DE19939706C2 - Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie - Google Patents

Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie

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Description

Die Erfindung betrifft einen Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser- Scanning-Mikroskopie, aufweisend ein Grundniveau und ein einziges fluoreszierendes Endniveau, zwischen denen (m - 1) Zwischenniveaus angeordnet sind, wobei die Abstände der (m + 1) Energieniveaus annähernd äquidistant sind.
Die Fluoreszenzmikroskopie dient der Untersuchung von Objekten, die mit einem Fluorophor (fluoreszierenden Farbstoff) markiert sind. Dabei wird das Objekt, in dem der Fluorophor angeregt werden soll, mit Licht einer dem Fluorophor entsprechenden charakteristischen Absorptionswellenlänge bestrahlt und die erzeugte Fluoreszenz gemessen. Möglich ist auch die Markierung der zu untersuchenden Objekte mit mehreren Fluorophoren, die unterschiedliche charakteristische Wellenlängen aufweisen. Trifft ein Lichtstrahl mit einer charakteristischen Wellenlänge auf das zu untersuchende Objekt, werden die eingebrachten Moleküle des Fluorophors angeregt und strahlen Licht einer anderen Wellenlänge ab.
Die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (MPLSM), im Fall der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie mit TPLSM bezeichnet, ist eine Weiterentwicklung der konfokalen Ein-Photonen-Laser- Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM).
Bei der Ein-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie wird ein Laser auf einen beugungsbegrenzten Durchmesser fokussiert und rastermäßig über das Untersuchungsobjekt gescannt. Die so im Untersuchungsobjekt angeregte Fluoreszenz der enthaltenen Fluorophore (Fluoreszenzmarker) wird über dieselbe Optik (die Scanning-Optik) detektiert, wobei ein Pinhole vor dem Empfänger als Raumfilter fungiert, das die Emission aus der Fokusebene selektiert. Nachteilig wirkt sich bei der Ein-Photonen-Anregung der Fluorophore aus, daß diese auch außerhalb der gescannten Fokusebene Emission hervorruft, vielfach auch Photobleichung und photodynamische Zerstörung des Untersuchungsobjektes, besonders bei Gewebe. Die Nachteile der Ein-Photonen-Laser-Scanning- Fluoreszenzmikroskopie können im wesentlichen durch die Multi-Photonen- Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie überwunden werden.
Hierbei wird der Fluorophor durch simultane Absorption von m Photonen (m ≧ 2) angeregt, was der nichtresonanten Mehr-Photonen-Absorption entspricht. Typischerweise hat der Fluorophor für die MPLSM seine langwelligste Elektronenabsorption im ultravioletten (UV) und blau-grünen Spektralbereich. Wird der Fluorophor simultan durch m Photonen des roten bzw. nahen infraroten (NIR) Spektralbereiches angeregt, kann der erste Anregungszustand besetzt und Fluoreszenz im sichtbaren Spektralbereich emittiert werden. Der Fluorophor hat im roten bzw. NIR-Spektralbereich praktisch keine Ein-Photonen-Absorption, d. h. die Anregung mit m roten bzw. NIR-Photonen erfolgt nicht über reelle, sondern virtuelle Zwischenniveaus.
Die Bilanzgleichung für die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz in einem Zweiniveausystem, bei dem die normierte Besetzungsdichte des Grundzustands n1 sei und die entsprechende normierte Besetzungsdichte des fluoreszierenden ersten Anregungszustandes n2, wobei n2 << n1 ist, lautet dann
Die simultane Zwei-Photonen-Absorption ist beispielsweise von W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb in "Handbook of Biological Confocal Microscopy", edited by James B. Pawley. Plenum Press, New York, 1995, pp. 445-458 oder von R. M. Williams, D. W. Piston und W. W. Webb in FASEB J. (1994) 8 (11), pp. 804-813, beschrieben. In US 5,034,613 ist ein Laser-Scanning- Mikroskop beschrieben, das auf der erwähnten simultanen Zwei-Photonen- Absorption eines Fluorophors beruht, mit dem die zu untersuchende Probe markiert wurde. Als Anregungsquelle dient ein Femtosekundenlaser.
