DE10201388A1

DE10201388A1 - Verfahren und / oder Apparaturen für mikroskopische Abbildung

Info

Publication number: DE10201388A1
Application number: DE10201388A
Authority: DE
Inventors: Ralf Wolleschensky; Michael Kempe; Magued B Nasr; Ayman F Abouraddy; Mark C Booth; Bahaa E A Saleh; Malvin C Telch; Alexander V Sergienko
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG; Boston University
Priority date: 2001-08-24
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2003-03-13

Description

Einleitung

Die hier vorgestellte Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Apparaturen, die auf der Mehrphotonenabsorption mit verbesserter räumlicher Auflösung beruhen. Wir schlagen die Verwendung von nichtklassischem Licht vor, wie zum Beispiel verschränkte Photonen oder gequetschtes Licht als Anregungsquelle, das eine nichtlineare Absorption ermöglicht, welche beispielsweise zur Fluoreszenzanregung in einer Probe, die Fluorophore enthält, bzw. zur Modifikation der Probe führt. Durch Fokussieren des Lichtes der nichtklassischen Lichtquelle auf eine Probe, wie es in der Erfindung beschrieben wird, kann die laterale und auch die axiale Auflösung bekannter optischer Anordnungen übertroffen werden. Die hier vorgestellte Erfindung steht im Zusammenhang mit der Laser Scan Mikroskopie und der Laserspektroskopie mit hoher räumlicher Auflösung, bei denen die einzigartigen Eigenschaften des nichtklassischen Lichtes genutzt werden. Ferner wird von der Erfindung erwartet, daß sie in der Lithographie und für das Beschreiben/Lesen optischer Speicher Anwendung findet.

Hintergrund der Erfindung

Wir schlagen eine neue Methode und Apparatur für die Laser Scan Mikroskopie und die Spektroskopie unter Verwendung von nichtklassischem Licht vor.
Die Laser Scan Mikroskopie und die Spektroskopie zielen auf das Erhalten von dreidimensionalen Informationen über ein Objekt mit hoher räumlicher Auflösung. Unter den angewandten Abbildungsverfahren ist die Fluoreszenzabbildung in der Biowissenschaft am weitesten verbreitet. Ein klassisches Werkzeug dafür ist das konfokale Laserscanning- Mikroskop (CLSM) [1]. Für die Anregung kann entweder klassisches Laserlicht oder Licht von einer Glühlichtquelle verwendet werden.
Bei Anwendungen zum Beispiel in der Lithographie wird Laserlicht genutzt, um die chemische Struktur eines Materials (des Photoresists) zu modifizieren. Aufgrund der hohen räumlichen Selektivität dieses Prozesses können zweidimensionale Strukturen im Photoresist erzeugt werden. Bei Anwendung chemischer Ätztechniken kann das Material in den Regionen, wo die chemische Struktur des Photoresists verändert wurde, modifiziert werden [2].
Bei einer anderen Anwendung wird Licht genutzt, um die Eigenschaften eines Materials, das zum Speichern von Informationen in einem optischen Speicher verwendet wird, wieder lokal zu verändern [3].
Die Anregung der endogenen oder exogenen Fluorophore innerhalb des Objektes oder die Modifizierung des Objektes durch Licht (d. h. die chemische Struktur des Photoresists) erfolgt gewöhnlich durch die Absorption von Photonen in einem einzigen Schritt (pro angeregtem Molekül ist ein Photon erforderlich) - der linearen Absorption; oder in einem mehrstufigen Prozeß (die quasi-simultane Absorption von mindestens zwei Photonen pro angeregtem Molekül ist erforderlich) - der nichtlinearen Absorption.
Damit eine nichtlineare Absorption im Objekt stattfinden kann, ist eine hohe Spitzenintensität des Anregungslichtes am Ort der Interaktion erforderlich, um einen ausreichenden Absorptionsgrad zu erreichen. Oft können solch hohe Spitzenintensitäten nur durch die Verwendung von Kurzpuls-Laserstrahlung zur Anregung, kombiniert mit einer starken Fokussierung des Lichtes, erreicht werden. Aufgrund der hohen Spitzenintensität sind das Ausbleichen und Schäden an empfindlichen Objekten (z. B. wegen der lichtelektrischen Dissoziation oder Plasmaerzeugung) ein häufiges Problem in der Mehrphotonen- Fluoreszenzmikroskopie. Dieser Nachteil liegt letzten Endes am Zufallscharakter des Auftreffens von Photonen klassischer Lichtquellen (z. B. Glühlampen oder Laser), so daß es wenig wahrscheinlich ist, daß zwei oder mehr Photonen innerhalb des Absorptionsquerschnittes des Mediums, das angeregt werden soll, gleichzeitig ankommen.
Für die Laser Scan Mikroskopie mit Einphotonenanregung ergeben sich dreidimensionale Abbildungsmöglichkeiten durch eine konfokalen Anordnung, wobei die aus einem kleinen Punkt im Anregungsvolumen austretende Fluoreszenz konfokal auf einen Punktdetektor abgebildet wird. Im allgemeinen befindet sich eine Lochblende (Pinhole) vor einem Standard-Photoempfänger. In einem Mehrphotonen-Fluoreszenzmikroskop (MPFM) sorgt der nichtlineare Charakter der Anregung (d. h. die nichtlineare Abhängigkeit des Absorptionsgrades von der unmittelbaren Laserintensität) für eine Lokalisierung der Anregung, die vergleichbar (für ein Zweiphotonen-Fluoreszenzmikroskop - TPFM) oder sogar besser ist als die konfokale Auflösung ohne Verwendung einer konfokalen Empfängeranordnung.

