DE102018215833B4

DE102018215833B4 - Optische Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen

Info

Publication number: DE102018215833B4
Application number: DE102018215833.9A
Authority: DE
Inventors: Markus Gräfe; Marta Gilaberte Basset; Falk Eilenberger; Frank Setzpfand
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2020-04-02
Anticipated expiration: 2038-09-19
Also published as: DE102018215833A1; US20220034813A1; WO2020058076A1

Abstract

Bei der optischen Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen ist/sind von einer Quelle nichtklassischen Lichtes ein oder mehrere Multiphotonenstrahlen, aber mindestens ein oder zwei Photonenpaarstrahlen auf ein erstes optisches System, bestehend aus einer Anordnung aus mindestens einer Linse oder einem Photonen reflektierenden Element oder einem anderem strahlformenden Element oder einer Kombination dieser, gerichtet ist. Das erste optische System (3) ist ausgebildet, das nichtklassische Licht zu einem Lichtblatt (4) oder einer lichtblattartigen Form zu formen und von dort auf eine Probe (5) zu richten, so dass mit den mehreren gleichzeitig auf/in der Probe auftreffenden Mehrphotonenzuständen Fluoreszenzstrahlung mittels Mehrphotonenabsorption angeregt wird. Durch Anregung erhaltene Fluoreszenzstrahlung (6) trifft mittels eines zweiten optischen Systems (7) auf ein Detektionssystem (8) auf, das zur ortsaufgelösten Erfassung von Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen mittels nichtklassischem Licht. Das Anwendungsgebiet liegt im Bereich der Fluoreszenzmikroskopie und Multiphotonenabsorptionsanalyse. Dies ist zum Beispiel für die mikroskopische Untersuchung von biochemischen Proben in den Lebenswissenschaften und der Medizin von großer Bedeutung, aber auch für chemisch-materialanalytische Untersuchungen von Stoffen.
Dabei erfolgt die Anregung und Detektion von Fluoreszenzlicht mittels Multi-, insbesondere Zweiphotonenabsorption von Photonenpaaren für Anwendungen, die analog zur Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden können.
Es existieren bereits verschiedene Lösungsansätze, die aber alle mit prinzipiellen Nachteilen behaftet sind. Diese bereits bekannten Lösungen lassen sich prinzipiell in drei Kategorien einteilen:

