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TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen
Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen
Patentanspruchs 1 sowie auf ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den
Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs
16.
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STAND DER TECHNIK
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In
der Fluoreszenzlichtmikroskopie wird Licht verschiedener Wellenlängen
benötigt, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe zur
Fluoreszenz anzuregen, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe
gezielt wieder abzuregen (zum Beispiel in der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie),
um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe gezielt in einen Dunkelzustand
zu überführen (zum Beispiel in der GSD-Fluoreszenzlichtmikroskopie)
oder um denselben Farbstoff in einander überdeckenden,
aber unterschiedlichen räumlichen Bereichen einerseits
zur Fluoreszenz anzuregen und andererseits durch stimulierte Emission
wieder abzuregen oder in einen Dunkelzustand zu überführen.
Um diese Anforderungen zu erfüllen, können mehrere
verschiedene monochromatische Lichtquellen eingesetzt werden, um das
Licht mit den unterschiedlichen Wellenlängen bereitzustellen.
Weil es sich bei den hierfür geeigneten monochromatischen
Lichtquellen in aller Regel um Laser hoher Qualität handelt,
da das Licht in Pulsen hoher Intensität benötigt
wird, sind entsprechend aufgebaute Fluoreszenzlichtmikroskope sehr
kostspielig. Für einige Wellenlängen ist es auch
grundsätzlich schwierig geeignete Laser ausreichender Qualität
zu finden.
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Unter
anderem aus der
DE
10 2005 020 003 A1 ist es bekannt, einen Gaslaser als Lichtquelle
bei der Fluoreszenzlichtmikroskopie einzusetzen, der mehrere nutzbare
Emissionslinien aufweist oder zumindest auf mehrere Emissionslinien
abstimmbar ist. Gaslaser sind jedoch kostspielig in der Anschaffung und
aufwändig im Betrieb. Zudem decken die bei einem Gaslaser
nutzbaren Emissionslinien allenfalls einen kleinen Spektralbereich
soweit ab, dass alle in diesen Spektralbereich fallenden Absorptionslinien möglicher
Fluoreszenzfarbstoffe mit gutem Wirkungsquerschnitt angesprochen
werden können.
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Aus
dem
US-Patent 6,710,918 ist
ein Fluoreszenzlichtmikroskop bekannt, bei dem Licht einer bestimmten
Wellenlänge zum Überführen eines Fluoreszenzfarbstoffs
in einer Probe von einem Zustand in einen anderen Zustand dadurch
bereitgestellt wird, dass Licht einer anderen Wellenlänge
von einem Laser, insbesondere einem modengekoppelten Titanium-Saphir-Laser,
der bei 800 nm Wellenlänge emittiert, in ein optisches
Element eingekoppelt wird, das die Intensität des eingekoppelten
Lichts einer Wellenlänge auf ein kontinuierliches Spektrum
verteilt, welches kleinere und größere Wellenlängen
als das eingekoppelte Licht aufweist und welches als Superkontinuum
bezeichnet wird. Das optische Element kann dabei zum Beispiel eine
sich über eine Länge von 30 mm bis 90 mm im Querschnitt
stark verjüngende Lichtleiterfaser sein (eine sogenannte
"tapered Fiber"), die eine Gesamtlänge von 1 m aufweist,
oder eine mikrostrukturierte optische Faser mit photonischer Bandlücke
("photonic Band Gap"), die auch als photonische Kristallfaser ("photonic
Crystal Fiber") bezeichnet wird. Bei einer photonic Crystal Fiber
wird die photonische Bandlücke durch eine bienenwabenartige
Mikrostruktur um einen sehr kleinen Faserkern von nur etwa 2 μm
Durchmesser erzeugt. Die typische Länge einer photonic
Crystal Fiber (PCF) beträgt 38 cm. Eine spektrale Verteilung
in Form eines Superkontinuums ermöglicht es zwar, Licht
jeder beliebigen Wellenlänge für das Überführen
eines Fluoreszenzfarbstoffs von einem Zustand in einen anderen aus
dem Superkontinuum zu selektieren. Die bei jeder einzelnen Wellenlänge
des Superkontinuums zur Verfügung stehende Lichtleistung
ist jedoch gegenüber der Ausgangsleistung des anregenden
Lasers extrem reduziert. Zudem ist ein erheblicher Aufwand erforderlich,
um ein Superkontinuum mit einer zumindest annähernd homogenen
Intensitätsverteilung und insbesondere einer zeitlich stabilen
Intensitätsverteilung bereitzustellen. So hat die Entwicklung entsprechender
Fluoreszenzlichtmikroskope von der Patentanmeldung der Idee bis
zu kommerziellen Produkten mehr als fünf Jahre gedauert.
