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Die
Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungslichtquelle
für Anregungslicht,
um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe während eines begrenzten Zeitraums
in einem räumlichen
Bereich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht mit Wellenlängen in
einem Wellenlängenbereich
anzuregen, und mit einer gepulsten Abregungslichtquelle für Abregungslicht,
um den Fluoreszenzfarbstoff bis auf einen gegenüber dem räumlichen Bereich verkleinerten
Restbereich wieder abzuregen, wobei Licht von der Probe mit anderen
Wellenlängen
als denjenigen des Anregungslichts und des Abregungslichts der spontanen
Emission von Fluoreszenzlicht aus dem Restbereich des räumlichen
Bereichs zuordbar ist.
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Das
Wiederabregen des Fluoreszenzfarbstoffs kann dabei so betrieben
werden, dass der Restbereich, d. h. der Teilbereich der Probe, in
dem der Fluoreszenzfarbstoff angeregt bleibt und aus dem spontan
emittiertes Fluoreszenzlicht von der Probe ausschließlich stammt,
kleiner als die Beugungsgrenze wird. D. h., mit einem Fluoreszenzmikroskop
der eingangs beschriebenen Art kann die Abbe'sche Beugungsgrenze bei der räumlichen
Auflösung
unterschritten werden.
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Insbesondere
bezieht sich die Erfindung auf ein solches Fluoreszenzmikroskop,
bei dem die Abregungslichtquelle vorgesehen ist, um den Fluoreszenzfarbstoff
außerhalb
des Restbereichs durch stimulierte Emission mit der Wellenlänge des
Abregungslichts wieder abzuregen. Ein derartiges Fluoreszenzmikroskop
wird auch als STED-Fluoreszenzmikroskop bezeichnet, wobei die Abkürzung STED für Stimulated
Emission Depletion = Entvölkerung (des
fluoreszenzfähigen
Zustands) durch stimulierte Emission steht.
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Ein
STED-Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art ist aus
der WO 95/21393 bekannt. Zu einem gepulsten Laser, der als Anregungslichtquelle
verwendet werden kann, ist hier angegeben, dass er das Anregungslicht
vorzugsweise mit einer Pulsbreite von 1 fs bis 1 ns abgibt. Ein
als Abregungslichtquelle verwendeter Laser soll das Abregungslicht
hingegen mit einer bevorzugten Pulsbreite von 1 ps bis 1 ns abgeben.
Mit welchen Lasern dies realisiert werden soll, ist in der WO 95/21393 nicht
offenbart. Beide angegebenen Pulsbreiten sind deutlich kürzer als
die Lebensdauer des fluoreszierenden Zustands eines typischen Fluoreszenzfarbstoffs
von einigen wenigen Nanosekunden.
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In
der Praxis der STED-Fluoreszenzmikroskopie hat sich herausgestellt,
dass die Pulsbreite des Abregungslichts vorzugsweise länger als
etwa 100 ps sein sollte. Längere
Pulse führen
zu einer Ineffizienz bei der stimulierten Emission, kürzere hingegen bei
den für
eine vollständige
Abregung erforderlichen hohen Energien pro Puls zu die Probe schädigenden Prozessen,
vermutlich durch Mehrfotonenabsorption. Als Abregungslichtquellen
für die
STED-Fluoreszenzmikroskopie werden derzeit verschiedene Dioden-
und Festkörperlaser
verwendet. Mit Diodenlasern werden die für STED-Fluoreszenzmikroskopie benötigten Energien
pro Puls kaum erreicht. Bei Festkörperlasern, z. B. Titan-Saphir
Lasern, sind die im gepulsten Betrieb erreichbaren Pulsbreiten deutlich
kürzer
als 100 ps und müssen
durch nachgeschaltete Systeme gestreckt werden, die jedoch die Strahlqualität beeinträchtigen.
Zudem ist die Linienbreite von gepulsten Festkörperlasern mit einigen Nanosekunden
vergleichsweise breit.
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Eine
weitere Anforderung an die Abregungslichtquelle und auch an die
Anregungslichtquelle besteht in der Praxis der STED-Fluoreszenzmikroskopie
darin, für
die Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe Anregungslicht
mit unterschiedlichen Wellenlängen
und hierauf abgestimmtes Abregungslicht mit entsprechend ebenfalls
unterschiedlichen Wellenlängen
bereitzustellen. Hierzu sind durchstimmbare Laserlichtquellen bekannt,
z. B. Titan-Saphir Laser mit nachgeschaltetem optisch parametrisiertem
Oszillator (OPO). Diese durchstimmbaren Laserlichtquellen sind jedoch
als solche extrem komplex und weisen zudem die oben zu Festkörperlasern aufgeführten grundsätzlichen
Nachteile auf.