a. Zweiphotonenfluoreszenzmikroskpie mit klassischem Licht, wie sie in US 5,503,613 B und US 6,020591 B offenbart sind. Dabei wird die Zweiphotonenabsorption mittels Dauerstrichlaser mit sehr hoher Intensität oder mit gepulsten Lasern mit Pulsen im Pico- oder Femtosekundenbereich realisiert. Die Zweiphotonenabsorptionswahrscheinlichkeit und somit auch die Fluoreszenzintensität hängen dabei quadratisch von der momentanen Anregungsintensität ab. Die anregende Laserstrahlung wird zur Verbesserung der Absorptionswahrscheinlichkeit fokussiert. In der klassischen Zweiphotonenfluoreszenzmikroskopie wird der Fokus axial entlang der optischen Achse des Systems ausgebildet. Nur im Fokus können Fluoreszenzmoleküle per Zweiphotonenabsorption angeregt werden und somit Fluoreszenz zeigen. Es wird jedoch der gesamte Probenbereich entlang der optischen Achse mit einer hohen Strahlungsdosis und entsprechend hoher Energie beaufschlagt. Dies führt sowohl zum Ausbleichen der Fluoreszenz, als auch zu Phototoxizität, besonders bei biologischen Proben.
b. Eine alternative Lösung ist der Zweiphotonen-Lichtblattmodus. Hierbei ist der Fokus der Anregungsstrahlung als Ebene - Lichtblatt genannt - senkrecht zur Beobachtungsrichtung ausgebildet. Dazu wird durch ein geeignetes optisches System die zu untersuchende Probe lateral durchleuchtet. Das Lichtblatt kann durch einen Linienfokus, eine Linienabbildung oder einen lateral scannenden Laserstrahl gebildet werden. Nur in diesem Lichtblatt können Fluoreszenzmoleküle per Zweiphotonenabsorption angeregt werden und somit Fluoreszenz zeigen. Nachteil der Methode ist die Notwendigkeit der Beleuchtung mit sehr intensitätsstarken Dauerstrichlasern oder Lasersystemen für ultrakurze Laserpulse. In beiden Fällen wird die Probe mit Laserstrahlung hoher Intensität oder gar von Laserpulsen durchstrahlt und einer hohen Bestrahlungsdosis mit hoher Energie ausgesetzt. Dies führt sowohl zum Ausbleichen der Fluoreszenz, als auch zu Phototoxizität, besonders bei biologischen Proben. Auch hier hängt die Zweiphotonenabsorptionswahrscheinlichkeit und somit auch die Fluoreszenzintensität quadratisch von der momentanen Anregungsintensität ab.
c. Möglichkeiten zur Photonenpaarfluoreszenzmikroskopie sind auch aus US 5,796,477 B bekannt. Dabei wird die Zweiphotonenabsorption nicht durch intensitätsstarke oder gepulste Laser angeregt, sondern durch Photonenpaare aus zwei korrelierten (in Raum, Zeit, Impuls und/oder Energie) Photonen. Diese können insbesondere durch spontane Differenzfrequenzkonvertierung in einem nichtlinearen Kristall außerhalb der Probe generiert werden. Die beiden Photonen können bei ihrer Bewegung von der Photonenpaarquelle zur jeweiligen Probe voneinander räumlich getrennt werden. Haben sie eine unterschiedliche Wellenlänge kann dies mit einem dichroitischen Spiegel erreicht werden. Weisen sie entgegengesetzte Polarisation auf, können sie durch einen Polarisationsstrahlteiler räumlich getrennt werden. Es ist aber ebenso möglich, dass beide Photonen einen Kristall mit nichtlinearen optischen Eigenschaften räumlich separiert verlassen und damit bereits räumlich getrennt sind. Anschließend werden die beiden Photonenstrahlen überkreuzend in die Probe fokussiert. Im Überlappbereich der im Fokus aufeinander treffenden Photonen kann dann die Zweiphotonenabsorption stattfinden. In diesem Szenario sind die Zweiphotonenabsorption und damit die Fluoreszenzintensität linear proportional zur momentanen Anregungsintensität. Ein weiterer Vorteil ist, dass das fokale Volumen gegenüber dem in a. beschriebenen Verfahren kleiner sein kann. Nachteilig an diesem Verfahren ist der komplexe experimentelle Aufbau, da sichergestellt sein muss, dass beide Photonen eines Paares exakt zur gleichen Zeit im Strahlüberlappvolumen ankommen und innerhalb der Probe aufeinandertreffen. Dies kann durch die sehr kurze Kohärenzzeit und möglicherweise unterschiedlicher aber korrelierter Wellenlänge der beiden Photonen erschwert sein. Daher ist eine sehr genaue Justage, die zu Lasten der Flexibilität und Praktikabilität geht, erforderlich.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten für die Fluoreszenzmikroskopie anzugeben, mit denen der lokale Energieeintrag bei der Fluoreszenzanregung reduziert werden kann und bei denen ein einfacher optischer Aufbau mit reduziertem Justageaufwand einsetzbar ist.
So sind aus DE 102 11458 A1 ein Verfahren und eine Anordnung zur Erhöhung der Auflösung in einem Mikroskop bekannt.
DE 102 01 388 A1 betrifft ein Verfahren und Apparaturen für mikroskopische Anwendungen.
Ein Verfahren und Anordnungen zur mikroskopischen Abbildung sind in WO 03/060610 A1 beschrieben.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer optischen Anordnung, die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist, gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung können mit in untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen realisiert werden.
Das hier vorgeschlagene Verfahren beruht auf der Nutzung einer vorzugsweise kollinearen Quelle von der insbesondere Photonenpaare oder aber auch Mehrphotonenzustände gleichzeitig auf eine Probe emittiert werden und dabei das Prinzip der Lichtblattmikroskopie anwendbar ist.