Zudem sind die entsprechenden Fluoreszenzlichtmikroskope kostspielig,
was unter anderem an dem Titan-Saphir-Laser mit der notwendigen
Ausgangsleistung und den im kommerziellen Produkt eingesetzten PCF
liegt.
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AUFGABE DER ERFINDUNG
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen
einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen
Patentanspruchs 1 und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen
des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 15 aufzuzeigen,
bei denen ohne großen und kostspieligen Aufwand und ohne
Stabilitätsprobleme Licht unterschiedlicher Wellenlängen
zur Verfügung steht, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe
von einem Zustand in einen anderen Zustand zu überführen.
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LÖSUNG
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Erfindungsgemäß wird
die Aufgabe durch ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen
einer Probe mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs
1 und durch ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des
unabhängigen Patentanspruchs 16 gelöst. Die abhängigen
Patentansprüche 2 bis 15 betreffen bevorzugte Ausführungsformen
des neuen Verfahrens, während die abhängigen Patentansprüche
17 bis 28 auf bevorzugte Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops
gerichtet sind.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bei
dem neuen Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer
Probe wird die Lichtleiterfaser derart ausgewählt und wird
das Licht mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser
eingekoppelt, dass in der Lichtleiterfaser Raman-Streuung in solchem
Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum neben einer
Linie der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien
aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als
ihr halber Abstand zu der er ihr im Blauen benachbarten Linie des
Lichtspektrums ist; und die bestimmte Wellenlänge zum Überführen
des Fluoreszenzfarbstoffs wird aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien
ausgewählt.
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Bei
dem neuen Verfahren wird der Effekt der stimulierten Raman-Streuung
in einer Lichtleiterfaser ausgenutzt, der bei auf die Länge
der Lichtleiterfaser abgestimmter Intensität des eingekoppelten
Lichts zur Ausbildung rotverschobener Stokes-Linien neben der Linie
des eingekoppelten Lichts führt. Mindestens wird bei dem
neuen Verfahren eine solche Stokes-Linie erzeugt, wobei die Anzahl
der Stokes-Linien mit zunehmender Intensität des eingekoppelten Lichts und
zunehmender Länge der Lichtleiterfaser ansteigt. Die Stokes-Linien
mit den größten Wellenlängen, das heißt
die am weitesten rotverschobenen Stokes-Linien sind zwar weniger
scharf ausgebildet. Selbst die am weitesten rotverschobene Stokes-Linie weist
aber in eine so geringe Halbwertsbreite auf, dass sie über
einen kleinen Wellenlängenbereich von wenigen Nanometern
einen hohen prozentualen Anteil der Intensität des eingekoppelten
Lichts umfasst. Die zwischen dieser am weitesten rotverschobenen Stokes-Linie
und der Linie des eingekoppelten Lichts liegenden weiteren Stokes-Linien
sind schärfer. Jede von ihnen erfüllt das oben
angegebene Kriterium in Bezug auf Ihre Halbwertsbreite, und weist über
ein Band von wenigen Nanometern stehen einige Prozent der Intensität
des eingekoppelten Lichts zur Verfügung. Dabei liegt der
Abstand der rotverschobenen Stokes-Linien untereinander bzw. zu
der Linie des eingekoppelten Lichts bei 10–20 nm, typischerweise bei
12–15 nm, wenn die Wellenlänge des eingekoppelten
Lichts bei etwa 500 nm liegt. Der genaue Wert hängt von
dem Material und Aufbau der Lichtleiterfaser sowie der Wellenlänge
des eingekoppelten Lichts ab. Die Stokes-Linien liegen damit so
dicht nebeneinander, dass jeder Fluoreszenzfarbstoff, dessen relevante
Absorptionslinie zwischen die Wellenlänge des eingekoppelten
Lichts und die Wellenlänge der am stärksten rotverschobenen
Stokes-Linie fällt, mit einer oder sogar mehreren der Stokes-Linien
bedient werden kann. Hierfür steht über einem
kleinen Wellenlängenbereich innerhalb der Halbwertsbreite
der Stokes-Linien, das heißt gut diskriminierbar, ein großer
Anteil der Intensität des eingekoppelten Lichts stabil
zur Verfügung, wobei die Lage der Stokes-Linien und ihr
relativer Intensitätsanteil an dem Lichtspektrum stabil
ist, ohne dass hierfür besondere Maßnahmen getroffen
werden müssten. Vorteile des neuen Verfahrens sind aber
nicht erst vorhanden, wenn im Lichtspektrum, das aus der Lichtleiterfaser austritt,
mehrere Stokes-Linien vorliegen. Bereits eine einzige Stokes-Linie
neben der Linie des eingekoppelten Lichts verdoppelt die Verwendungsmöglichkeiten
von Licht aus dem austretenden Lichtspektrum.
