DE102007048135B4

DE102007048135B4 - Fluoreszenzlichtmikroskopisches Messen einer Probe mit rotverschobenen Stokes-Linien

Info

Publication number: DE102007048135B4
Application number: DE102007048135A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Hell Stefan W.; Brian RANKIN; Dr. Kellner Robert; Jaydev JETHWA; Thorsten STAUDT
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2007-10-05
Publication date: 2012-02-16
Anticipated expiration: 2027-10-06
Also published as: WO2009047189A3; US20100187438A1; WO2009047189A2; JP2011503525A; EP2195612A2; DE102007048135A1; US8039815B2

Abstract

Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe, – wobei ein Fluoreszenzfarbstoff in der Probe mit Licht einer bestimmter Wellenlänge von einem Zustand in einen anderen Zustand überführt wird, – wobei Licht einer anderen Wellenlänge mit einer solchen Mindestintensität in eine Lichtleiterfaser eingekoppelt wird, dass aufgrund eines nichtlinearen Effekts ein Lichtspektrum mit gegenüber der anderen Wellenlänge verschobenen Wellenlängen aus der Lichtleiterfaser austritt, und – wobei das Licht mit der bestimmten Wellenlänge aus dem Lichtspektrum ausgesondert wird, und – wobei Fluoreszenzlicht von der Probe ortsauflösend gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) derart ausgewählt wird und dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser (13) eingekoppelt wird, dass in der Lichtleiterfaser (13) Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum (17) neben einer Linie (18) der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linie (19 bis 28) aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der er ihr im Blauen benachbarten Linie (18 bis 28) des Lichtspektrums (17) ist, und dass die bestimmte Wellenlänge aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien (19 bis 28) ausgewählt wird.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 sowie auf ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 16.
STAND DER TECHNIK
In der Fluoreszenzlichtmikroskopie wird Licht verschiedener Wellenlängen benötigt, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe zur Fluoreszenz anzuregen, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe gezielt wieder abzuregen (zum Beispiel in der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie), um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe gezielt in einen Dunkelzustand zu überführen (zum Beispiel in der GSD-Fluoreszenzlichtmikroskopie) oder um denselben Farbstoff in einander überdeckenden, aber unterschiedlichen räumlichen Bereichen einerseits zur Fluoreszenz anzuregen und andererseits durch stimulierte Emission wieder abzuregen oder in einen Dunkelzustand zu überführen. Um diese Anforderungen zu erfüllen, können mehrere verschiedene monochromatische Lichtquellen eingesetzt werden, um das Licht mit den unterschiedlichen Wellenlängen bereitzustellen. Weil es sich bei den hierfür geeigneten monochromatischen Lichtquellen in aller Regel um Laser hoher Qualität handelt, da das Licht in Pulsen hoher Intensität benötigt wird, sind entsprechend aufgebaute Fluoreszenzlichtmikroskope sehr kostspielig. Für einige Wellenlängen ist es auch grundsätzlich schwierig geeignete Laser ausreichender Qualität zu finden.
Unter anderem aus der DE 10 2005 020 003 A1 ist es bekannt, einen Gaslaser als Lichtquelle bei der Fluoreszenzlichtmikroskopie einzusetzen, der mehrere nutzbare Emissionslinien aufweist oder zumindest auf mehrere Emissionslinien abstimmbar ist. Gaslaser sind jedoch kostspielig in der Anschaffung und aufwändig im Betrieb. Zudem decken die bei einem Gaslaser nutzbaren Emissionslinien allenfalls einen kleinen Spektralbereich soweit ab, dass alle in diesen Spektralbereich fallenden Absorptionslinien möglicher Fluoreszenzfarbstoffe mit gutem Wirkungsquerschnitt angesprochen werden können.
Aus dem US-Patent 6,710,918 ist ein Fluoreszenzlichtmikroskop bekannt, bei dem Licht einer bestimmten Wellenlänge zum Überführen eines Fluoreszenzfarbstoffs in einer Probe von einem Zustand in einen anderen Zustand dadurch bereitgestellt wird, dass Licht einer anderen Wellenlänge von einem Laser, insbesondere einem modengekoppelten Titanium-Saphir-Laser, der bei 800 nm Wellenlänge emittiert, in ein optisches Element eingekoppelt wird, das die Intensität des eingekoppelten Lichts einer Wellenlänge auf ein kontinuierliches Spektrum verteilt, welches kleinere und größere Wellenlängen als das eingekoppelte Licht aufweist und welches als Superkontinuum bezeichnet wird. Das optische Element kann dabei zum Beispiel eine sich über eine Länge von 30 mm bis 90 mm im Querschnitt stark verjüngende Lichtleiterfaser sein (eine sogenannte ”tapered Fiber”), die eine Gesamtlänge von 1 m aufweist, oder eine mikrostrukturierte optische Faser mit photonischer Bandlücke (”photonic Band Gap”), die auch als photonische Kristallfaser (”photonic Crystal Fiber”) bezeichnet wird. Bei einer photonic Crystal Fiber wird die photonische Bandlücke durch eine bienenwabenartige Mikrostruktur um einen sehr kleinen Faserkern von nur etwa 2 μm Durchmesser erzeugt. Die typische Länge einer photonic Crystal Fiber (PCF) beträgt 38 cm. Eine spektrale Verteilung in Form eines Superkontinuums ermöglicht es zwar, Licht jeder beliebigen Wellenlänge für das Überführen eines Fluoreszenzfarbstoffs von einem Zustand in einen anderen aus dem Superkontinuum zu selektieren. Die bei jeder einzelnen Wellenlänge des Superkontinuums zur Verfügung stehende Lichtleistung ist jedoch gegenüber der Ausgangsleistung des anregenden Lasers extrem reduziert. Zudem ist ein erheblicher Aufwand erforderlich, um ein Superkontinuum mit einer zumindest annähernd homogenen Intensitätsverteilung und insbesondere einer zeitlich stabilen Intensitätsverteilung bereitzustellen. So hat die Entwicklung entsprechender Fluoreszenzlichtmikroskope von der Patentanmeldung der Idee bis zu kommerziellen Produkten mehr als fünf Jahre gedauert. Zudem sind die entsprechenden Fluoreszenzlichtmikroskope kostspielig, was unter anderem an dem Titan-Saphir-Laser mit der notwendigen Ausgangsleistung und den im kommerziellen Produkt eingesetzten PCF liegt.
