CN111982870B - 一种扫描结构光超分辨显微成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种扫描结构光超分辨显微成像装置及方法，装置包括：第一激光组件、第二激光组件、扫描器、探测器以及计算终端；第一激光组件和第二激光组件用于产生激发光和环形STED光；扫描器用于控制激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发；探测器用于采集荧光信号，得到荧光结构光图像；计算终端用于根据荧光结构光图像重构超分辨图像。本发明通过环形STED光和强度随时间正弦变化的激发光对待成像样品进行扫描激发，得到超过衍射极限的条纹结构光图像，利用探测器实时同步逐点采集荧光信号，通过算法重构出超分辨图像，在低功率激发条件下可实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨成像。

Description

一种扫描结构光超分辨显微成像装置及方法

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种扫描结构光超分辨显微成像装置及方法。

背景技术

荧光显微镜以其无损、非入侵、特异性标记及可以对活体细胞进行实时动态成像的优势，在生命科学研究中得到了广泛应用。但由于光学衍射极限的限制，一般成像最高分辨率仅能达到约200nm。

为了突破衍射极限对荧光显微分辨率的限制，一系列新颖的超分辨显微成像方法被提出：随机光学重建显微(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)技术，受激辐射耗尽(stimulated emission depletion，STED)技术，结构光照明显微(structured illumination microscopy，SIM)技术，以及饱和结构光超分辨显微(SSIM)技术。STORM成像需要采集数万张原始图像，成像速度受限；STED成像需要高功率的STED光使荧光分子去激发，而且，要求的分辨率越高，需要的STED光的功率越大，限制了使用范围；SIM成像分辨率在衍射极限基础上只能提高两倍；SSIM成像需要非常高的光功率才能实现荧光分子的饱和激发，不适用于活细胞成像，无法发挥SIM的优势。

因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明提供了一种扫描结构光超分辨显微成像装置及方法，克服现有STORM成像速度慢，STED超分辨技术需要提高STED光功率的方法提高成像分辨率，以及现有结构光照明超分辨技术需要饱和激发提高分辨率，无法在低功率激发条件下实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨成像等问题。

第一方面，本实施例公开了一种扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，包括：第一激光组件、第二激光组件、扫描器、探测器以及计算终端；

所述第一激光组件用于产生强度随时间正弦变化的激发光；

所述第二激光组件用于产生环形STED光；

所述扫描器用于控制所述激发光和所述环形STED光对待成像样品进行扫描激发；

所述探测器用于采集待成像样品在所述激发光和所述环形STED光扫描激发后产生的荧光信号，得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像；

所述计算终端用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像，以及基于所述若干局部超分辨图像合成待成像样品的完整超分辨图像。

所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，所述第一激光组件包括：第一激光器、强度调制器、第一激发滤光片以及第一反射镜；

所述第一激光器用于产生第一激光；

所述强度调制器用于将所述第一激光调制成强度随时间正弦变化的激发光；

所述第一激发滤光片用于对所述激发光进行过滤；

所述第一反射镜用于将所述第一激发滤光片过滤后的激发光反射至所述扫描器。

所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，所述第二激光组件包括：第二激光器、螺旋相位片、第二激发滤光片以及第一分束镜；