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Für ein konfokales
Fluoreszenzmikroskop, also ein Fluoreszenzmikroskop, bei dem keine
Erhöhung
der räumlichen
Auflösung
durch Wiederabregen des Fluoreszenzfarbstoffs in der räumlichen
Umgebung eines interessierenden Teilbereichs der Probe erfolgt,
ist es aus der WO 99/42884 bekannt, akusto-optische Elemente als
spektral selektive Elemente einzusetzen, um das von der Probe kommende
Fluoreszenzlicht von dem Anregungslicht zu trennen. Akusto-optische
Elemente zeichnen sich durch eine besonders hohe spektrale Selektivität aus. So
ist es mit einem akusto-optischen Element möglich, Licht mit einer Linienbreite
von 1 nm auszublenden. Derart schmalbandiges Licht wird in aktuellen
konfokalen Fluoreszenzmikroskopen von als Anregungslichtquellen
verwendeten und als Dauerstrichlaser betriebenen Festkörperlasern
bereitgestellt.
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Diese
Filterbreite von akusto-optischen Elementen kann nicht erhöht werden,
um sie an auszublendendes Licht mit größerer Linienbreite anzupassen.
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Neben
gepulsten Dioden- und Festkörperlasern
sind auch gepulste Gaslaser in Form so genannter modengekoppelter
Gaslaser bekannt. Diese sind jedoch derzeit nicht kommerziell verfügbar. Kommerziell
verfügbar
sind derzeit nur als Dauerstrichlaser zu betreibende Gaslaser.
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Ein
bekannter Gaslaser ist der ArKr-Laser, der als Dauerstrichlaser
z. B. in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt wird.
Ein Vorteil des ArKr-Lasers ist, dass er eine Mehrzahl von Wellenlängen im
zur Anregung von Fluoreszenzfarbstoff nutzbaren Spektralbereich
aufweist. Es besteht jedoch eine grundsätzliche Tendenz, alle Gaslaser
aus Kosten- und Stabilitätsgründen durch
Festkörperlaser
zu ersetzen. Aus den genannten Kosten- und Stabilitätsgründen ist
es häufig
sogar sinnvoll, statt eines ArKr-Lasers mehrere Festkörperlaser,
möglicherweise
kombiniert mit optisch parametrisierten Oszillatoren (OPOs) einzusetzen,
um bei einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop Anregungslicht mit unterschiedlicher
Wellenlänge
bereitzustellen.
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AUFGABE DER
ERFINDUNG
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Fluoreszenzmikroskop der
eingangs beschriebenen Art, insbesondere ein STED-Fluoreszenzmikroskop,
aufzuzeigen, bei dem grundsätzlich
besonders günstige
Voraussetzungen für
das Trennen des Fluoreszenzlichts aus einem interessierenden Teilbereich der
Probe von anderem Licht von der Probe gegeben sind.
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LÖSUNG
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Die
Aufgabe der Erfindung wird durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den
Merkmalen des unabhängigen
Patentanspruchs 1 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen
des neuen Fluoreszenzmikroskops sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 11
beschrieben.
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BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Bei
dem neuen Fluoreszenzmikroskop ist die Abregungslichtquelle ein
modengekoppelter Gaslaser mit einer Linienbreite des Abregungslichts
von weniger als 2 nm. Überraschenderweise
stellt sich heraus, dass der Aufwand für einen kommerziell nicht verfügbaren modengekoppelten
Gaslaser und auch die mit seinem Betrieb verbundenen Stabilitätsprobleme
dadurch aufgewogen werden, dass insbesondere das Abregungslicht
mit einer Linienbreite von weniger als 2 nm bereitgestellt werden
kann. Modengekoppelte Gaslaser sind ohne weiteres in der Lage, gepulstes
Abregungslicht mit einer Linienbreite von maximal 1,0 nm und auch
noch deutlich weniger bereitzustellen. Dies ermöglicht es, Licht von der Probe
mit der Wellenlänge
des Abregungslichts sehr schmalbandig von dem spontan emittierten
Fluoreszenzlicht von der Probe zu trennen. Hierdurch werden Bandbreitenverluste
bei der Detektion des aus dem jeweiligen Restbereich der Probe spontan
emittierten Fluoreszenzlichts minimiert. Mit einem modengekoppelten
Gaslaser als Abregungslichtquelle sind jedoch noch weitere grundsätzliche
Vorteile verbunden. Die Kohärenzlänge von
modengekoppelten Gaslasern ist vergleichsweise lang, so dass die
gezielte Ausbildung von Interferenzmustern mit dem Abregungslicht,
wie sie beispielsweise im Rahmen der so genannten 4 Pi-Fluoreszenzmikroskopie
zur räumlichen
Verteilung des Abregungslichts um einen interessierenden Teilbereich
einer Probe eingesetzt wird, ohne kritische Justagen im Strahlengang
möglich
ist. Modengekoppelte Gaslaser besitzen auch eine ausgezeichnete
transversale Mode TEM00 mit sehr guter Strahlqualität. Daneben
können
modengekoppelte Gaslaser zur gezielten Beeinflussung des abgestrahlten
Laserlichts auch selektiv in einer höheren Mode, wie beispielsweise
TEM01, TEM10, TEM11 usw. betrieben werden. Die verfügbaren Pulsenergien
sind bei einem Gaslaser ausreichend hoch, und dies bei in aller
Regel mehreren für
das Abregungslicht verfügbaren
Linien, bei denen der Gaslaser selektiv oder auch simultan betrieben
werden kann.