Aus der DE 103 47 712 A1 ist eine Lichtquelle für die Fluoreszenzmikroskopie, einschließlich der STED-Mikroskopie, bekannt, bei der die Wellenlänge mittels einer photonischen Faser oder eines optisch-parametrischen Oszillators (OPO) beeinflusst werden kann. Bei einem OPO wird die gewünschte Wellenlänge durch einen nicht linear-optischen 3-Wellen-Frequenzkonversionsprozess generiert, bei dem die eingestrahlte Frequenz der Pumpwelle in zwei Frequenzen (Signal und Idler) aufgespalten wird.
Aus der DE 100 12 881 A1 ist eine Raman-Verstärkeranordnung auf Basis einer Standard-Einmodenfaser bekannt, bei der mittels stimulierter Raman-Streuung eines leistungsstarken optischen Pumpsignals Stokeswellen erzeugt werden, um ein einlaufendes optisches Signal zu verstärken.
In der EP 1 662 296 A1 wird eine Vorrichtung beschrieben, mit der einfallendes Licht basierend auf Dispersions- und Polarisations-Effekten spektral aufgespalten wird. Diese Vorrichtung wird auch als Lichtquelle zur Anwendung in der STED-Mikroskopie vorgeschlagen, wobei von einem einfallenden Laserstrahl Licht einer solchen Wellenlänge abgetrennt wird, die der Wellenlänge des interessierenden Fluoreszenzlichts von einer Probe genau entspricht, so dass dieses Licht zur Abregung durch stimulierte Emission besonders geeignet ist, während das verbleibende Licht des Laserstrahls als Anregungslicht verwendet wird.
Aus der WO 03/016781 A2 ist eine Vorrichtung zur Erzeugung von Licht in einem gewünschten Wellenlängenbereich bekannt, mit der die Anregung einer Probe in einem noch kleineren Bereich als bei der STED-Mikroskopie möglich sein soll. Dabei basiert die Lichtemission der Vorrichtung auf photoinduzierter Anregung von Oberflächenplasmonen einer Metallschicht.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 16 aufzuzeigen, bei denen ohne großen und kostspieligen Aufwand und ohne Stabilitätsprobleme Licht unterschiedlicher Wellenlängen zur Verfügung steht, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe von einem Zustand in einen anderen Zustand zu überführen.
LÖSUNG
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 16 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 15 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des neuen Verfahrens, während die abhängigen Patentansprüche 17 bis 30 auf bevorzugte Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops gerichtet sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem neuen Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe wird die Lichtleiterfaser derart ausgewählt und wird das Licht mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser eingekoppelt, dass in der Lichtleiterfaser Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum neben einer Linie der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der er ihr im Blauen benachbarten Linie des Lichtspektrums ist; und die bestimmte Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs wird aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien ausgewählt.
Bei dem neuen Verfahren wird der Effekt der stimulierten Raman-Streuung in einer Lichtleiterfaser ausgenutzt, der bei auf die Länge der Lichtleiterfaser abgestimmter Intensität des eingekoppelten Lichts zur Ausbildung rotverschobener Stokes-Linien neben der Linie des eingekoppelten Lichts führt. Mindestens wird bei dem neuen Verfahren eine solche Stokes-Linie erzeugt, wobei die Anzahl der Stokes-Linien mit zunehmender Intensität des eingekoppelten Lichts und zunehmender Länge der Lichtleiterfaser ansteigt. Die Stokes-Linien mit den größten Wellenlängen, das heißt die am weitesten rotverschobenen Stokes-Linien sind zwar weniger scharf ausgebildet. Selbst die am weitesten rotverschobene Stokes-Linie weist aber in eine so geringe Halbwertsbreite auf, dass sie über einen kleinen Wellenlängenbereich von wenigen Nanometern einen hohen prozentualen Anteil der Intensität des eingekoppelten Lichts umfasst. Die zwischen dieser am weitesten rotverschobenen Stokes-Linie und der Linie des eingekoppelten Lichts liegenden weiteren Stokes-Linien sind schärfer. Jede von ihnen erfüllt das oben angegebene Kriterium in Bezug auf Ihre Halbwertsbreite, und weist über ein Band von wenigen Nanometern stehen einige Prozent der Intensität des eingekoppelten Lichts zur Verfügung. Dabei liegt der Abstand der rotverschobenen Stokes-Linien untereinander bzw. zu der Linie des eingekoppelten Lichts bei 10–20 nm, typischerweise bei 12–15 nm, wenn die Wellenlänge des eingekoppelten Lichts bei etwa 500 nm liegt. Der genaue Wert hängt von dem Material und Aufbau der Lichtleiterfaser sowie der Wellenlänge des eingekoppelten Lichts ab. Die Stokes-Linien liegen damit so dicht nebeneinander, dass jeder Fluoreszenzfarbstoff, dessen relevante Absorptionslinie zwischen die Wellenlänge des eingekoppelten Lichts und die Wellenlänge der am stärksten rotverschobenen Stokes-Linie fällt, mit einer oder sogar mehreren der Stokes-Linien bedient werden kann. Hierfür steht über einem kleinen Wellenlängenbereich innerhalb der Halbwertsbreite der Stokes-Linien, das heißt gut diskriminierbar, ein großer Anteil der Intensität des eingekoppelten Lichts stabil zur Verfügung, wobei die Lage der Stokes-Linien und ihr relativer Intensitätsanteil an dem Lichtspektrum stabil ist, ohne dass hierfür besondere Maßnahmen getroffen werden müssten. Vorteile des neuen Verfahrens sind aber nicht erst vorhanden, wenn im Lichtspektrum, das aus der Lichtleiterfaser austritt, mehrere Stokes-Linien vorliegen. Bereits eine einzige Stokes-Linie neben der Linie des eingekoppelten Lichts verdoppelt die Verwendungsmöglichkeiten von Licht aus dem austretenden Lichtspektrum.