所述第二激光器用于产生第二激光；

所述螺旋相位片用于将所述第二激光调制成环形STED光；

所述第二激发滤光片用于对所述环形STED光进行过滤；

所述第一分束镜用于将所述第二激发滤光片过滤后的环形STED光反射至所述扫描器。

所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，所述装置还包括：第一物镜、针孔以及第二物镜；

所述第一物镜用于将所述第一反射镜反射的激发光和所述第一分束镜反射的环形STED光汇聚至所述针孔；

所述针孔用于对所述第一物镜汇聚的激发光和环形STED光进行空间滤波；

所述第二物镜用于将所述针孔空间滤波后的激发光和环形STED光准直照射到所述扫描器上。

所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，所述装置还包括：扫描透镜、管镜和第三物镜；

所述扫描透镜用于接收所述扫描器发出的激发光和环形STED光，对其进行扩束后发出；

所述管镜用于接收所述扫描透镜发出的扩束后的激发光和环形STED光，对其进行准直后发出；

所述第三物镜用于接收所述管镜准直后的激发光和环形STED光，将其聚焦到待成像样品上激发产生荧光信号。

所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，所述装置还包括：第二分束镜；

所述第二分束镜用于将待成像样品上激发产生的荧光信号反射至所述探测器。

所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，所述装置还包括：发射滤光片和第一透镜；

所述发射滤光片用于对所述第二分束镜反射的荧光信号进行过滤；

所述第一透镜用于将所述发射滤光片过滤后的荧光信号汇聚至所述探测器。

所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其中，所述强度调制器的调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上激发光光强，r为待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，t为时间，

为初始相位。

第二方面，本实施例还公开了一种扫描结构光超分辨显微成像方法，其中，包括：

通过第一激光组件产生的强度随时间正弦变化的激发光和第二激光组件产生的环形STED光对待成像样品进行扫描激发，产生荧光信号；

采集待成像样品被激发光和环形STED光扫描激发产生的荧光信号，得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像；

提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像；

基于所述若干局部超分辨图像合成待成像样品的完整超分辨图像。

所述的扫描结构光超分辨显微成像方法，其中，所述提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像的步骤包括：

提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对同一取向的荧光结构光图像的频率分量进行复位后叠加，得到不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值；

对不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值分别进行傅里叶逆变换，得到待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像。

本发明提供了一种扫描结构光超分辨显微成像装置及方法，通过强度随时间正弦变化的激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发，得到超过衍射极限的条纹结构光图像，利用探测器实时同步逐点采集荧光信号，通过算法重构出待成像样品的超分辨图像，能够将传统STED超分辨显微镜的分辨率进一步提高2倍，即在低功率激发条件下可实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨成像。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中提供的一种扫描结构光超分辨显微成像装置的结构示意图；

图2是本发明实施例中提供的一种扫描结构光超分辨显微成像方法的较佳实施例流程图。

附图中各标记：1、第一激光组件；2、第二激光组件；3、扫描器；4、探测器；5、计算终端；6、第二分束镜；7、第一物镜；8、针孔；9、第二物镜；10、扫描透镜；11、管镜；12、第三物镜；13、发射滤光片；14、第一透镜；15、待成像样品；101、第一激光器；102、强度调制器；103、第一激发滤光片；104、第一反射镜；201、第二激光器；202、螺旋相位片；203、第二激发滤光片；204、第一分束镜。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

在实施方式和申请专利范围中，除非文中对于冠词有特别限定，否则“一”与“所述”可泛指单一个或复数个。

另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

为了突破衍射极限对荧光显微分辨率的限制，人们提出了一系列新颖的超分辨显微成像方法。Rust课题组提出了STORM(stochastic optical reconstructionmicroscopy，随机光学重建显微)技术，通过控制荧光分子稀疏发光，使得一个衍射极限范围内基本不会有两个分子同时发光而导致不可区分，通过多次成像和定位获得各个荧光分子的位置而重构出超分辨图像。该方法分辨率可达到横向高于20nm、轴向高于50nm的水平。但重构一幅超分辨图像需要采集平均数万张原始图像，成像速度受限，同时需要具有开关效应的荧光探针，对染料的要求高，限制了其适用范围。

Hell课题组提出了受激辐射耗尽(stimulated emission depletion，STED)技术，其特点是利用套在激发光周围的高强度环形STED光使衍射极限范围内除中心点外的荧光分子发生受激辐射而不产生荧光，等效于将系统的点扩散函数(PSF)尺寸大幅缩小以获取超分辨图像。引入STED光后分辨率可以大幅提高到远高于衍射极限分辨率的水平(几十纳米甚至更高),而且系统分辨率越高，需要的STED光功率也越高。但高功率的STED光对生物样品损伤较大，特别是活细胞，因此，不适合活细胞动态成像，且必须使用特殊STED染料，限制了样品的范围。