Zusammenfassung der Erfindung

Mit der hier vorgestellten Erfindung soll eine dreidimensionale Auflösung erreicht werden, die besser ist als die, die bei Verwendung eines Laserscanning-Mikroskops mit Mehrphotonenabsorption erzielt wird.
Bei einem N-Photonenabsorptionsprozeß, bei dem Licht der Wellenlänge λ verwendet wird, entspricht nach der hier vorgestellten Erfindung die Auflösung bei einer konfokalen Anordnung einem CLSM mit linearer Absorption von Licht der Wellenlänge λ geteilt durch N. Im Unterschied dazu ist bei einer N-Photonenabsorption unter Verwendung bekannter mikroskopischer Anordnungen die Wellenlänge λ entscheidend für die Auflösung. Die Vorteile der nichtlinearen Absorption von Licht der Wellenlänge λ gegenüber der linearen Absorption von Licht mit einer Wellenlänge von λ/N bei Verwendung des CLSM liegen in einer höheren Eindringtiefe, einer geringeren Streuung und einer vereinfachten Optik.
Bei der Absorption von nichtklassischem Licht gemäß dieser Erfindung hängt der Absorptionsgrad linear von der Lichtintensität ab, also genügt eine kontinuierliche Lichtquelle mittlerer Leistung (Strahlungsleistung) für eine effektive Mehrphotonenabsorption. Diese Tatsache reduziert die Komplexität und die Kosten der erforderlichen Lichtquelle. Außerdem können die Nachteile, die hohe Spitzenintensitäten für die Probe mit sich bringen, vermieden werden. Dies erweitert die Anwendung des MPFM auch auf Proben, die empfindlich gegenüber Schäden und Ausbleichen sind. Darüber hinaus macht die Verwendung von nichtklassischem Licht, wie verschränkte Photonen, neuartige spektroskopische Verfahren möglich, die es in Verbindung mit der in dieser Erfindung beschriebenen optischen Anordnung erlauben, detaillierte Informationen über die Probe bei hoher räumlicher Auflösung zu erhalten.
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet nichtklassisches Licht Licht mit besonderer Photonenstatistik. Solch eine nichtklassische Lichtquelle erzeugt N Photonen, die zeitlich und räumlich korreliert sind. Eines der Ziele dieser Erfindung ist es, Methoden und Anordnungen aufzuzeigen, nach denen der Weg von N Photonen zur Probe so gestaltet ist, daß sie sich in einem Punkt in der Probe vereinigen und gleichzeitig über einen N- Photonenabsorptionsprozeß aufeinander einwirken. Nichtklassisches Licht kann über den Prozeß der spontanen parametrischen Frequenzkonversion (SPDC) in einem nichtlinearen Kristall wie β-Bariumborat (BBO) oder Lithiumniobat (LN) erzeugt werden. Wenn solch ein nichtlinearer Kristall zweiter Ordnung mit einem stark kohärenten Pumplaser gepumpt wird, werden Paare aus verschränkten Photonen (Photonenpaarstrahlen) erzeugt. Das nichtlineare Material kann auch periodisch gepolt werden (z. B. PPLN), um eine höhere Wirksamkeit bei der Erzeugung verschränkter Photonen zu erzielen. Nichtklassisches Licht kann auch durch Quetschen in einem optischen parametrischen Verstärker (OPA) oder Oszillator (OPO) erzeugt werden. Die Prinzipien der Mikroskopie und Spektroskopie mit verschränkten Photonen wurden im Patent US 5, 796, 477 [4] beschrieben. Ein Überblick über die Erzeugung und das Verhalten von gequetschtem Licht kann in [5] gefunden werden.
Die folgende Diskussion der Erfindung betrifft die Fluoreszenzanregung mit verschränkten Photonen, die in einem nichtlinearen Kristall durch spontane parametrische Frequenzkonversion erzeugt werden, ohne den Umfang der Erfindung darauf zu beschränken.
Die Schlüsselaufgabe der optischen Anordnung für die Anregung der Probe besteht darin abzusichern, daß die N korrelierten Photonen der nichtklassischen Lichtquelle bei voller numerischer Apertur der Objektivlinse auf einem beugungsbegrenzten Punkt der Probe ankommen. Oft werden einige oder alle N Photonen der nichtklassischen Lichtquelle kollinear emittiert. In diesem Falle, und in einer der Aufbauvarianten für die optische Konfiguration, liegt die Quelle des nichtklassischen Lichtes nahe der hinteren Brennebene der Objektivlinse, die in die Probe fokussiert. Diese Ebene fällt mit der primären telezentrischen Ebene des Beleuchtungsstrahlenganges des Mikroskops zusammen. Die infolge der Absorption von Photonenpaaren emittierte Fluoreszenz wird auf einem Detektor abgebildet, dessen Signal elektronisch verarbeitet wird. Die Empfängereinrichtung könnte eine konfokale Anordnung unter Verwendung eines Punktdetektors sein. Alternativ dazu ist die nichtkonfokale Messung mittels eines Großflächendetektors möglich (d. h., die Empfängerfläche ist viel größer als die Punktverwaschungsfunktion in der Empfängerebene). Um ein Bild zu erhalten, wird die Probe durch den Anregungsstrahl gerastert, dann folgt die Verarbeitung und Darstellung des Empfängersignals, wie in der Laser Scan Mikroskopie bekannt.
