JP4212471B2

JP4212471B2 - 偏光コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡使用のシステム及び方法

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Publication number: JP4212471B2
Application number: JP2003510910A
Authority: JP
Inventors: カオリャンサニークイエ; ジ−キンチェン
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2001-07-03
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2022-06-27
Also published as: EP1405049A1; US20030011765A1; EP1405049B1; US6798507B2; JP2004534232A; ATE539330T1; WO2003004983A1

Description

本願は、米国仮特許出願第６０／３０２，９２８号（２００１年７月３日出願）の優先権を主張し、該仮特許出願の全記載内容を、本願明細書の一部としてここに援用する。

本発明は、顕微鏡使用法の分野に関し、より特定的にはコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡使用法の分野に関する。

コヒーレントアンチストークスラマン散乱（カース：ＣＡＲＳ）の顕微鏡使用法では、分子の振動をコントラストメカニズムとして使用することにより化学及び生物学的試料のイメージングを行う。特に、ＣＡＲＳ顕微鏡法では、少なくとも２つのレーザ場（laser field）、すなわち中心周波数ω_pのポンプ電磁場（pump electromagnetic field）と、中心周波数ω_sのストークス電磁場（Stokes electromagnetic field）とを使用する。ポンプ電磁場とストーク電磁場が試料と相互作用し、位相整合方向に周波数ω_AS＝２ω_p−ω_sを有するコヒーレントアンチストーク場を生成する。ω_p−ω_sのラマンシフトが所与の振動モードで共鳴するように整調されると、強化されたＣＡＲＳ信号がアンチストークス周波数ω_ASで観察される。

蛍光顕微鏡使用法とは異なり、ＣＡＲＳ顕微鏡使用法では、イメージングは生物学的及び化学的物質の振動コントラストに依存するため、蛍光体（光退色を受ける可能性がある）を使用する必要がない。さらに、ＣＡＲＳ顕微鏡使用法のコヒーレントな本質により、自然発生的ラマン顕微鏡法に比べてかなり高い感度を提供する。このため、より低い平均励起パワー（生物学的試料に対して耐性がある）を使用することができる。ω_AS＞ω_p，ω_sの事実により、バックグラウンド蛍光が存在しても信号が検出可能である。

例えば、米国特許第４，４０５，２３７号には、時間的及び空間的に重複した、異なる波長の２つのパルス列を使用して試料を同時に照射する、コヒーレントアンチストークスラマン分光学イメージング装置が開示されている。上記’２３７特許は、２つのレーザビームの非共線的形状及び二次元検出器による位相整合方向における信号ビームの検出を開示している。

米国特許第６，１０８，０８１号は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱を使用した顕微鏡振動的イメージングの別の方法及び装置を開示する。上記’０８１特許の装置では、共線的なポンプ及びストークスビームを、開口数（ＮＡ）の高い対物レンズによって集束させた。信号の励起強度に対する非線形の依存性により、焦点のプローブボリュームが小さいことを保証し、厚い試料の三次元区分を可能にする。信号ビームは順方向において検出される。

（上記’０８１特許にもとづく）従来技術のＣＡＲＳイメージングシステム１０が図１に概略的に示されている。システム１０において、それぞれ周波数ω_p，ω_sの共線的なポンプビーム及びストークスビーム１２が、顕微鏡対物レンズ１６及び試料１８に向けられる。ＣＡＲＳ信号が順方向において検出され、集光光学系２０によって受信され、１つ以上のフィルタ２２によってフィルタリングされ、検出器２６によって検出される。

しかしながら、ＣＡＲＳイメージングにおいて生成された信号は、かなりの量のバックグラウンドを含み、このバックグラウンドには信号がそこからフィルタリングされるか、または何らかの方法で識別されなければならない振動コントラスト（vibrational contrast）がない。例えば、図２に示されるように、水中に埋め込まれた５３５ｎｍのポリスチレン球の従来の横方向のＣＡＲＳ強度プロファイルは、球３２からの特性ＣＡＲＳ信号に加え、水３０からのＣＡＲＳバックグラウンドを相当量含む。このような等方性バルク水からのバックグラウンドが存在するために、ＣＡＲＳイメージング感度は、特に生物学的な用途において高めるのが難しい。ＣＡＲＳバックグラウンドは、三次非線形感受率に対する電子的な寄与によって生じる。対象となる試料及びこれを取り囲む等方性バルク媒体（すなわち、溶剤）のＣＡＲＳ信号に対する非共鳴の寄与も存在し、これはラマンシフトω_p−ω_sから独立している。