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Die
Vorteile eines modengekoppelten Gaslasers als Abregungslichtquelle
sind zum Beispiel voll nutzbar, wenn die Abregungslichtquelle vorgesehen ist,
um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb
des Restbereichs der Probe durch stimulierte Emission wieder abzuregen.
Die von dem Abregungslicht stimulierte Emission der Probe weist
die Wellenlänge
des Abregungslichts auf. Das heißt, wenn die Linienbreite des Abregungslichts,
wie bei dem modengekoppelten Gaslaser besonders schmal ist, gilt
dies auch für
die stimulierte Emission der Probe. Diese kann also mit einem schmalbandigen
Filter zusammen mit reflektierten Anteilen des Abregungslichts von
dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht abgetrennt werden. Selbst
wenn die Wellenlänge
des Abregungslichts mitten innerhalb des Wellenlängenbereichs liegt, in dem
der Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiert, bleibt es daher bei
nur kleinen Bandbreitenverlusten bei der Detektion des in einem
interessierenden Teilbereich der Probe spontan emittierten Fluoreszenzlichts.
Da jedoch festzustellen ist, dass der relative Anteil der stimulierten
Emission der Probe an dem Licht von der Probe mit der Wellenlänge des
Abregungslichts gegenüber
den von der Probe reflektierten Anteilen des Abregungslichts in
aller Regel vernachlässigbar
gering ist, stellen sich wesentlichen Vorteile des neuen Fluoreszenzmiroskops
allein dadurch ein, dass das Abregungslicht spektral schmalbandig
ist und entsprechend seine von der Probe reflektierten Anteile von
dem Fluoreszenzlicht spektral schmalbandig, d.h. mit geringen Detektionsbandbreitenverlusten, von
der Probe abtrennbar sind.
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Ein
weiterer wichtiger Vorteil von modengekoppelten Gaslasern ist, dass
sie in der Lage sind, Licht mit Pulsbreiten in einem Bereich von
50 bis 1000 ps und dabei insbesondere auch in einem Bereich von
100 bis 500 ps bereitzustellen. Hierdurch wird der für die STED-Fluoreszenzmikroskopie
ideale Pulsbreitenbereich des Abregungslichts von mehr als 100 bis
etwa 300 ps voll abgedeckt.
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Wenn
der modengekoppelte Gaslaser des neuen Fluoreszenzmikroskops ein
ArKr-Gaslaser ist, so kann bei dem Abregungslicht auf die Vielzahl
der für
die Abregung eines Fluoreszenzfarbstoffs brauchbaren Linien eines
ArKr-Gaslasers zurückgegriffen werden.
Dabei kann auch die Lichtquelle für das Anregungslicht ein ArKr-Gaslaser
sein. Es ist sogar möglich,
einen einzigen ArKr-Gaslaser sowohl als Anregungslichtquelle als
auch als Abregungslichtquelle vorzusehen, wobei er Laserlicht mit
mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen zugleich abgibt. In diesem
Fall sind für
das Anregungslicht und das Abregungslicht vorzugsweise partiell
unterschiedliche Strahlengänge
zu der Probe vorzusehen, wobei die Weglänge mindestens eines der beiden Strahlengänge gegenüber derjenigen
des anderen Strahlengangs veränderbar
ist, um die zeitliche Abfolge des Eintreffens des Anregungslichts
und des Abregungslichts in der Probe einzustellen.
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Der
modengekoppelte Gaslaser als Anregungslichtquelle des neuen Fluoreszenzmikroskops kann
aber auch in an sich bekannter Wiese mit einem weiteren Laser synchronisiert
sein, der die Anregungslichtquelle ausbildet. Der weitere Laser
kann, wie im Zusammenhang mit dem ArKr-Gaslaser schon angedeutet
wurde, ein weiterer modengekoppelter Gaslaser sein. Es kann sich
aber beispielsweise auch um einen Dioden- oder Festkörperlaser
handeln. Eine Synchronisation des modengekoppelte Gaslaser des neuen
Fluoreszenzmikroskops mit einem oder mehreren weiteren Lasern gleicher
oder unterschiedlicher Bauart kann auch zum Zweck von Mehrfarbenanwendungen
erfolgen.
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In
besonders bevorzugten konkreten Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzmikroskops ist
mindestens ein akusto-optisches Element vorgesehen, das Licht mit
der Wellenlänge
des Abregungslichts von dem Fluoreszenzlicht von der Probe abtrennt.