Dabei emittiert eine Quelle nicht klassischen Lichts Multiphotonenstrahlen, aber mindestens Photonenpaarstrahlen von insbesondere Photonenpaaren oder aber auch Mehrphotonenzuständen, bevorzugt in kollinearer Geometrie. Dies kann durch spontane Differenzfrequenzkonvertierung/spontane parametrische Fluoreszenz in einem nichtlinearen, auch periodisch gepolten optischen Kristall geschehen. Der/die Multiphotonenstrahl(en) gelangt/gelangen durch ein erstes optisches System auf eine Probe, so dass ein Lichtblatt oder eine lichtblattartige Form ausgebildet wird.
Das Lichtblatt oder die lichtblattartige Form kann dabei als zeitlich konstanter Linienfokus aber auch als in der Lichtblattebene gescannter Photonenstrahl ausgebildet sein oder sich durch die zeitliche Abfolge kleiner Teillichtblätter zusammensetzen. Ein dazu geeignetes erstes optisches System kann eine Linse oder ein Photonen reflektierendes optisches Element oder eine Polarisationsoptik oder ein optischer Filter oder eine beliebige Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente sein.
Ein Lichtblatt oder eine lichtblattartige Form lässt sich auch durch eine Bewegung eines optischen Elements, das Bestandteil des ersten optischen Systems sein kann, erreichen. So kann man beispielsweise ein Photonen reflektierendes Element um eine Rotationsachse verschwenken und so die Position an der Probe, an der die Photonenpaare gleichzeitig auftreffen, verändern, ähnlich, wie es bei den bekannten Scannerspiegeln in der Lasertechnik möglich ist.
Nur in dem im Bereich des ausgebildeten Lichtblatts oder der lichtblattartigen Form durchleuchteten Bereich der Probe ist eine gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen, insbesondere von Photonenpaaren und damit Fluoreszenzanregung möglich. Ein Teil der Fluoreszenzstrahlung wird unter optionaler Verwendung eines zweiten optischen Systems auf ein Detektionssystem treffen und dort detektiert werden. Das zweite optische System kann eine optische Linse oder ein Fluoreszenzstrahlung reflektierendes Element oder eine Polarisationsoptik oder ein optischer Filter oder eine beliebige Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente sein. Ein Detektorsystem sollte eine ortsaufgelöste Messung der Fluoreszenzstrahlung, die innerhalb des Lichtblatts angeregt worden ist, ermöglichen. Das Detektorsystem kann eine Kamera mit genügender Empfindlichkeit sein. Beispiele dafür sind eine CCD, EMCCD, ICCD, CMOS-Kamera, SPAD-Array. Es kann ein optischer Filter oder ein zweites optisches System enthalten. Das zweite optische System sowie das Detektionssystem können auch als Einheit ausgeführt sein.
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Variante können auch mehrere Photonenstrahlen genutzt werden, so dass in mehreren Lichtblättern oder in Bereichen mit lichtblattartiger Form an der Probe gleichzeitig Fluoreszenz angeregt werden kann. Die Anregung der Fluoreszenz kann explizit auch über Multiphotonenabsorption von Mehrphotonenzuständen, insbesondere von Photonenpaaren, die gleichzeitig auf eine Probe auftreffen, geschehen. Derartige Multiphotonenzustände können z.B. durch sogenannte N00N states realisiert werden, wobei dann eine N-Photonenabsorption stattfindet.
Eine Quelle nichtklassischen Lichtes kann beispielsweise ein von einem Laser gepumpter nichtlinearer Kristall oder eine anderer Quelle von Photonenpaaren oder Multiphotonenzuständen sein, wie beispielsweise eine von einem Laser gepumpte Wellenleiterstruktur in einem nichtlinearen Kristall, oder mindestens zwei identische kohärent gepumpte Quantenpunkte.
Die erfindungsgemäße Lösung hat gegenüber dem Stand der Technik für Fluoreszenzmikroskopie mittels Multiphotonenabsoprtion einige Vorteile. Da die Fluoreszenzintensität linear mit der momentanen Beleuchtungsintensität skaliert, kann die Bestrahlungsdosis der Probe bei gleichbleibender Signalausbeute reduziert werden oder Signalstärke und Bildkontrast der mit dem Detektionssystem erfassten Fluoreszenzstrahlung bei gleichbleibender Bestrahlungsdosis gesteigert werden. Das Verfahren ist damit maximal schonend, ohne unnötige Lichtbelastung der Probe und erlaubt somit Langzeitstudien von photosensitiven Proben, da sowohl Fluoreszenzbleaching als auch Phototoxizität minimiert werden können. Im Gegensatz zur Photonenpaarfluoreszenzmikroskopie ist der Aufbau deutlich vereinfacht und robuster gestaltet, so dass eine Kostenreduktion und Verbesserung der axialen Auflösung erreicht werden kann. Der kollineare Aufbau ist kompatibel und mit bestehenden Lichtblatt-Mikroskopsystemen implementierbar. Außerdem kann Multiphotonenstrahlung mit Photonen einer bestimmten Mittenwellenlänge zu fokalen Volumina fokussiert werden, welche sonst nur mit Laserlicht der halben Wellenlänge erreichbar sind. Damit kann die axiale Auflösung der erfassbaren Fluoreszenzstrahlung innerhalb des jeweiligen Lichtblatts erhöht werden. Insgesamt sind eine erhöhte Effizienz, erhöhte Ortsauflösung und erhöhte Eindringtiefe möglich. Ebenso ist der lineare Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und Photonenstrahlintensität von Vorteil für die Datenauswertung, da ein linearer Zusammenhang zwischen Messgröße (Fluoreszenzsignal) und Anregungsgröße (Strahlungsdosis) vorliegt.
Nachfolgend soll die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert werden.
Dabei zeigt:

1 in schematischer Form ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Anordnung.

In 1 ist gezeigt, wie ein Photonenpaarstrahl 2 von einer kollinearen Quelle nicht klassischen Lichts 1 auf ein erstes optisches System 3 gerichtet ist. Das erste optische System 3 kann, wie in den Ansprüchen definiert ausgebildet sein.
Der mit dem ersten optischen System 3 beeinflusste Photonenpaarstrahl 2 wird so auf/in die Probe 5 gerichtet, dass mindestens eine eindimensionale linienförmige Bewegung der Position, an der der Photonenpaarstrahl 2 auf die Probe 5 auftrifft oder in die Probe eintritt, zur Ausbildung eines Lichtblattes 4 erfolgt. Die Bewegung kann durch eine Bewegung eines die Photonen reflektierenden Elements, insbesondere mittels einer Schwenkbewegung um eine Rotationsachse eines reflektierenden Elements erreicht werden.
Mit auf die Probe 5 auftreffenden oder in die Probe 5 eintretenden Photonenpaaren wird eine Anregung von Fluoreszenzstrahlung 6 innerhalb des Lichtblatts 4 erreicht.
So generierte Fluoreszenzstrahlung 6 trifft auf ein zweites optisches System 7 auf, das ebenfalls so ausgebildet ist, wie in den Ansprüchen definiert. Mit dem Detektorsystem 8 erfolgt eine ortsaufgelöste Erfassung von Fluoreszenzstrahlung, die fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet werden kann.