Gustafsson课题组提出了结构光照明显微(structured illuminationmicroscopy，SIM)技术，SIM基本原理是利用莫尔条纹将原本不能通过系统的高频信息平移到可观察的频率范围内来实现超分辨。具体是利用周期性结构照明光激发样品,使频域上由于结构光频谱与物频谱的卷积而产生携带物体信息的多级频谱，需后期数据处理将多级频谱分开可有效获得样品的高频信息，实现超分辨成像。由于结构光的空间频率受到激发光学传递函数的限制，其空间频率最多为激发光学传递函数的截止频率，因此其分辨率最多提高2倍。

为了提高SIM的分辨率，Gustafsson课题组在SIM的基础上提出了饱和结构光超分辨显微(SSIM)技术，利用荧光分子的饱和激发使样品在正弦光波激发下发出具有高阶频率分量的非正弦分布结构荧光，从而实现了多级频谱拓展，将分辨率提高到了几十纳米的水平。然而这种方法需要非常高的光功率才能实现荧光分子的饱和激发，这种方法并不适用活细胞成像，无法发挥SIM的优势。

为了克服现有STORM成像速度慢，STED超分辨技术需要提高STED光功率的方法提高成像分辨率，现有结构光照明超分辨技术需要饱和激发提高分辨率，无法在低功率激发条件下实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨成像等问题，本实施例公开了一种扫描结构光超分辨显微成像装置，如图1所示，包括：第一激光组件1、第二激光组件2、扫描器3、探测器4以及计算终端5；其中，所述第一激光组件1用于产生强度随时间正弦变化的激发光；所述第二激光组件2用于产生环形STED光；所述扫描器3用于控制所述激发光和所述环形STED光对待成像样品15进行扫描激发；所述探测器4用于采集待成像样品15在所述激发光和所述环形STED光扫描激发后产生的荧光信号，得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像；所述计算终端5用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品15不同取向的若干局部超分辨图像，以及基于所述若干局部超分辨图像合成待成像样品15的完整超分辨图像。

具体实施时，第一激光组件1和第二激光组件2产生强度随时间正弦变化的激发光和环形STED光经过扫描器3照射到待成像样品15上，激发待成像样品15产生荧光信号，并由探测器4采集荧光信号。本实施例中激发光强度调制、光束扫描和荧光信号探测同步进行，探测器4逐点连续记录形成一幅荧光结构光图像。通过改变调制函数相位，重复上述步骤，可以获得不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像。然后通过计算终端5提取各个荧光结构光图像中的频率分量，根据频率分量重构出待成像样品15不同取向的若干局部超分辨图像，并将若干局部超分辨图像合成待成像样品15的完整超分辨图像。激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发时，环形STED光区域内的激发态荧光分子由于受激辐射而迅速回落到基态，无法发射荧光信号，只有激发光中心区域内的荧光分子发射荧光信号，可获得超过衍射极限的条纹结构光图像，且条纹结构光图像中相邻条纹间距与STED显微分辨率相同，利用探测器4采集荧光信号，最终得到的超分辨图像的分辨率比STED分辨率提高2倍。

进一步地，所述第一激光组件1包括：第一激光器101、强度调制器102、第一激发滤光片103以及第一反射镜104。所述第一激光器101用于产生第一激光；所述强度调制器102用于将所述第一激光调制成强度随时间正弦变化的激发光；所述第一激发滤光片103用于对所述激发光进行过滤；所述第一反射镜104用于将所述第一激发滤光片103过滤后的激发光反射至所述扫描器3。具体应用过程中，第一激光器101产生的第一激光经过强度调制器102进行强度调制，得到强度随时间正弦变化的激发光，随后激发光经过第一激发滤光片103过滤阻挡激发光以外的背景光，并通过第一反射镜104反射至扫描器3。