Dass sich mittels stimulierter Raman-Streuung in einer Single Mode Faser rotverschobene Stokes-Linien in regelmäßigen Abständen erzeugen lassen, ist grundsätzlich bekannt. Eine Übersicht über die Effekte stimulierter Raman-Streuung ist zum Beispiel zu finden bei Agrawal, Ch. 8: Stimulated Raman Scattering (Agrawal, Govind P., Nonlinear Fiber Optics, 2. ed., San Diego, Calif., 1995). Trotz dieses seit Jahrzehnten bekannten Effekts ist bislang keine Anwendung auf dem Gebiet der Fluoreszenzlichtmikroskopie erfolgt. Stattdessen sind, wie eingangs berichtet, mit großem Aufwand Fluoreszenzlichtmikroskope entwickelt worden, bei denen ein Lichtspektrum mit einem Superkontinuum erzeugt wird. Diesem Stand der Technik gegenüber weist das neue Verfahren jedoch erhebliche Vorteile auf, indem es bei den Wellenlängen jeder Stokes-Linie eine viel höhere Lichtintensität bereitstellt. Das vermeintliche Fehlen von Licht mit Wellenlängen zwischen den einzelnen Stokes-Linien bzw. zwischen der ersten Stokes-Linie und der Linie des eingekoppelten Lichts ist demgegenüber ohne größere Bedeutung, weil die Linien ausreichend dicht beieinander liegen. Hinzu kommen die Stabilität der Lage der Stokes-Linien und ihrer relativen Intensität. Retrospektiv ist es daher verwunderlich, warum in der praktischen Entwicklung der bekannte Effekt der stimulierten Raman-Streuung als Basis für eine Lichtquelle mit mehreren Wellenlängen in der Fluoreszenzlichtmikroskopie gänzlich übergangen wurde.
Auch die Lichtleiterfaser muss bei dem neuen Verfahren keine aufwändige mikrostrukturierte oder sich lokal stark verjüngende Faser sein. Vielmehr handelt es sich vorzugsweise um eine herkömmliche Single Mode Faser mit zumindest annähernd konstantem Durchmesser oder jedenfalls keiner ausgeprägten lokalen Verjüngung und ohne Mikrostruktur um einen Faserkern minimalen Durchmessers. Dafür ist die bei dem neuen Verfahren eingesetzte Single Mode Faser vergleichsweise lang. Dies gilt insbesondere dann, wenn mehrere oder gar viele rotverschobene Stokes-Linien erzeugt werden sollen, um Licht über einen größeren Spektralbereich für das Überführen von Fluoreszenzfarbstoffen von einem Zustand in einen anderen Zustand zur Verfügung zu stellen. Die Single Mode Faser kann eine Abschneidewellenlänge (cut off Wellenlänge) aufweisen, die auf der blauen Seite nicht weit, z. B. weniger als 70 nm, von der Wellenlänge des eingekoppelten Lichts entfernt liegt.
Konkret beträgt die Mindestlänge einer herkömmlichen Single Mode Faser bei dem neuen Verfahren 9 m. Um mehrere rotverschobene Stokes-Linien zu erhalten, ist jedoch eine Mindestlänge von 19 m bevorzugt. Damit die Anzahl der nutzbaren rotverschobenen Stokes-Linien eine Größenordnung von 10 erreichen kann, ist eine Länge der Single Mode Faser von ungefähr 30 m oder mehr sinnvoll. Mit 10 rotverschobenen Stokes-Linien wird durch das gesamte Lichtspektrum am Ausgang der Single Mode Faser, das die Wellenlänge des eingekoppelten Lichts als weitere Linie aufweist, ein Wellenlängenbereich von etwa 150 nm abgedeckt.
Wenn die Lichtleiterfaser bei dem neuen Verfahren eine mikrostrukturierte Faser ist, sollte ihre Länge jedoch so kurz wie möglich gehalten werden, da derartige Lichtleiterfasern im Gegensatz zu herkömmlichen Single Mode Faser eine sehr hohe längenabhängige Dämpfung aufweisen.