Aufgrund der geringen Linienbreite des Abregungslichts kann bei
dem neuen Fluoreszenzmikroskop ein akusto-optisches Element eingesetzt werden,
um das von der Probe kommende Licht mit der Wellenlänge des
Abregungslichts selektiv auszublenden. Dabei kann das akusto-optische
Element ein so genanntes AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder ein
AOTF (Acousto-Optical-Tuneable-Filter) sein.
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Jedes
akusto-optische Element kann gleichzeitig auch dazu vorgesehen sein,
von der Probe reflektiertes Anregungslicht von dem Fluoreszenzlicht von
der Probe abzutrennen. Auf diese Weise bleibt nur das spontan emittierte
Fluoreszenzlicht aus dem interessierenden Teilbereich der Probe übrig.
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Mindestens
eines der akusto-optischen Elemente kann auch zur Ausbildung eines
akusto-optischen
Strahlteilers verwendet werden, mit dem zugleich das Anregungslicht
und/oder das Abregungslicht in den Strahlengang zwischen einem Fotodetektor
und der Probe eingekoppelt wird.
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Der
Restbereich des räumlichen
Bereichs, dessen spontaner Emission von Fluoreszenzlicht das Licht
von der Probe mit anderen Wellenlängen als denjenigen des Anregungslichts
und des Abregungslichts zuordbar ist, kann aus einem einzelnen punktförmigen oder
linienförmiger
Teilbereich der Probe oder aus einem Muster aus mehreren punkt-
oder linienförmigen
Teilbereichen bestehen. D. h., der durch das Abregungslicht gegenüber dem
räumlichen
Bereich, in dem die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Anregungslicht
erfolgte, verkleinerte Restbereich kann sowohl einen als auch mehrere
punktförmige
Teilbereiche, aber auch einen oder mehrere linienförmige Teilbereiche
umfassen. eine Verbesserung der räumlichen Auflösung bis
unter die Beugungsgrenze wird bereits dann erreicht, wenn die Abmessungen
der jeweiligen Teilbereiche die Beugungsgrenze in einer einzigen
Richtung unterschreiten.
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Vorteilhafte
Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen und
der gesamten Beschreibung. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere
den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer
Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen.
Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen
der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche abweichend
von den gewählten
Rückbeziehungen
ist ebenfalls möglich
und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die
in separaten Zeichnungsfiguren dargestellt sind oder bei deren Beschreibung
genannt werden. Diese Merkmale können
auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Im
Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter
bevorzugter Ausführungsbeispiele
weiter erläutert
und beschrieben.
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1 zeigt
die Energieniveaus eines Fluoreszenzfarbstoffs, die im Rahmen seiner
Verwendung bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie eine Rolle spielen.
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2 skizziert
den zeitlichen Ablauf der Pulse des Anregungslichts und des Abregungslichts
bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie.
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3 skizziert
die zu 1 zugehörigen Wellenlängen und
Wellenlängenspektren.
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4 zeigt
ein Blockdiagramm zu dem neuen Fluoreszenzmikroskop.
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5 skizziert
eine Realisation des Fluoreszenzmikroskops gemäß 4; und
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6 zeigt
eine Anordnung von zwei akusto-optischen Elementen im Strahlengang
zwischen einer Probe und einem Fotodetektor gemäß 4 oder 5.
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FIGURENBESCHREIBUNG
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1 zeigt
das Energiespektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs. Durch Anregungslicht 5 gelangt der
Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Grundzustand 1 innerhalb
seines elektrischen S0-Zustands in einen angeregten
Zustand 4 innerhalb seines elektrischen S1-Zustands.
Dieser angeregte Zustand 4 zerfällt innerhalb des elektrischen
S1-Zustands in den fluoreszierenden Zustand 3.
Aus dem fluoreszierenden Zustand 3 gelangt der Fluoreszenzfarbstoff
unter spontaner Emission von Fluoreszenzlicht 6 wieder
in einen Zustand innerhalb seines elektrischen S0-Zustands.
Der Fluoreszenzfarbstoff kann aber auch durch Abregungslicht 7 zu
stimulierter Emission gezwungen werden, insbesondere dann, wenn
die Intensität
des Abregungslichts 7 über
einer Sättigungskonzentration
für die
Stimulation des Fluoreszenzfarbstoffs zu der stimulierten Emission
liegt. Die Stimulation des Fluoreszenzfarbstoffs zu der stimulierten
Emission wird bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie
dazu genutzt, eine mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Probe,
die aufgrund der Abbe'schen Beugungsgrenze
nur innerhalb eines einen interessierenden Teilbereich einschließenden und
größeren räumlichen
Bereichs mit dem Anregungslicht 5 zur spontanen Fluoreszenz
angeregt werden kann, außerhalb
des Teilbereichs mit dem Abregungslicht 7 wieder abzuregen,
wodurch die räumliche
Auflösung beim
Messen der Probe durch Erfassen des aus dem Teilbereich emittierten
Fluoreszenzlichts unter deutlichem Überschreiten der Beugungsgrenze
gesteigert werden kann. Aufgrund der Lebensdauer des fluoreszierenden
Zustands 3 von typischerweise einigen wenigen Nanosekunden
ist es eine technische Herausforderung, das interessierende Fluoreszenzlicht 6 aus
dem jeweiligen Teilbereich der Probe sowohl von reflektierten Anteilen
des Anregungslichts 5 als auch von reflektierten Anteilen
des Abregungslichts 7 zu separieren. Daneben tritt zwar
auch noch zusätzliches
Licht in Form der mit dem Abregungslicht 7 stimulierten
Emission des Fluoreszenzfarbstoffs auf; diese stimulierte Emission
weist aber dieselbe Wellenlänge
wie das Abregungslicht 7 auf, ist also von diesem nicht
zu unterscheiden, und ihre Intensität ist viele Größenordnungen
kleiner als diejenige der reflektierten Anteile des Abregungslichts 7.