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Dass
sich mittels stimulierter Raman-Streuung in einer Single Mode Faser
rotverschobene Stokes-Linien in regelmäßigen Abständen
erzeugen lassen, ist grundsätzlich bekannt. Eine Übersicht über
die Effekte stimulierter Raman-Streuung ist zum Beispiel zu finden
bei Agrawal, Ch. 8: Stimulated Raman Scattering (Agrawal,
Govind P., Nonlinear Fiber Optics, 2. ed., San Diego, Calif., 1995).
Trotz dieses seit Jahrzehnten bekannten Effekts ist bislang keine Anwendung
auf dem Gebiet der Fluoreszenzlichtmikroskopie erfolgt. Stattdessen
sind, wie eingangs berichtet, mit großem Aufwand Fluoreszenzlichtmikroskope
entwickelt worden, bei denen ein Lichtspektrum mit einem Superkontinuum
erzeugt wird. Diesem Stand der Technik gegenüber weist
das neue Verfahren jedoch erhebliche Vorteile auf, indem es bei
den Wellenlängen jeder Stokes-Linie eine viel höhere Lichtintensität
bereitstellt. Das vermeintliche Fehlen von Licht mit Wellenlängen
zwischen den einzelnen Stokes-Linien bzw. zwischen der ersten Stokes-Linie und
der Linie des eingekoppelten Lichts ist demgegenüber ohne
größere Bedeutung, weil die Linien ausreichend
dicht beieinander liegen. Hinzu kommen die Stabilität der
Lage der Stokes-Linien und ihrer relativen Intensität.
Retrospektiv ist es daher verwunderlich, warum in der praktischen
Entwicklung der bekannte Effekt der stimulierten Raman-Streuung
als Basis für eine Lichtquelle mit mehreren Wellenlängen in
der Fluoreszenzlichtmikroskopie gänzlich übergangen
wurde.
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Auch
die Lichtleiterfaser muss bei dem neuen Verfahren keine aufwändige
mikrostrukturierte oder sich lokal stark verjüngende Faser
sein. Vielmehr handelt es sich vorzugsweise um eine herkömmliche
Single Mode Faser mit zumindest annähernd konstantem Durchmesser
oder jedenfalls keiner ausgeprägten lokalen Verjüngung
und ohne Mikrostruktur um einen Faserkern minimalen Durchmessers.
Dafür ist die bei dem neuen Verfahren eingesetzte Single
Mode Faser vergleichsweise lang. Dies gilt insbesondere dann, wenn
mehrere oder gar viele rotverschobene Stokes-Linien erzeugt werden sollen,
um Licht über einen größeren Spektralbereich für
das Überführen von Fluoreszenzfarbstoffen von einem
Zustand in einen anderen Zustand zur Verfügung zu stellen.
Die Single Mode Faser kann eine Abschneidewellenlänge (cut
off Wellenlänge) aufweisen, die auf der blauen Seite nicht
weit, z. B. weniger als 70 nm, von der Wellenlänge des
eingekoppelten Lichts entfernt liegt.
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Konkret
beträgt die Mindestlänge einer herkömmlichen
Single Mode Faser bei dem neuen Verfahren 9 m. Um mehrere rotverschobene
Stokes-Linien zu erhalten, ist jedoch eine Mindestlänge
von 19 m bevorzugt. Damit die Anzahl der nutzbaren rotverschobenen
Stokes-Linien eine Größenordnung von 10 erreichen
kann, ist eine Länge der Single Mode Faser von ungefähr
30 m oder mehr sinnvoll. Mit 10 rotverschobenen Stokes-Linien wird
durch das gesamte Lichtspektrum am Ausgang der Single Mode Faser,
das die Wellenlänge des eingekoppelten Lichts als weitere
Linie aufweist, ein Wellenlängenbereich von etwa 150 nm
abgedeckt.