Bei einer anderen in dieser Erfindung vorgestellten Konfiguration wird die Quelle der verschränkten Photonen nahe einer Ebene angebracht, die zur primären telezentrischen Ebene des Beleuchtungsstrahlenganges des Mikroskops konjugiert ist. In diesem Falle können komplexere Konfigurationen der Quelle realisiert werden. Solch ehe Quelle verschränkter Photonen kann zum Beispiel in einer konjugierten telezentrischen Ebene eines Standard-CLSM liegen.
Eine andere Aufbauvariante enthält Elemente zur Schaffung einer optischen Verzögerung zwischen den Photonen, die ein Paar bilden. Solch eine optische Verzögerung kann sich zwischen der Quelle und der Objektivlinse befinden und ermöglicht die Untersuchung spektroskopischer Eigenschaften einer Probe mit hoher räumlicher Auflösung.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Bild 1A zeigt die statistischen Eigenschaften über die Zeit, d. h. die Anzahl der Photonen, die in einem Zeitintervall ΔT ankommen, bei Verwendung einer nichtklassischen Lichtquelle mit N-fachen (in diesem Falle 4-fachen) Photonen, im Vergleich zu einer klassischen Lichtquelle. Bild 1B ist die schematische Darstellung eines N-Photonenabsorptionsprozesses durch S reale oder virtuelle Zustände von Energiestufe E₁ nach E₂.
In Bild 2 wird die Fluoreszenzanregung schematisch dargestellt, die entsprechend der Erfindung auf der klassischen Zweiphotonenabsorption (links) bzw. auf der Absorption verschränkter Photonen (rechts) basiert.
Bild 3 ist ein Diagramm der grundlegenden optischen Fokussierungskonfiguration gemäß der Erfindung unter Verwendung der in der Beschreibung verwendeten Notation.
Bild 4 ist ein Diagramm, das den axialen Verlauf der Anregung der verschränkten Photonen (nichtklassisch) im Vergleich zur Zweiphotonen- (TP) anregung (klassisch) zeigt.
Bild 5 ist ein Diagramm, das den lateralen Verlauf der Anregung der verschränkten Photonen (nichtklassisch) im Vergleich zur Zweiphotonen- (TP) anregung (klassisch) zeigt.
Bild 6 ist ein Diagramm, das die Tiefendiskriminierung des Mikroskops verschränkter Photonen mit konfokalem Empfang im Vergleich zu einem TPFM zeigt.
Bild 7 ist ein Diagramm, in dem eine Vorzugskonfiguration des Mikroskops verschränkter Photonen dargestellt ist.
Bild 8 ist ein Diagramm, in dem eine weitere Vorzugskonfiguration des Mikroskops verschränkter Photonen dargestellt ist.
Bild 9 ist ein Diagramm, in dem eine Vorzugsvariante des Mikroskops verschränkter Photonen mit Elementen für die Nutzung spektroskopischer Kontrastinformationen dargestellt ist.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung nutzt den Unterschied zwischen der Absorption bei einer klassischen Lichtquelle und der bei einer nichtklassischen Lichtquelle, wie z. B. verschränkte Photonen in einem fokussierten Strahl. Bild 1A zeigt die zeitlichen statistischen Eigenschaften einer nichtklassischen Lichtquelle, die korrelierte Photonen erzeugt, im Vergleich zu einer klassischen Lichtquelle. Innerhalb jedes Zeitintervalls ΔT emittiert eine klassische Lichtquelle eine willkürliche Anzahl von Photonen, die einer lichtquellenabhängigen statistischen Verteilung folgen, während eine nichtklassische Lichtquelle eine N-fache Anzahl zu willkürlichen Zeiten emittiert. Bild 1B zeigt einen N-Photonenabsorptionsprozeß zwischen den Energiestufen E₁ und E₂. Die dazwischen liegenden Zustände S können virtuelle Energiezustände oder reale Zustände sein.
Die Auswirkungen dieses Unterschieds auf die Abhängigkeit der Absorptionsrate und die Probenwechselwirkung sind bekannt. Wir konzentrieren uns hier auf die Bedeutung für die Auflösung und beschreiben Konfigurationen, bei denen dieser Unterschied für die hochauflösende Abbildung genutzt wird. Die spätere Bedeutung ist höchst einfach erklärt für den Fall einer Zweiphotonenabsorption, obwohl klar ist, daß die hier dargestellte Erfindung genauso für Mehrphotonenprozesse gilt. Wir werden unsere Diskussion außerdem der Einfachheit halber auf eine Dimension in transversaler Richtung beschränken. Die Erweiterung auf ein zweidimensionales System mit Rotationssymmetrie zur optischen Achse ist einfach und die Schlußfolgerungen sind unverändert.
Der axiale und transversale Verlauf der Zweiphotonenanregung einer Probe, der für die Auflösung der Anordnung entscheidend ist, soll für zwei Fälle bestimmt werden:

- Klassische Zweiphotonenanregung. In diesem Fall wird für die Anregung der Probe eine Lichtquelle mit der Wellenlänge 2λ_p verwendet.
- Anregung durch verschränkte Photonen. Wir verwenden verschränkte Photonen, die zur Anregung der Probe in einem nichtlinearen optischen Kristall (NLC) über einen Frequenzkonversionsprozeß erzeugt werden. In diesem Fall emittiert die Pumpe Licht der Wellenlänge λ_p und die entarteten frequenzkonvertierten Photonen haben jeweils die Wellenlänge 2λ_p. Die Beschränkung auf entartete Photonen geschieht um der Argumentation willen und grenzt den Umfang der Erfindung keineswegs ein.

Die beiden Fälle sind in Bild 2 dargestellt. G⁽²⁾(x₁, z₁, t₁; x₂, z₂, t₂) ist die Wahrscheinlichkeit der Messung eines Photonenpaares an Raum-Zeit-Punkten (x₁, z₁, t₁) und (x₂, z₂, t₂). Für die Fluoreszenzanregung über einen Zweiphotonenprozeß sind wir an gleichen Ankunftszeiten interessiert, t₁ = t₂ = t, und da die Funktion G⁽²⁾(x₁, z₁, t; x₂, z₂, t) für eine monochromatische Lichtquelle zeitkonstant ist, verschwindet die Zeitvariable und uns bleibt G⁽²⁾(x₁, z₁; x₂, z₂).
Die Übertragungsfunktion vom Objekt zum Bild für ein lineares monochromatisches optisches System ist gegeben durch

wobei alle Felder dieselbe Polarisation haben. Hier sind E_o(x_o; ω) und E_i(x_i; ω) die skalaren elektrischen Felder in der Objekt- bzw. Bildebene, und h(x_i, x_o; ω) ist die Amplitudenpunktverwaschungsfunktion des Systems zwischen der Bild- und Objektebene.
Das in Bild 3 gezeigte optische System wird für die Fokussierung in beiden Fällen - der klassischen Anregung und der Anregung mit verschränkten Photonen - verwendet. Das Schema illustriert gemäß der Erfindung eine einfache Beleuchtungsanordnung mit einer nichtklassischen Lichtquelle in einer telezentrischen Ebene.
Für eine Ebene im Abstand z von der Brennebene lautet die Amplitudenpunktverwaschungsfunktion [6]

wobei

die Fourier- Transformierte der verallgemeinerten Pupillenfunktion

ist.
Hier ist λ die Wellenlänge des monochromatischen, skalaren elektrischen Feldes, f ist die Brennweite der Linse und d ist der Abstand zwischen der telezentrischen (Objekt-)Ebene und der Linse. In diesen Berechnungen wird die Pupillenfunktion der Linsenapertur p(x) als rechteckig und mit der Weite A angenommen. Es soll darauf hingewiesen werden, daß dies die Amplitudenpunktverwaschungsfunktion für ein eindimensionales optisches System (in transversaler Richtung) ist, deshalb wurde die Proportionalitätskonstante von

abgeändert.
Für die nächste Diskussion gehen wir von der folgenden Annahme über die Anordnung in Bild 2A (klassische Lichtquelle) aus:

- das Pumplicht ist eine monochromatische ebene Welle,
- Näherung dünner Linsen,
- Probe reagiert auf die Ankunft eines Photonenpaares nur an einem einzigen Raum-Zeit-Punkt.

