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Die Erfindung betrifft eine Optische Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen mittels nichtklassischem Licht. Das Anwendungsgebiet liegt im Bereich der Fluoreszenzmikroskopie und Multiphotonenabsorptionsanalyse. Dies ist zum Beispiel für die mikroskopische Untersuchung von biochemischen Proben in den Lebenswissenschaften und der Medizin von großer Bedeutung, aber auch für chemisch-materialanalytische Untersuchungen von Stoffen.
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Dabei erfolgt die Anregung und Detektion von Fluoreszenzlicht mittels Multi-, insbesondere Zweiphotonenabsorption von Multiphotonen-Zuständen bzw. Photonenpaaren für Anwendungen, die analog zur Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden können.
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Es existieren bereits verschiedene Lösungsansätze, die aber alle mit prinzipiellen Nachteilen behaftet sind. Diese bereits bekannten Lösungen lassen sich prinzipiell in drei Kategorien einteilen:
- a. Zweiphotonenfluoreszenzmikroskpie mit klassischem Licht, wie sie in US 5,503,613 B und US 6,020591 B offenbart sind. Dabei wird die Zweiphotonenabsorption mittels Dauerstrichlaser mit sehr hoher Intensität oder mit gepulsten Lasern mit Pulsen im Pico- oder Femtosekundenbereich realisiert. Die Zweiphotonenabsorptionswahrscheinlichkeit und somit auch die Fluoreszenzintensität hängen dabei quadratisch von der momentanen Anregungsintensität ab. Die anregende Laserstrahlung wird zur Verbesserung der Absorptionswahrscheinlichkeit fokussiert. In der klassischen Zweiphotonenfluoreszenzmikroskopie wird der Fokus axial entlang der optischen Achse des Systems ausgebildet. Nur im Fokus können Fluoreszenzmoleküle per Zweiphotonenabsorption angeregt werden und somit Fluoreszenz zeigen. Es wird jedoch der gesamte Probenbereich entlang der optischen Achse mit einer hohen Strahlungsdosis und entsprechend hoher Energie beaufschlagt. Dies führt sowohl zum Ausbleichen der Fluoreszenz, als auch zu Phototoxizität, besonders bei biologischen Proben.
- b. Eine alternative Lösung ist der Zweiphotonen-Lichtblattmodus. Hierbei ist der Fokus der Anregungsstrahlung als Ebene - Lichtblatt genannt - senkrecht zur Beobachtungsrichtung ausgebildet. Dazu wird durch ein geeignetes optisches System die zu untersuchende Probe lateral durchleuchtet. Das Lichtblatt kann durch einen Linienfokus, eine Linienabbildung oder einen lateral scannenden Laserstrahl gebildet werden. Nur in diesem Lichtblatt können Fluoreszenzmoleküle per Zweiphotonenabsorption angeregt werden und somit Fluoreszenz zeigen. Nachteil der Methode ist die Notwendigkeit der Beleuchtung mit sehr intensitätsstarken Dauerstrichlasern oder Lasersystemen für ultrakurze Laserpulse. In beiden Fällen wird die Probe mit Laserstrahlung hoher Intensität oder gar von Laserpulsen durchstrahlt und einer hohen Bestrahlungsdosis mit hoher Energie ausgesetzt. Dies führt sowohl zum Ausbleichen der Fluoreszenz, als auch zu Phototoxizität, besonders bei biologischen Proben. Auch hier hängt die Zweiphotonenabsorptionswahrscheinlichkeit und somit auch die Fluoreszenzintensität quadratisch von der momentanen Anregungsintensität ab.