Wenn die Lichtleiterfaser bei dem neuen Verfahren dennoch eine mikrostrukturierte Faser ist, ist eine solche mit einem gasgefüllten Hohlkern bevorzugt, bei der die Wahl des Gases bzw. seiner Zusammensetzung in dem Hohlkern eine Einflussnahme auf die Rotverschiebung, d. h. den Abstand der Stokes-Linien erlaubt.
Um die hohe Dämpfung einer mikrostrukturierten Faser mit gasgefülltem Hohlkern zu begrenzen, kann sie zur Erzeugung nur einer Stokes-Linie genutzt werden, wofür eine vergleichsweise geringe Länge ausreicht. Das aus der mikrostrukturierten Faser austretende Lichtspektrum aus zwei Linien kann anschließend in eine herkömmliche Single Mode Faser eingekoppelt werden. um zu jeder dieser Linien zusätzliche rotverschobene Stokes-Linien auszubilden.
Die Intensität des Lichts der anderen Wellenlänge, das in die Lichtleiterfaser eingekoppelt wird, sollte mindestens 50 Watt Spitzenleistung (peak power) betragen, was für die Ausbildung einer Stokes-Linie ausreichend sein kann. Um mehrere oder gar viele Stokes-Linien zu erzeugen sollte die Intensität 500 Watt und vorzugsweise mindestens 1000 Watt Spitzenleistung erreichen. Der bei einer bestimmten Lichtleiterfaser für das Erzeugen einer bestimmten Anzahl von Stokes-Linien erforderliche Wert der Spitzenleistung hängt auch vom Durchmesser der Lichtleiterfaser ab. Dieser bestimmt zusammen mit der Spitzenleistung die Intensität des eingekoppelten Lichts in der Lichtleiterfaser.
Besonders günstige Verhältnisse stellen sich dann ein, wenn das Licht der anderen Wellenlänge in Pulsen von 0,5–5 ns Dauer in die Lichtleiterfaser eingekoppelt wird. Bei längeren Pulsen besteht die Gefahr, dass stimulierte Brillouin-Streuung in der Lichtleiterfaser dominiert. Auch bei kürzeren Pulsen geht der Effekt der Ausbildung stabiler Stokes-Linien durch die stimulierte Raman-Streuung zurück. Die Dauer der Pulse des eingekoppelten Lichts entspricht bei dem neuen Verfahren etwa auch der Dauer der Pulse des aus der Single Mode Faser austretenden Lichts. Pulse von 0,5–5 ns Dauer, insbesondere Pulse von 1–3 ns Dauer sind für das Überführen von Fluoreszenzfarbstoffen zwischen zwei Zuständen in der Fluoreszenzlichtmikroskopie von besonderem Interesse, wenn solche Transfers bis zur Sättigung getrieben werden sollen, was verschiedentlich der Fall ist.
Wie bereits angesprochen wurde, kann ein Lichtspektrum mit mehreren oder gar möglichst vielen rotverschobenen Stokes-Linien erwünscht sein. Konkret kann das Lichtspektrum bei dem neuen Verfahren mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7 und am meisten bevorzugt mindestens 10 rotverschobene Stokes-Linien aufweisen. Auch bei noch mehr rotverschobenen Stokes-Linien entfällt auf jede dieser Stokes-Linien ein Intensitätsanteil von mehreren Prozent der Intensität des eingekoppelten Lichts.
Bei dem neuen Verfahren sind die Stokes-Linien rotverschoben. Das heißt, sie weisen eine größere Wellenlänge als das in die Lichtleiterfaser eingekoppelte Licht auf. Mit anderen Worten sollte die andere Wellenlänge des eingekoppelten Lichts am blauen Ende des sichtbaren Spektrums liegen. Es gibt zwar Gaslaser, die in diesem Bereich emittieren. Besonders günstig ist es aber, wenn die andere Wellenlänge durch Frequenzverdopplung einer Lasergrundfrequenz bereitgestellt wird. Derartige frequenzverdoppelte Laser können aufgrund der Lasergrundfrequenz im Bereich von 1 μm als kostengünstige Festkörperlaser aufgebaut werden. So kann das Licht der anderen Wellenlänge insbesondere mit einem sogenannten Mikrochiplaser bereitgestellt werden. Hierbei handelt es sich um einen kostengünstig verfügbaren Festkörperlasertyp, bei dem es sich beispielsweise um einen frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser handeln kann. Während ein frequenzverdoppelter Nd:YAG-Laser üblicher Weise eine Emissionswellenlänge von 532 nm aufweist, gibt es auch Mikrochiplaser, die bei anderen Wellenlängen in einem Bereich von 450–600 nm, insbesondere in einem Bereich zwischen 500 und 550 nm emittieren. Damit kann Einfluss auf die Lage der einzelnen rotverschobenen Stokes-Linien genommen werden. Geht man von einem konstanten Abstand der rotverschobenen Stokes-Linien von etwa 12–15 nm aus, so können mit zwei wechselweise eingesetzten Halbleiterlasern, deren Emissionswellenlängen um etwa 6–7 nm auseinanderfallen, Stokes-Linien im Abstand von etwa 6–7 nm erzeugt werden. Mit drei verschiedenen Mikrochiplasern, deren Emissionswellenlängen etwa 4–5 nm auseinanderfallen, können entsprechend Stokes-Linien im Abstand von 4–5 nm über den gesamten Wellenlängenbereich des Lichtspektrums am Ausgang der Single Mode Faser bereitgestellt werden.