Für die klassische Zweiphotonenanregung ist die Absorptionsrate der Probe (des Fluorophors) proportional zu G⁽²⁾(x_i, z; x_i, z) α I²(x_i, z).
Der axiale Verlauf der Anregung entlang der z-Achse, d. h. bei x_i = 0, ist gegeben durch

wobei

und der transversale Verlauf in der Brennebene (z = 0) ist gegeben durch
Die Menge

ist die normierte Länge in axialer Richtung, gemessen von der Brennebene, wobei z_c = 2λ_pF² _# und typischerweise f » z_c und V ≍ 1, so daß
Die Menge x'_i ist die normierte Länge x_i in der Bildebene, so daß

wobei x_c = 2λ_pF_# (siehe Bild 2). Hier ist F_# die Linsenanzahl F, definiert als

wobei f und A die Brennweite bzw. die Apertur der Linse und 2λ_p die Wellenlänge der Lichtquelle ist. Es sollte erwähnt werden, daß x_c und z_c die charakteristischen Längen in transversaler bzw. axialer Richtung sind. Die Breite des Anregungsverlaufs in transversaler und axialer Richtung ist proportional zu diesen Werten.
Für die Diskussion der Anregung durch verschränkte Photonen gehen wir von folgender Annahme der experimentellen Bedingungen der Anordnung im Bild 2B (nichtklassische Lichtquelle) aus:

- das Pumplicht ist eine monochromatische ebene Welle
- Näherung dünner Linsen
- Probe reagiert auf die Ankunft eines Photonenpaares nur an einem einzigen Raum-Zeit-Punkt
- Ein Spektralfilter sehr schmaler Bandbreite, dessen Mittenfrequenz mit der Frequenz der entarteten Photonen zusammenfällt, wird hinter dem Kristall angebracht, so daß nur entartete Photonen zur Anregung der Probe beitragen.

Für die Anregung durch verschränkte Photonen berechnen wir G⁽²⁾(x_i, z; x_i, z), der Einfachheit halber als G⁽²⁾(x_i, z) abgekürzt, als

ist eine Fresnelsche Zahl,

ist eine äquivalente Kristalldicke; l ist die Kristalldicke und n_o(2λ_p) ist die Brechzahl des ordentlichen Strahles im NLC für die entartete Wellenlänge. Da µ₁ « 1 und µ₂ « 1 für alle praktischen Werte von l und Abstände d, vereinfacht sich die Gleichung (7) zu g(α - β) = δ(α - β). Als Ergebnis der Gleichung (6) ist der axiale Verlauf der Anregung gegeben durch

was mit dem klassischen Fall in Gleichung (3) verglichen werden sollte. Der transversale Verlauf der Anregung ist gegeben durch

was mit Gleichung (5) verglichen werden sollte. Beachten Sie, daß für den axialen und für den transversalen Anregungsverlauf die Argumente das Zweifache und die Potenz der funktionalen Abhängigkeit die Hälfte derer der klassischen Ergebnisse betragen.
Bild 4 zeigt den normierten axialen Verlauf für die klassische Zweiphotonenanregung (durchgehende Linie) und Anregung durch verschränkte Photonen (punktierte Linie).
In Bild 5 sind die gleichen Kurven jeweils für den transversalen Verlauf dargestellt.
So wird gezeigt, daß das Fokussieren entarteter Photonen, die zum Beispiel durch den Frequenzkonversionsprozeß in einem nichtlinearen Kristall erzeugt wurden, die Größe (sowohl axial als auch transversal) des Verlaufs der Anregung um 31% im Vergleich zur klassischen Zweiphotonenanregung (d. h. 1/e Weite des verschränkten Photons = 0,69 1/e Weite der klassischen) verringert.
Ein weiteres wichtiges Merkmal für die dreidimensionale Abbildung ist die Möglichkeit der Herstellung optischer Schnitte, auch Tiefendiskriminierung genannt. Sie kann als Reaktion des Systems auf das Abtasten einer dünnen, lateral homogenen, fluoreszierenden Schicht durch den Fokus beschrieben werden. Im Unterschied zur klassischen Zweiphotonenanregung liefert die Anregung, die nichtklassisches Licht nutzt, keine optischen Schnitte.
Dies ist eine Folge der linearen Abhängigkeit des Absorptionsgrades vom Anregungsphotonenfluß. Durch Hinzufügung einer konfokalen Empfängereinheit analog zur Einphotonenanregung in einem CLSM kann die Tiefenunterscheidung erreicht werden. Das Verhalten ist