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Wenn
die Lichtleiterfaser bei dem neuen Verfahren eine mikrostrukturierte
Faser ist, sollte ihre Länge jedoch so kurz wie möglich
gehalten werden, da derartige Lichtleiterfasern im Gegensatz zu
herkömmlichen Single Mode Faser eine sehr hohe längenabhängige
Dämpfung aufweisen.
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Wenn
die Lichtleiterfaser bei dem neuen Verfahren dennoch eine mikrostrukturierte
Faser ist, ist eine solche mit einem gasgefüllten Hohlkern
bevorzugt, bei der die Wahl des Gases bzw. seiner Zusammensetzung
in dem Hohlkern eine Einflussnahme auf die Rotverschiebung, d. h.
den Abstand der Stokes-Linien erlaubt.
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Um
die hohe Dämpfung einer mikrostrukturierten Faser mit gasgefülltem
Hohlkern zu begrenzen, kann sie zur Erzeugung nur einer Stokes-Linie genutzt
werden, wofür eine vergleichsweise geringe Länge
ausreicht. Das aus der mikrostrukturierten Faser austretende Lichtspektrum
aus zwei Linien kann anschließend in eine herkömmliche
Single Mode Faser eingekoppelt werden, um zu jeder dieser Linien zusätzliche
rotverschobene Stokes-Linien auszubilden.
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Die
Intensität des Lichts der anderen Wellenlänge,
das in die Lichtleiterfaser eingekoppelt wird, sollte mindestens
50 Watt Spitzenleistung (peak power) betragen, was für
die Ausbildung einer Stokes-Linie ausreichend sein kann. Um mehrere oder
gar viele Stokes-Linien zu erzeugen sollte die Intensität
500 Watt und vorzugsweise mindestens 1000 Watt Spitzenleistung erreichen.
Der bei einer bestimmten Lichtleiterfaser für das Erzeugen
einer bestimmten Anzahl von Stokes-Linien erforderliche Wert der
Spitzenleistung hängt auch vom Durchmesser der Lichtleiterfaser
ab. Dieser bestimmt zusammen mit der Spitzenleistung die Intensität
des eingekoppelten Lichts in der Lichtleiterfaser.
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Besonders
günstige Verhältnisse stellen sich dann ein, wenn
das Licht der anderen Wellenlänge in Pulsen von 0,5–5
ns Dauer in die Lichtleiterfaser eingekoppelt wird. Bei längeren
Pulsen besteht die Gefahr, dass stimulierte Brillouin-Streuung in
der Lichtleiterfaser dominiert. Auch bei kürzeren Pulsen
geht der Effekt der Ausbildung stabiler Stokes-Linien durch die
stimulierte Raman-Streuung zurück. Die Dauer der Pulse
des eingekoppelten Lichts entspricht bei dem neuen Verfahren etwa
auch der Dauer der Pulse des aus der Single Mode Faser austretenden
Lichts. Pulse von 0,5–5 ns Dauer, insbesondere Pulse von
1–3 ns Dauer sind für das Überführen von
Fluoreszenzfarbstoffen zwischen zwei Zuständen in der Fluoreszenzlichtmikroskopie
von besonderem Interesse, wenn solche Transfers bis zur Sättigung
getrieben werden sollen, was verschiedentlich der Fall ist.
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Wie
bereits angesprochen wurde, kann ein Lichtspektrum mit mehreren
oder gar möglichst vielen rotverschobenen Stokes-Linien
erwünscht sein. Konkret kann das Lichtspektrum bei dem neuen
Verfahren mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7 und am meisten
bevorzugt mindestens 10 rotverschobene Stokes-Linien aufweisen.
Auch bei noch mehr rotverschobenen Stokes-Linien entfällt
auf jede dieser Stokes-Linien ein Intensitätsanteil von
mehreren Prozent der Intensität des eingekoppelten Lichts.