例えば、図３に示されるように、上皮細胞のＣＡＲＳ画像４０と線４４−４４に沿った強度プロファイル４２の合成図は、信号がＣＡＲＳバックグラウンドを含み、このバックグラウンドが顕微鏡試料信号から簡単に識別できないことを示している。横方向の寸法（μｍ）が横軸に沿って示され、信号強度（ｃｔｓ）が縦軸に沿って示されている。実施形態によっては、試料及び溶剤の非共鳴バックグランドが、試料の共鳴ＣＡＲＳ信号を圧倒する場合もある。

ＣＡＲＳ分光学において非共鳴バックグラウンド場を低減するための１つのアプローチとして、非共鳴バックグラウンドが共鳴信号とは異なる偏光（polarization）特性を有するという事実を利用する方法がある。実際には、この方法は、偏光方向の異なるノンコリニア（非共線）励起ビームを使用して行う。例えば、アウダー（Ｏｕｄｅｒ）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、シェン（Ｓｈｅｎ）による“Polarization-Sensitive Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy” （Applied Physics Letters, June 1979, pp.758-760 (1979)）及びアクマノフ（Ａｋｈｍａｎｏｖ）、ブンキン（Ｂｕｎｋｉｎ）、イワノフ（Ｉｖａｎｏｖ）、コロティブ（Ｋｏｒｏｔｅｅｖ）による“Coherent ellipsometry of Raman Scattering of Light”（JETP Letters, Vol.25, pp.416-420(1977)）を参照のこと。

しかしながら、高解像度の顕微鏡使用法においては、厳重に集束された（tightly focused）コリニア（共線）励起ビームが必要である。厳密に集束した偏光ビームは、偏光スクランブルを生じさせることが知られている。ボーン及びウルフ（Born and Wolf）による”Principles of Optics”（Pergaman Press, 1989, pp. 435-449）参照のこと。

米国特許第４，４０５，２３７号米国特許第６，１０８，０８１号アウダー（Ｏｕｄｅｒ）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、シェン（Ｓｈｅｎ）著、"Polarization-Sensitive Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy" （Applied Physics Letters, June 1979, pp.758-760 (1979) アクマノフ（Ａｋｈｍａｎｏｖ）、ブンキン（Ｂｕｎｋｉｎ）、イワノフ（Ｉｖａｎｏｖ）、コロティブ（Ｋｏｒｏｔｅｅｖ）著、"Coherent ellipsometry of Raman Scattering of Light"（JETP Letters, Vol.25, pp.416-420(1977)）ボーン及びウルフ（Born and olf）著、"Principles of Optics"（Pergaman Press, 1989, pp 435-449）

したがって、ＣＡＲＳ顕微鏡の改良された感度を提供し、特に、非共鳴バックグラウンドを低減し、より高い信号対バックグランド比を得るＣＡＲＳ検出スキームを提供するシステム及び方法が求められている。

本発明は、顕微鏡試料中に生成された非線形コヒーレント場を検出するシステム及び方法を提供する。１つの実施形態においては、システムは、第１周波数の第１の偏光（polarized）電磁場を生成する第１のソースと、第１周波数とは異なる第２周波数の第２の偏光電磁場を生成する第２のソースとを含む。システムは、さらに、第１の偏光電磁場と第２の偏光電磁場とを、偏光角の差がφになるように共線的に合成する光学系を含む。ここで、φはゼロと等しくない。光学系は、合成された電磁場を共通の焦点ボリュームに向ける。システムはさらに、焦点ボリュームにおける第１及び第２の偏光電磁場に応答して生成される非線形コヒーレント場を検出する偏光感応検出器を含む。

直線偏光ビームは、高開口数レンズによって厳密に集束されると、スクランブル偏光（scrambled polarization）を表すことが知られている。しかしながら、出願人は、このような厳密に集束した励起ビームの偏光スクランブルは、ＣＡＲＳ信号の非線形強度依存のために、ＣＡＲＳ信号の偏光をスクランブルしないということを発見した。高開口数レンズの使用において、出願人は、偏光濾波信号が非共鳴バックグラウンド信号を含む従来のＣＡＲＳ信号に優る可能性があることを見出した。本システムは、高感度でスペクトル選択性を備えた振動イメージングを可能にする。ラマン散乱と溶媒のいずれからの非共鳴バックグラウンド信号も、本発明の偏光技術により効果的に抑制される。例えば、たんぱく質アミドＩバンドのコントラストにもとづく汚点のない細胞（unstained cell）を鮮明に撮像できる。