wobei 2λ_p und λ_f die Wellenlänge des Anregungslichtes und die Fluoreszenz sind bzw. I_c die Intensitäts-Punktverwaschungsfunktion für die konfokale Empfängeranordnung ist. Dieses Verhalten wäre zu vergleichen mit dem Verhalten im Falle der Zweiphotonenanregung mit einer nichtkonfokalen Empfängeranordnung

bzw. mit einer konfokalen Empfängeranordnung
Bild 6 zeigt diese Verläufe unter der vereinfachten Annahme, daß λ_p = λ_f. Es sollte beachtet werden, daß der Verlauf der nichtklassischen Anregung bei Wellenlänge 2λ_p mit konfokaler Empfängeranordnung gleich der Verteilung der Einphotonenanregung bei Wellenlänge λ_p in einem CLSM ist.
Zusammengefaßt verhält sich ein System, das als Anregung nichtklassisches Licht der Wellenfänge 2λ_p über eine Fokussierungsanordnung gemäß der hier beschriebenen Erfindung verwendet, hinsichtlich der Auflösung wie ein System mit Einphotonen- Fluoreszenzanregung der halben Wellenlänge (d. h. λ_p). Das erstgenannte System liefert eine höhere Auflösung als ein nichtkonfokales MPFM-System, das eine klassische Lichtquelle der Wellenlänge 2λ_p verwendet.
Nachstehend werden Vorzugskonfigurationen der Erfindung diskutiert.
In einer Vorzugskonfiguration, wie in Bild 7A schematisch dargestellt, ist die nichtklassische Lichtquelle Teil der Objektivlinse. Aufgrund der Bedingung der Phasenübereinstimmung im nichtlinearen Kristall hat ein veränderter Einfallswinkel des Pumplasers auf den Kristall einen unerwünschten Effekt auf die Eigenschaften der erzeugten Photonen. Deshalb kann solch eine Anordnung nur in Verbindung mit dem Objektscanning verwendet werden. In einer anderen Version, in Bild 7B dargestellt, befindet sich der nichtlineare Kristall außerhalb der Objektivlinse mit der Möglichkeit eines doppelten Durchgangs des Pumplichtes durch den Kristall, um die Leistung der nichtklassischen Lichtquelle zu erhöhen. Bei beiden Varianten muß der nichtlineare Kristall nahe der hinteren Brennebene der Objektivlinse angebracht werden, die auch die primäre telezentrische Ebene ist.
In Bild 7A beleuchtet das kollimierte Licht des Pumplasers L die Probe Sa und passiert dabei einen dichroitischen Strahlteiler MDB, eine Scanningoptik SO, die Mikroskoptubuslinse TL sowie ein speziell entwickeltes Objektiv für verschränkte Photonen EPO, das auf der rechten Seite im Detail dargestellt ist. Das EPO besteht aus einem lichtlinearen Kristall NLC in oder in der Nähe der Pupillenebene PP des Mikroskopobjektivs O, die mit der primären telezentrischen Ebene PTP der Beleuchtung zusammenfällt. Zwischen EPO und O befindet sich ein Filter HPF, der die Wellenlänge des Pumplasers ausblendet, längere Wellenlängen jedoch hindurchläßt (Frequenzkonversions-Anordnung, wie in der Literatur beschrieben). Die EPO-Elemente können günstigerweise in ein Objektivgehäuse eines herkömmlichen Standardmikroskopes eingebaut werden. Die in der Probe angeregte Fluoreszenz geht durch EPO, TL und SO hindurch, wird durch den Strahlteiler MDB reflektiert und mittels der Lochblendenoptik PO durch eine Lochblende PH hindurch auf den Detektor DE abgebildet.
Im Bild 7B ist im Unterschied zur Anordnung in Bild 7A die nichtlineare Optik NLC außerhalb des Gehäuses der Objektivlinse angebracht, das ankommende Licht wird durch einen Polarisations-Strahlteiler PBS oder einen dichroitischen Strahlteiler dorthin gelenkt. Die Rückseite des NLC ist reflektierend, so daß das Pumplicht und das frequenzkonvertierte Licht in Richtung PBS zurückreflektiert werden. Der PBS lenkt das Pumplicht zurück in Richtung des Lasers L und richtet das frequenzkonvertierte Licht, das rechtwinklig zum Pumplicht polarisiert wird, über das Objektiv O auf die Probe Sa. In dieser Anordnung befindet sich der Detektor auf der rechten Seite, und das von der Probe kommende fluoreszierende Licht wird durch den MDB reflektiert. Die in den Abb. 7A und B gezeigten Anordnungen sind für eine Probe bestimmt, die von einem Scanningtisch (nicht dargestellt) in mindestens zwei Richtungen bewegt wird (Objektscanning). Weiterhin kann das optische System bei beiden Anordnungen die Scanningoptik SO und die Tubuslinse TL beinhalten, wie in 7A gezeigt, oder auch nicht, wie in 7B gezeigt.