Bei der simultanen Zwei-Photonen-Absorption ist die Besetzung des angeregten Zustandes und somit auch die Fluoreszenzintensität selbst quadratisch von der Anregungsintensität abhängig. Damit tritt merkliche Absorption und Fluoreszenz bei Verwendung hochaperturiger Objektive nur im unmittelbaren Fokusbereich des Laserlichtes auf, wodurch die o. g. Nachteile der Ein-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie im wesentlichen überwunden werden und auch das konfokale Raumfilter entfällt.
Die MPLSM hat aber ihre eigenen Nachteile: Aus Gleichung (1) resultiert, daß zur Fluoreszenzanregung schon im Fall der Zwei-Photonen-Absorption hohe Photonenflußdichten erforderlich sind. Dies gilt um so mehr im Fall m < 2, z. B. bei dem in WO 97/11355 A1 beschriebenen Verfahren für die Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie, bei dem die zu untersuchende Probe mit Licht solcher Parameter bestrahlt wird, daß der Fluorophor simultan mindestens drei Photonen absorbiert. Hohe Photonenflußdichten bringen auf Grund der hohen lokalen Feldstärke die Gefahr des elektrischen Durchschlags in der zu untersuchenden Probe mit sich. Dieser Gefahr kann am ehesten durch die Verwendung ultrakurzer Impulse im Femtosekundenbereich begegnet werden, um hohe Pulsleistungen für eine effiziente Multi-Photonen-Anregung bei geringerer mittlerer Leistung (Minimierung thermischer Schäden) zu gewährleisten. Es sind aber relativ aufwendige Gerätekonfigurationen erforderlich, denn Photonenflußdichten ≧ 1029 cm-2s-1 müssen verfügbar sein. Diese notwendigen hohen Photonenflußdichten bringen (neben der Gefahr der Plasmabildung in der zu untersuchenden Probe und aufwendiger Gerätekonfiguration) einen weiteren Nachteil der Multi-Photonen-Laser- Fluoreszenzmikroskopie mit sich: An die Multi-Photonen-Absorption kann sich typischerweise die sehr effektive, aber unerwünschte (z. T. mehrfache) Ein-Photonen-Absorption anschließen, die zu Photoionisations- und Bleichungsprozessen führt, wie ebenfalls bereits erwähnt.
In US 5,796,477 A ist u. a. für die Anwendung in der Mikroskopie eine Lichtquelle angegeben, die zwei oder mehrere Strahlen von untereinander korrelierten Photonen aussendet. Die beschriebene Quelle ermöglicht das praktisch simultane Auftreffen von Photonenpaaren (bzw. -tripels usw.) auf der zu untersuchenden Probe, beispielsweise einem Targetmaterial, einem Fluorophor. Für eine m-Photonen-Absorption in dem zu untersuchenden Material wird dieses dadurch charakterisiert, dass die energetischen Abstände der (m + 1) Energieniveaus des Materials annähernd äquidistant sind und die zwischen Grundniveau und fluoreszierendem Endniveau liegenden (m - 1) Zwischenniveaus virtuell oder reell sein können. In einem solchen fluoreszierenden Material findet eine simultane m- Photonen-Absorption statt. Die in der erwähnten US-Patentschrift beschriebene Lichtquelle ist im Vergleich zu üblichen MPLSM-Lichtquellen technisch aufwendig, da wegen der Ausnutzung nichtlinearer optischer Effekte komplizierte Bauelemente zur Realisierung erforderlich sind. Ausserdem erhöht das Auftreten von Photonenpaaren und -tripels die Wahrscheinlichkeit von Bleichungsprozessen im zu untersuchenden Material, da eine vom fluoreszierenden Niveau ausgehende erneute simultane m-Photonenabsorption a priori eine wesentlich höherenergetische Anregung darstellt als eine ohne korrelierte Photonen auftretende mögliche Ein-Photonen-Absorption aus dem fluoreszierenden Niveau.