図４に示されるように、本発明の１実施形態によるシステム５０は、ポンプビーム５２を生成するソースと第１偏光フィルタ５４、及びストークスビーム５６を生成するソースと第２偏光フィルタ５８を含む。１つのビーム、例えば図示されるようにポンプビームが、４分の１波長板６０及び２分の１波長板６２を含む偏光修正部を通過し、ポンプビームの偏光とストークスビームの偏光との角度差が生じる。２つのビームはビーム合成器６４によって合成され、例えばミラー６６を介して、例えばレンズ６８を含むイメージング光学系に向けられ、試料７０に向けられる。試料からの放射場（radiation field）（共鳴信号及び非共鳴信号のいずれも含む）が、例えばレンズ７２を含む光学系によって受光され、偏光フィルタ７４を通過してから、任意に波長フィルタ７６によって濾波され、レンズ７８を介して検出器８０の方向に向けられる。ポンプビームとストークスビームは、２つの同期された５ｐｓ近赤外線パルス列である。ポンプビームとストークスビームはいずれも直線偏光されている。ポンプビーム５２の偏光方向は２分の１波長板６２で調節可能である。角度φは、以下に説明するように７１．６度に設定される。４分の１波長板６０は、ダイクロイックミラー（二色鏡）によって誘導されたポンプ場における複屈折を補償するために使用される。下部の対物レンズは水式対物レンズ（water objective）（ＮＡ＝１．２）でもよく、上部の対物レンズはオイル対物レンズ（oil objective）（Ｎ．Ａ＝１．４）でもよい。偏光感応検出器（polarization sensitive detector）は、回転台上に取り付けられた偏光分析器と、データ取得システムに接続されたアバランシェフォトダイオードとを含む。更なる実施形態においては、例えば、同時係属中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１９６７８（２００１年６月２０日出願）に開示されるように、システムは後方（外（epi））方向に偏光感度検出器を含み、外方向において放射場を検出する。前記ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１９６７８は、２０００年７月１３日出願の米国仮特許出願第６０／２１８，０９１号の優先権を主張する。これらいずれの出願の記載内容も本願明細書の一部としてここに援用する。

システムの動作を以下に説明する。ポンプビーム５２は周波数ω_pを有し、ストークスビーム５６は周波数ω_Sを有し、いずれもｚ軸に沿って伝播する。図５に示されるように、ポンプビームはｘ軸に沿って直線偏光され、ストークスビームはｘ軸に対する角度φに沿って偏光される。ω_p−ω_sが分子振動で共鳴すると、入射場の試料との相互作用により、非共鳴部分Ｐ^NRと振動共鳴部分Ｐ^Rとを含む三次偏光が誘導される。Ｐ^NRのｘ及びｙ成分は次式のように表すことができる。

同様に、共鳴部分のｘ及びｙ成分も次のように表すことができる。

システムに電子的共鳴が存在しない場合、ｘ^NRは周波数から独立した実量である。この場合、非共鳴ＣＡＲＳ場の偏光解消度（depolarization ratio）ρ_NR＝ｘ^NR ₂₁₁₂／ｘ^NR ₁₁₁₁は１／３を想定する。したがって、Ｐ^NRは、次式のように、ｘ軸に対する角度αで直線偏光される。

ここで、角度αはｔａｎα＝ρ_NRｔａｎφによってφに関連付けられている。

図５は、ポンプ及びストークス場の偏光ベクトル、非共鳴ＣＡＲＳ信号、共鳴ＣＡＲＳ信号、及び分析器偏光器を示している。非共鳴バックグランドは、偏光がＰ^NRに垂直な状態で、分析器を検出器の手前に配置することで除去できる。Ｐ^R（式（２））の２成分のＰ^NRに垂直な方向に沿った全投射（total projection）は、次式のように表すことができる。

ここで、ρ_R＝ｘ^R ₂₁₁₂／ｘ^R ₁₁₁₁は、共鳴ＣＡＲＳ場の偏光解消度（depolarization ratio）である。値ρ_Rは、電子的共鳴が存在しない場合の自発ラマン偏光解消度に等しい。