In Bild 7C wird das Pumplicht L und das frequenzkonvertierte Licht, nachdem es einmal durch den nichtlinearen Kristall NLC hindurchgegangen ist, durch einen sphärischen Spiegel M zurück in den nichtlinearen Kristall NLC fokussiert. Nach Passieren des PBS wird das frequenzkonvertierte Licht durch die Linse L kollimiert und zur Probe gelenkt, wie in Bild 7B beschrieben. Diese Konfiguration hat den Vorteil, daß die Lichtintensität L innerhalb des Kristalls aufgrund der Fokussierung viel höher ist, so daß eine Verstärkung der frequenzkonvertierten Photonen zur Erhöhung der Strahlungsleistung der Paare verschränkter Photonen ermöglicht wird.
Der Nachteil der Beschränkung auf das Objektscanning wird bei einer Konfiguration entsprechend Bild 8 vermieden, wo die Quelle der verschränkten Photonen in einer konjugierten telezentrischen Ebene des Mikroskops angebracht ist. Diese Anordnung der Quelle, wiederum unter der Annahme, daß korrelierte Photonen kollinear erzeugt werden, sichert ein beugungsbegrenztes Fokussieren des nichtklassischen Lichts. Ein Vorteil dieser Konfiguration besteht darin, daß mehr Platz für die Quelle zur Verfügung steht, so daß zum Beispiel mit der resonanzverstärkten Herstellung verschränkter Photonen gearbeitet werden kann. Bild 8 zeigt eine standardmäßige konfokale Scanninganordnung mit Laser L, XY-Scanner für zwei senkrecht zueinander stehende Abtastrichtungen, optisches Übertragungssystem RL, Übersichtsobjektiv SO, Tubuslinse TL, Objektiv O, Probe Sa, dichroitischem Strahlteiler MDB, Lochblendenoptik PO, Lochblende PH und Detektor DE. Hinter dem Laser befindet sich in einer telezentrischen Ebene des Beleuchtungsstrahlenganges eine nichtklassische Lichtquelle EPS (vorzugsweise basiert auf der Frequenzkonvertierung in einem nichtlinearen Kristall) mit Filter HPF zur Beseitigung des Pumplichts, sowie die telezentrische Optik CL1, CL2. Somit wird die Lichtquelle eines Standard-LSM ersetzt bzw. mit einer nichtklassischen Lichtquelle in einer telezentrischen Ebene des Beleuchtungsstrahlenganges kombiniert, womit man sich die Methode für die Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung, die in dieser Erfindung beschrieben ist, zunutze macht.
Wenn die nichtklassische Lichtquelle (d. h. verschränkte Photonen) in der Pupillenebene des Mikroskops angebracht wird, können die paarweisen Photonen voneinander getrennt und zueinander verzögert werden, wie in Bild 9 gezeigt, um spektroskopische Untersuchungen zu ermöglichen, wie sie bereits bekannt sind. Zum Beispiel kann die Trennung im nichtentarteten Fall, bei unterschiedlichen Wellenlängen der Photonen des Paares, durch Verwendung eines geeigneten dichroitischen Strahlteilers erreicht werden, wobei dessen Transmissionskante zwischen den Wellenlängen der verschränkten Photonen liegt. Unterscheiden sich die Photonen des Paares durch ihre Polarisation, können alternativ dazu Polarisations-Strahlteiler verwendet werden. Schließlich kann sogar bei nicht unterscheidbaren Photonen eines Paares eine unvollständige Trennung erreicht werden, und zwar durch Verwendung eines 50 : 50-Strahlteilers (die Hälfte der Paare pro Strahlteiler wird getrennt). Die Verzögerung kann durch Bewegen einer Verzögerungseinheit in einem Strang der Anordnung erreicht werden. Bild 9 zeigt teilweise die in Bild 8 beschriebene Anordnung, aber zwischen CL1 und CL2 befinden sich die Linsen CL3 und CL4 sowie ein dichroitischer Spiegel DC1, der die Photonen des Paars in die zwei verschiedenen Richtungen d1 und d2 lenkt. Die beiden Strahlen werden dann durch den Spiegel DC2 wieder zusammengeführt. M1 ist ein Ablenkspiegel für den Lichtstrahl d1.
Der Spiegel M2 lenkt den Lichtstrahl d2 auf einen Rückstrahler RR um, der zur Einstellung der Verzögerung in der Weglänge zwischen d1 und d2 verschoben werden kann. Referenzen [1] J. B. Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press, New York und London, 1995.
[2] T. Tanaka and S. Kawata, "Three-dimensional fabrication and three-dimensional observation by two-photon-absorption for micro-structure," Proc. SPIE, Band 3937, Seiten 92-96, 2000.
[3] Y. Kawata, H. Ishitobi und S. Kawata, "Use of two-photon absorption in a photorefractive crystal for three-dimensional optical memory," Opt. Lett., Band 23, Nr. 10, Seiten 756-758, 1998.
[4] M. C. Teich und B. E. A. Saleh, "Entangled-photon microscopy, spectroscopy, and imaging," U.S. Patent 5,796,477, August 1998.
[5] M. I. Kolobov, "The spatial behavior of nonclassical light," Reviews of Modern Physics, Band 71, Nr. 5, Seiten 1539-1589 (1999).
[6] J. W. Goodman, Introduction to Fourier Optics, Kapitel 6, McGraw-Hill, New York, 1968.
[7] B. E. A. Saleh und M. C. Teich, Fundamentals of Photonics, Kapitel 4, Wiley- Interscience, New York, 1991.