- c. Möglichkeiten zur Photonenpaarfluoreszenzmikroskopie sind auch aus US 5,796,477 B bekannt. Dabei wird die Zweiphotonenabsorption nicht durch intensitätsstarke oder gepulste Laser angeregt, sondern durch Photonenpaare aus zwei korrelierten (in Raum, Zeit, Impuls und/oder Energie) Photonen. Diese können insbesondere durch spontane Differenzfrequenzkonvertierung in einem nichtlinearen Kristall außerhalb der Probe generiert werden. Die beiden Photonen können bei ihrer Bewegung von der Photonenpaarquelle zur jeweiligen Probe voneinander räumlich getrennt werden. Haben sie eine unterschiedliche Wellenlänge kann dies mit einem dichroitischen Spiegel erreicht werden. Weisen sie entgegengesetzte Polarisation auf, können sie durch einen Polarisationsstrahlteiler räumlich getrennt werden. Es ist aber ebenso möglich, dass beide Photonen einen Kristall mit nichtlinearen optischen Eigenschaften räumlich separiert verlassen und damit bereits räumlich getrennt sind. Anschließend werden die beiden Photonenstrahlen überkreuzend in die Probe fokussiert. Im Überlappbereich der im Fokus aufeinander treffenden Photonen kann dann die Zweiphotonenabsorption stattfinden. In diesem Szenario sind die Zweiphotonenabsorption und damit die Fluoreszenzintensität linear proportional zur momentanen Anregungsintensität. Ein weiterer Vorteil ist, dass das fokale Volumen gegenüber dem in a. beschriebenen Verfahren kleiner sein kann. Nachteilig an diesem Verfahren ist der komplexe experimentelle Aufbau, da sichergestellt sein muss, dass beide Photonen eines Paares exakt zur gleichen Zeit im Strahlüberlappvolumen ankommen und innerhalb der Probe aufeinandertreffen. Dies kann durch die sehr kurze Kohärenzzeit und möglicherweise unterschiedlicher aber korrelierter Wellenlänge der beiden Photonen erschwert sein. Daher ist eine sehr genaue Justage, die zu Lasten der Flexibilität und Praktikabilität geht, erforderlich.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten für die Fluoreszenzmikroskopie anzugeben, mit denen der lokale Energieeintrag bei der Fluoreszenzanregung reduziert werden kann und bei denen ein einfacher optischer Aufbau mit reduziertem Justageaufwand einsetzbar ist.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer optischen Anordnung, die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist, gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung können mit in untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen realisiert werden.
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Bei der erfindungsgemäßen Anordnung ist von einer Strahlungsquelle elektromagnetische Strahlung auf eine biologische Probe zur Ausbildung eines ein- oder zweidimensionalen Lichtblatts gerichtet. In der Probe ist mindestens ein Fluorophor enthalten. Dabei ist die elektromagnetische Strahlung mit mindestens zwei Wellenlängen so ausgewählt, dass sie das/die Fluorophor(e) photoaktiviert oder photodeaktiviert, abhängig von der Wellenlänge der elektomagnetischen Strahlung. Bei einer Photoaktivierung wird/werden das/die Fluorophor(e) von einem nicht zur Fluoreszenz anregbaren Zustand (dark state) in einen zur Fluoreszenz anregbaren Zustand (bright state) durch Beleuchtung mit elektromagnetischer Strahlung einer bestimmten Wellenlänge und anschließend photodeaktiviert, in dem das/die Fluorophor(e) von einem zur Fluoreszenz anregbaren Zustand (bright state) in einen nicht zur Fluoreszenz anregbaren Zustand (dark state) durch Beleuchtung mit elektromagnetischer Strahlung einer anderen bestimmten Wellenlänge innerhalb des Lichtblatts gebracht.
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Von einer Quelle nichtklassischen Lichtes ist/sind ein oder mehrere Multiphotonenstrahl(en), aber mindestens ein oder zwei Photonenpaarstrahl(en), auf ein erstes optisches System bestehend aus einer Anordnung aus mindestens einer optischen Linse oder einem Photonen reflektierenden Element oder einem polarisierenden optischen Element, oder einem optischen Filter oder einer Kombination dieser gerichtet. Vom ersten optischen System ist/sind der/die Multiphotonenstrahl(en) auf eine Probe im Bereich des Lichtblatts gerichtet, so dass mit den mehreren gleichzeitig auf/in der Probe auftreffenden Mehrphotonenzuständen Fluoreszenzstrahlung des Fluorophors oder der Fluorophore mittels Mehrphotonenabsorption angeregt wird.