理論上は、上式のＰ（垂直方向）からの信号にはバックグラウンドはない。しかしながら、実際には、信号パスにおける光学系の複屈折及び厳密な焦点での偏光のスクランブルのために、残留バックグラウンドが存在する。消光比（extinction ratio）は、分析器の回転によって得られる最大信号の最小信号に対する比として定義される。非共鳴バックグラウンドに対する消光比をｒとすると、振動コントラストは次式により求められる。

よって、αが４５度に等しいとき、振動のコトラストは最大になる。φ＝ｔａｎ^-1（３ｔａｎα）の関係により、角度φの最適値は７１．６度になる。偏光ＣＡＲＳ顕微鏡使用法は、ρ_R≠ρ_NRでのラマンバンドの仕様により振動イメージングに適用できる。例えば、ρ_Rがゼロであれば、平行偏光励起信号の場合に比べ、コントラストがｒ／４倍改良される。

検出器において測定されたポンプ信号とストークス信号の消光比はいずれもおよそ１２０：１である。水／ガラスの界面からの非共鳴ＣＡＲＳ信号のより高い消光比が、図６において符号８２で示されるように、偏光信号の評価において実験的に見られている。これは、ＣＡＲＳが３次非線形プロセスであり、よって入射場の消光成分がＣＡＲＳ信号にほとんど寄与しないためである。

図７は、水／ガラスの界面におけるポリスチレン球に対するＣＡＲＳスペクトル８４、Ｐ−ＣＡＲＳスペクトル８６及びラマンスペクトル８８を示している。１６００ｃｍ^-1及び１５８２ｃｍ^-1における２つのＰ−ＣＡＲＳバンドがラマンバンドに一致している。高い信号対バックグラウンド比（１０：１）が得られ、球及びその周囲の媒質からの非共鳴信号が効果的に抑制されていることが示されている。１６２０ｃｍ^-1近くの弱い水のラマンバンドからのＰ−ＣＡＲＳ信号は検出できない。より特定的には、カラーガラス上にスピンコートされて水で覆われた１μｍのポリスチレン球を使用した。１００ｋＨｚの繰り返し周波数（repetition rate）において、３５０μＷのポンプパワー及び２５０μＷのストークスパワーでＰ−ＣＡＲＳスペクトラムを得た。ポンプ周波数は１３３２５ｃｍ^-1に固定された。ストークス周波数は１１６９１ｃｍ^-1から１１７８０ｃｍ^-1に整調された。Ｐ−ＣＡＲＳ信号は３０倍に乗算された。

図８Ａから図８Ｃは、ω_p−ω_sが１６０１，１５８２及び１５５３ｃｍ^-1に整調されたポリスチレン球のＰ−ＣＡＲＳ画像を示している。ポンプ及びストークスパワーは、４００ｋＨｚの繰り返し周波数で、それぞれ１．４及び０．７ｍｗであった。取得時間は、各画像で１．０分であった。強度プロファイル９０，９２及び９４が、矢印で示される線９６−９６を横切るように画像の下部に示されている。ω_p−ω_sが１６０１ｃｍ^-1に整調されている場合、高い信号対バックグラウンド比が球を横断する強度プロファイルから見られる。ω_p−ω_sを１５８２ｃｍ^-1に整調すると、ピーク強度は図８Ａに示されるピーク強度の半分になり、これは図７に示されるポリスチレンのＰ−ＣＡＲＳスペクトルに一致する。ω_p−ω_sが任意の振動共鳴からはずれて整調されると、信号はほぼ消滅する。これらの結果により、Ｐ−ＣＡＲＳ顕微鏡使用法がコントラストの高い振動イメージングを実現することが示される。

