die ebenen Wellen des Anregungslichts 10 so deformiert, dass sich in dem Fokusbereich eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts 10 mit einer zentralen Nullstelle und daran angrenzenden, den Rest des Fokusbereichs abdeckenden Intensitätsmaxima einstellt. So erfasst ein Detektor 12, der von dem Fluoreszenzfarbstoff der Probe 2 spontan emittiertes Fluoreszenzlicht registriert, nur noch Fluoreszenzlicht aus dem Messbereich, der Abmessungen unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts mit den eingesetzten Wellenlängen aufweist. Das Anregungslicht 5 wird von dem Detektor 12 durch einen dichroitischen Spiegel 14 ferngehalten, der die Strahlengänge des Anregungslichts 5 und des Fluoreszenzlichts 13 trennt. Das Abregungslicht 10 wird von dem Detektor 12 durch einen dichroitischen Spiegel 15 ferngehalten, der die Strahlengänge des Abregungslichts 10 und des Fluoreszenzlichts 13 trennt. Eine Abtasteinrichtung 16 kann dazu vorgesehen sein, ein optisches Element 17 der Optik 6, durch das Anregungslicht 5 als auch das Abregungslicht 10 als auch das Fluoreszenzlicht 13 von der Probe hindurch treten, so bewegt, dass die mit dem Fluoreszenzfarbstoff in der Probe zwei markierte Strukturen dreidimensional abgetastet wird.
Fig. 2 zeigt oben den zeitlichen Verlauf der Intensität des Anregungslichts 5. Zwischen begrenzten Zeiträumen 18, in denen die Intensität des Anregungslichts null ist, besteht das Anregungslicht aus einzelnen Pulsen mit einer Pulsdauer kürzer als ihr Abstand. Die begrenzten Zeiträume 18 weisen eine typische Dauer von 1 μs auf. Die Frequenz der Pulse 19 des Anregungslichts 5 liegt bei über 120 MHz, wobei ihr Abstand mindestens 10 Mal größer ist als ihre Dauer. Diese Zahlenverhältnisse werden in Fig. 2 nicht vollständig widergespiegelt. In der Mitte zeigt Fig. 2 den Intensitätsverlauf des Abregungslichts 10 über der Zeit. Das Abregungslicht 10 wird kontinuierlich, d. h. mit konstanter Intensität, auf die Probe 2 aufgebracht, außer in den begrenzten Zeiträumen 18, in dem seine Intensität ebenfalls null ist. Unten zeigt Fig. 2 die Empfindlichkeit 20 des Detektors 12 gemäß Fig. 1 über der Zeit. Diese ist kontinuierlich, d. h. auch über die begrenzten Zeiträume 18 hinweg gegeben.
BEZUGSZEICHENLISTE
Vorrichtung
Probe
Anregungslichtquelle
Pulslaser
Anregungslicht
Optik
Objektiv
Abregungslichtquelle
Diodenlaser
Abregungslicht
Phasenmodulator
Detektor
Spontan emittiertes Fluoreszenzlicht
Dichroitischer Spiegel
Dichroitischer Spiegel
Abtasteinrichtung
Optisches Element
Begrenzter Zeitraum
Puls
Empfindlichkeit

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in einer Probe, wobei gepulstes Anregungslicht in die Probe fokussiert wird, um den in einem Fokusbereich befindlichen Fluoreszenzfarbstoff zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht anzuregen, wobei Abregungslicht, das eine andere Wellenlänge als das Anregungslicht aufweist, auf die Probe gerichtet wird, um angeregten Fluoreszenzfarbstoff außerhalb eines gegenüber dem Fokusbereich verkleinerten Messbereichs vor seiner spontanen Emission abzuregen, und wobei von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiertes Fluoreszenzlicht registriert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des Anregungslichts (5) so ausgewählt wird, dass das Anregungslicht (5) den Fluoreszenzfarbstoff über einen Mehrphotonenprozess anregt, und dass das Abregungslicht (10), das eine kürzere Wellenlänge als das Anregungslicht (5) aufweist, über eine Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (10) hinweg kontinuierlich auf die Probe (2) gerichtet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das von dem Fluoreszenz- farbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht (13) über eine Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) hinweg kontinuierlich registriert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Abregungslicht (10) mit einem Diodenlaser (9) bereitgestellt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (5) mit einer Frequenz von mindestens 80 MHz, vorzugsweise mindestens 100 MHz, mehr bevorzugt mindestens 120 MHz und am meisten bevorzugt mindestens 150 MHz gepulst wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Pulse (19) des Anregungslichts (5) eine Dauer von höchstens 1 Zehntel, vorzugs- weise von höchstens 1 Hundertstel, mehr bevorzugt von höchstens 1 Tausendstel und am meisten bevorzugt von höchstens 1 Zehntausendstel ihres Pulsabstands aufweisen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (2) mit dem Messbereich oder einer Mehrzahl gleichartiger Messbereiche, aus denen das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht (13) räumlich getrennt registriert wird, dreidimensional abgetastet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Abregungslicht (10) in Richtung der optischen Achse des Anregungslichts (5) vor und hinter dem Messbereich auf die Probe (2) gerichtet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (5) und das Abregungslicht (10) jeweils nach der Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) für einen begrenzten Zeitraum (18) unterbrochen werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der begrenzte Zeitraum der Unterbrechung (18) eine Dauer von 0,5 bis 50 μs, vorzugsweise von 1 bis 2 μs, aufweist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zeitraum der Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) 100 ns bis 50 μs, vorzugsweise 0,5 bis 2 μs, ausmacht.