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Fluoreszenz wird also erst dann angeregt, wenn fluoreszenzaktivierende elektromagnetische Strahlung und ein Multiphotonenstrahl gleichzeitig auf eine Position einer Probe auftreffen.
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Durch Anregung erhaltene Fluoreszenzstrahlung trifft mittels eines zweiten optischen Systems auf ein Detektionssystem auf, das zur ortsaufgelösten Erfassung von Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist.
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Das hier vorgeschlagene Verfahren beruht auf der Nutzung einer vorzugsweise kollinearen Quelle von der insbesondere Photonenpaare oder aber auch Mehrphotonenzustände gleichzeitig auf eine Probe emittiert werden und dabei das Prinzip der Lichtblattmikroskopie anwendbar ist sowie einer zusätzlichen Ausbildung eines Lichtblatts mit elektromagnetischer Strahlung im Bereich der Probe. Dabei kann ein Lichtblatt eindimensional als Linie oder auch zweidimensional als eine bestrahlte Fläche ausgebildet werden. Hierbei verhindert die Photoaktivierung und -deaktivierung der Fluorophore, dass Fluoreszenz außerhalb des Lichtblattbereiches der Multiphotonenstrahlen angeregt wird.
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Eine Quelle nicht klassischen Lichts emittiert Multiphotonenstrahlen, aber mindestens ein oder zwei Photonenpaarstrahlen von insbesondere Photonenpaaren oder aber auch Mehrphotonenzuständen, bevorzugt in kollinearer Geometrie in den Bereich des ausgebildeten Lichtblatts. Dies kann durch spontane Differenzfrequenzkonvertierung/spontane parametrische Fluoreszenz in einem nichtlinearen, auch periodisch gepolten optischen Kristall oder einer Wellenleiterstruktur in einem nichtlinearen Kristall geschehen. Der/die Multiphotonenstrahl(en) gelangt/gelangen durch ein erstes optisches System auf eine Probe, so dass Fluoreszenz der Fluorophore angeregt werden kann, die mit dem Detektionssystem ortsausgelöst erfasst und dann ausgewertet werden kann.
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Das Lichtblatt oder die lichtblattartige Form kann dabei als zeitlich konstanter Linienfokus aber auch als in der Lichtblattebene gescannter Lichtstrahl ausgebildet sein oder durch die zeitliche Abfolge kleiner Teillichtblätter zusammensetzen. Ein dazu geeignetes erstes optisches System kann eine optische Linse oder ein die elektromagnetische Strahlung reflektierendes optisches Element sein. Die Ausbildung eines Lichtblatts kann beispielsweise durch eine Bewegung mindestens eines optischen Elements oder eines optischen Elements, das die Strahlquerschnittsfläche der elektromagnetischen Strahlung vergrö-ßert, auf das die von der Strahlungsquelle emittierte elektromagnetische Strahlung gerichtet ist, erfolgen.
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Von der Strahlungsquelle sollte Strahlung mit einer Wellenlänge, die für das jeweils eingesetzte Fluorophor zur Photoaktivierung und -deaktivierung spezifisch ist, emittiert werden. Die Strahlungsquelle kann insbesondere eine oder mehrere Laserstrahlquellen sein. Außerdem kann die lichtblattformende Quelle auch eine optische Linse oder eine Photonen reflektierendes Element oder eine Polarisationsoptik oder ein optischer Filter oder eine beliebige Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente enthalten.
Als Fluorophor kann man beispielsweise autofluoreszierende Moleküle oder molekulare Fluoreszenzmarker, wie z.B. Green Fluorescence Protein (GFP) oder DAPI einsetzen.
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Ein erstes optisches System kann eine optische Linse oder eine Photonen reflektierendes Element oder eine Polarisationsoptik oder ein optischer Filter oder eine beliebige Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente sein.