具体实施时，强度调制器102的调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上激发光光强，r为待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，t为时间，

为初始相位。为简化令

则调制函数简化为

调制后的激发光强度满足

待成像样品受激发光和环形STED光扫描激发后，产生的荧光信号光强为

具体地，扫描器3为二维扫描器，在扫描待成像样品15时，扫描器3先沿待成像样品15纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成后，再沿待成像样品15横向进行逐点扫描，重复执行上述逐点扫描的步骤，直至待成像样品15扫描完成。控制终端5与强度调制器102、探测器4和扫描器3连接，通过控制终端5同步控制强度调制器102对激发光强度进行调制，扫描器3对待成像样品15进行扫描，探测器4对荧光信号进行采集，成像速度快。

进一步地，所述第二激光组件2包括：第二激光器201、螺旋相位片202、第二激发滤光片203以及第一分束镜204；所述第二激光器201用于产生第二激光；所述螺旋相位片202用于将所述第二激光调制成环形STED光；所述第二激发滤光片203用于对所述环形STED光进行过滤；所述第一分束镜204用于将所述第二激发滤光片203过滤后的环形STED光反射至所述扫描器3。具体地，第二激光器201产生的第二激光经过螺旋相位片202调制成环形STED光，环形STED光经过第二激发滤光片203过滤阻挡环形STED光以外的背景光后，通过第一分束镜204反射至扫描器3。

具体实施时，所述装置还包括：第一物镜7、针孔8以及第二物镜9。所述第一物镜7用于将所述第一反射镜104反射的激发光和所述第一分束镜204反射的环形STED光汇聚至所述针孔8；所述针孔8用于对所述第一物镜7汇聚的激发光和环形STED光进行空间滤波；所述第二物镜9用于将所述针孔8空间滤波后的激发光和环形STED光准直照射到所述扫描器3上。具体地，激发光经第一反射镜104反射和第一分束镜204透射，与第一分束镜204反射的环形STED光汇合后，由第一物镜7汇聚到针孔8进行空间过滤，再由第二物镜9准直成平行光照射到扫描器3上对待成像样品15进行逐行扫描。

进一步地，所述装置还包括：扫描透镜10、管镜11和第三物镜12。所述扫描透镜10用于接收所述扫描器3发出的激发光和环形STED光，对其进行扩束后发出；所述管镜11用于接收所述扫描透镜10发出的扩束后的激发光和环形STED光，对其进行准直后发出；所述第三物镜12用于接收所述管镜11准直后的激发光和环形STED光，将其聚焦到待成像样品15上激发产生荧光信号。具体地，扫描器3出射的激发光和环形STED光经扫描透镜10和管镜11后，由第三物镜12聚焦激发待成像样品15发射荧光信号，环形STED光区域内的激发态分子由于受激辐射而迅速回落到基态，无法发射荧光信号，只有激发光中心区域的荧光分子发射荧光信号，因此可获得超过衍射极限的条纹结构光图像，且条纹结构光图像中相邻条纹间距与STED显微分辨率相同。

具体实施时，所述装置还包括第二分束镜6，所述第二分束镜6用于将待成像样品15上激发产生的荧光信号反射至所述探测器4。具体地，待成像样品15在激发光和环形STED光扫描激发后产生的荧光信号由第三物镜12收集，先后经由管镜11、扫描透镜10、扫描器3、第二物镜9、针孔8和第一物镜7到达第二分束镜6，由第二分束镜6将待成像样品15产生的荧光信号反射至探测器4。