図９に示されるように、純Ｎメチルアセトアミド液のラマンスペクトル１００及びＰ−ＣＡＲＳスペクトル１０２が、４００ｋＨｚのパルス繰り返し周波数で、１．６ｍＷ及び０．８ｍＷの平均ポンプパワー及びストークスパワーで記録された。Ｎ−メチルアセトアミドは、ペプチドの特性アミド振動を含むモデル化合物である。１６５２ｃｍ^-1におけるアミドＩバンドが、高い信号対バックグラウンド比を示している。アミドＩバンドにもとづく汚点のない上皮細胞のＰ−ＣＡＲＳイメージングが例示される。図１０Ａ及び図１０Ｂは、ω_p−ω_sがそれぞれ１６５０ｃｍ^-1及び１７４５ｃｍ^-1に整調された、汚点のない上皮細胞のＰ−ＣＡＲＳ画像を示している。ポンプパワーとストークスパワーは、４００ｋＨｚの繰り返し周波数において、それぞれ１．８ｍＷ及び１．０ｍＷであった。取得時間は８分であった。画像の下部には、画像中に示された線に沿った強度プロファイル１０４及び１０６が示されている。ω_p−ω_sを１６５２^-1のプロテインアミドＩバンドに整調することにより、細胞質の複数の小さい特徴から強度の信号が観察される（図１０Ａ）。これらの明るい特色は、たんぱく質が豊富で、将来的な研究対象となる糸粒体であってもよい。核はより弱い信号を示す。ω_p−ω_sがアミドＩバンドからはずれて１７４５ｃｍ^-1に調整されると、振動コントラストは大きく減少する（図１０Ｂ）。これにより、コントラストに主に寄与するのはアミドＩバンドの共鳴ＣＡＲＳ信号であることが示される。

したがって、偏光ＣＡＲＳ顕微鏡使用法は、ラマン散乱及びその周囲の媒質からの非共鳴バックグラウンドを抑制することにより、高いコントラストで、（例えばたんぱく質の）振動イメージングを実現する。例えば、たんぱく質のアミドバンドにもとづくライブ細胞の高感度振動イメージングが示される。使用された平均励起パワー（〜２ｍＷ）は、ライブの細胞によって許容できる。この方法は、異種の物質における種々の化学種のイメージングにも使用できる。

当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、上記の実施形態には数多くの修正及び変更が可能であることがわかるだろう。

従来技術のＣＡＲＳ顕微鏡使用システムの概略図である。図１に示されるような従来技術のＣＡＲＳ顕微鏡システムにより記録した、試料のＣＡＲＳ画像及び横方向の強度プロファイルを示すグラフ表示である。図１に示されるような従来技術のＣＡＲＳ顕微鏡システムにより記録した、上皮細胞のＣＡＲＳ画像及び横方向の強度プロファイルを示すグラフ表示である。本発明の実施形態による偏光ＣＡＲＳ顕微鏡システムの概略図である。図４に示されるようなシステムにおけるポンプ、ストークス、共鳴及び非共鳴場の偏光ベクトルを概略的に示すグラフである。非共鳴ＣＡＲＳ信号と、ストークスビームと分析器との角度偏光差との関係を示すグラフである。試料に対する、本発明の実施形態によるラマンスペクトル、ＣＡＲＳスペクトル、偏光ＣＡＲＳスペクトルを示すグラフである。本発明の実施形態によって記録された試料の偏光ＣＡＲＳ画像及び横方向の強度プロファイルを示す図である。本発明の実施形態によって記録された試料の偏光ＣＡＲＳ画像及び横方向の強度プロファイルを示す図である。本発明の実施形態によって記録された試料の偏光ＣＡＲＳ画像及び横方向の強度プロファイルを示す図である。本発明の実施形態によるさらなる試料のラマンスペクトル及び偏光ＣＡＲＳスペクトルを示すグラフである。本発明の実施形態によって記録されたさらなる試料の偏光ＣＡＲＳ画像及び横方向の強度プロファイルを示すグラフである。本発明の実施形態によって記録されたさらなる試料の偏光ＣＡＲＳ画像及び横方向の強度プロファイルを示すグラフである。