D. h., dieses zusätzliche
Licht ist in aller Regel praktisch vernachlässigbar, auch wenn es im Folgenden
extra angesprochen wird.
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2 zeigt
ein Beispiel für
die zeitliche Abfolge der Intensitäten des Anregungslichts 5,
des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6 und des Abregungslichts 7 bei
der STED-Fluoreszenzmikroskopie.
Einem Puls 8 des Anregungslichts 5 folgt ein Puls 9 des
Abregungslichts 7. Der Puls 9 weist günstiger
Weise eine Pulsdauer von über
100 ps bis zu etwa 300 ps auf, um einerseits deutlich kürzer als
der Zeitraum zu sein, über
den das Fluoreszenzlicht 6 von dem Fluoreszenzfarbstoff
spontan emittiert wird, und um andererseits trotz der gewünschten
Sättigung
bei der stimulierten Emission die Probe und den Fluoreszenzfarbstoff
nicht mit übermäßigen Energiedichten
zu belasten. Der Puls 8 des Anregungslichts 5 kann,
wie hier dargestellt, kürzer
als der Puls des Abregungslichts 7 sein. Dies ist jedoch
nicht zwingend. Auch der zeitliche Abstand der beiden Pulse 8 und 9 ist
hier nur als Beispiel zu verstehen. So ist auch eine weitgehende
zeitliche Überschneidung
der Pulse 8 und 9 möglich. Die zeitliche Relativlage
der Pulse 8 und 9 ist dahingehend zu optimieren,
dass das Signal des Fluoreszenzlichts 6 aus dem interessierenden
Teilbereich der Probe besonders deutlich ist. Eine zeitliche Separation
des Fluoreszenzlichts 6 aus dem interessierenden Teilbereich
der Probe ist aufgrund der dichten Abfolge der Pulse 8 und 9 und des
sich daran unmittelbar anschließenden
interessierenden Fluoreszenzlichts 6 allerdings allenfalls
mit extremem Aufwand möglich
und bislang nicht realisiert worden.
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Praktisch
erfolgt daher die Abtrennung des Anregungslichts 5 und
des Abregungslichts 7 von dem interessierenden Fluoreszenzlicht 6 durch
eine spektrale Selektion. 3 skizziert
die Wellenlängen Lambda,
die bei dem anhand der 1 und 2 erläuterten
Vorgang auftreten. Wenn man von vernachlässigbar kleinen Anteilen des
spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6 absieht, weist
das Anregungslicht 5 die kürzeste Wellenlänge, d.
h. die höchste
Quantenenergie, auf. Das Fluoreszenzlicht 6 weist auch
in dem hier dargestellten Fall von spektral schmalbandigem Anregungslicht 5 Wellenlängen Lambda
aus einem vergleichsweise ausgedehnten Wellenlängenbereich 10 von
einigen Nanometern Breite auf. Die Wellenlänge des Abregungslichts 7 ist länger als
diejenige des Anregungslichts 5 und hier auch länger als
die meisten auftretenden Wellenlängen
des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6. Damit bleibt
ein Detektionsfenster 11 zwischen den Wellenlängen des
Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7, in
dem spontan emittiertes Fluoreszenzlicht 6 detektiert werden
kann, ohne zugleich von der jeweiligen Probe reflektiertes Anregungslicht 5 oder
Abregungslicht 7 bzw. die stimulierte Emission mit derselben
Wellenlänge
wie das Abregungslicht 7 aus anderen Bereichen der Probe
als dem interessierenden Teilbereich zu detektieren. Die spektrale
Breite des Detektionsfenster 11 hängt stark davon ab, wie groß die Linienbreiten
des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 tatsächlich sind,
die hier sehr schmalbandig wiedergegeben sind. Insbesondere kommt
es dabei auf die Linienbreite des Abregungslichts 7 an,
da sich dessen Wellenlänge
grundsätzlich viel
tiefer innerhalb des Wellenlängenbereichs 10 befindet,
während
die Wellenlänge
des Abregungslichts 5 immer am äußeren Rand des Wellenlängenbereichs 10 liegt.