Deshalb ist es Aufgabe der Erfindung, einen Fluorophor für die Multi- Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie anzugeben, der zur Anregung der Fluoreszenz eine wesentlich geringere Laserintensität (Photonenflußdichte) im Vergleich zu üblich eingesetzten Fluorophoren erfordert, um so einerseits den gerätetechnischen Aufwand für den zu verwendenden Laser zu verringern und andererseits weitgehend die Gefahr des elektrischen Durchschlags in der zu untersuchenden Probe zu eliminieren und den unerwünschten Photochemie-Effekt nach Ein-Photonen-Absorption aus dem fluoreszierenden Niveau zu minimieren.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Fluorophor für die Multi-Photonen- Laser-Scanning-Mikroskopie der eingangs genannten Art angegeben, bei dem erfindungsgemäß zur Realisierung einer stufenweisen m-Photonen- Absorption (mit m ≧ 2) die (m - 1) Zwischenniveaus als reelle Niveaus ausgebildet sind und Ein-Photonen-Absorption zwischen direkt aufeinanderfolgenden Niveaus erlaubt ist.
Der erfindungsgemäße Fluorophor weist die für die Ortsauflösung vorteilhafte Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der m-ten Potenz der Anregungsintensität auf, ohne daß als Wirkungsmechanismus die - bisher im Stand der Technik beschriebene - simultane (nichtresonante) Mehr- Photonen-Absorption auftritt. Vielmehr wird in der erfindungsgemäßen Lösung der Wirkungsmechanismus der stufenweisen Multi-Photonen- Absorption gezielt ausgenutzt, d. h. die Anregung erfolgt nicht über virtuelle, sondern über reelle Zwischenniveaus. Damit ist auch die Ursache für die Notwendigkeit hoher Photonenflußdichten, wie sie bisher für bekannte Lösungen notwendig sind, beseitigt, wodurch der gerätetechnische Aufwand verringert wird. Der erfindungsgemäße Fluorophor verfügt nunmehr auch noch im Spektralbereich, der dem m-ten Teil der Energie des Übergangs vom Grundzustand zum fluoreszierenden Zustand entspricht (d. h. der m- fachen Wellenlänge), über eine merkliche - hier erwünschte - Ein-Photonen- Absorption.
Die Merkmale des erfindungsgemäßen Fluorophors können z. B. dann vorliegen, wenn der fluoreszierende Zustand des Fluorophors für m = 2 der zweite angeregte Singulettzustand (S2) ist, oder wenn der Fluorophor auf der langwelligen Seite der S0→S1-Absorptionsbande eine lang auslaufende Flanke besitzt, die einen merklichen Anteil noch bei dem 1/m-ten Energiebetrag (d. h. der m-fachen Wellenlänge) des S0→S1-Übergangs hat.
Bei dem erfindungsgemäßen Fluorophor ist die Fluoreszenzintensität der m- ten Potenz der Anregungsintensität proportional (wie beim Fluorophor mit simultaner Mehr-Photonen-Anregung), aber im Vergleich zu letzterem wird bei dem neuen Fluorophor-Mechanismus eine vergleichbare Besetzung des fluoreszierenden Niveaus, d. h. eine vergleichbare Fluoreszenzintensität, bei wesentlich geringeren Anregungsintensitäten erreicht. Die Summe der Energien der Photonen für die zu erzeugenden Übergänge muß der Energie des Übergangs vom Grundniveau zum fluoreszierenden Niveau entsprechen. Die Anregung kann hierfür entweder mit Lasern unterschiedlicher Wellenlänge erfolgen, was aber aufwendiger ist, oder aber mit einem Lasern (einer Wellenlänge). Dies richtet sich jeweils nach der Lage der Zwischenniveaus.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß der Fluorophor für die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zur Realisierung einer stufenweisen Zwei-Photonen-Absorption (m = 2) ein reelles Zwischenniveau zwischen Grundniveau und dem fluoreszierenden Niveau aufweist, insbesondere ist der Fluorophor im Falle der Vitalzellenmikroskopie Melanin. Für einen derartigen Fluorophor gilt gemäß Anspruch 1, daß sich das reelle Niveau etwa in der Mitte zwischen Grundniveau und fluoreszierendem Niveau befindet und Ein-Photonen-Übergänge zwischen Grundniveau und reellem Zwischenniveau und zwischen reellem Zwischenniveau und fluoreszierendem Niveau erlaubt sind.
Mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Fluorophors mit stufenweiser Mehr-Photonen-Anregung der Fluoreszenz wird der gerätetechnische Aufwand für den Laser der MPLSM-Vorrichtung verringert, weitgehend die Gefahr des elektrischen Durchschlags in der Probe beseitigt und auch der unerwünschte Photochemie-Effekt nach Ein-Photonen-Absorption aus dem fluoreszierenden Niveau auf Grund der vergleichsweise geringen Photonenflußdichten verringert.
Die Erfindung wird im folgenden Ausführungsbeispiel für die Zwei-Photonen- Anregung anhand von Zeichnungen näher erläutert.
Dabei zeigen:
Fig. 1 das Energieniveauschema für die simultane Zwei-Photonen- Anregung (Modell A) und das Energieniveauschema für den stufenweisen Zwei-Photonen-Absorptionsprozeß (Modell B);
Fig. 2 das Energieniveauschema für die simultane Zwei-Photonen- Absorption mit anschließender Ein-Photonen-Absorption;
Fig. 3 das Ergebnis der numerischen Berechnung der Besetzungsdichten der fluoreszierenden Niveaus in Abhängigkeit von der Photonenflußdichte der Anregungsstrahlung gemäß den Modellen A und B in Fig. 1;
Fig. 4 das Ergebnis der numerischen Berechnung der Besetzungsdichten der fluoreszierenden Niveaus in Abhängigkeit von der Pulsdauer gemäß den Modellen A und B in Fig. 1;
Fig. 5 das Absorptionsspektrum von synthetischem Melanin, gelöst in Dimethyl-Sulfoxid;
Fig. 6 das Fluoreszenzspektrum von synthetischem Melanin, gelöst in Dimethyl-Sulfoxid;
Fig. 7 Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Anregungsintensität für synthetisches Melanin, gelöst in Dimethyl-Sulfoxid.
In den ersten Figuren wird die Erfindung zunächst an einem repräsentativen modellmäßigen (theoretischen) Beispiel und allgemeingültigen Formeln für die stufenweise Zwei-Photonen-Anregung im Vergleich zur - dem Stand der Technik nach bekannten - simultanen Zwei-Photonen-Anregung näher erläutert.
In Fig. 1 sind die Energietermschemata für die simultane Zwei-Photonen- Anregung durch Modell A und der stufenweise Zwei-Photonen- Absorptionsprozeß, der gezielt durch die erfindungsgemäße Lösung ausgenutzt wird, durch Modell B dargestellt. Mit nA und nB sind die Besetzungsdichten der fluoreszierenden Niveaus 2 (Modell A) und 3 (Modell B) bezeichnet, mit σ12', σ2'3 die Ein-Photonen-Absorptionsquerschnitte und σ 2|(12) ist der Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitt, der für typische Fluorophore maximal in der Größenordnung 10-48 bis 10-50 cm4s liegt, kA,ij und kB,ij sind die zugehörigen Relaxationskonstanten. Das Grundniveau ist für beide Modelle mit 1, das reelle Zwischenniveau in Modell B mit 2' bezeichnet.