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Bei
dem neuen Verfahren sind die Stokes-Linien rotverschoben. Das heißt,
sie weisen eine größere Wellenlänge als
das in die Lichtleiterfaser eingekoppelte Licht auf. Mit anderen
Worten sollte die andere Wellenlänge des eingekoppelten
Lichts am blauen Ende des sichtbaren Spektrums liegen. Es gibt zwar
Gaslaser, die in diesem Bereich emittieren. Besonders günstig
ist es aber, wenn die andere Wellenlänge durch Frequenzverdopplung
einer Lasergrundfrequenz bereitgestellt wird. Derartige frequenzverdoppelte
Laser können aufgrund der Lasergrundfrequenz im Bereich
von 1 μm als kostengünstige Festkörperlaser
aufgebaut werden. So kann das Licht der anderen Wellenlänge
insbesondere mit einem sogenannten Mikrochiplaser bereitgestellt
werden. Hierbei handelt es sich um einen kostengünstig verfügbaren
Festkörperlasertyp, bei dem es sich beispielsweise um einen
frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser handeln kann. Während
ein frequenzverdoppelter Nd:YAG-Laser üblicher Weise eine Emissionswellenlänge
von 532 nm aufweist, gibt es auch Mikrochiplaser, die bei anderen
Wellenlängen in einem Bereich von 450–600 nm,
insbesondere in einem Bereich zwischen 500 und 550 nm emittieren. Damit
kann Einfluss auf die Lage der einzelnen rotverschobenen Stokes-Linien
genommen werden. Geht man von einem konstanten Abstand der rotverschobenen
Stokes-Linien von etwa 12–15 nm aus, so können
mit zwei wechselweise eingesetzten Halbleiterlasern, deren Emissionswellenlängen
um etwa 6–7 nm auseinanderfallen, Stokes-Linien im Abstand von
etwa 6–7 nm erzeugt werden. Mit drei verschiedenen Mikrochiplasern,
deren Emissionswellenlängen etwa 4–5 nm auseinanderfallen,
können entsprechend Stokes-Linien im Abstand von 4–5
nm über den gesamten Wellenlängenbereich des Lichtspektrums
am Ausgang der Single Mode Faser bereitgestellt werden.
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Mikrochiplaser
sind zur Emission von Pulsen einer Dauer von etwa 1–3 ns
besonders gut geeignet. Dies stellt eine optimale Dauer der Pulse
für den Einsatz in der hochauflösenden Fluoreszenzlichtmikroskopie
dar. Die Pulswiederholungsrate bei einem herkömmlichen
Mikrochiplaser kann mit 1–100 KHz etwas niedriger liegen,
als dies für die Fluoreszenzlichtmikroskopie erwünscht
ist, wo eine Pulswiederholungsrate im Megaherzbereich bevorzugt
ist. Eine Pulswiederholungsrate von 1 MHz ist aber auch bei Mikrochiplasern
ausreichender Spitzenleistung realisierbar. Eine weitere Möglichkeit
besteht darin, die aus der Lichtleiterfaser austretenden Lichtpulse
der einen, für das Überführen des jeweiligen
Fluoreszenzfarbstoffs von seinem einen in seinen anderen Zustand
benötigten Wellenlänge zu teilen und zeitlich versetzt
wieder zusammenzuführen. Dem Fachmann sind die hierfür
notwendigen Techniken bekannt. Hierzu zählt es, eine einzelne
Stokes-Linie spektral aufzufächern und einen Teil der spektralen
Bestandteile vor dem Wiederzusammenführen der spektralen Bestandteile
um einen halben zeitlichen Abstand der Pulse zu verzögern.
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Eine
weitere Möglichkeit, die Pulswiederholungsrate des Lichts
der interessierenden einen Wellenlänge zu erhöhen,
wobei diese eine Wellenlänge eine gewisse Toleranzbreite
aufweist, besteht darin, verschiedene, nicht zeitgleiche Lichtpulse
unterschiedlicher Wellenlängen in dieselben oder andere Lichtleiterfaser
einzukoppeln und Stokes-Linien von den verschiedenen Lichtpulsen
als Lichtpulse der einen Wellenlänge zum Überführen
des Fluoreszenzfarbstoffs von dem einen Zustand in den anderen Zustand
zu nutzen. Wenn die beiden unterschiedlichen Wellenlängen,
mit denen die nicht zeitgleichen Lichtpulse in die Lichtleiterfaser
eingekoppelt werden, den Abstand der Stokes-Linien aufweisen, können
auf diese Weise sogar Lichtpulse genau einer Wellenlänge
mit erhöhter Wiederholungsrate der Pulse erzeugt werden.
Wenn die Stokes-Linien jedoch in unterschiedlichen Single Mode Fasern
erzeugt werden, müssen sie sich in der Wellenlänge
zumindest etwas unterscheiden, um bei gleicher Polarisation auf
eine übereinstimmende optische Achse ausgerichtet werden
zu können.