Insbesondere dann, wenn die Wellenlänge des Abregungslichts 7 noch
tiefer als in 3 dargestellt in dem Wellenlängenbereich 10 liegt, kann
es zur Erzielung einer großen
Detektionsbandbreite nötig
werden, auch Anteile des Fluoreszenzlichts 6 mit größerer Wellenlänge als
der Wellenlänge des
Abregungslichts 7 zu detektieren. Hierzu muss dann aus
einem sich weiter zu größeren Wellenlängen hin
erstreckenden Detektionsfenster 11 das Abregungslicht 7 selektiv
ausgeblendet werden. Dies gelingt nur mit sehr schmalbandigen Filtern.
Als solche schmalbandigen Filter sind konkret akusto-optische Elemente
bekannt, mit denen Licht mit einer Linienbreite von etwa 1 nm selektiv
ausgeblendet werden kann. Diese spektral schmalbandigen Filter können jedoch
nur dann sinnvoll eingesetzt werden, wenn das Abregungslicht 7 und
die von ihm stimulierte Emission gleicher Wellenlänge eine
entsprechend schmale Linienbreite aufweisen. Dies wird bei dem im
nachfolgend beschriebenen Fluoreszenzmikroskop erreicht.
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Das
Blockdiagramm gemäß 4 gibt
eine Übersicht über den
Aufbau eines STED-Fluoreszenzmikroskops 12 als
konkrete Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskops. Ein
modengekoppelter Gaslaser 13 ist hier sowohl als Anregungslichtquelle 14 als
auch als Abregungslichtquelle 15 vorgesehen. Das Anregungslicht 5 und das
Abregungslicht 7 werden von den modengekoppelten Gaslaser 13 in
gleichzeitigen Pulsen abgegeben. In einem Verzögerungsgenerator 16 wird
eine Verzögerung
zwischen den Pulsen des Abregungslichts 7 gegenüber den
Pulsen des Anregungslichts 5 herbeigeführt (vgl. 2).
In einer Phasenkontrolleinrichtung 17 wird die räumliche
Verteilung der Phasen des Abregungslichts 7 in einer solchen
Weise moduliert, dass sich in dem den interessierenden Teilbereich
der Probe einschließenden
räumlichen Bereich
die gewünschte
Intensitätsverteilung
des Abregungslichts 7 relativ zu dem Anregungslicht 5 ergibt.
In einer Einkoppeleinrichtung 18 wird das Anregungslicht 5 und
das Abregungslicht 7 in den Strahlengang des STED-Fluoreszenzmikroskops 12 zwischen
der Probe 19 und einem Fotodetektor 20 eingekoppelt.
Von der Einkoppeleinrichtung 18 gelangt das Anregungslicht 5 und
das Abregungslicht 7 zu der Probe 19. Von der
Probe 19 zurück
gelangen neben reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 und des
Abregungslichts 7 sowohl das interessierende Fluoreszenzlicht 6 von
der spontanen Emission aus dem jeweiligen Teilbereich der Probe
als auch die stimulierte Emission der Probe 19 mit derselben
Wellenlänge
wie das Abregungslicht 7. Eine Separation des Fluoreszenzlichts 6 erfolgt
in einer Filtereinrichtung 21, die vor dem Fotodetektor 20 angeordnet
ist. Auch die Einkoppeleinrichtung 18 kann an der Filterung
beteiligt sein, damit nur das interessierende Fluoreszenzlicht 6 den
Detektor 20 erreicht.
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5 zeigt
eine Realisation des STED-Mikroskops 12 gemäß dem Blockdiagramm
in 4. Der modengekoppelte Gaslaser 13 ist
ein ArKr-Gaslaser 22, in dessen Laserkavität ein Modenkoppler 23 vorgesehen
ist, um das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 mit
dem Gaslaser 13 in Form von einzelnen Pulsen zu erzeugen.
Dabei ist die Laserkavität
des Gaslasers 13 mit einem Umlenkspiegel 24 gefaltet,
um die Gesamtbaulänge
des Gaslasers 13 zu reduzieren. Um bei der Modenkopplung
eine Dispersionskompensation zwischen dem Anregungslicht 5 und
dem Abregungslicht 7 herbeizuführen, ist die Laserkavität des Gaslasers 13 jenseits
des Modenkopplers 13 in zwei unterschiedliche Arme für das Anregungslicht 5 und
das Abregungslicht 7 aufgeteilt. Dabei kann die dispersive
Wirkung des Modenkopplers 23 für die Aufteilung der Laserkavität in die
unterschiedlichen Arme für
das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 ausreichend
sein oder beispielsweise durch eine zusätzliche dispersive Wirkung
des Umlenkspiegels 24 unterstützt werden. Die Linienspezifizität der Laserkavität für das Anregungslicht 5 und
das Abregungslicht 7 ist jeweils durch eine Lochblende 25 bzw. 26 vor
dem in unterschiedlichem Abstand zu dem Umlenkspiegel 24 angeordneten
Resonatorspiegeln 27 und 28 realisiert. Der modengekoppelte
Gaslaser 22 wird in der transversalen TEM00-Mode betrieben,
in der er eine hohe Strahlqualität
mit hoher Kohärenzlänge aufweist.