Mikrochiplaser sind zur Emission von Pulsen einer Dauer von etwa 1–3 ns besonders gut geeignet. Dies stellt eine optimale Dauer der Pulse für den Einsatz in der hochauflösenden Fluoreszenzlichtmikroskopie dar. Die Pulswiederholungsrate bei einem herkömmlichen Mikrochiplaser kann mit 1–100 KHz etwas niedriger liegen, als dies für die Fluoreszenzlichtmikroskopie erwünscht ist, wo eine Pulswiederholungsrate im Megaherzbereich bevorzugt ist. Eine Pulswiederholungsrate von 1 MHz ist aber auch bei Mikrochiplasern ausreichender Spitzenleistung realisierbar. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die aus der Lichtleiterfaser austretenden Lichtpulse der einen, für das Überführen des jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffs von seinem einen in seinen anderen Zustand benötigten Wellenlänge zu teilen und zeitlich versetzt wieder zusammenzuführen. Dem Fachmann sind die hierfür notwendigen Techniken bekannt. Hierzu zählt es, eine einzelne Stokes-Linie spektral aufzufächern und einen Teil der spektralen Bestandteile vor dem Wiederzusammenführen der spektralen Bestandteile um einen halben zeitlichen Abstand der Pulse zu verzögern.
Eine weitere Möglichkeit, die Pulswiederholungsrate des Lichts der interessierenden einen Wellenlänge zu erhöhen, wobei diese eine Wellenlänge eine gewisse Toleranzbreite aufweist, besteht darin, verschiedene, nicht zeitgleiche Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlängen in dieselben oder andere Lichtleiterfaser einzukoppeln und Stokes-Linien von den verschiedenen Lichtpulsen als Lichtpulse der einen Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs von dem einen Zustand in den anderen Zustand zu nutzen. Wenn die beiden unterschiedlichen Wellenlängen, mit denen die nicht zeitgleichen Lichtpulse in die Lichtleiterfaser eingekoppelt werden, den Abstand der Stokes-Linien aufweisen, können auf diese Weise sogar Lichtpulse genau einer Wellenlänge mit erhöhter Wiederholungsrate der Pulse erzeugt werden. Wenn die Stokes-Linien jedoch in unterschiedlichen Single Mode Fasern erzeugt werden, müssen sie sich in der Wellenlänge zumindest etwas unterscheiden, um bei gleicher Polarisation auf eine übereinstimmende optische Achse ausgerichtet werden zu können.
Wenn dann die neuen Verfahren eine Anregungslichtquelle, insbesondere eine Laserdiode, die Anregungslicht für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff bereitstellt, synchron zu den Nichtpulsen der einen Wellenlänge, mit denen der Fluoreszenzfarbstoff lokal wieder abgeregt wird, getriggert wird, kann dies beim Einkoppeln nicht zeitgleicher Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlänge in dieselbe oder andere Lichtleiterfaser(n) erfolgen, ohne dass diese nicht zeitgleichen Lichtpulse untereinander synchronisiert werden müssen, weil eine Laserdiode ohne weiteres im hohen Megaherzbereich getaktet werden kann. Die beiden Lichtquellen für die nicht zeitgleichen Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlänge können daher relativ zueinander freilaufen.
Während im letzten Absatz bereits eine Anwendung des neuen Verfahrens bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie angedeutet wurde, kann die Erfindung auch bei herkömmlicher Fluoreszenzlichtmikroskopie, aber auch bei anderen Techniken der Fluoreszenzlichtmikroskopie mit Erhöhung der Ortsauflösung durch Schalten von Fluoreszenzfarbstoffen zwischen verschiedenen Zuständen, wie beispielsweise GSD-Fluoreszenzlichtmikroskopie und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie angewandt werden.
Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet des neuen Verfahrens ist das so genannte Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), bei dem aus dem Fluoreszenzlicht von der Probe Fluoreszenzlebensdauerabbildungen der Probe im Zeit- oder Frequenzbereich generiert werden. Das neue Verfahren stellt auf einfache Weise Anregungslicht verschiedener, ausreichend fein abgestufter Wellenlängen zur Verfügung, um das Fluorescence Lifetime Imaging bei verschiedenen Farben zu betreiben.
Bei einem erfindungsgemäßen Fluoreszenzlichtmikroskop ist die Lichtleiterfaser derart ausgewählt und koppelt der Laser Licht mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser ein, dass in der Lichtleiterfaser Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum neben der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der ihr im Blauen benachbarten Linie des Lichtspektrums ist; und die wellenlängenselektiven Mittel sondern das Licht mit der bestimmten Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien aus. Einzelheiten der neuen Vorrichtung ergeben sich aus den angehängten Ansprüchen in Verbindung mit den voranstehenden Erläuterungen des neuen Verfahrens.
Erwähnenswert ist jedoch, dass eine Frequenzerhöhungseinrichtung, die verschiedene Lichtpulse zusammenführt, um die Pulswiederholungsrate des Lichts der interessierenden einen Wellenlänge zu erhöhen, für diese Zusammenführung ein dispersives optisches Element aufweisen kann. Beispiele für geeignete dispersive optische Elemente umfassen Prismen und Prismenanordnungen. Besonders bevorzugt sind jedoch akustooptische Filter, die in Umkehrrichtung verwendet werden, um Lichtpulse nur geringfügig unterschiedlicher Wellenlängen auf einer optischen Achse zusammen zu führen.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
1 zeigt schematisch den Aufbau einer ersten Ausführungsform eines Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt ein Lichtspektrum, das bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1 zur Verfügung steht.