Claims

焦点ボリュームの中の顕微鏡試料に生成された非線形コヒーレント場を検出するシステムであって、
第１の周波数の第１の偏光電磁場を生成する第１のソースと、
前記第１の周波数と異なる第２の周波数で第２の偏光電磁場を生成する第２のソースと、
第１の偏光電磁場と第２の偏光電磁場とを、偏光角の差φがゼロでないように共線的に合成し、合成された電磁場を前記焦点ボリュームに向ける光学系と、
偏光フィルタを含み、前記焦点ボリュームにおける前記第１及び第２の偏光電磁場に応答して生成された非線形コヒーレント場を検出する偏光感応検出器と、
を含むシステム。
請求項１に記載のシステムにおいて、
前記非線形コヒーレント場は、共鳴部分と非共鳴部分とを含み、
前記非共鳴部分は、第３偏光角に沿って偏光され、
前記偏光感応検出器は、前記第３偏光角にほぼ垂直な方向に偏光させた放射場を検出する
システム。
請求項１に記載のシステムにおいて、
前記角度φは約７１度に等しいシステム。
請求項１に記載のシステムにおいて、
前記第１のソースは４分の１波長板を含むシステム。
請求項１に記載のシステムにおいて、
前記第１のソースは２分の１波長板を含むシステム。
請求項１に記載のシステムにおいて、
前記第１のソースは偏光フィルタを含むシステム。
請求項１に記載のシステムにおいて、
前記第２のソースは偏光フィルタを含むシステム。
前記第１のソースおよび第２のソースは、それぞれ偏光フィルタを含むシステム。
焦点ボリュームの中の試料からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱信号を検出するシステムであって、
ポンプ周波数のポンプ場を生成するポンプソースと、
前記ポンプ周波数とは異なるストークス周波数のストークス場を生成するストークスソースと、
前記ポンプ場を偏光させて偏光ポンプ場を生成するポンプ偏光光学系と、
前記ストークス場を偏光させて偏光ストークス場を生成するストークス偏光光学系と、
前記偏光ポンプ場と前記偏光ストークス場の偏光方向の角度がゼロでないように調節する調節光学系と、
前記偏光ポンプ場と前記偏光ストークス場とを共線的に合成し、合成された電磁場を前記焦点ボリュームに向ける光学系と、
偏光フィルタを含み、前記焦点ボリュームにおける前記偏光ポンプ場と前記偏光ストークス場とに応答して生成された非線形コヒーレント場を検出する偏光感応検出器と、
を含むシステム。
請求項９に記載のシステムにおいて、
前記調節光学系は４分の１波長板を含むシステム。
請求項９に記載のシステムにおいて、
前記調節光学系は２分の１波長板を含むシステム。
請求項９に記載のシステムにおいて、
前記偏光感応検出器は偏光フィルタを含むシステム。
請求項１２に記載のシステムにおいて、
前記偏光フィルタは、前記焦点ボリュームにおける前記偏光ポンプ場と前記偏光ストークス場との相互作用によって生成された非共鳴信号の偏光角に垂直な角度に位置決めされているシステム。
請求項９に記載のシステムにおいて、
前記調節光学系は、前記偏光ポンプ場と前記偏光ストークス場との偏光方向の角度関係を約７０度に調節するシステム。
請求項１〜１４のいずれか１つに記載のシステムにおいて、
前記合成された電磁場を前記焦点ボリュームに向ける光学系は、開口数１．２の集束レンズを含むシステム。
焦点ボリュームの中の顕微鏡試料に生成された非線形コヒーレント場を検出する方法であって、
第１の周波数の第１の電磁場を生成するステップと、
前記第１の周波数と異なる第２の周波数の第２の電磁場を生成するステップと、
前記第１の電磁場を偏光させるステップと、
前記第２の電磁場を偏光させるステップと、
前記偏光第１電磁場と前記偏光第２電磁場の偏光方向の角度がゼロでないように調節するステップと、
前記偏光第１電磁場と前記偏光第２電磁場とを共線的に合成するステップと、
合成された前記第１の偏光電磁場と前記偏光第２電磁場とを前記焦点ボリュームに向けるステップと、
前記焦点ボリュームにおける前記第１の偏光電磁場及び前記第２偏光電磁場に応答して生成された非線形コヒーレント場を偏光フィルタを含む偏光感応検出器で、検出するステップと、
を含む方法。
請求項１６に記載の方法において、
前記非線形コヒーレント場を検出するステップは、前記焦点ボリュームにおける前記偏光第１電磁場と前記偏光第２電磁場との相互作用によって生成された前記非線形コヒーレント場の偏光フィルタリングを含む方法。
焦点ボリュームの中の試料からコヒーレントアンチストークスラマン散乱信号を検出する方法であって、
ポンプ周波数の偏光ポンプ場を生成するステップと、
前記ポンプ周波数と異なるストークス周波数の偏光ストークス場を生成するステップと、
前記ポンプ場と前記ストークス場を、該ストークス場とポンプ場との相対偏光角がゼロでないように共線的に合成するステップと、
前記ポンプ場とストークス場を、集束レンズを通過させ、前記焦点ボリュームに向けて順方向に向けるステップと、
前記試料ボリュームから生成されたコヒーレントアンチストークス場を偏光フィルタを含む偏光感応検出器で、検出するステップと、
を含む方法。