具体实施时，所述装置还包括：发射滤光片13和第一透镜14；所述发射滤光片13用于对所述第二分束镜6反射的荧光信号进行过滤；所述第一透镜14用于将所述发射滤光片13过滤后的荧光信号汇聚至所述探测器4。具体地，第二分束镜6将待成像样品15产生的荧光信号反射至发射滤光片13，发射滤光片13阻挡荧光信号以外的背景光后，由第一透镜14将发射滤光片13过滤后的荧光信号汇聚到探测器4，由探测器4记录荧光信号光强度。

在上述装置的基础上，本发明还公开了一种扫描结构光超分辨显微成像方法，如图2所示，所述方法包括：

S1、通过第一激光组件产生的强度随时间正弦变化的激发光和第二激光组件产生的环形STED光对待成像样品进行扫描激发，产生荧光信号；

S2、采集待成像样品被激发光和环形STED光扫描激发产生的荧光信号，得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像；

S3、提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像；

S4、基于所述若干局部超分辨图像合成待成像样品的完整超分辨图像。

具体实施时，通过第一激光组件产生强度随时间正弦变化的激发光，通过第二激光组件产生环形STED光，通过激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发，产生荧光信号。环形STED光区域内的激发态分子由于受激辐射迅速回落到基态而无法产生荧光信号，只有激发光中心区域内的荧光分子发射荧光信号，因此可获得超过衍射极限的条纹结构光图像，且条纹结构光图像中相邻条纹间距与STED显微分辨率相同。通过改变激发光的调制函数的周期和初相位，可以得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像，利用WS重构算法重构出对应取向的局部超分辨图像，然后将各取向的局部超分辨图像合成一幅完整超分辨图像，即得到待成像样品的完整超分辨图像。WS重构算法是广义结构光超分辨重构算法，不但适用于线性结构光超分辨图像重构，也适用于非线性结构光和饱和激发结构光的超分辨图像重构。

在一具体实施方式中，步骤S3具体包括：

S31、提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对同一取向的荧光结构光图像的频率分量进行复位后叠加，得到不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值；

S32、对不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值分别进行傅里叶逆变换，得到待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像。

具体实施时，假设激发光的调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上激发光光强，r为待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，t为时间，

为初始相位。则激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发后，产生的荧光信号的强度为：

一般一种取向下的荧光结构光图像，需要获得至少在相位

时的荧光结构光图像，荧光信号经过探测器逐点记录形成的荧光结构光图像的傅里叶变化为：

通过获取

相位下的荧光结构光图像，就可以解出频率分量S(k)、S(k-k_p)和S(k+k_p)，将上述分离的各频率分量复位并相加，得到不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值。最后将不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值转换到时域，即对不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值分别进行傅里叶逆变换，即可得到待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像。

综上所述，本发明提供了一种扫描结构光超分辨显微成像装置及方法，装置包括：第一激光组件、第二激光组件、扫描器、探测器以及计算终端；第一激光组件用于产生强度随时间正弦变化的激发光；第二激光组件用于产生环形STED光；扫描器用于控制激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发；探测器用于采集待成像样品在激发光和环形STED光扫描激发后产生的荧光信号，得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像；计算终端用于提取各个荧光结构光图像中的频率分量，根据频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像，以及基于若干局部超分辨图像合成待成像样品的完整超分辨图像。本发明通过强度随时间正弦变化的激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发，得到超过衍射极限的条纹结构光图像，利用探测器实时同步逐点采集荧光信号，通过算法重构出超分辨图像，对比STORM技术，该方法成像速度快，对比STED技术，该方法能够使其分辨率再提高2倍，对比结构光照明超分辨技术，该方法不需要饱和激发，就可以实现几十甚至几纳米分辨，该技术在低功率激发条件下可实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种扫描结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，包括：第一激光组件、第二激光组件、扫描器、探测器以及计算终端；

所述第一激光组件用于产生强度随时间正弦变化的激发光；

所述第二激光组件用于产生环形STED光；

所述扫描器用于控制所述激发光和所述环形STED光对待成像样品进行扫描激发；

所述探测器用于采集待成像样品在所述激发光和所述环形STED光扫描激发后产生的荧光信号，得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像；