1 1. Vorrichtung zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenz- farbstoff markierten Struktur in einer Probe, mit einer Anregungslichtquelle für gepulstes Anregungslicht, mit einer das Anregungslicht in die Probe fokussierenden Optik, um den in einem Fokusbereich befindlichen Fluoreszenzfarbstoff zur spontanen Emission von Fluores- zenzlicht anzuregen, mit einer Abregungslichtquelle für Abregungslicht, das eine andere Wellenlänge als das Anregungslicht aufweist, mit einer das Abregungslicht auf die Probe richtenden Optik, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb eines gegenüber dem Fokusbereich verkleinerten Messbereichs abzuregen, und mit einem Detektor, der von dem Fluoreszenz- farbstoff spontan emittiertes Fluoreszenzlicht registriert, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle (3) das Anregungslicht (5) mit einer solchen Wellenlänge abstrahlt, dass das Anregungslicht (5) den Fluoreszenzfarbstoff über einen Mehrphotonenprozess anregt, und dass die Abregungslichtquelle (8) das Abregungslicht (10), das eine kürzere Wellenlänge als das Anregungslicht (5) aufweist, über eine Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) hinweg kontinuierlich auf die Probe (2) richtet.
12. Vorrichtung nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (12) das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht (13) über eine Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) hinweg kontinuierlich registriert.
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Abregungslichtquelle (8) einen Diodenlaser (9) aufweist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle (5) einen Pulslaser (6) aufweist, der das Anregungslicht (5) in Pulsen (19) mit einer Frequenz von mindestens 80 MHz, vorzugsweise mindestens 100 MHz, mehr bevorzugt mindestens 120 MHz und am meisten bevorzugt mindestens 150 MHz abgibt.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle (3) einen Pulslaser (4) aufweist der das Anregungslicht (5) in einzelnen Pulsen (19) abgibt, die eine Dauer von höchstens 1 Zehntel, vorzugsweise von höchstens 1 Hundertstel, mehr bevorzugt von höchstens 1 Tausendstel und am meisten bevorzugt von höchstens 1 Zehntausendstel ihres Abstands aufweisen.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Abtasteinrichtung (16) vorgesehen ist, die die Probe (2) mit dem Messbereich oder einer Mehrzahl gleichartiger Messbereiche, aus denen der Detektor (12) das von dem Fluoreszenz- farbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht (13) räumlich getrennt registriert, dreidimensional abtastet.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die das Abregungslicht (10) auf die Probe richtende Optik (6) ebene Wellenfronten des Abregungs- lichts so modifiziert, dass das Abregungslicht (10) in Richtung der optischen Achse des Anregungslichts (5) Intensitätsmaxima vor und hinter dem Messbereich aufweist.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuerungseinrichtung vorgesehen ist, die das Einfallen des Anregungslichts (5) und des Abregungslichts (10) jeweils nach der Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) für einen begrenzten Zeitraum (18) unterbricht.
19. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der begrenzte Zeitraum (18) mindestens in einem Bereich von einer Dauer von 1 bis 2 μs, vorzugsweise von 0,5 bis 3 μs einstellbar ist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zeitraum der Vielzahl von Pulsen (19) des Anregungslichts (5) mindestens in einem Bereich von 100 ns bis 50 μs, vorzugsweise von 0,5 bis 2 μs einstellbar ist.
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