Ist nun der Anregungsimpuls gegeben mit I(t) = Imax.i(t), wobei Imax die Spitzenintensität und i(t) die Pulsform bezeichnet, und unter der Annahme, daß
  • 1. kA,21.t << 1 bzw. kB,31.t << 1, d. h. kurze Pulse wirken bzw. langsame Relaxationen, und
  • 2. niedrige Intensitäten bzw. geringe Besetzung der angeregten Niveaus vorliegen,
dann gilt für die Besetzungsdichten nA
und nB
der fluoreszierenden Niveaus für simultane bzw. stufenweise Zwei-Photonen-Anregung:
wobei O(I 3|max) ein Restglied bezeichnet, das von der 3. Potenz der Anregungsintensität abhängt und bei den in der Praxis verwendeten Intensitäten vernachlässigbar ist.
Ist die Pulsform i(t) gaußförmig, die Pulsdauer τ(fwhm) und die Maximumstelle t0, so folgt
nA(Imax, t0) = 0.38.σ 2|(12).τ.I 2|max + O(I 3|max) (4)
nB(Imax, t0) = 0.14.σ12'.σ2'3.τ2.I 2|max + O(I 3|max) (5)
Dies bedeutet, beide Besetzungsdichten, sowohl nA für die simultane Zwei- Photonen-Anregung als auch nB für die stufenweise Zwei-Photonen- Anregung, hängen quadratisch von der Anregungsintensität ab, d. h. auch bei stufenweiser Zwei-Photonen-Anregung (Modell B) ist die Fluoreszenzintensität quadratisch von der Anregungsintensität abhängig.
Die für die Multi-Photonen-Anregung bisher bekannter Fluorophore notwendigen hohen Photonenflußdichten (≧ 1029 cm-2s-1) ziehen einen - bereits erwähnten - weiteren Nachteil nach sich: An die simultane Multi- Photonen-Absorption kann sich typischerweise die sehr effektive, aber unerwünschte (z. T. mehrfache) Ein-Photonen-Absorption anschließen, wie sie in Fig. 2 im Termschema für die simultane Zwei-Photonen-Absorption eines realen TPF-Fluorophors mit Grundniveau 1, fluoreszierendem Niveau 2 und höher angeregtem Elektronenniveau 4 dargestellt ist (σ 2|(12) bezeichnet wiederum den Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitt; σ24 den Ein- Photonen-Absorptionsquerschnitt und kA,42 und kA,21 die zugehörigen Relaxationskonstanten). Diese Absorption führt aber zu den erwähnten unerwünschten Photoionisations- und Bleichungsprozessen.
Numerische Berechnungen für nA und nB unter Berücksichtigung der zur Beschreibung der Fig. 1 gemachten Voraussetzungen sind an einem konkreten Beispiel in Fig. 3 gezeigt. Sie sind in guter Übereinstimmung mit den obigen analytischen Ausdrücken für nA und nB. Man sieht in Fig. 3, in der die normierte Besetzungsdichte nA für Modell A (simultane Zwei- Photonen-Absorption) und die normierte Besetzungsdichte nB für Modell B (stufenweise Zwei-Photonen-Absorption) in Abhängigkeit von der Photonenflußdichte dargestellt sind, daß zur Erzielung des gleichen Effektes (d. h. gleiche Besetzungsdichte des fluoreszierenden Zustands) der stufenweise Anregungsprozeß eine wesentlich geringere Anregungsintensität erfordert, die etwa zwei Größenordnungen unter der für den simultanen Prozeß liegt. Die Berechnungen erfolgten für folgende Parameter: Pulsdauer der Anregung τ = 1 ps; für Modell A - σ 2|(12) = 10-49 cm4s; kA,21 = 108 s-1; für Modell B - σ12' = σ2'3 = 10-16 cm2; kB,2'1 = 1010 s-1; kB,31 = 108 s-1.