3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzlichtmikroskops in schematischer Darstellung, und
4 zeigt die für eine Variante des Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß 3 wesentlichen Teile eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzlichtmikroskops.
FIGURENBESCHREIBUNG
Das in 1 skizzierte Fluoreszenzlichtmikroskop 1 dient zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe 2, in der eine interessierende Struktur mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Der Fluoreszenzfarbstoff wird mit Anregungslicht 3 von einer Laserdiode 4 im Fokusbereich eines Objektivs 5 zu Fluoreszenz angeregt. Daraufhin von dem Fluoreszenzfarbstoff aus dem Fokusbereich emittiertes Fluoreszenzlicht 6 wird mit einem Detektor 7 ortsauflösend, das heißt unter Zuordnung zu einem bestimmten Ort der Probe 2 detektiert. Um die Abmessungen des Orts der Probe 2, aus dem das Fluoreszenzlicht 6 stammen kann, unter die Beugungsgrenze abzusenken, wird der Fluoreszenzfarbstoff in der Probe 2 mit Abregungslicht 8 einer von dem Anregungslicht 3 abweichenden Wellenlänge außerhalb eines interessierenden Messpunkts durch stimulierte Emission wieder abgeregt, wobei mit einem Phasenfilter 9 aus dem Abregungslicht 8 ein Interferenzmuster ausgebildet wird, das an der Stelle des interessierenden Messpunkts eine Nullstelle und darum herum eine Intensität aufweist, mit der die stimulierte Emission des Fluoreszenzfarbstoffs bis zur Sättigung getrieben wird. Die Wellenlänge des Abregungslichts 8 ist größer als die Wellenlänge von Licht 10 eines als Mikrochiplaser 11 ausgebildeten Lasers 15, das in eine Lichtleiterfaser 13 in Form voneinander beabstandeter Pulse eingekoppelt wird. Dabei ist der Mikrochiplaser 11 ein frequenzverdoppelter Laser 15, der im blauen Bereich des sichtbaren Spektrums emittiert. Die hohe Lichtintensität in der Lichtleiterfaser 13, die eine herkömmliche Single Mode Faser 12 mit über ihrer Länge konstantem Durchmesser ist, führt zu stimulierter Raman-Streuung mit Ausbildung mehrerer rotverschobener Stokes-Linien in einem Lichtspektrum, das aus der Single Mode Faser 12 austritt. Eine der Stokes-Linien wird mit einem wellenlängenselektiven Element 14 selektiert und bildet das Abregungslicht 8 aus.
2 skizziert das Lichtspektrum 17, das bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 aus der Single Mode Faser 12 austritt. Dieses Lichtspektrum 17 entstand konkret durch Einstrahlen von Pulsen einer Wellenlänge von 532 nm (frequenzverdoppelter Nd:YAG) und einer Pulsdauer von 1,5 ns sowie einer Pulswiederholungsrate von 7 kHz bei 20 mW mittlerer Leistung und 1,9 kW Spitzenleistung in eine Standard Single Mode Glasfaser (Schaefter und Kirchhoff, cut-off Wellenlänge ca. 470 nm, Modenfelddurchmesser (Kerndurchmesser) ca. 5 μm, numerische Apertur 0,11, polarisationserhaltende Panda-Faser) von 30 m Länge. Die Einkoppeleffizienz, d. h. die transmittierte Gesamtleistung, betrug 50%. Ähnliche Spektren entstanden mit Single Mode Glasfasern der Firma Thorlabs (cut-off Wellenlänge 480 nm). Das Lichtspektrum 17 weist eine erste Linie 18 des in die Single Mode Faser 12 eingekoppelten Lichts 10 bei der Wellenlänge 532 nm auf, mit der der Mikrochiplaser 11 emittierte. Hieran schließt sich eine Vielzahl von rotverschobenen Stokes-Linien 19 bis 28 an, die jeweils einige Prozent der Gesamtintensität des Lichtspektrums 17 umfassen. Die am weitesten rotverschobenen Stokes-Linien 26 bis 28 weisen zwar eine zunehmende Halbwertsbreite auf. Auch sie umfassen aber über einen Bereich von wenigen Nanometern mehrere Prozent der Gesamtintensität des Lichtspektrums 17. Der Abstand 29 der rotverschobenen Stokes-Linien 19 bis 28 untereinander und der ersten rotverschobenen Stokes-Linien 19 gegenüber der Linie 18 beträgt jeweils etwa 12–15 nm. Das heißt, bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1 kann das Abregungslicht 8 in Schritten von 12–15 nm über den gesamten Bereich des Spektrums 17 hinweg bezüglich seiner Wellenlänge eingestellt werden. Dabei werden, weil jede der Stokes-Linien eine Halbwertsbreite 30 aufweist, die kleiner als der halbe Abstand 29 ist, mit der gewählten Stokes-Linie große Anteile der Intensität des Lichts 10 von dem Laser 11 für das Anregungslicht 8 genutzt. Bei einem herkömmlichen Mikrochiplaser 11 sind diese Anteile so groß, dass sie zur Verdopplung der Rate der Pulse des Lasers 11 noch aufgespaltet und unter zeitlichem Versatz auf die Probe 2 gerichtet werden können.