Insbesondere in dem Bereich der Laserkavität des Gaslasers 13 jenseits
des Modenkopplers 23 kann aber auf die Mode auch willentlich
so Einfluss genommen werden, dass der Gaslaser 13, z. B.
zur Strahlformung, gezielt in einer höheren Mode, so wie TEM01, TEM10
oder TEM11, betrieben wird. Der Verzögerungsgenerator 16 ist
in 5 durch eine Anordnung mit einem dichroitischen
Spiegel 29, zwei Umlenkprismen 31 und 32 und
einem Umlenkspiegel 33 realisiert. Durch die Verschiebung
eines der Umlenkprismen 31 und 32, was hier bei
dem Umlenkprisma 32 durch einen Doppelpfeil 34 angedeutet
ist, verändert sich
die Weglänge
für das
Abregungslicht 7 gegenüber
dem Anregungslicht 5 und damit die zeitliche Lage des Pulses 9 gemäß 2 gegenüber dem Puls 8 gemäß 2. Über weitere
Umlenkspiegel 34 und 35 sowie durch ein Linsensystem 36 aus
mindestens einer Linse gelangt das Anregungslicht 5 zusammen
mit dem Abregungslicht 7 zu einem dichroitischen Spiegel 37.
Von dort gelangt das Anregungslicht 5 durch ein weiteres
Linsensystem 39 aus mindestens einer Linse zu einem akusto-optischen Strahlteiler 40 und
wird dort in dem Strahlengang zwischen der Probe 19 und
dem Fotodetektor 20 eingekoppelt. Das Abregungslicht 7 gelangt
von dem dichroitischen Spiegel 37 durch ein Linsensystem 41 aus
mindestens einer Linse zu einem so genannten Spatial Light Modulator 42 als
Realisation der Phasenkontrolleinrichtung 17. Von dort
gelangt das modulierte Abregungslicht 7 durch ein weiteres
optisches System 43 aus mindestens einer Linse zu einem
dichroitischen Spiegel 44, der hier zum Einkoppeln des
Abregungslichts 7 in den Strahlengang zwischen der Probe 19 und
dem Fotodetektor 20 dient. In diesem Strahlengang ist zwischen
dem dichroitischen Spiegel 44 und der Probe 19 ein
Objektiv 45 vorgesehen. Durch dieses Objektiv 45 gelangt
von der Probe 19 das Fluoreszenzlicht 6 zusammen
mit reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 sowie
die von dem Abregungslicht 7 stimulierte Emission gleicher
Wellenlänge
zurück zu
dem dichroitschen Spiegel 44. Von dort gelangt das von
der Probe kommende Licht durch ein optisches System 46 aus
mindestens einer Linse zu dem akusto-optischen Strahlteiler 40,
der sowohl Licht mit der Wellenlänge
des Anregungslichts 5 als auch Licht mit der Wellenlänge des
Abregungslichts 7 auskoppelt. Dasselbe gilt für einen
weiteren akusto-optischen Strahlteiler 47, der hier ausschließlich zum
Herausfiltern weiterer Anteile von Licht mit den Wellenlängen des
Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 dient.
Von dort gelangt das Fluoreszenzlicht 6 durch ein optisches
System aus mindestens einer Linse 48 durch eine konfokal
zu dem interessierenden Teilbereich der Probe 19 angeordnete
Lochblende 49 sowie durch ein Sperrfilter 50 zu
dem Fotodetektor 20. Das Sperrfilter 50 ergänzt die
Sperrwirkung der akusto-optischen Strahlteiler 40 und 47 für das von
der Probe 19 reflektierte Abregungslicht 7 und die
von dem Abregungslicht 7 in der Probe stimulierte Emission
gleicher Wellenlänge.
Der Einsatz der akusto-optischen Strahlteiler 40 und 47 zum
Ausblenden sowohl des Anregungslichts 5 als auch des Abregungslichts 7 und
der von diesem außerhalb
des jeweils interessierenden Teilbereichs der Probe stimulierten
Emission gleicher Wellenlänge
ist bei dem STED-Fluoreszenzmikroskop 12 deshalb
möglich, weil
der ArKr-Gaslaser 22 sowohl das Anregungslicht 5 als
auch das Abregungslicht 7 mit jeweils schmaler Linienbreite
von weniger als 1 nm bereitstellt. Bei einer derart schmalen Linienbreite
weisen akusto-optische Elemente für die durch Ihre akustische
Ansteuerung ausgewählten
Wellenlängen
eine gute Sperrwirkung auf. Weiterhin können die Pulse des modengekoppelten
ArKr-Gaslasers direkt in dem Fluoreszenzmikroskop 12 verwendet
werden, ohne dass sie in ihrer Länge
verändert
werden müssen.