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Wenn
dann die neuen Verfahren eine Anregungslichtquelle, insbesondere
eine Laserdiode, die Anregungslicht für den jeweiligen
Fluoreszenzfarbstoff bereitstellt, synchron zu den Nichtpulsen der
einen Wellenlänge, mit denen der Fluoreszenzfarbstoff lokal
wieder abgeregt wird, getriggert wird, kann dies beim Einkoppeln
nicht zeitgleicher Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlänge
in dieselbe oder andere Lichtleiterfaser(n) erfolgen, ohne dass
diese nicht zeitgleichen Lichtpulse untereinander synchronisiert werden
müssen, weil eine Laserdiode ohne weiteres im hohen Megaherzbereich
getaktet werden kann. Die beiden Lichtquellen für die nicht
zeitgleichen Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlänge können
daher relativ zueinander freilaufen.
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Während
im letzten Absatz bereits eine Anwendung des neuen Verfahrens bei
der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie angedeutet wurde, kann die Erfindung
auch bei herkömmlicher Fluoreszenzlichtmikroskopie, aber
auch bei anderen Techniken der Fluoreszenzlichtmikroskopie mit Erhöhung
der Ortsauflösung durch Schalten von Fluoreszenzfarbstoffen zwischen
verschiedenen Zuständen, wie beispielsweise GSD-Fluoreszenzlichtmikroskopie
und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie angewandt werden.
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Ein
besonders interessantes Anwendungsgebiet des neuen Verfahrens ist
das so genannte Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), bei dem aus
dem Fluoreszenzlicht von der Probe Fluoreszenzlebensdauerabbildungen
der Probe im Zeit- oder Frequenzbereich generiert werden. Das neue
Verfahren stellt auf einfache Weise Anregungslicht verschiedener, ausreichend
fein abgestufter Wellenlängen zur Verfügung, um
das Fluorescence Lifetime Imaging bei verschiedenen Farben zu betreiben.
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Bei
einem erfindungsgemäßen Fluoreszenzlichtmikroskop
ist die Lichtleiterfaser derart ausgewählt und koppelt
der Laser Licht mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser
ein, dass in der Lichtleiterfaser Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert
wird, dass das Lichtspektrum neben der eingekoppelten Wellenlänge
mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite
kleiner als ihr halber Abstand zu der ihr im Blauen benachbarten
Linie des Lichtspektrums ist; und die wellenlängenselektiven
Mittel sondern das Licht mit der bestimmten Wellenlänge
zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs aus einer
der rotverschobenen Stokes-Linien aus. Einzelheiten der neuen Vorrichtung
ergeben sich aus den angehängten Ansprüchen in
Verbindung mit den voranstehenden Erläuterungen des neuen
Verfahrens.
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Erwähnenswert
ist jedoch, dass eine Frequenzerhöhungseinrichtung, die
verschiedene Lichtpulse zusammenführt, um die Pulswiederholungsrate des
Lichts der interessierenden einen Wellenlänge zu erhöhen,
für diese Zusammenführung ein dispersives optisches
Element aufweisen kann. Beispiele für geeignete dispersive
optische Elemente umfassen Prismen und Prismenanordnungen. Besonders bevorzugt
sind jedoch akustooptische Filter, die in Umkehrrichtung verwendet
werden, um Lichtpulse nur geringfügig unterschiedlicher
Wellenlängen auf einer optischen Achse zusammen zu führen.
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Vorteilhafte
Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen,
der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung
genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer
Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ
oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend
von erfindungsgemäßen Ausführungsformen
erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere
den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer
Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu
entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen
der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche
ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen
der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt.
Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen
dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese
Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche
kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen
aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen
der Erfindung entfallen.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Im
Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter
bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert
und beschrieben.
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1 zeigt
schematisch den Aufbau einer ersten Ausführungsform eines
Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2 zeigt
ein Lichtspektrum, das bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1 zur
Verfügung steht.
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3 zeigt
eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen
Fluoreszenzlichtmikroskops in schematischer Darstellung, und
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4 zeigt
die für eine Variante des Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß 3 wesentlichen
Teile eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzlichtmikroskops.
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FIGURENBESCHREIBUNG
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Das
in 1 skizzierte Fluoreszenzlichtmikroskop 1 dient
zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe 2,
in der eine interessierende Struktur mit einem Fluoreszenzfarbstoff
markiert ist. Der Fluoreszenzfarbstoff wird mit Anregungslicht 3 von
einer Laserdiode 4 im Fokusbereich eines Objektivs 5 zu
Fluoreszenz angeregt. Daraufhin von dem Fluoreszenzfarbstoff aus
dem Fokusbereich emittiertes Fluoreszenzlicht 6 wird mit
einem Detektor 7 ortsauflösend, das heißt
unter Zuordnung zu einem bestimmten Ort der Probe 2 detektiert.