3 skizziert eine andere Möglichkeit, die Rate der Pulse des Abregungslichts 8 gegenüber der Rate der Pulse eines einzelnen Mikrochiplasers 11 zu erhöhen. Hierzu sind hier zwei Mikrochiplaser 11' und 11'' vorgesehen, die Licht 10' bzw. 10'' mit unterschiedlicher Wellenlänge emittieren. Das Licht 10' bzw. 10'' von beiden Mikrochiplasern 11' und 11'' wird mit einem Strahlteiler 31, der z. B. als akustooptisches Filter 32 ausgebildet sein kann, auf eine optische Achse zusammengeführt und in die Single Mode Faser 12 eingekoppelt. Dabei ist der Abstand der Wellenlänge des Lichts 10 von der Wellenlänge des Lichts 10'' ungefähr so groß wie der Abstand zwischen den Stokes-Linien 19 bis 28 gemäß 2, so dass zu jeder Stokes-Linie in dem Lichtspektrum, das durch das Licht 10' ausgelöst wird, eine Stokes-Linie gleicher Wellenlänge in dem Lichtspektrum existiert, das durch das Licht 10'' ausgelöst wird. Wenn die beiden Laser 11' und 11'' dann ihre Pulse zu unterschiedlichen Zeitpunkten emittieren, weist das Abregungslicht 8 hinter dem wellenlängenselektiven Element 14, das hier ein schmalbandiges Farbfilter 34 ist, eine verdoppelte Pulsrate auf. Die Laserdiode 4, die das Anregungslicht 8 gibt, wird dabei in Abhängigkeit von beiden Mikrochiplasern 11' und 11'' getriggert, die relativ zueinander freilaufen können, das heißt untereinander nicht synchronisiert sein müssen.
Während das Fluoreszenzlichtmikroskop 1 gemäß 3 nur eine Single Mode Faser 12 bei der Erhöhung der Pulsrate der Pulse des Abregungslichts 8 einsetzt, sind hierfür gemäß 4 zwei Single Mode Fasern 12' und 12'' vorgesehen, in denen jeweils das Licht 10' bzw. 10'' von einem der Mikrochiplaser 11' bzw. 11'' ein Lichtspektrum mit Stokes-Linien ausbildet. Dabei werden die beiden Lichtspektren durch den Strahlteiler 31, der hier auch das wellenlängenselektive Element 14 ausbildet, so zusammengeführt, dass zwei Stokes-Linien mit leicht unterschiedlichen, aber doch gemeinsam als Abregungslicht 8 verwendbaren Stokes-Linien auf einer gemeinsamen optischen Achse austreten. Der sich an das Phasenfilter 9 anschließende Teil des Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß 4 ist nicht dargestellt und entspricht 3.
Bezugszeichenliste

1: Fluoreszenzlichtmikroskop
2: Probe
3: Anregungslicht
4: Laserdiode
5: Objektiv
6: Fluoreszenzlicht
7: Detektor
8: Abregungslicht
9: Phasenfilter
10: Licht
11: Mikrochiplaser
12: Single Mode Faser
13: Lichtleiterfaser
14: wellenlängeselektives Element
15: Laser
16: Strahlteiler
17: Lichtspektrum
18: Linie
19: Stokes-Linie
20: Stokes-Linie
21: Stokes-Linie
22: Stokes-Linie
23: Stokes-Linie
24: Stokes-Linie
25: Stokes-Linie
26: Stokes-Linie
27: Stokes-Linie
28: Stokes-Linie
29: Abstand
30: Halbwertsbreite
31: Strahlteiter
32: akustooptisches Filter
33: Linse
34: Farbfilter

Claims

Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe, – wobei ein Fluoreszenzfarbstoff in der Probe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge von einem Zustand in einen anderen Zustand überführt wird, – wobei Licht einer anderen Wellenlänge mit einer solchen Mindestintensität in eine Lichtleiterfaser eingekoppelt wird, dass aufgrund eines nichtlinearen Effekts ein Lichtspektrum mit gegenüber der anderen Wellenlänge verschobenen Wellenlängen aus der Lichtleiterfaser austritt, und – wobei das Licht mit der bestimmten Wellenlänge aus dem Lichtspektrum ausgesondert wird, und – wobei Fluoreszenzlicht von der Probe ortsauflösend gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) derart ausgewählt wird und dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser (13) eingekoppelt wird, dass in der Lichtleiterfaser (13) Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum (17) neben einer Linie (18) der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linie (19 bis 28) aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der ihr im Blauen benachbarten Linie (18 bis 28) des Lichtspektrums (17) ist, und dass die bestimmte Wellenlänge aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien (19 bis 28) ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge in eine mikrostrukturlose und verjüngungsfreie Single Mode Faser (12) mit einer Länge von mindestens 9 m eingekoppelt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Single Mode Faser (12) mindestens 19 m, vorzugsweise mindestens 30 m beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge in eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern eingekoppelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge, bevor es in die Single Mode Faser (12) eingekoppelt wird, durch eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern geführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des Lichts (10) der anderen Wellenlänge mindestens 50 W Spitzenleistung, vorzugsweise mindestens 400 Watt Spitzenleistung, am meisten bevorzugt mindestens 1000 Watt Spitzenleistung beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge in Pulsen von 0,5 bis 5 ns Dauer, vorzugsweise in Pulsen von 1 bis 3 ns Dauer in die Lichtleiterfaser (13) eingekoppelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtspektrum (17) mindestens 2, vorzugsweise mindestens 5, mehr bevorzugt mindestens 7 und am meisten bevorzugt mindestens 10 rotverschobene Stokes-Linien (19 bis 28) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die andere Wellenlänge durch Frequenzverdopplung einer Lasergrundfrequenz bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge mit einem Mikrochiplaser (11) bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die andere Wellenlänge in einem Bereich zwischen 450 und 600 nm, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 500 und 550 nm liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass aus der Lichtleiterfaser (13) austretende Lichtpulse der einen Wellenlänge geteilt und zeitlich versetzt wieder zusammengeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene, nicht zeitgleiche Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlängen in dieselbe oder andere Lichtleiterfaser(n) (13, 13', 13'') eingekoppelt werden und dass Stokes-Linien (19 bis 28) von den verschiedenen Lichtpulsen als Lichtpulse der einen Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs von dem einen Zustand in den anderen Zustand genutzt werden.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anregungslichtquelle, insbesondere eine Laserdiode (4), die Anregungslicht (3) für den Fluoreszenzfarbstoff bereitstellt, synchron zu den Lichtpulsen der einen Wellenlänge, mit denen der Fluoreszenzfarbstoff lokal wieder abgeregt wird, getriggert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Fluoreszenzlicht (6) von der Probe (2) eine Fluoreszenzlebensdauerabbildung der Probe generiert wird.