Sie weisen die für
STED-Fluoreszenzmikroskopie optimale Pulsbreite von wenigen 100
ps auf. Durch Veränderung der
Lagen der zur Linienselektion dienenden Lochblenden 25 und 26 ist
es unter gleichzeitiger Abstimmung der Dispersionskorrektur mit
den Resonatorspiegeln 27 und 28 überdies
möglich,
aus der Vielzahl der bei einem ArKr-Gaslaser grundsätzlich zur Verfügung stehenden
Linien jeweils die beiden auszuwählen,
die für
die Anregung und Abregung eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs
in der Probe 19 besonders gut geeignet sind.
-
6 zeigt
als vergrößertes Detail
von 5 den Aufbau des akusto-optischen Strahlteilers 40.
Der akusto-optische Strahlteiler 40 weist zwei akusto-optische
Elemente 51 und 52 auf. Das akusto-optische Element 51 wird
aktiv angesteuert, um das Anregungslicht 5 über einen
Umlenkspiegel 53 in den Strahlengang zwischen dem Detektor 20 und
der Probe 19 einzukoppeln und um im Gegenzug sowohl das
von der Probe reflektierte Anregungslicht 5 als auch das
von der Probe reflektierte Abregungslicht 7 sowie die von
diesem stimulierte Emission gleicher Wellenlänge von dem spontan emittierten
Fluoreszenzlicht 6 abzutrennen. Das zweite akusto-optische Element 52 dient
hier im Wesentlichen zur Kompensation von Dispersions- und Doppelbrechungseffekten,
da das akusto-optische Element 51 auch das Fluoreszenzlicht 6,
das keine feste Wellenlänge
aufweist (s. 3) spektral aufspaltet. D. h.,
das zweite akusto-optische Element 52 richtet die einzelnen spektralen
Anteile des Fluoreszenzlichts 6 wieder parallel zueinander
aus. Es kann zusätzlich
zur Ein- und insbesondere Auskopplung bzw. Ausfilterung weiterer
Anteile des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 dienen.
Die hier verwendeten akusto-optischen Elemente 51 und 52 sind
als Acousto-Optical Tuneable Filters bekannt. Es können auch so
genannte Acousto-Optical Deflectors als die akusto-optischen Elemente 51 und 52 eingesetzt
werden. Weiterhin sind auch bekannte akusto-optische Elemente verwendbar,
die einen speziellen Kristall mit dispersionsfreier nullter Ordnung
umfassen, so dass keine Dispersionskorrektur benötigt wird, sondern vielmehr
mit jedem akusto-optischen Element eine Unterdrückung einer oder mehrerer Linien
aus dem Licht von der Probe betrieben werden kann. Die typische
Extinktion jedes als AOTF realisierten akusto-optischen Elements
liegt für
die selektierten Linien mit der Linienbreite von ca. 1 nm bei etwa
95 %. Bei Verwendung mehrerer aktiver akusto-optischer Elemente 51 in
Verbindung mit dem Sperrfilter 50 gemäß 5 können das
Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 sowie
die von diesem stimulierte Emission gleicher Wellenlänge sehr
effektiv von dem Fotodetektor 20 ferngehalten werden.
-
- 1
- Zustand
- 2
- Zustand
- 3
- Zustand
- 4
- Zustand
- 5
- Anregungslicht
- 6
- Fluoreszenzlicht
- 7
- Anregungslicht
- 8
- Puls
- 9
- Puls
- 10
- Wellenlängenbereich
- 11
- Detektionsfenster
- 12
- STED-Fluoreszenzmikroskop
- 13
- modengekoppelter
Gaslaser
- 14
- Anregungslichtquelle
- 15
- Abregungslichtquelle
- 16
- Verzögerungsgenerator
- 17
- Phasenkontrolleinrichtung
- 18
- Einkoppeleinrichtung
- 19
- Probe
- 20
- Detektor
- 21
- Filtereinrichtung
- 22
- ArKr-Gaslaser
- 23
- Modenkoppler
- 24
- Umlenkspiegel
- 25
- Lochblende
- 26
- Lochblende
- 27
- Resonatorspiegel
- 28
- Resonatorspiegel
- 29
- dichroitischer
Spiegel
- 31
- Umlenkprisma
- 32
- Umlenkprisma
- 33
- Umlenkspiegel
- 34
- Umlenkspiegel
- 35
- Umlenkspiegel
- 36
- Linsensystem
- 37
- dichroitischer
Spiegel
- 39
- Linsenssystem
- 40
- akusto-optischer
Strahlteiler
- 41
- Linsensystem
- 42
- Spatial
Light Modulator
- 43
- Linsensystem
- 44
- dichroitischer
Spiegel
- 45
- Objektiv
- 46
- Linsensystem
- 47
- akusto-optischer
Strahlteiler
- 48
- Linsensystem
- 49
- Lochblende
- 50
- Sperrfilter
- 51
- akusto-optisches
Element
- 52
- akusto-optisches
Element
- 53
- Umlenkspiegel