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Nur im vom Lichtblatt oder der lichtblattartigen Form durchleuchteten Bereich der Probe mit der photoaktivierenden Wellenlänge ist eine gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen, insbesondere von Photonenpaaren und damit Fluoreszenzanregung möglich. Ein Teil der Fluoreszenzstrahlung wird unter optionaler Verwendung eines zweiten optischen Systems auf ein Detektionssystem treffen und dort detektiert werden. Das zweite optische System kann eine optische Linse oder ein Fluoreszenzstrahlung reflektierendes Element oder eine Polarisationsoptik oder ein optischer Filter oder eine beliebige Anordnung mehrerer dieser optischen Elemente sein. Ein Detektorsystem sollte eine ortsaufgelöste Messung der Fluoreszenzstrahlung, die innerhalb des Lichtblatts angeregt worden ist, ermöglichen. Das Detektorsystem kann eine Kamera mit genügender Empfindlichkeit sein. Beispiele dafür sind eine CCD, EMCCD, ICCD, CMOS-Kamera, SPAD-Array. Es kann ein optischer Filter oder ein zweites optisches System enthalten. Das zweite optische System sowie das Detektionssystem können auch als Einheit ausgeführt sein.
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Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Variante können auch mehrere Photonenstrahlen genutzt werden, so dass in mehreren Lichtblättern oder in Bereichen mit lichtblattartiger Form an der Probe gleichzeitig Fluoreszenz angeregt werden kann. Die Anregung der Fluoreszenz kann explizit auch über Multiphotonenabsorption von Mehrphotonenzuständen, insbesondere von Photonenpaaren, die gleichzeitig auf eine Probe auftreffen, geschehen. Derartige Multiphotonenzustände können z.B. durch sogenannte N00N states realisiert werden, wobei dann eine N-Photonenabsorption stattfindet.
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Eine Quelle nichtklassischen Lichtes kann beispielsweise ein von einem Laser gepumpter nichtlinearer Kristall oder ein von einem Laser gepumpter nichtlinearer Kristall oder Wellenleiterstruktur in einem nichtlinearen Kristall, oder mindestens zwei identische kohärent gepumpte Quantenpunkte sein.
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Eine abgewandelte Variante besteht darin, dass der Photonenpaarstrahl in zwei Teilstrahlen aufgespalten wird, was z.B. durch einen dichroitischen Spiegel oder einen Polarisationsstrahlteiler erreicht werden kann. Die Teilstrahlen werden getrennt und dann durch jeweils ein erstes optisches System, das insbesondere als eine Anordnung aus Linsen und oder Spiegeln ist, sich kreuzend in/auf die Probe gerichtet. Außerdem können auch mehrere Photonenpaarstrahlen genutzt werden, so dass an mehreren Positionen gleichzeitig Fluoreszenz angeregt werden kann. Es ist auch möglich, diese Photonenpaarstrahlen zu kombinieren, um einen einzigen Photonenpaarstrahl zu erhalten und punktweise Fluoreszenz anzuregen. Bei einer weiteren Ausbildungsform kann im Gegensatz zur punktweisen Bildgebung, wie sie bisher beschrieben worden ist, ein zweidimensionaler Bereich, in dem an jedem Punkt Photonenpaare entstehen können, auf die Probe im vom Lichtblatt oder einem lichtblattartigen Bereich durchleuchteten Bereich abzubilden und somit in diesem Bereich Zweiphotonenabsorption und damit Fluoreszenz zu generieren. Dies kann z.B. durch die Abbildung der Oberfläche eines nichtlinearen Kristalls, in welchem die Photonenpaare erzeugt werden, auf die Probe geschehen.