Fluoreszenzlichtmikroskop mit: – einer Lichtquelle, die Licht einer bestimmen Wellenlänge bereitstellt, um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer zu untersuchenden Probe von einem Zustand in einen anderen Zustand zu überführen, – wobei die Lichtquelle einen Laser, eine Lichtleiterfaser und wellenlängenselektive Mittel aufweist, – wobei der Laser Licht einer anderen Wellenlänge mit einer solchen Mindestintensität in die Lichtleiterfaser einkoppelt, dass aufgrund eines nichtlinearen Effekts ein Lichtspektrum mit gegenüber der anderen Wellenlänge verschobenen Wellenlängen aus der Lichtleiterfaser austritt, und – wobei die wellenlängenselektiven Mittel das Licht mit der bestimmten Wellenlänge aus dem Lichtspektrum aussondern, und – einem Detektor, der Fluoreszenzlicht von der Probe ortsauflösend misst, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) derart ausgewählt ist und dass der Laser (15) das Licht (10) der anderen Wellenlänge mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser (13) einkoppelt, dass in der Lichtleiterfaser (13) Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum (17) neben der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien (19 bis 28) aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der ihr im Blauen benachbarten Linie (18 bis 28) des Lichtspektrums (17) ist, und dass die wellenlängenselektiven Mittel das Licht mit der bestimmten Wellenlänge aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien (19 bis 28) aussondern.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) eine mikrostrukturlose und verjüngungsfreie Single Mode Faser (12) mit einer Länge von mindestens 9 m ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Single Mode Faser (12) mindestens 19 m, vorzugsweise mindestens 30 m beträgt.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Single Mode Faser (12) eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern vorgeschaltet ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser (15) das Licht (10) der anderen Wellenlänge in Pulsen von mindestens 50 W Spitzenleistung, vorzugsweise mindestens 150 Watt Spitzenleistung, am meisten bevorzugt mindestens 450 Watt Spitzenleistung in die Lichtleiterfaser (13) einkoppelt.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser (15) das Licht (10) der anderen Wellenlänge in Pulsen von 0,5 bis 5 ns Dauer, vorzugsweise in Pulsen von 1 bis 3 ns Dauer in die Lichtleiterfaser (13) einkoppelt.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtspektrum (17) mindestens 2, vorzugsweise mindestens 5, mehr bevorzugt mindestens 7 und am meisten bevorzugt mindestens 10 rotverschobene Stokes-Linien (19 bis 28) umfasst.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser (15) ein frequenzverdoppelter Laser ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser (15) ein Mikrochiplaser (11) ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die andere Wellenlänge in einem Bereich zwischen 450 und 600 nm, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 500 und 550 nm liegt.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass eine Frequenzerhöhungseinrichtung vorgesehen ist, die aus der Lichtleiterfaser (13) austretende Lichtpulse der einen Wellenlänge teilt und zeitlich versetzt wieder zusammenführt.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass eine Frequenzerhöhungseinrichtung vorgesehen ist, die verschiedene, nicht zeitgleiche Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlängen in dieselbe oder andere Lichtleiterfaser(n) (13, 13', 13'') einkoppelt und benachbarte Stokes-Linien (19 bis 28) von den verschiedenen Lichtpulsen als Lichtpulse der einen Wellenlänge zusammenführt.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 27 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Frequenzerhöhungseinrichtung ein dispersives optisches Element, insbesondere ein akustooptisches Filter (32), zum Zusammenführen der Lichtpulse aufweist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 26 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anregungslichtquelle, insbesondere eine Laserdiode (4), vorgesehen ist, die Anregungslicht (3) für den Fluoreszenzfarbstoff bereitstellt und die synchron zu den Lichtpulsen der einen Wellenlänge, mit denen der Fluoreszenzfarbstoff lokal wieder abgeregt wird, getriggert ist.