Um die Abmessungen des Orts der Probe 2, aus dem das Fluoreszenzlicht 6 stammen
kann, unter die Beugungsgrenze abzusenken, wird der Fluoreszenzfarbstoff
in der Probe 2 mit Abregungslicht 8 einer von
dem Anregungslicht 3 abweichenden Wellenlänge
außerhalb eines interessierenden Messpunkts durch stimulierte Emission
wieder abgeregt, wobei mit einem Phasenfilter 9 aus dem
Abregungslicht 8 ein Interferenzmuster ausgebildet wird,
das an der Stelle des interessierenden Messpunkts eine Nullstelle
und darum herum eine Intensität aufweist, mit der die stimulierte
Emission des Fluoreszenzfarbstoffs bis zur Sättigung getrieben
wird. Die Wellenlänge des Abregungslichts 8 ist
größer als die Wellenlänge von Licht 10 eines
als Mikrochiplaser 11 ausgebildeten Lasers 15,
das in eine Lichtleiterfaser 13 in Form voneinander beabstandeter
Pulse eingekoppelt wird. Dabei ist der Mikrochiplaser 11 ein
frequenzverdoppelter Laser 15, der im blauen Bereich des
sichtbaren Spektrums emittiert. Die hohe Lichtintensität
in der Lichtleiterfaser 13, die eine herkömmliche
Single Mode Faser 12 mit über ihrer Länge
konstantem Durchmesser ist, führt zu stimulierter Raman-Streuung
mit Ausbildung mehrerer rotverschobener Stokes-Linien in einem Lichtspektrum,
das aus der Single Mode Faser 12 austritt. Eine der Stokes-Linien
wird mit einem wellenlängenselektiven Element 14 selektiert
und bildet das Abregungslicht 8 aus.
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2 skizziert
das Lichtspektrum 17, das bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 aus
der Single Mode Faser 12 austritt. Dieses Lichtspektrum 17 entstand
konkret durch Einstrahlen von Pulsen einer Wellenlänge
von 532 nm (frequenzverdoppelter Nd:YAG) und einer Pulsdauer von
1,5 ns sowie einer Pulswiederholungsrate von 7 kHz bei 20 mW mittlerer
Leistung und 1,9 kW Spitzenleistung in eine Standard Single Mode
Glasfaser (Schaefter und Kirchhoff, cut-off Wellenlänge
ca. 470 nm, Modenfelddurchmesser (Kerndurchmesser) ca. 5 μm,
numerische Apertur 0,11, polarisationserhaltende Panda-Faser) von
30 m Länge. Die Einkoppeleffizienz, d. h. die transmittierte
Gesamtleistung, betrug 50%. Ähnliche Spektren entstanden
mit Single Mode Glasfasern der Firma Thorlabs (cut-off Wellenlänge
480 nm). Das Lichtspektrum 17 weist eine erste Linie 18 des
in die Single Mode Faser 12 eingekoppelten Lichts 10 bei
der Wellenlänge 532 nm auf, mit der der Mikrochiplaser 11 emittierte.
Hieran schließt sich eine Vielzahl von rotverschobenen
Stokes-Linien 19 bis 28 an, die jeweils einige
Prozent der Gesamtintensität des Lichtspektrums 17 umfassen.
Die am weitesten rotverschobenen Stokes-Linien 26 bis 28 weisen zwar
eine zunehmende Halbwertsbreite auf. Auch sie umfassen aber über
einen Bereich von wenigen Nanometern mehrere Prozent der Gesamtintensität
des Lichtspektrums 17. Der Abstand 29 der rotverschobenen
Stokes-Linien 19 bis 28 untereinander und der ersten
rotverschobenen Stokes-Linien 19 gegenüber der
Linie 18 beträgt jeweils etwa 12–15 nm.
Das heißt, bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1 kann
das Abregungslicht 8 in Schritten von 12–15 nm über
den gesamten Bereich des Spektrums 17 hinweg bezüglich
seiner Wellenlänge eingestellt werden. Dabei werden, weil
jede der Stokes-Linien eine Halbwertsbreite 30 aufweist,
die kleiner als der halbe Abstand 29 ist, mit der gewählten Stokes-Linie
große Anteile der Intensität des Lichts 10 von
dem Laser 11 für das Anregungslicht 8 genutzt.