Die Gleichungen (4) und (5) zeigen auch, daß eine Differenzierung zwischen beiden Anregungsprozessen über die Pulsdauer τ der Anregungsstrahlung bei gleicher Photonenflußdichte möglich ist. Simultane Zwei-Photonen- Anregung ergibt einen linearen Verlauf der Besetzungsdichte nB als Funktion von der Pulsdauer τ, während der stufenweise Prozeß eine quadratische Charakteristik aufweist. Auch hier zeigen numerische Untersuchungen die Gültigkeit der Gleichungen (4) und (5). Fig. 4 zeigt die normierte Besetzungsdichte im Pulsmaximum n(t0) in Abhängigkeit von der Pulsdauer τ für eine Photonenflußdichte der Anregungsstrahlung von 1026 cm-2s-1 bei Verwendung des in der Beschreibung von Fig. 3 angegebenen Parametersatzes.
Die folgenden Fig. 5 bis 7 zeigen für einen erfindungsgemäßen Fluorophor, nämlich synthetisches Melanin, gelöst in Dimethylsulfoxid, das gemessene Absorptions- und Fluoreszenzspektrum sowie die Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Photonenflußdichte der Anregung.
Dieser Fluorophor ist ein heterogenes Polymergemisch, das als Proteinkomplex u. a. Bestandteil der menschlichen Haut ist und deren Farbe mitbestimmt. Gegenüber UV-Strahlung kommt dem Melanin eine zentrale Schutzfunktion zu.
Wie aus Fig. 5, in der die optische Dichte OD in Abhängigkeit von der Wellenlänge dargestellt ist, ersichtlich ist, zeigt Melanin eine vom nahen UV bis ins NIR monoton fallende, keinerlei Feinstruktur aufweisende Absorption. Das Fluoreszenzspektrum bei Einphotonenanregung weist eine relativ breite Emissionsbande mit einem Maximum bei ca. 610 nm auf. Im Vergleich zur Absorption bei 400 nm besitzt die langweilig auslaufende Absorptionsflanke bei der doppelten Wellenlänge 800 nm noch einen Anteil von ca. 10%.
Zur Anregung bei 800 nm wird ein Femtosekundenlasersystem (Pulsdauer: 120 fs, Pulsenergie im Probenbereich: 1 µJ) verwendet. Die optische Dichte OD(500 nm) beträgt 0,03 cm-1, die Schichtdicke d ist gleich 1 cm. Die dadurch induzierte Fluoreszenz liegt im blau-grün-roten Spektralbereich mit einem Maximum bei ca. 610 nm (vgl. Fig. 6, in der die relative Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Wellenlänge dargestellt ist) und zeigt deutlich die quadratische Abhängigkeit von der Anregungsintensität, wie in Fig. 7 dargestellt, die sie als Resultat einer Zwei- Photonen-Absorption bei den folgenden Parametern Anregung - 800 nm; Emission - 600 nm; d = 1 cm; OD(500 nm) = 0,03 cm-1 charakterisiert. Daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Fluorophor um resonante, nichtsimultane Zwei-Photonen-Absorption handelt, kann durch Variation der Dauer des Anregungsimpulses (s. Gleichungen (4) und (5)) gezeigt werden.

Claims (3)

1. Fluorophor für die Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie, aufweisend ein Grundniveau und ein einziges fluoreszierendes Endniveau, zwischen denen (m - 1) Zwischenniveaus angeordnet sind, wobei die Abstände der (m + 1) Energieniveaus annähernd äquidistant sind, dadurch gekennzeichnet, daß die (m - 1) Zwischenniveaus als reelle Niveaus ausgebildet sind und Ein- Photonen-Absorption zwischen direkt aufeinanderfolgenden Niveaus erlaubt ist.
2. Fluorophor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluorophor für die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (m = 2) ein reelles Zwischenniveau zwischen Grundniveau und dem fluoreszierenden Niveau aufweist.
3. Fluorophor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluorophor für die Vitalzellenmikroskopie Melanin ist.
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