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Die erfindungsgemäße Lösung hat gegenüber dem Stand der Technik für Fluoreszenzmikroskopie mittels Multiphotonenabsoprtion einige Vorteile. Da die Fluoreszenzintensität linear mit der momentanen Beleuchtungsintensität skaliert, kann die Bestrahlungsdosis der Probe bei gleichbleibender Signalausbeute reduziert werden oder Signalstärke und Bildkontrast der mit dem Detektionssystem erfassten Fluoreszenzstrahlung bei gleichbleibender Bestrahlungsdosis gesteigert werden. Das Verfahren ist damit maximal schonend, ohne unnötige Lichtbelastung der Probe und erlaubt somit Langzeitstudien von photosensitiven Proben, da sowohl Fluoreszenzbleaching als auch Phototoxizität minimiert werden können. Im Gegensatz zur Photonenpaarfluoreszenzmikroskopie ist der Aufbau deutlich vereinfacht und robuster gestaltet, so dass eine Kostenreduktion und Verbesserung der axialen Auflösung erreicht werden kann. Der kollineare Aufbau ist kompatibel und mit bestehenden Lichtblatt- und Fluoreszenz-Mikroskopsystemen implementierbar. Außerdem kann Photonenpaarstrahlung mit Photonen einer bestimmten Mittenwellenlänge zu fokalen Volumina fokussiert werden, welche sonst nur mit Laserlicht der halben Wellenlänge erreichbar sind. Damit kann die Auflösung der erfassbaren Fluoreszenzstrahlung innerhalb des jeweiligen Lichtblatts, in dem die Photoaktivierung erfolgt, erhöht werden. Insgesamt sind eine erhöhte Effizienz, erhöhte Ortsauflösung und erhöhte Eindringtiefe möglich. Ebenso ist der lineare Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und Photonenstrahlintensität von Vorteil für die Datenauswertung, da ein linearer Zusammenhang zwischen Messgröße (Fluoreszenzsignal) und Anregungsgröße (Strahlungsdosis) vorliegt.
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Nachfolgend soll die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert werden.
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Dabei zeigt:
- 1 in schematischer Form ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Anordnung.
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In 1 ist gezeigt, wie ein Photonenpaarstrahl 2 von einer kollinearen Quelle 1 nicht klassischen Lichts auf ein erstes optisches System 3 gerichtet ist. Das erste optische System 3 kann, wie in den Ansprüchen definiert ausgebildet sein.
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Der mit dem ersten optischen System 3 beeinflusste Photonenpaarstrahl 2 wird so auf/in die Probe 4 gerichtet, dass er im Bereich eines Lichtblatts auf die Probe 4 auftrifft oder in die Probe 4 eintritt. Die Ausbildung eines Lichtblatts erfolgt mittels einer Strahlungsquelle 5, von der elektromagnetische Strahlung 6 auf die Probe 4 gerichtet ist. Die biologische Probe ist eine Fluoreszenzprobe, die mindestens ein Fluorophor enthält. Die elektromagnetische Strahlung 6 weist eine Wellenlänge zur Photoktivierung des Fluorophors oder der Fluorophore auf und kann nach der Fluoreszenzaufnahme eine zweite Wellenlänge aussenden, um die Fluoreszenz zu photodeaktivieren. Eine Fluoreszenzanregung des Fluorophors tritt auf, wenn mehrere Photonen von Quelle 1 gleichzeitig auf die Probe 4 auftreffen bzw. in die Probe 4 eindringen. Allein mit der Ausbildung eines Lichtblatts werden die Fluorophore innerhalb des Lichtblatts photoaktiviert bzw. nach Fluoreszenzbildaufnahme photodeaktiviert.
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Die Veränderung der Position an der Photonen die Probe 4 erreichen, kann durch eine Bewegung eines die Photonen reflektierenden Elements, insbesondere mittels einer Schwenkbewegung um eine Rotationsachse eines reflektierenden Elements erreicht werden.
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Mit auf die Probe 4 auftreffenden oder in die Probe 4 eintretenden Photonenpaaren wird eine Anregung von Fluoreszenzstrahlung 7 innerhalb des Lichtblatts erreicht.
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Die generierte Fluoreszenzstrahlung 7 trifft auf ein zweites optisches System 8 auf, das ebenfalls so ausgebildet ist, wie in den Ansprüchen definiert. Mit dem Detektorsystem 9 erfolgt eine ortsaufgelöste Erfassung von Fluoreszenzstrahlung, die fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet werden kann.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 5503613 [0003]
- US 6020591 [0003]
- US 5796477 [0003]