Bei einem herkömmlichen Mikrochiplaser 11 sind
diese Anteile so groß, dass sie zur Verdopplung der Rate
der Pulse des Lasers 11 noch aufgespaltet und unter zeitlichem
Versatz auf die Probe 2 gerichtet werden können.
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3 skizziert
eine andere Möglichkeit, die Rate der Pulse des Abregungslichts 8 gegenüber
der Rate der Pulse eines einzelnen Mikrochiplasers 11 zu erhöhen.
Hierzu sind hier zwei Mikrochiplaser 11' und 11'' vorgesehen,
die Licht 10 bzw. 10'' mit unterschiedlicher Wellenlänge
emittieren. Das Licht 10' bzw. 10'' von beiden
Mikrochiplasern 11' und 11'' wird mit einem Strahlteiler 31,
der z. B. als akustooptisches Filter 32 ausgebildet sein
kann, auf eine optische Achse zusammengeführt und in die
Single Mode Faser 12 eingekoppelt. Dabei ist der Abstand der
Wellenlänge des Lichts 10' von der Wellenlänge des
Lichts 10'' ungefähr so groß wie der
Abstand zwischen den Stokes-Linien 19 bis 28 gemäß 2,
so dass zu jeder Stokes-Linie in dem Lichtspektrum, das durch das
Licht 10' ausgelöst wird, eine Stokes-Linie gleicher
Wellenlänge in dem Lichtspektrum existiert, das durch das
Licht 10'' ausgelöst wird. Wenn die beiden Laser 11' und 11'' dann
ihre Pulse zu unterschiedlichen Zeitpunkten emittieren, weist das
Abregungslicht 8 hinter dem wellenlängenselektiven
Element 14, das hier ein schmalbandiges Farbfilter 34 ist,
eine verdoppelte Pulsrate auf. Die Laserdiode 4, die das
Anregungslicht 8 gibt, wird dabei in Abhängigkeit
von beiden Mikrochiplasern 11' und 11'' getriggert,
die relativ zueinander freilaufen können, das heißt
untereinander nicht synchronisiert sein müssen.
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Während
das Fluoreszenzlichtmikroskop 1 gemäß 3 nur
eine Single Mode Faser 12 bei der Erhöhung der
Pulsrate der Pulse des Abregungslichts 8 einsetzt, sind
hierfür gemäß 4 zwei Single
Mode Fasern 12' und 12'' vorgesehen, in denen
jeweils das Licht 10' bzw. 10'' von einem der
Mikrochiplaser 11' bzw. 11'' ein Lichtspektrum
mit Stokes-Linien ausbildet. Dabei werden die beiden Lichtspektren
durch den Strahlteiler 31, der hier auch das wellenlängenselektive
Element 14 ausbildet, so zusammengeführt, dass
zwei Stokes-Linien mit leicht unterschiedlichen, aber doch gemeinsam
als Abregungslicht 8 verwendbaren Stokes-Linien auf einer
gemeinsamen optischen Achse austreten. Der sich an das Phasenfilter 9 anschließende
Teil des Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß 4 ist
nicht dargestellt und entspricht 3.
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- 1
- Fluoreszenzlichtmikroskop
- 2
- Probe
- 3
- Anregungslicht
- 4
- Laserdiode
- 5
- Objektiv
- 6
- Fluoreszenzlicht
- 7
- Detektor
- 8
- Abregungslicht
- 9
- Phasenfilter
- 10
- Licht
- 11
- Mikrochiplaser
- 12
- Single
Mode Faser
- 13
- Lichtleiterfaser
- 14
- wellenlängeselektives
Element
- 15
- Laser
- 16
- Strahlteiler
- 17
- Lichtspektrum
- 18
- Linie
- 19
- Stokes-Linie
- 20
- Stokes-Linie
- 21
- Stokes-Linie
- 22
- Stokes-Linie
- 23
- Stokes-Linie
- 24
- Stokes-Linie
- 25
- Stokes-Linie
- 26
- Stokes-Linie
- 27
- Stokes-Linie
- 28
- Stokes-Linie
- 29
- Abstand
- 30
- Halbwertsbreite
- 31
- Strahlteiter
- 32
- akustooptisches
Filter
- 33
- Linse
- 34
- Farbfilter
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 102005020003
A1 [0003]
- - US 6710918 [0004]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Agrawal, Ch.
8: Stimulated Raman Scattering (Agrawal, Govind P., Nonlinear Fiber
Optics, 2. ed., San Diego, Calif., 1995) [0009]