Claims

Optische Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen, bei der von einer Quelle nichtklassischen Lichtes (1) ein oder mehrere Multiphotonenstrahl(en), aber mindestens ein oder zwei Photonenpaarstrahl(en) (2), auf ein erstes optisches System (3) bestehend aus einer Anordnung aus mindestens einer Linse oder einem Photonen reflektierenden Element oder einem anderen strahlformenden Element oder einer Kombination dieser gerichtet ist/sind und das erste optische System (3) ausgebildet ist, das nichtklassische Licht zu einem Lichtblatt (4) oder einer lichtblattartigen Form zu formen und von dort auf eine Probe (5) zu richten, so dass mit den mehreren gleichzeitig auf/in der Probe auftreffenden Mehrphotonenzuständen Fluoreszenzstrahlung mittels Mehrphotonenabsorption angeregt wird und durch Anregung erhaltene Fluoreszenzstrahlung (6) mittels eines zweiten optischen Systems (7) auf ein Detektionssystem (8) auftrifft, das zur ortsaufgelösten Erfassung von Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle nichtklassischen Lichtes (1) ein von einem Laser gepumpter nichtlinearer Kristall oder Wellenleiterstruktur in einem nichtlinearen Kristall, oder mindestens zwei identische kohärent gepumpte Quantenpunkte sind.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Multiphotonenstrahl(en), aber mindestens ein oder mehrere Photonenpaarstrahl(en) (2), bevorzugt in kollinearer Geometrie auf das erste optische System (3) gerichtet ist/sind.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mit zwei Photonen in Form eines Photonenpaares Fluoreszenzstrahlung anregbar ist.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbildung eines Lichtblatts (4) mittels des ersten optischen Systems (3) erfolgt, das ausgebildet ist, mindestens einen Multiphotonenstrahl (2) durch eine Bewegung eines optischen Elements, das Bestandteil des ersten optischen Systems (3) ist, sowie die Position des Auftreffens des mindestens einen Multiphotonenstrahls (2) auf/in die Probe (5) linienförmig zu verändern, so dass ein entsprechender linienförmiger Bereich mindestens einer Linie mindestens einmal bestrahlt wird.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein von der Photonenstrahlquelle (1) emittierter Multiphotonenstrahl (2) in mehrere Teilstrahlen aufgeteilt und die Teilstrahlen zur Ausbildung jeweils eines Lichtblatts mittels mindestens eines ersten optischen Systems (3) auf/in die Probe (5) gerichtet sind.
Anordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbildung mindestens eines Lichtblattes (4) oder lichtblattartigen Form mittels mindestens eines ersten optischen Systems (3) erfolgt, das ausgebildet ist, die Teilstrahlen durch die Bewegung eines optischen Elements, das Bestandteil des ersten optischen Systems (3) ist, sowie die Position des Auftreffens der Teilstrahlen auf/in der Probe (5) linienförmig zu verändern, so dass ein entsprechender linienförmiger Bereich mindestens einer Linie mindestens einmal mit einem Teilstrahl bestrahlt wird.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur ortsaufgelösten Abbildung der Probe (5) eine ein- oder zwei- oder dreidimensionale Bewegung der Probe (5) erfolgt.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes optisches System (3) und/oder ein zweites optisches System (7) mit einem nichtlinearen optischen Kristall, einer optischen Linse, einem Photonen reflektierenden Element, einer Polarisationsoptik, einen optischen Filter oder eine Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente gebildet ist/sind.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein von der Quelle nichtklassischen Lichts (1) kollinear emittierter Multiphotonenstrahl mittels eines dichroitischen Spiegels oder eines Polarisationsstrahlteilers in mehrere Teilstrahlen aufteilbar ist, die an verschiedenen Positionen auf/in die Probe (5) gerichtet sind.
Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektorsystem (8) eine CCD-, eine EMCCD-, eine ICCD- oder eine CMOS-Kamera oder ein SPAD-Array ist.