Claims

1. Methode und/oder Apparatur für mikroskopische Abbildung auf der Grundlage nichtlinearer Absorption von Licht, wobei korrelierte Paare N-facher Photonen, N = 2,3-n, wie Paare, Dreiergruppen, Vierergruppen usw. auf einen Punkt auf der Probe fokussiert werden.

2. Methode und/oder Apparatur für mikroskopische Abbildung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die N-fachen Photonen zeitlich und räumlich korreliert sind.

3. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die Lichtquelle verschränkte Photonen erzeugt.

4. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die Lichtquelle gequetschte Photonen erzeugt.

5. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die mikroskopische Anordnung aus einem Laserscanning-Mikroskop mit Objekt- oder Strahlrasterung besteht.

6. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der sich eine Quelle nichtklassisch erzeugter, kollinear emittierter Photonen in oder nahe einer telezentrischen Ebene des Beleuchtungsstrahlenganges des Mikroskops befindet.

7. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, wobei es sich bei der Absorption um eine Mehrphotonenabsorption handelt, die die Absorption von mindestens zwei Photonen pro Molekül des anzuregenden Fluorophors umfaßt.

8. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche zur Anwendung in der Lithographie, bei der die Mehrphotonenabsorption in einem Photoresist stattfindet und die Struktur des Materials verändert.

9. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die Mehrphotonenabsorption zum Beschreiben eines optischen Speichers angewandt wird.

10. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die Lichtquelle mindestens aus einem nichtlinearen Kristall besteht, in dem eine Frequenzkonversion von gepumpten Photonen in verschränkte Photonen stattfindet.

11. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der Mehrfachdurchgänge durch den/die Kristalle genutzt werden.

12. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der eine Verstärkung der Paare genutzt wird.

13. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der die Verstärkung der beim ersten Durchgang durch den Kristall erzeugten Paare durch Fokussieren des Strahls auf den zweiten Durchgang durch den Kristall erfolgt.

14. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der sich eine Quelle nichtklassisch erzeugter, kollinear emittierter Photonen in oder nahe der Pupillenebene der Objektivlinse, die auf die Probe abbildet, befindet.

15. Methode und/oder Apparatur gemäß Anspruch 14, bei der diese Ebene mit der primären telezentrischen Ebene des Beleuchtungsstrahlenganges zusammenfällt.

16. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der sich die Lichtquelle innerhalb des Gehäuses der Objektivlinsen befindet.

17. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der sich die Lichtquelle in einer anderen telezentrischen Ebene als der primären telezentrischen Ebene befindet.

18. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der sich die Lichtquelle in einer telezentrischen Ebene vor den optischen Elementen, die für das Abrastern der Probe durch den Strahl zuständig sind, befindet.

19. Methode und/oder Apparatur für die spektroskopische Untersuchung von Proben mit hoher räumlicher Auflösung, vorzugsweise gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, auf der Grundlage der Fluoreszenzanregung durch nichtklassisches Licht, bei der sich eine Quelle nichtklassisch erzeugter, kollinear emittierter Photonen in oder nahe einer telezentrischen Ebene des Beleuchtungsstrahlenganges befindet.

20. Methode und/oder Apparatur gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, bei der sich hinter der Quelle nichtklassischen Lichts, innerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges, ein Element zur Trennung der paarweisen Photonen, ein Element zur optischen Verzögerung der Photonen des Paares zueinander und ein Element zur erneuten Zusammenführung der Photonen des Paares nach der Verzögerung befinden.