所述计算终端用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像，以及基于所述若干局部超分辨图像合成待成像样品的完整超分辨图像；

所述第一激光组件包括：第一激光器、强度调制器、第一激发滤光片以及第一反射镜；

所述第一激光器用于产生第一激光；

所述强度调制器用于将所述第一激光调制成强度随时间正弦变化的激发光；

所述第一激发滤光片用于对所述激发光进行过滤；

所述第一反射镜用于将所述第一激发滤光片过滤后的激发光反射至所述扫描器；

所述第二激光组件包括：第二激光器、螺旋相位片、第二激发滤光片以及第一分束镜；

所述第二激光器用于产生第二激光；

所述螺旋相位片用于将所述第二激光调制成环形STED光；

所述第二激发滤光片用于对所述环形STED光进行过滤；

所述第一分束镜用于将所述第二激发滤光片过滤后的环形STED光反射至所述扫描器；

所述装置还包括：第一物镜、针孔以及第二物镜；

所述第一物镜用于将所述第一反射镜反射的激发光和所述第一分束镜反射的环形STED光汇聚至所述针孔；

所述针孔用于对所述第一物镜汇聚的激发光和环形STED光进行空间滤波；

所述第二物镜用于将所述针孔空间滤波后的激发光和环形STED光准直照射到所述扫描器上。

2.根据权利要求1所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述装置还包括：扫描透镜、管镜和第三物镜；

所述扫描透镜用于接收所述扫描器发出的激发光和环形STED光，对其进行扩束后发出；

所述管镜用于接收所述扫描透镜发出的扩束后的激发光和环形STED光，对其进行准直后发出；

所述第三物镜用于接收所述管镜准直后的激发光和环形STED光，将其聚焦到待成像样品上激发产生荧光信号。

3.根据权利要求2所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述装置还包括：第二分束镜；

所述第二分束镜用于将待成像样品上激发产生的荧光信号反射至所述探测器。

4.根据权利要求3所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述装置还包括：发射滤光片和第一透镜；

所述发射滤光片用于对所述第二分束镜反射的荧光信号进行过滤；

所述第一透镜用于将所述发射滤光片过滤后的荧光信号汇聚至所述探测器。

5.根据权利要求1所述的扫描结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述强度调制器的调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上激发光光强，r为待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，t为时间，

为初始相位。

6.一种扫描结构光超分辨显微成像方法，其特征在于，包括：

通过第一激光组件产生的强度随时间正弦变化的激发光和第二激光组件产生的环形STED光对待成像样品进行扫描激发，产生荧光信号；

采集待成像样品被激发光和环形STED光扫描激发产生的荧光信号，得到不同取向和不同相位的若干荧光结构光图像；

提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像；

基于所述若干局部超分辨图像合成待成像样品的完整超分辨图像；

所述通过第一激光组件产生的强度随时间正弦变化的激发光和第二激光组件产生的环形STED光对待成像样品进行扫描激发，产生荧光信号，包括：

通过第一激光组件产生强度随时间正弦变化的激发光，通过第二激光组件产生环形STED光，通过激发光和环形STED光对待成像样品进行扫描激发，产生荧光信号；其中，环形STED光区域内的激发态分子由于受激辐射迅速回落到基态而无法产生荧光信号，只有激发光中心区域内的荧光分子发射荧光信号；

获得超过衍射极限的条纹结构光图像，且条纹结构光图像中相邻条纹间距与STED显微分辨率相同。

7.根据权利要求6所述的扫描结构光超分辨显微成像方法，其特征在于，所述提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，根据所述频率分量重构出待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像的步骤包括：

提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对同一取向的荧光结构光图像的频率分量进行复位后叠加，得到不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值；

对不同取向的荧光结构光图像的频率分量叠加值分别进行傅里叶逆变换，得到待成像样品不同取向的若干局部超分辨图像。

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